酶活性实验

酶活性实验（精选十篇）

酶活性实验 篇1

1 材料与方法

1.1 材料与器具

收集人唾液中的唾液淀粉酶, 备齐试管3只, 小漏斗一只, 瓷比色盘一个。

1.2 方法

(1) 收集唾液:用少量蒸馏水漱口 (为了清除口腔内食物残渣) , 收集唾液2ml, 用蒸馏水稀释5~10倍 (根据各人的酶活性而定) 。取小漏斗, 垫小块脱脂棉, 过滤稀释唾液, 滤液备用。 (2) 取试管3只, 编号1、2、3, 按表1添加试剂。 (3) 将各试管混匀, 取瓷比色盘一个, 预先在各池分别加1滴稀碘液。每隔1min从第2管吸取溶液1滴, 加到已加有碘液的比色盘小池中, 直至此管不与碘呈色 (即只显碘的浅棕色) 时, 向各管加碘液2滴, 摇匀观察。本实验要求在室温条件下进行。

2 结 果

试管1溶液显紫色, 试管2溶液显棕黄色, 试管3溶液显蓝色。

3 讨 论

酶活性实验 篇2

关于温度影响酶活性因素实验流程的再设计

酶活性的大小受多方面因素影响,其中温度是影响酶活性的重要因素之一,也是中专生化实验中验证影响酶活性因素的.主要定性实验之一.笔者根据多年的实验教学经验对实验流程进行再设计,同时通过进一步实验,验证出酶的另一性质,收到了良好的教学效果.

作 者：吴晨怡  作者单位：鞍山师范学院附属卫校,辽宁,鞍山,114001 刊 名：卫生职业教育 英文刊名：HEALTH VOCATIONAL EDUCATION 年，卷(期)： 27(7) 分类号：G424.31 关键词：温度   酶活性   实验流程  

对果胶酶活性影响因素的实验改进 篇3

关键词：果胶酶；温度；pH；酶用量

在高中必修一模块“探究影响酶活性的条件”中，是通过定性分析探究酶的最适温度和pH，而本课题是建立在此基础上，通过定量分析来进行温度和pH对酶活性的影响，同时还探究了果胶酶的最适用量。

一、材料与方法

1.材料：苹果、质量浓度2%果胶酶、0.1mol/L NaOH溶液、

0.1mol/L HCl溶液。

2.仪器：搅碎机、pH计、电热恒温水浴锅、刻度试管、量筒、漏斗、滤纸、吸管。

3.方法：（1）将苹果洗净切丁，按照苹果：水=2：1的比例，放入搅碎机搅碎至匀浆状态；（2）用双层纱布过滤苹果匀浆，至烧杯中待用；（3）①探究最适温度：设置温度梯度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，果汁用量5毫升，果胶酶用量为2毫升，果汁和果胶酶先分别水浴2分钟，然后将果胶酶加入果汁中水浴20分钟；②探究最适pH：设置pH梯度2、3、4、5、6、7、8，先将果汁和果胶酶分别调至相应pH值，然后按照果胶酶5毫升、果胶酶2毫升的用量混合均匀，在50℃水浴中反应20分钟；③探究果胶酶的最适用量：使用相同浓度的果胶酶溶液，使用不同的体积，设置酶量梯度为0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL。果汁用量为5mL，加入不同体积的果胶酶，通过加入蒸馏水保证每组液体体积相同，在50℃水浴中反应20分钟；（4）观察分层现象及果汁的澄清度，并记录。（5）过滤，并且记录过滤后的果汁的体积。（6）计算出汁率：出汁率=（果汁质量-水的质量）/苹果质量。

二、结果与分析

1.最适温度。酶的本质是蛋白质，只有在有效温度范围内，酶才具有催化作用。当温度为最适温度时，酶催化反应的速率达到最大。从表1中得出，随着温度的增加，果汁量及出汁率先增加后减少，当温度为55℃时，果汁量和出汁率达到最大值，分别为

5.4mL和52%，此时酶活性最强；同时，果汁出现的分层现象最明显，并且果汁澄清度也最佳。最终，可以得出结论，此果胶酶的最适温度为55℃。

2.最适pH值。果汁的pH值不仅影响果胶酶对果胶的作用，而且还影响果胶胶体物质的稳定性。从表2中得出，随着pH值的增加，果汁量及果汁率先增加后减少，當pH=4时，果汁量和果汁率达到最大值，同时，果汁出现分层现象，澄清度最佳。因此，pH=4为此果胶酶的最适pH值。

3.最适酶用量。果胶酶的用量对果汁澄清效果有很大影响。果胶酶用量少时，果胶物质不完全分解，澄清度差；用量过多，在工业生产中，会增加生产成本，并且酶蛋白又会使果汁产生成本。从表3中可以看出，当酶用量为小于3.5mL时，果汁量随酶用量的增加而增加；果胶酶用量增加到3.5mL时，出汁率达到55%，并且基本变化不大。因此，酶的最适用量为3.5mL。

三、结论与分析

1.在制作果汁过程中，增加使用纱布过滤的步骤。使用纱布过滤后，果汁为均匀的溶液状态，便于用吸管定量吸取，增加了实验的准确性和操作性。

2.合理设置单因素梯度。由于时间等因素，在大班学生分组实验中，设置合理的梯度是很有必要的。例如，本实验的温度梯度可设置为45℃、50℃、55℃、60℃，pH值梯度为2、3、4、5，酶用量梯度为2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL。这样既能合理利用有限的课堂时间，并且也能达到理想的实验效果。

3.设置固定的pH值，使用pH试纸的准确性不高，并且pH计对学生不易操作和大部分学校不具备较好实验条件。多次实验结果表明，通过滴加不同滴数的0.1mol/L HCL溶液和NaOH溶液进行定性分析，再测定溶液的pH值，能达到很好的实验效果。此实验改进，可大大降低实验的复杂性，并且可以达到实验目的。

通过果胶酶对苹果汁处理的单因素实验结果表明，果胶酶的最适温度为55℃，最适pH值为4，最适酶用量为3.5mL。

参考文献：

[1]王爱丽.“果汁中的果胶和果胶酶”的实验改进与创新[J].生物学通报，2010，45（7）：57-59.

酶活性实验 篇4

关键词：温度对酶活性的影响,实验教学

高中生物必修一《分子与细胞》模块第五章第一节《酶的特性》中设计了一个学生探究性实验,即“探究温度对酶活性的影响”。该实验原理是淀粉遇碘液呈蓝色。适宜条件下α-淀粉酶使淀粉逐步水解成麦芽糖和葡萄糖。(α-淀粉酶的最适温度是60℃左右)麦芽糖和葡萄糖遇碘液不显色,但二者都是还原糖,加入斐林试剂后在55~60℃水浴加热会产生砖红色沉淀。教学目标是学会设置对照;学会控制自变量,观察和检测因变量的变化;概述温度对酶的活性的影响;体验探究过程,领悟科学探究方法,学会用准确的语言阐明实验探究的结果。实验结论为:酶促反应需要适宜的温度,高温会使酶变性失活;低温降低酶的活性。真正的实验能否得出这样的结论呢?

在认真阅读了课本和教学参考书的相关内容,并进行了仔细的思考和分析之后,我形成了自己的授课思路。

[新课引入]让学生思考加酶洗衣粉的包装袋上注明的适用温度范围含义,引导学生理解“不同的温度对酶的活性是有影响的”的含义。那么,如何证明自己的观点是正确的呢?(接下来引导学生探究)

[分组情况]将学生分成四人一个小组,让学生小组合作探究温度对酶活性的影响,每组确定一个主发言人。

[实验材料]教师参照高中生物必修一《实验探究报告册》第38页提供的实验材料、器具提供多种实验材料供学生选择。

[探究过程]探究一:探究实验所用的酶材料。

教师:展示α-淀粉酶,新鲜的肝脏研磨液,提问:肝脏研磨液里主要包含哪种酶?

学生:过氧化氢酶。

教师:如果选用过氧化氢酶来探究温度对酶活性的影响,合适吗?

学生:不合适。

教师:为什么?

学生:因为高温会加速H2O2的分解,影响实验结果。

教师总结:对,如果我们在实验中设置高温条件,温度不仅会对酶的活性产生影响,还会对化学反应本身的速率产生影响。这样的实验设计不够严密。建议用淀粉酶来探究温度对酶活性的影响。

探究二:探究如何控制实验变量

教师:控制变量对于设计一个严谨的、可行性高的实验来说尤为重要。请大家思考大屏幕上所列出的问题。

(1)你设计实验的自变量是什么?怎么控制自变量?

(2)因变量是什么?衡量因变量大小的指标是什么?如何检测该指标?

(3)该实验有哪些无关变量?怎么控制?

学生:认真思考、讨论、完成上述问题后,选择实验试剂、用具,根据所选材料对要探究的问题作出假设,并设计实验步骤。

教师:设计思考题,列出实验中控制的自变量,观察和检测因变量指标以及控制无关变量中容易出现的问题,指导学生按照探究实验的基本步骤设计好实验,帮助学生解决问题。

(由设计较好的几组进行交流、展示。)

教师:在每个小组介绍完实验步骤时,询问各组设计中的自变量及其控制方法,因变量指标的观察和检测方法。

(其他同学认真倾听,听完后讨论。)

教师对设计较好的地方给予肯定和鼓励,及时纠正出现的问题,和学生一起对探究时出现的问题进行归纳与总结:(1)没有对照,我们无法判断实验结果是否正确。(2)实验组和对照组只有一个变量。(3)要严格控制无关变量,遵循无关变量相同且适宜原则。(4)因变量指标的检验方法一定要简便可行。

(5)酶的量和底物的量会影响酶促反应的速率,所以实验中每种酶和反应物的加入量必须相同且适宜。

探究三:探究实验时要注意的一些问题

教师:请同学们思考、讨论以下问题。

问题1:因变量指标的检验用碘液好还是用斐林试剂好?

提示:探究“温度对酶活性的影响”是要观察不同温度对酶活性的影响,如果选碘液作为指示剂,可通过溶液中蓝色的深浅,直观地显示出不同温度条件下淀粉的分解情况。特别是当温度设置较密时,如温度分别为0℃,10℃,20℃,…,60℃,…,100℃时,选用碘液可以看到随淀粉分解反应的进行,蓝色逐渐消失的过程,而不能选择斐林试剂,因为其他温度条件下也可能生成砖红色沉淀,但是如果实验中只设置了三个温度条件,如0℃(冰水中)、60℃和100℃(沸水中),加入斐林试剂只有60℃条件下处理的淀粉溶液才有砖红色沉淀生成,即反应在60℃时能够进行,其他两个温度条件下无砖红色沉淀生成,反应不能进行。这时可以选用斐林试剂作为指示剂。两相比较,选择碘液更好。

问题2:控制底物温度还是控制酶温度?不同温度溶液混合会改变原有溶液的温度吗?

提示:既要控制底物温度又要控制酶温度,而且二者混合前温度必须相同。原因是酶具有高效性,如不先进行同温处理,而是先混合后调温,可能出现温度还未调好反应就已经进行,以至于影响到实验结果。不同温度溶液混合会改变原有溶液的温度。

学生:讨论后及时找出本组设计方案的不足,进一步修改完善。

教师:师生共同讨论归纳,总结出比较合理的实验设计,展示如下:

(1)取六支洁净的试管,分别标号1,2,3,4,5,6。

(2)向1~3号试管中各加入1mLα-淀粉酶溶液,向4~6号试管中各加入2mL淀粉溶液。

(3)将1号和4号试管放入0℃冰水浴中,2号和5号试管放入60℃水浴中,3号和6号试管放入100℃沸水浴中,均保温5分钟。

(4)分别将置于相同温度下的两支试管中的溶液混合均匀,仍然分别在0℃、60℃、100℃条件下保温,让混合液反应5分钟。

(5)将反应后的三支试管取出,分别加入等量碘液,震荡摇匀,观察溶液颜色变化,是否变蓝及变蓝程度,记录结果。

[教学反思]人们总说,实验教学特别简单,教师教起来既容易,又省心。而实行新课改后,探究实验要求学生们通过探究去开拓自身的创造性思维,让学生在解决问题的过程中去发现问题,进一步探究。新课程的探究实验要求学生改变学习方式、提高解决实际问题的能力,也要求教师不断学习、拓宽自己的知识面,改变教学观念,勤奋探索,从而更好地驾驭新教材,做好实验教学和高中生物教学工作。新课程的实验教学改革给学生和教师的共同成长提供了契机,使学生和教师在共同探索问题、解决问题中交流沟通,在共同查找资料、摄取信息中增加互动,增进了解。

酶活性实验 篇5

点突变研究酶活性的文章阅读有感

羧肽酶A的Try248曾被认为是酶催化活性的提供质子的位点。在此之前，科学家已经研究过嗜热菌蛋白酶酸碱催化的反应机制。

这篇文章利用酪氨酸和苯丙氨酸只有一个酚羟基的差异，利用点突变的方式，改变羧肽酶248位的氨基酸。

对其cDNA进行诱变使得TAT→TTT，从而氨基酸的密码子发生变化，在翻译过程中Try248→Phe248。

实验又将野生型和突变型cDNA转到带有α-因子的酵母载体中，进行蛋白质的表达。

在1986年的时候，点突变技术刚刚形成不久，对于点突变研究酶活性也是一个刚刚开始的技术方式。本文在NATURE上发表时，正是对酶的性质研究的一个新方向的开始。

点突变后，单个氨基酸的改变如何影响酶活性的，或者单个氨基酸如何在酶催化反应的作用，本研究的作者通过四个方面的实验，不同方向上佐证羧肽酶A的248位酪氨酸并不是酸碱催化位点而是一个酶的催化结合位点。

-5第一个实验为：测量野生型和突变型的CPA对四种不同底物酶催化的Kcat、Km、10Kcat/Km

得到的结果为突变的酶影响了反应的亲和力。

第二个实验为：利用抑制剂PCI对野生型和突变型酶分解肽类底物的Ki值。

得到的结果说明抑制剂结合了酶的结合位点，同时野生型和突变型的酶活性都收到了相同的影响。这个结果反映了，Try248只是酶催化反应的结合位点。

第三个实验为：X-衍射实验，说明了248位酪氨酸在酶催化反应中没有像酸碱催化一样提供质子，而是这个位点提供了底物与催化剂结合的结合位点。

第四个实验为：TNM的硝化实验。TNM硝化了野生型的248位酪氨酸。使得其提供氢键的位点发生了变化，所以相对于突变型，其酶活性变化较大。这个实验再次验证了248位酪氨酸为酶和底物的结合位点，而不是催化位点。

逐渐干旱对牡丹保护酶活性的影响 篇6

关键词：牡丹；逐渐干旱；复水；保护酶

中图分类号： S685.110.1；Q945.78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0156-02

收稿日期：2013-12-25

基金项目：国家自然科学基金（编号：31200468）。

作者简介：李军（1987—），河南信阳人，硕士研究生，研究方向为植物生理生态学。E-mail：LEEJUN19870824@163.com。

通信作者：孔祥生，教授，主要从事植物生理生态研究。E-mail：kxsh55@163.com。牡丹花朵硕大、色彩艳丽，具有很高的观赏价值[1-3]，此外，牡丹皮具有较高药用价值，牡丹籽油具有高食用价值，牡丹精油具有高商品价值[4]。然而，水分不足会影响牡丹的正常生长发育，进而影响牡丹的价值[5]。植物在代谢过程中一部分氧分子不可避免地被还原为活性氧，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、单线态氧、过氧化氢等[6]。当植物遭受到逆境胁迫时，活性氧的产生速度会加快。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）是植物体内抵御活性氧毒害的重要抗氧化保护酶系统[7]。笔者对牡丹干旱胁迫过程中及复水后保护酶活性变化进行研究，探索牡丹抵御干旱胁迫的机制，旨在为开发利用牡丹资源提供依据。

1材料与方法

1.1材料

牡丹品种洛阳红、乌龙捧盛均由河南省洛阳市中国洛阳国家牡丹基因库提供，株龄均为4年生。2012年10月，选取生长健壮、长势均一的洛阳红、乌龙捧盛各10株，移栽装盆，每盆1株，塑料盆直径 28 cm，高23 cm，土壤为洛阳市郊大田肥沃土壤。装盆后正常水分管理。2013年5月，干旱处理前10 d，每天用称重法补水，确保土壤相对含水量为80%，之后停止浇水，自然干旱。停止浇水后每天取样1次，测定叶片保护酶活性，同时用称重法计算土壤相对含水量，待大部分叶片萎蔫时复水。2013年5月10日开始试验，5月11日土壤相对含水量下降至70%（轻度干旱），5月12日下降至58%（轻度干旱），5月13日下降至46%（中度干旱），5月14日下降至35%（重度干旱），5月15日下降至26%（重度干旱），5月17日复水至土壤相对含水量为80%，控水1 d后（5月18日）再取样1次。取样时自上向下选取枝条第3至4张叶，每次测定重复3次。

1.2方法

采用氮蓝四唑光还原法[8]测定SOD活性，采用愈创木酚法[8]测定POD活性，采用紫外吸收法[9]测定CAT活性。

1.3数据处理

用SPSS 13.0软件进行方差分析，用皮尔逊相关系数法统计保护酶活性的相关性。

2结果与分析

2.1干旱胁迫对牡丹叶片SOD活性的影响

由图1可知，随着土壤相对含水量的逐渐降低，洛阳红、乌龙捧盛的SOD活性均呈先上升后下降趋势。当土壤相对含水量为35%时（重度干旱），2种牡丹叶片SOD活性均达最高水平，此时洛阳红叶片SOD活性比对照高47.18%，乌龙捧盛比对照高34.95%，差异均达显著水平。当土壤相对含水量为26% （重度干旱）时，2种牡丹叶片SOD活性均下降。复水后，2种牡丹叶片SOD活性均低于重度干旱胁迫（土壤相对含水量为26%）。

2.2干旱胁迫对牡丹叶片POD活性的影响

由图2可知，洛阳红、乌龙捧盛叶片的POD活性均随着干旱胁迫程度的增加呈逐渐升高趋势。当土壤相对含水量为26%时（重度干旱胁迫），2种牡丹叶片的POD活性均达最高，洛阳红比对照高66.66%，乌龙捧盛比对照高7958%，差异均达显著水平。复水后，相比于重度干旱胁迫（土壤相对含水量为26%），2种牡丹叶片的POD活性均有所降低，且差异均达显著水平。

2.3干旱胁迫对牡丹叶片CAT活性的影响

由图3可知，随着干旱胁迫程度的增加，洛阳红、乌龙捧盛叶片的CAT活性均呈先上升后下降趋势。当土壤相对含水量为46%时（中度干旱胁迫），2种牡丹叶片的CAT活性均最大。当土壤相对含水量为35%时 （重度干旱胁迫），与中度干旱胁迫相比，洛阳红叶片的CAT活性下降但差异不显著，乌龙捧盛叶片的CAT活性下降且差异显著。复水后，与重度干旱胁迫（土壤相对含水量为26%）相比，2种牡丹叶片的CAT活性有所下降，且差异均显著。

2.4牡丹叶片抗氧化保护酶活性间的相关性分析

由表1、表2可知，洛阳红SOD活性与POD活性间存在显著正相关，SOD活性与CAT活性间存在极显著正相关，POD活性与CAT活性间相关性不显著。乌龙捧盛SOD活性与POD活性间存在显著正相关，SOD活性与CAT活性、POD活性与CAT活性间相关性不显著。由此可知，牡丹在遭受干旱胁迫后，3种保护酶之间存在内在联系及协同作用，以更好地清除活性氧，减少对细胞的伤害。

表1洛阳红叶片3种抗氧化酶间的相关系数

指标相关系数SOD 活性POD活性CAT活性SOD活性1.000POD活性0.821*1.000CAT活性0.906**0.7461.000注：“*”“**”分别表示显著相关、极显著相关。表2同。

nlc202309041604

3结论与讨论

SOD、POD、CAT是植物细胞内抵御活性氧毒害的重要保护酶系统，它们具有清除超氧阴离子自由基、过氧化氢、羟自

表2乌龙捧盛叶片3种抗氧化酶间的相关系数

指标相关系数SOD活性POD活性CAT活性SOD活性1.000POD活性0.792*1.000CAT活性0.6040.6501.000

由基等功能[10]。SOD能催化毒性较强的超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成毒性较弱的H2O2、氧分子，H2O2由POD、CAT 2种酶清除[6]。当水分充足时，牡丹叶片内活性氧的产生与清除处于动态平衡；当水分不足时，动态平衡被打破，活性氧积累[11]。活性氧与细胞内的成分很容易发生反应，能够直接或间接启动膜脂过氧化反应，破坏磷脂双分子层，伤害细胞膜系统，导致细胞损伤甚至死亡[10]。随着干旱胁迫程度的加剧，洛阳红、乌龙捧盛叶片的SOD活性均呈先升高后下降趋势，这与前人关于白桦（Betula platyphylla）[7]、马铃薯（Solanum tuberosum）[12]、甘草（Glycyrrhiza uralensis）[10]的研究结果一致。中度干旱胁迫下，2种牡丹叶片的SOD活性开始升高，原因可能是随着干旱胁迫加剧，牡丹叶片中超氧阴离子自由基积累，SOD可能受到超氧阴离子自由基增多的诱导因而活性显著升高，以更好地清除超氧阴离子自由基[6]。POD、CAT均能清除H2O2，随着干旱程度增加，洛阳红、乌龙捧盛叶片的POD活性均呈先升高后下降趋势，这与前人研究结果[13]一致。随着干旱胁迫加剧，2种牡丹叶片的CAT活性均呈先上升后下降的趋势，这与前人研究结果[14-15]一致。随着水分胁迫的加剧，SOD、CAT活性均呈先升高后下降趋势，这可能是由于许多抗氧化酶为诱导酶，干旱胁迫因子促进诱导酶合成的同时，也会对已合成酶的结构造成破坏，加快酶的分解速度，降低酶活性。干旱胁迫未达到一定程度时，抗氧化酶合成占优势，当胁迫超过阈值后，抗氧化酶破坏占优势[6]。植物体内抗氧化保护机制包括氧化酶系统、非酶系统，本试验仅针对3种抗氧化保护酶进行了研究，抗坏血酸、类胡萝卜素等抗氧化剂非酶系统也同样值得研究[16]。

参考文献：

[1]侯小改，段春燕，刘素云，等. 不同土壤水分条件下牡丹的生理特性研究[J]. 华北农学报，2007，22（3）：80-83.

[2]李永华，翟敏，李颖旭，等. 干旱胁迫下牡丹叶片光合作用与抗氧化酶活性变化[J]. 河南农业科学，2007（5）：91-93.

[3]邵小斌，朱朋波，陈翠竹，等. 牡丹温室内催花栽培技术[J]. 江苏农业科学，2008（6）：150-151.

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[5]左敏，高素萍，王岑涅，等. 干旱胁迫对天彭牡丹生理生化和观赏特性的影响[J]. 西南农业学报，2011，24（4）：1290-1293.

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[10]李明，王根轩.干旱胁迫对甘草幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响[J]. 生态学报，2002，22（4）：503-507.

[11]赵丽英，邓西平，山仑. 活性氧清除系统对干旱胁迫的响应机制[J]. 西北植物学报，2005，25（2）：413-418.

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[16]Basu S，Roychoudhury A，Saha P P，et al. Differential antioxidative responses of indica rice cultivars to drought stress[J]. Plant Growth Regulation，2010，60（1）：51-59.

酶活性实验 篇7

1 实验材料

1.1 实验动物

6月龄日本大耳白兔60只, 雌雄各半, 体重2.0～3.0kg, 由成都中医药大学实验动物研究中心提供, 三级动物, 动物许可证:99011号。

1.2 实验药物与试剂

颈康灵胶囊:由成都中医药大学附属医院药剂科提供。颈复康颗粒:承德颈复康药业集团有限公司生产, 规格:5g/袋。2%戊巴比妥钠注射液:上海新亚药业有限公司生产。超氧化物歧化酶 (SOD) 测试盒:南京建成生物工程研究所。考马斯亮兰蛋白测试盒:南京建成生物工程研究所。高速ATP酶测试盒:南京建成生物工程研究所。

1.3 主要实验仪器

DF110型电子天平:常熟仪器设备厂, 分度值0.1mg。DY89-I型电动玻璃匀浆机:宁波新芝科器研究所。DK-600A型电热恒水箱:上海一恒科学仪器有限公司。FR-180FA高速冰冻离心机:日立工机株式会社。LDZ5-2型自动平衡离心机:北京医用离心机厂。721分光光度仪:上海第三分光仪器厂。N35S制冰机, 微量移液器, 自制支架。

2 实验方法

2.1 动物分组

将60只日本大耳白兔适应性饲养1周, 按体重、性别随机分为6组:正常组、模型组及颈康灵药物组 (低、中、高剂量组) 及颈复康对照组, 每组10只。

2.2 模型制作

参照施杞的风寒湿痹造模法并加以改进:以自制支架固定兔低头45度左右, 使后颈部肌肉呈牵拉状态, 每日2次, 每次2小时, 每日造模时间随机确定, 连续8周后, 剪去兔后颈部毛发暴露皮肤, 继续头部固定的同时, 于后颈部敷冰块, 并施以冷风刺激, 在加以风寒湿等刺激因素后, 造模时间与频率同前, 保持上述各因素并存再连续造模4周。

2.3 给药处理

造模结束后, 按照临床体重60kg成人拟用剂量的5、10、20倍分别为低剂量组、中剂量组和高剂量组, 正常组和模型组经灌胃给予蒸馏水10ml。低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃给予颈康灵混悬液10ml (含药量分别为0.13g/kg、0.27g/kg、0.53g/kg) , 颈复康组经灌胃给予颈复康药液10ml (含药量0.83g/kg) 。以上给药均为每日1次, 连续4周。隔10天称1次体重以调整给药量。

2.4 指标检测

2.4.1 标本采集

动物饲养16周后, 麻醉, 切开家兔后颈部皮肤, 在颈2～4棘突旁0.5cm左右, 取皮下肌肉组织约0.5cm3。然后于0～4℃条件下修剪标本, 剔去筋膜及神经组织, 迅速置冰蒸馏水中漂洗去除残留血迹后, 取出称重, 以锡箔纸包裹, 放入-70℃冰箱中备测。

2.4.2 组织处理及指标测定

将待测组织充分剪碎后, 加9倍冰生理盐水, 在组织匀浆器中持续研磨5分钟左右, 制成10%的组织匀浆, 离心取上清液, 1000～1500r/min离心10分钟, 取上清液0.2ml加0.8ml生理盐水稀释成2%的匀浆待测。同时用考马斯亮兰试剂测定2%组织匀浆蛋白 (按试剂盒说明书操作) 。并按试剂盒说明检测超氧化物歧化酶 (SOD) 及Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性。

2.5 统计学处理

所有数据均采用SPSS12.0统计软件做单因素方差分析、q检验进行数据处理。确定检验水准为α=0.05, P<0.05为显著性检验水准。

3实验结果 见表1。

与正常组比较*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较△P<0.05, △△P<0.01;与颈复康组比较▲P<0.05, ▲▲P<0.01:与低剂量组比较☆P<0.05, ☆☆P<0.01

4 讨论

颈康灵是针对“寒瘀互结”为病机特点的颈椎病拟方而成, 由桂枝、羌活、葛根、姜黄、天麻、麝香等中药组成, 全方共奏散寒祛瘀、祛风除湿、温经止痛之功。临床用于颈椎病治疗疗效肯定。本实验从酶学活性变化方面对由散寒祛瘀中药制备而成的颈康灵的作用机制进行初步探讨, 以期为今后对该类药物的深入研究奠定基础。

SOD是一种酶抗氧化剂, 由蛋白质和金属离子组成。具有特定的生物催化功能, 广泛存在于生物体的各组织内, 能清除超氧阴离子自由基, 使细胞免受损伤, 在维持机体内自由基的动态平衡中起着重要的作用。而自由基在某些生理状态和病理状态下生成增加则破坏细胞结构, 引起脂质过氧化, 对机体造成损害[1,2], 因此SOD酶活性的高低对维持体内自由基的动态平衡有着重要的意义。研究表明[3]SOD对骨骼肌损伤有一定的预防作用, 也有研究[4]提示, 细胞内SOD活性显著降低所导致的体内脂质过氧化, 能抑制细胞膜上ATP酶的活性, 同样也是导致Na+-K+-ATP酶活性低下的重要因素。可见, SOD与自由基、ATP酶之间有着较为密切的联系, 因此本实验选取SOD为观测指标之一。本实验研究结果提示颈康灵可保护SOD酶活性, 可能是发挥其治疗颈椎病作用的一个重要机制。

Na+-K+-ATP酶又称为钠钾泵 (Na+-K+Pump) , 是一种高分子蛋白质, 存在于多种生物膜。该酶在骨骼肌的肌膜上含量高、活性强, 其活性根据胞内外的离子浓度改变情况而调节, 目的是维持肌膜两侧“内高钾外高钠”的离子梯度, 据估计, 一般细胞大约把它代谢所获得的能量的20%～30%用于钠泵的转运, 以保持Na+、K+在细胞内外的不均匀分布。该酶和动作电位、兴奋收缩-耦联、骨骼肌的兴奋性等关系密切, 骨骼肌的一系列活动都离不开Na+-K+-ATP酶[5]。众多研究表明, Na+-K+-ATP酶活性对保证骨骼肌的持续兴奋性和收缩能力很关键, 而且与骨骼肌疲劳有着密切的关系, 如颈椎病发病过程中, 骨骼肌疲劳能加重颈椎病致病因素对颈部软组织的损伤, 而诱发疾病[6]。

肌细胞内Ca2+浓度及其动态平衡不仅参与肌肉收缩等即刻反应, 而且在肌肉损伤和改建等过程中也起着重要作用[7]。胞浆钙浓度升高和异常, Ca2+内流均可能是骨骼肌损伤的致病原因[8], 胞浆Ca2+浓度的异常增高, 将给细胞钙的缓冲器-线粒体带来众多危害, 而线粒体功能障碍则ATP生成不足, 进而使依赖于ATP供能的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性下降[9]。而位于骨骼肌细胞内质网 (肌质网) 膜上的Na+-K+-ATP酶是调节细胞内Ca2+浓度的重要蛋白质之一[10], Na+-K+-ATP酶也可以通过Na2+-Ca2+交换来调节胞浆内升高的Ca2+浓度, 二者酶活性的下降使Ca2+浓度调节功能发生障碍, 加重骨骼肌的损伤。

Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶作为存在于生物膜上的蛋白质, 其活力的大小是细胞能量代谢及功能有无损伤的重要指标[11]。Na+-K+-ATP酶活性下降主要使细胞膜电位紊乱, 并且也影响了调节细胞内Ca2+平衡的功能, Ca2+-ATP酶活性下降导致细胞内钙超载, 激惹一系列代谢紊乱, 两者均可致细胞结构退变, 甚至丧失生命力[12]。而整个肌细胞的损伤, 最终则导致骨骼肌的损伤。颈部肌肉如若不能正常调节颈椎动力学平衡, 导致动力平衡系统失衡, 进一步则引起颈部椎体-韧带-椎间盘组织构成的静力平衡系统的失衡, 最终导致整个颈椎系统生物力学功能的紊乱, 使颈椎稳定性丧失, 出现颈椎间盘的退变而发病。由此可见Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶与颈椎病发病之间有着密切的联系。而本实验研究表明颈康灵对Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均具有保护作用, 酶活性得到有效保护则能抑制因其活性降低而产生的系列副作用, 从而发挥其有效的治疗机制。

摘要：目的:观察颈康灵对颈椎病模型家兔颈部肌肉酶活性的影响, 探讨其治疗颈椎病的作用机理。方法:60只日本大耳白兔随机分为6组:正常组, 模型组, 颈康灵低、中、高剂量3组和颈复康对照组。除正常组以外, 其它各组均建立风寒湿痹颈椎病模型, 然后分别给药治疗, 疗程结束后检测颈部肌肉SOD、Na+-K+-ATP和Ca2+-ATP酶活性。结果:模型组家兔颈部肌肉超氧化物歧化酶 (SOD) 、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性均低于正常组 (P<0.01) ;颈康灵中、高剂量均能提高模型组家兔颈部肌肉3种酶活性, 统计学比较有显著性差异 (P<0.01) ;与正常组、颈复康组比较, 均无显著性差异 (P>0.05) 。结论:颈康灵对颈椎病兔颈部肌肉SOD、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性有保护作用。

关键词：颈椎病/中医药疗法,@颈康灵/治疗应用,兔

参考文献

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[9]徐建广, 顾玉东, 李继峰.缺血对神经肌肉超微结构及酶组织化学的影响.中华实验外科杂志, 2003, 20 (6) :499.

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[11]徐雷, 杨磊, 杜柳涛, 等.静态负荷对大鼠离体骨骼肌能量代谢的影响.中国工业医学杂志, 2005, 18 (1) :14.

苹果过氧化物酶活性及同工酶分析 篇8

该试验以苹果作为研究材料, 测定不同品种苹果同工酶的表达和过氧化物酶活性, 分析不同品种苹果之间的亲缘性, 为生产中苹果的选种和分类以及品质鉴定提供生化依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2014年4月下旬, 从佳木斯市水果市场购买了7种苹果, 分别为蛇果、奶油富士、乔纳金、烟台富士、冰糖果、国光和黄元帅, 用于过氧化物酶活性及同工酶分析。

1.2 方法

1.2.1 同工酶提取

将苹果用清水洗净, 蒸馏水漂洗, 滤纸吸干后称重, 称取4g样品, 加8mL样品提取液 (pH7.2的蔗糖-磷酸缓冲液) , 冰浴下研磨至匀浆, 4层纱布过滤, 将滤液4℃下4 000r·min-1离心15min。取上清液即同工酶提取液 (样品) 置于-20℃冰箱保存备用, 也可直接用于电泳[3]。

1.2.2 电泳

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法, 分离胶浓度7.5%, 浓缩胶浓度3.5%。4℃恒压 (350V) 电泳, 电极缓冲液为pH 8.3Tris-Gly系统。样品点样量均为20μL, 电泳重复2次。

1.2.3染色及迁移率 (Rf) 的测定

采用醋酸联苯胺法染POD, 待酶带显现清晰后, 用流水漂洗后置蒸馏水中保存, Rf测定按照张相歧的方法[4]。

1.2.4 凝胶板的保存

用10%甘油浸泡玻璃纸8h以上, 然后在玻璃板上先放1张玻璃纸铺平, 其上放凝胶, 凝胶上再放1张玻璃纸, 排除玻璃纸与凝胶间的气泡, 阴干、保存, 以备考证。

1.2.5 过氧化物酶活性测定

采用愈创木酚法测定过氧化物酶活性[5,6]。

POD活性=V1·ΔOD/0.01V2W·Δt

式中:ΔOD为反应初速度阶段的吸光度差, 比色波长470nm;Δt为ΔOD对应的时间 (min) ;V1为提取酶液总体积 (mL) ;V2为测定时取用的提取酶液体积 (mL) ;W为植物样品鲜重 (g) ;0.01为以吸光度值 (ΔOD) 变化0.01为1个酶活性单位 (U) 。

2 结果与分析

2.1 不同品种苹果过氧化物酶同工酶谱分析

植物体内具各种不同代谢功能的酶类是由遗传决定的。同工酶就是控制这些酶的等位基因的变异产物, 过氧化物酶是最常被用作分析的同工酶。过氧化物酶在植物组织中广泛分布, 参与多种生理活动, 并且为生长发育提供了基因表达的灵敏指标, 是一种重要的遗传标记[7,8]。样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 采用联苯胺-醋酸-过氧化氢染色法染色。由图1可知, 7个样品共显现7种酶带。依染色深浅区分为强带、次强带、弱带和痕迹带4个级别。蛇果显示5条酶带, Rf0.28和Rf0.32为强带, Rf0.47和Rf0.59为次强带, Rf0.60为痕迹带;奶油富士显示6条酶带, Rf0.21、Rf0.60和Rf0.65为弱带, Rf0.28为强带, Rf0.47和Rf0.59为次强带;乔纳金显示3条酶带, Rf0.28为痕迹带, Rf0.32为弱带, Rf0.59为次强带;烟台富士显示6条酶带, Rf0.21和Rf0.65为弱带, Rf0.28为强带, Rf0.47、Rf0.59和Rf0.60为次强带。冰糖果显示6条酶带, Rf0.21为痕迹带, Rf0.28为强带, Rf0.65为弱带, Rf0.47、Rf0.59和Rf0.60为次强带;国光显示6条酶带, Rf0.21和Rf0.28为强带, Rf0.47和Rf0.65为痕迹带, Rf0.59为次强带, Rf0.60为弱带;黄元帅显示4条酶带, Rf0.28和Rf0.60为痕迹带, Rf0.32为弱带, Rf0.59为次强带。

从POD同工酶酶谱 (图1) 中可以看出, 奶油富士、烟台富士、冰糖果和国光均显现6条相同酶带, 即Rf0.21, 0.28, 0.47, 0.59, 0.60和0.65, 且Rf0.28处4种苹果均为强带, Rf0.59处均为次强带, 另外4条酶带POD活性也相近, 可以看出奶油富士、烟台富士、冰糖果和国光4种苹果遗传表达相近, 外观相似口感相近, 奶油富士、烟台富士和冰糖果同属富士系列, 且富士最初也是由国光培育而成 (富士苹果是日本农林水产省果树试验场盛冈分场于1939年以国光为母本, 元帅为父本进行杂交, 历经20余年, 选育出的苹果优良品种, 具有晚熟、质优、味美、耐贮等优点, 于1962年正式命名, 是世界上最著名的晚熟苹果品种) , 同工酶是基因表达的产物, 所以这4种苹果在遗传上有较大的相似性;通过分析图谱还看出, 乔纳金与黄元帅共显现4条酶带, 3条酶带均相同, 即Rf0.28都为痕迹带、Rf0.32都为弱带、Rf0.59都为次强带, 在外观上乔纳金和黄元帅也有相似之处, 都有些黄色, 有斑点, 所以根据POD同工酶表达特点可知乔纳金和黄元帅在遗传表达上相近, 可能在杂交育种过程中两者的杂交亲本有很大程度的相近;从POD同工酶表达酶谱中还可以看出, 7种苹果均表达Rf0.59酶带, 且活性相同 (均为次强带) , 可见此酶带的表达可能与苹果的共同特性有关, 所以该酶带可以作为苹果属的特征性酶带;POD同工酶酶谱中, 蛇果Rf0.32酶带表达活性很强 (为强带) , 乔纳金和黄元帅有此带但活性很弱 (弱带) , 其它苹果没有此酶带, 所以Rf0.32酶带可以作为蛇果特异表达的特征性酶带;Rf0.21酶带仅国光表达活性较强 (为强带) , 其余6种表达很弱 (弱带和痕迹带) 或不表达, 所以此酶带可以作为国光特异表达的特征性酶带;Rf0.65酶带只有奶油富士、烟台富士、冰糖果和国光表达, 且这4种苹果遗传表达相近, 所以Rf0.65的条带可能是这一系列品种的特征酶带。

1.蛇果;2.奶油富士;3.乔纳金;4.烟台富士;5.冰糖果;6.国光;7.黄元帅1.Red Delicious;2.Cream Fuji;3.Jonagold;4.Yantai Fuji;5.Bingtangguo;6.Ralls;7.Golden Delicious

2.2 不同品种苹果的过氧化物酶活性分析

将苹果过氧化物酶同工酶活性测定结果代入POD活性公式, 得到蛇果POD活性为1.68U, 奶油富士POD活性为4.56U, 乔纳金POD活性为0.822U, 烟台富士POD活性为0.468U, 冰糖果POD活性为1.03U, 国光POD活性为3.08U, 黄元帅POD活性为1.17U。奶油富士POD活性最高, 之后活性由高到低依次为国光、蛇果、黄元帅、冰糖果和乔纳金, 烟台富士POD活性最低。

从POD活性方面看, 乔纳金和黄元帅POD活性相近。奶油富士和国光的POD活性较高, 与其在POD同工酶酶谱中的表达程度一致, 黄元帅和乔纳金的POD活性与其在POD同工酶酶谱中的表达程度也基本一致, 但是冰糖果和烟台富士的POD活性与其在POD同工酶酶谱中的表达量不一致, 原因可能是在测定POD活性时受到温度、酸碱度、重金属和材料储存等因素影响。通过比较POD活性可以看出苹果POD活性与POD同工酶的表达量基本上一致。

3 结论与讨论

3.1 苹果POD酶带的共有性和不同品种的差异

7个苹果样品电泳图谱中均表达Rf0.59酶带, 可能此酶带与苹果的共同特性有关, 或者说该酶带可能是苹果属的特征性酶带。该试验所选7个苹果品种, 可大致划分为4类, 奶油富士、烟台富士、冰糖果和国光为一类, 与乔纳金、黄元帅、蛇果4个类型品种, 从图谱中可见到不论从酶谱带数目还是特有酶带上来看, 不同品种POD同工酶表现出一定的差异性。

3.2 不同产地苹果POD同工酶酶谱稳定性分析

奶油富士、烟台富士和冰糖果同属富士系列, 富士最初由国光培育而成, 所以这4种苹果在遗传上有较大的相似性。4种苹果产地不同, 但同工酶谱型非常相似, 均显现6条相同酶带, 且酶带活性也相近, 说明苹果中POD同工酶的表达比较稳定, 可以作为参考指标。

参考文献

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酶活性实验 篇9

一、教学观念转变前后教学方法对比

(一) 教学思路

观念转变前:为了弄清p H值、温度对酶活性有无影响, 让学生先预习本节内容, 课上按照教材中所给出的实验步骤, 学生进行分组操作, 观察结果、分析、得出结论。即实验与教学同步法。

观念转变后:为培养学生的探究意识、合作意识、自主学习的能力及创新能力, 我们将本节设计为一节实验探究课。首先将课堂学习过程前移, 课前印发给学生一些资料, 引发学生思考, 进而发现问题、提出问题, 分组选定课题, 做出假设, 设计实验。课上先通过交流完善实验设计, 然后完成实验, 得出结论, 展示成果, 最后组织学生讨论, 将结论应用于生产、生活实际。

(二) 教学目标

观念转变前: (1) 理解实验原理; (2) 初步学会探索影响酶活性的条件和方法; (3) 培养严谨的科学态度和实事求是的科学精神。

观念转变后: (1) 初步学会探索影响酶活性的条件和方法; (2) 探索酶在不同温度和p H值下催化底物水解情况; (3) 培养预习及自学能力; (4) 培养搜集、整理资料的能力; (5) 培养设计实验及实验操作能力; (6) 通过探究, 培养学生严谨的科学态度和实事求是的科学精神。

(三) 重点难点

观念转变前:影响酶活性的条件, 组织引导学生完成实验。

观念转变后:影响酶活性的条件, 组织指导学生实验设计过程及完成实验。

(四) 课前工作

观念转变前:预习本节教材内容, 弄清实验原理及实验步骤。

观念转变后:包括预习、组织学生交流、分组布置任务, 培养学生的合作意识。

(五) 教学过程

观念转变前: (1) 提出问题; (2) 完成实验; (3) 观察结果, 分析结果并得出结论, 达到共识; (4) 课堂检测, 完成实验报告。

观念转变后:观念转变后的教学过程包括七个阶段, 具体如下表。

通过前后两种教学方法的比较不难看出, 探究性实验课, 更加注重培养学生的创新精神和实践能力, 尤其是科学素养, 更加充分调动学生的学习积极性、主动性, 充分发掘学生的潜能。采用探究式实验教学还需要不断地研究和交流。

前后两种不同的教学方法, 根本上源于教师观念的转变。教育改革给教师提出了更高的要求:要有良好的素养和复合的知识结构;在实践中凝聚生成的教育智慧;富有科学精神和科学教育理念指导下的教育能力和研究能力。虽然我们现有能力离这些要求还有很大差距, 但只要我们教师转变思想观念, 勇于探索, 大胆实践, 就会向目标一步步迈进。

参考文献

[1]素质教育观念学习提要编写组编著.素质教育观念学习提要.三联书店, 2010.

酶活性实验 篇10

酪氨酸酶 (Tyrosinase) 是广泛存在于人体、动物、植物及微生物中的含铜氧化还原酶[5], 具有奇特的催化作用, 是生物体内黑色素合成的关键酶, 与皮肤的衰老及恶性黑色素瘤的发生有着紧密的关系[6]。酪氨酸酶的活性受到酪氨酸酶抑制剂的抑制, 使生物体内不能正常地合成黑色素。因此, 在医学和化妆品领域中常采用酪氨酸酶抑制剂来预防和治疗色素沉积、黑色素瘤等。此外, 酪氨酸酶抑制剂还可用作果蔬的防腐及害虫的调控剂[7]。当前对酪氨酸酶抑制剂的研究已经引起相关研究学者的高度重视。丝胶蛋白具有抑制酪氨酸酶的活性是由日本学者Kato[8]首先发现。自此之后, 尽管也有丝胶蛋白抑制酪氨酸酶活性的报道, 但是绝大多数所研究的丝胶蛋白都是利用有机溶剂从工业废水中进行提取, 很大程度上制约了丝胶蛋白在皮肤护理产品、食品添加剂等领域的应用[9]。安徽省农业科学院蚕桑研究所陈复生等[10]根据多年的家蚕遗传育种工作, 选育得到全天然丝胶茧, 其天然活性物质—丝胶蛋白不仅含量丰富, 而且对皮肤的刺激性小、乳化性能优良、安全性高, 因而在化妆品和保健食品等行业中具有广阔的发展前景。

本研究以育成的天然丝胶茧为材料, 从中提取丝胶蛋白, 采用多种蛋白酶进行酶解, 从中选取最佳蛋白酶;通过测定丝胶蛋白及其酶解产物的溶解性, 并以多巴为底物, 分析其对酪氨酸酶活性的抑制作用, 为发掘丝胶蛋白这一优质蛋白质的应用潜能提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

天然丝胶茧品种:绿S, 由本单位选育并饲养。饲养温度在25℃左右, 常规桑叶育, 化蛹后取茧壳作为实验材料。中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶 (南宁庞博生物工程有限公司) , 十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷、低标准蛋白质分子量 (Takara公司) , 蘑菇酪氨酸酶、L-多巴 (美国Sigma公司) , 其他试剂均为分析纯。

1.2 丝胶蛋白粉的制备

温水洗涤蚕茧, 60℃烘干后剪碎。准确称取5.00g碎茧壳, 加入到含250mL去离子水的烧瓶中, 于高温灭菌锅中125℃煮沸2.5h。室温冷却后采用四层纱布过滤, 将所获得的丝胶溶液进行真空抽滤, 于60℃旋转蒸发至约100mL。将丝胶蛋白浓缩液在-40℃下预冻2h后于-33℃, 压强1Pa条件下进行冷冻真空干燥, 所得丝胶粉末即为丝胶蛋白粉[11]。

1.3 蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果

参照文献[12]的方法选取中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对提取的丝胶蛋白进行酶解。在pH 7.0、反应温度50℃、酶浓度为0.5%、底物浓度10%、反应时间1h的条件下进行酶解。反应结束后立即加热至95℃, 保持5min, 进行灭酶活处理。待溶液冷却至室温, 即可将获得的丝胶蛋白酶解产物采用聚丙烯酰氨凝胶电泳法 (SDS-PAGE, 10%分离胶, 5%浓缩胶) 测定其分子量大小。将所得的丝胶蛋白酶解产物浓缩、冷冻干燥, 研磨成粉末状备用。

1.4 丝胶蛋白及其酶解产物的溶解性

准确称取1.00g丝胶蛋白及酶解产物, 配成质量百分比为10%的悬浮液, 于95℃水浴锅中振荡保温2.5h后, 5000r/min转速下离心30 min, 然后将上清液置于平面皿中烘干 (60℃) , 称取溶出物的质量, 根据以下公式计算溶解率。

其中m为溶出物的干质量, m0为样品的干质量。每个样品平行测定3次。

1.5 酪氨酸酶活性的抑制率测定

在黑色素合成的过程中, 酪氨酸在酪氨酸酶的作用下转化为多巴。多巴又被酪氨酸酶催化为多巴醌。多巴醌是体内黑色素合成的一个中间体, 也是一种有色物质, 可用分光光度计在475nm处测定其含量[13]。

准确吸取丝胶蛋白或酶解产物溶液、磷酸缓冲液 (pH 6.8) 、L-多巴溶液 (0.5mg/mL) 比色管中混合均匀, 25℃下放置约10min, 缓慢加入适量的酪氨酸酶液, 迅速转移到石英比色皿中, 于475nm处测第10min的吸光度。pH6.8的磷酸缓冲液为参比, 总反应体系为5mL。具体各组分含量见表1。

酪氨酸酶活性的抑制率 (%) =[1- (OD3–OD4) / (OD1–OD2) ]×100%

2 结果与分析

2.1 蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果

在蛋白酶 (木瓜/中性/碱性蛋白酶) 浓度为0.5%, pH 7.0, 50℃, 底物浓度10%, 反应时间1h的条件下, 分析这3种蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果。由图1可以看出, 丝胶蛋白的分子量在14~97.2kDa均有分布;丝胶蛋白经木瓜蛋白酶降解后, 其酶解产物的分子量集中分布在14~29kDa;而中性蛋白酶和碱性蛋白酶对丝胶蛋白的水解作用与对照组 (无蛋白酶) 相比几乎没有差别。显而易见, 木瓜蛋白酶对丝胶蛋白的酶解功效优于其他两种蛋白酶。因此, 选取丝胶蛋白的木瓜蛋白酶酶解产物进行下一步研究。

1—对照组 (无蛋白酶) 2—木瓜蛋白酶3—中性蛋白酶4—碱性蛋白酶M—蛋白标准

2.2 丝胶蛋白及酶解产物的溶解性

如表2所示, 酶解产物的平均溶解率 (68.83%) 高于丝胶蛋白 (52.77%) 。猜想原因可能是丝胶蛋白的肽链被木瓜蛋白酶切断, 蛋白质的高级结构受到损坏, 从而使水解产物本身含有的亲水性基团暴露出来, 与外界的水更易结合, 最终使其溶解性增强[14]。

2.3 丝胶蛋白及其酶解产物抑制酪氨酸酶的活性

丝胶蛋白及其酶解产物都具有不同程度的抗酪氨酸酶活性的能力 (图2) 。在相同的浓度下, 酶解产物对酪氨酸酶活性的抑制率要高于丝胶蛋白, 可能是因为酶解产物的分子量较小。随着质量分数的增加, 丝胶蛋白对酪氨酸酶活性的抑制率也随之提高, 说明丝胶蛋白的浓度与酪氨酸酶活性的抑制作用成正相关关系。酶解产物对酪氨酸酶活性的抑制率也出现类似现象, 呈剂量依赖性。

3 讨论

采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性白酶降解高分子量的丝胶, 结果显示木瓜蛋白酶降解能力高于其他两种蛋白酶。SDS-PAGE结果显示使用木瓜蛋白酶在反应条件为反应温度50℃、底物浓度10%、pH 7.0、酶浓度0.5%、反应时间为1h, 可以获得在14~29kDa范围的酶解产物 (图1) 。这是因为木瓜蛋白酶隶属于巯基蛋白酶, 首先分解精氨酸、赖氨酸的羧基端[15]。而丝胶蛋白含有较为丰富的精氨酸, 经木瓜蛋白酶酶解后, 释放出小分子的多肽和游离氨基酸[14]。这就说明了丝胶蛋白经木瓜蛋白酶降解后产物的分子量大幅减少。

丝胶蛋白中含有大量的亲水性氨基酸, 其中绝大多数都能够被人体吸收, 并且含有类黄酮等活性物质[16]。而黄酮类物质已经被证实具有抑制酪氨酸活性的作用[17]。这从理论上阐明了丝胶蛋白抑制酪氨酸酶活性的机制。本研究及前人的研究结果也进一步证明丝胶蛋白能够抑制酪氨酸酶活性[18]。

在本研究中, 丝胶蛋白的酶解产物对酪氨酸酶同样具有抑制作用, 且随着酶解产物浓度的增加, 其对酪氨酸酶的抑制率也随之提高, 呈现一定的剂量依赖性。这是因为丝胶蛋白经木瓜蛋白酶降解后产生了小分子量的丝胶多肽。这些多肽中又含有丰富的羟基、羧基等官能团, 使其与微量元素如铜、铁络合的几率大大提高, 最终抑制了酪氨酸酶的活性[7,8]。

丝胶及其水解产物可以根据其分子量大小应用到不同的领域中。10~70kDa的丝胶多肽与胰岛素共轭结合后添加到糖尿病小鼠中, 结果发现这种经过改良后的药物能够起到缓释作用[19];4~60kDa的丝胶多肽能够头发护理产品中常用的添加剂—水溶性的壳聚糖衍生物以及三甲胺衍生物发生相互作用, 更好地发挥产品的优良性能[12];平均分子量为30kDa的丝胶多肽可以取代哺乳类动物、昆虫细胞培养基中的胎牛血清, 从而大幅度地降低成本[20];低于20kDa的丝胶多肽还可以应用到包括皮肤和头发护理产品的化妆品、保健品和药物中[21]。