活性部位（精选八篇）
活性部位 篇1
关键词：蒌蒿,抗肿瘤,活性部位
肿瘤是以细胞异常增殖为特点的一类疾病, 常在机体局部形成肿块。肿瘤的种类繁多, 且具有不同的生物学行为和临床表现。有些肿瘤生长迅速, 侵袭力强, 可从原发部位扩散到身体其他部位, 严重影响机体健康, 我们称之为恶性肿瘤, 俗称癌症。它所带来的医疗费用及对患者和亲属产生的心理压力也是巨大的, 是目前全球居民死亡率最高的疾病之一。
蒌蒿 (Artemisia Selengensis Turcz.ex Bess.) 为菊科蒿属植物, 别名芦、蒿、芦蒿、水蒿、荑蒿等[1]。《神农本草经》将蒌蒿列为上品[2], 《本草纲目》将其收于草部第15卷[3], 为多年生草本植物, 全草入药, 性平、味甘, 有止血消炎、镇咳化痰、开胃健脾、散寒除湿等功效。沈夕坤等[4]药理研究表明, 蒌蒿可增强小鼠抗缺氧、抗疲劳、耐高温、耐低温能力, 有较好的补益和免疫促进作用。张健等[5]从萎蒿叶中首次分离得到化合物11, 13-dihydroatricarin, 发现该化合物对B-16细胞 (小鼠黑色素瘤细胞) 和HL-60细胞 (人原髓细胞白血病细胞) 有显著的抑制活性, 在浓度为1×10-5mol/L时, 抑瘤率均到达90%以上, 并且随着浓度的递减, 抑制作用也逐渐减弱。蒌蒿对痢疾杆菌、大肠埃希菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和多种真菌也均有良好的抑制作用[6]。目前关于蒌蒿的研究, 主要集中在抗菌、抗氧化、降压等活性物质基础和药理活性方面[7,8,9,10,11,12,13], 但蒌蒿抗肿瘤之功效, 并未引起人们的足够重视。本试验对蒌蒿抗肿瘤的活性部位进行初步研究, 为进一步筛选蒌蒿中抗肿瘤活性成分提供重要依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器
N-1100旋转蒸发仪 (东京理化器械株式会社) , AL104电子天平 (梅特勒-托利多公司) , NAPCO (美国Costar公司) , VD53真空干燥箱 (德国BIND公司) , Synergguv超纯水仪 (法国Millipore公司) , KQ-500E型超声波清洗器 (昆山市超声波仪器有限公司) , ST16R低温离心机 (Thermo Fishier公司) 。
1.2 材料
蒌蒿采自江西省九江市鄱阳湖畔, 经江西省食品药品检验所袁桂平主任中药师鉴定为菊科蒿属植物蒌蒿的全草。胰蛋白酶 (中国食品药品检定所, 批号:615-9605) , 小牛血清 (杭州四季青生物材料有限公司) ;RPMI 1640培养基 (GIBCO) ;二甲基亚砜 (DMSO) 、5-氟胞嘧啶 (5-Fu) 、四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 、环磷酰胺 (CTX) 均购于Sigma公司, 其他所用试剂均为分析纯。
1.3 细胞株及细胞培养
Hep G2细胞来源于军事医学科学院放射与医学辐射学研究所, 于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养Hep G2细胞, 在含有10%新生牛血 (不含抗生素) 的改良Eagle培养基 (DMEN) 培养基中生长, 每3~4天以0.25%胰蛋白酶进行消化传代, 取对数生长期细胞用于实验。
1.4 实验动物
本实验所用小鼠为SPF级昆明 (KM) 小鼠, 雌雄各半, 3~4周龄, 体重18~22 g, 动物合格证号:43004700005991, 由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。
2 方法
2.1 样品的制备
称取鲜蒌蒿36 kg, 切碎, 晾干, 得22 kg, 加95%乙醇100 kg, 回流提取2 h, 放出回流液, 药渣再用95%乙醇100 kg, 回流提取1.5 h, 放出回流液, 滤过, 合并滤液, 回收乙醇, 浓缩至相对密度为1.05的流浸膏5 kg, 加适量的水摇匀, 得总提取物。该总提取物分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯与水饱和正丁醇提取, 合并提取液, 回收溶剂, 依次得到石油醚层 (85 g) 、氯仿层 (143 g) 、乙酸乙酯层 (261 g) 和正丁醇层 (776 g) , 备用。临用前再用二甲基亚砜分别稀释成10、100、1000 g/L。
2.2 细胞增殖抑制实验
采用MTT法, 取对数生长期细胞稀释成1×104cells/m L, 立即接种于96孔培养板上, 每孔100μL, 然后在规定的实验孔中加入不同浓度的样品培养基, 每个平行3孔, 对照组 (5-Fu) 加等体积溶剂, 置37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养96 h, 然后以3000 r/min速度离心5 min, 每孔加0.2 m L新鲜配制的含有0.2 m L MTT的无血清培养基, 在37℃继续培养4 h, 再离心, 倒出上清液, 加0.2 m L二甲基亚砜溶解MTT甲臜沉淀, 超声5 min, 混匀, 在酶标仪上于570 nm的波长处测定吸光度 (A) 。按 (1-A样品组/A对照组) ×100%计算细胞增殖抑制率。
2.3 抗肿瘤活性体内试验
选用体重18~22 g的KM小鼠50只和生长良好的Hep G2细胞, 将Hep G2细胞制成细胞悬液, 接种于小鼠右侧腋部皮下, 约5×106个细胞/只。随机分成5组, 每组10只, 接种24 h后开始给药。其中, 乙酸乙酯层高、中、低剂量组 (100、200、400 mg/kg) , 每日灌胃给药1次, 共14次;环磷酰胺 (CTX) 阳性对照组腹腔注射给药 (30 mg/kg) , 第1、8天给药, 共给药2次;另设空白对照组, 给予等体积生理盐水。停药后24 h处死动物, 称体重、瘤重, 计算各组平均瘤重。按下列公式计算肿瘤抑制率:抑瘤率= (1-治疗组平均瘤重/空白对照组平均瘤重) ×100%。
2.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行分析, 计量资料数据以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验。计数资料以率表示, 采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 蒌蒿不同提取层对细胞增殖的抑制作用
结果表明, 四种提取层对Hep G2细胞增殖均有一定程度的抑制作用, 其中, 乙酸乙酯层的抑制作用最强, 并且随着浓度的递增, 抑制作用也逐渐增强, 提示蒌蒿的乙酸乙酯层对肿瘤细胞具有较强的细胞毒作用。见表1。
3.2 乙酸乙酯层的抑瘤作用
结果表明, 乙酸乙酯层表现出较强的肿瘤抑制作用, 并且随着给药剂量的增加, 瘤重逐渐下降, 说明抑瘤率显著增强。再次确定了乙酸乙酯层为抗肿瘤的有效部位。见表2。
4 讨论
本实验对蒌蒿4种提取层进行了体外抗肿瘤细胞毒性试验, 筛选出对Hep G2有较好的细胞增殖抑制作用的有效部位。结果, 乙酸乙酯层在1000 g/L时细胞增殖抑制率可达78.21%, 说明乙酸乙酯层为其有效部位。石油醚层、氯仿层、水饱和正丁醇层对Hep G2细胞增殖也有一定的抑制作用。体内抗肿瘤结果显示, 乙酸乙酯层在100 mg/kg对小鼠Hep G2肉瘤的抑制率为37.21%;当浓度增至400 mg/kg时, 抑瘤率高达71.63%, 说明乙酸乙酯层对Hep G2细胞增殖有显著的抑制作用, 并对小鼠移植性Hep G2瘤有较强的抑制作用, 随着给药剂量的增加, 瘤重逐渐下降, 抑瘤率明显升高。
注:与空白对照组比较, *P<0.05
抗肿瘤药物也是临床药物治疗中使用量较大的一类, 在所有类别药物的不良反应中抗肿瘤药物不良反应报告占了很大比例[14]。寻找天然抗肿瘤活性成分是抗癌药物研究的一个重要途径, 天然药物单体联合西药化疗治疗肿瘤疾病是又一重要途径[15], 利用这些天然活性物质进行结构修饰和优化, 提高活性强度和选择性, 改善物理化学性质和代谢动力学性质, 是另一重要途径[16,17]。
活性部位 篇2
【摘 要】 目的：探讨乌纠的止血活性部位，为其止血活性成分的筛选提供线索和依据。方法：用60%乙醇对乌纠原药材活性成分进行提取，回收乙醇，然后依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯对醇浸膏进行萃取，分别制得相应的部分和水部分。然后通过测定小鼠凝血时间、出血时间和血小板计数（PLC）等方法考察其活各部分的止血效果。结果：石油醚部分、正丁醇部分、乙酸乙酯部分和水部分均有止血作用，乌纠中石油醚提取物的止血效果最佳。
【关键词】 乌纠；出血；活性部位
【中图分类号】R29 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）11-0001-02
苗药乌纠系铁角蕨科铁角蕨属植物变异铁角蕨（Asplenium varians Wall.ex Hook.et Grev.）的全草，又名九倒生、铁郎鸡、地柏枝，主要分布于云南、贵州、四川至山西等地，是贵州苗族居住地区传统的民间药物，其性凉，味微苦，具有活血消肿、止血生肌的作用[1]。目前，铁角蕨属植物的化学成分和药理研究已有相关报道[2]，但关于苗药乌纠化学成分及止血活性部位的研究还未见报道。本文在对乌纠进行分段提取的基础上，考察乌纠的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物对小鼠止血活性的实验，为进一步研究其止血活性成分及止血机制提供指导。
1 材料与方法
1.1 药材 乌纠：产地贵州黔南、黔东南苗族地区，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为铁角蕨科铁角蕨属植物变异铁角蕨（Asplenium varians Wall.ex Hook.etGrev.）的全草；云南白药（瓶装）（批号：ZL13022，云南白药集团股份有限公司）。
1.2 动物 昆明种小鼠，清洁级，体重（20±2）g，雌雄各半，由贵阳医学院试验动物中心提供，合格证号：SCXK（黔）2002-0001。
1.3 试剂 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇均为分析纯。
1.4 实验方法
1.4.1 供试液的制备 取干燥乌纠，粉碎，过20目筛，称取1000g，于10L圆底烧瓶，用 60%乙醇，80℃下回流提取2.5h，抽滤，平行提取3次，合并抽滤液，滤液经减压回收乙醇，至无醇味，得到乌纠粗提取物。然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收有机溶剂，真空干燥（60℃），制成干浸膏[3]，分别得到石油醚提取物部位、正丁醇提取物部位、乙酸乙酯提取物部位和水提取物部位浸膏，并称定各提取物，临用前，用0.1% -CMC配成适宜浓度的溶液。
1.4.2 出血时间（BT）的测定（断尾法） 取小鼠60只，随机分为6组，即空白对照组、云南白药组（即阳性对照组，0.5g/kg）和石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组及水提物组4个给药组（提取物），试验小鼠每个给药组10只，雌雄各半。称取一定量的提取物用0.1% -CMC配成3g/kg药剂，分别灌胃给药1次/d，连续7d。末次给药后30min，小鼠夹固定，将小鼠尾尖0.5cm处横向切断，当血液自动流出时开始计时，每隔30s用滤纸吸去血滴1次，到血液不再流出为止（滤纸吸时无血）[4-5]，以人工创面形成到出血停止所用时间作为出血时间。
1.4.3 凝血时间（CT）测定 取小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，分组给药均与1.4.2方法相同，末次给药后30min，用眼科弯镊迅速摘去一侧眼球即有血液流出，用棉球擦去第一滴血，再于载玻片两端各滴1滴血，血滴直径约为5mm，立即记时，每隔30s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动1次，并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止所需时间即为凝血时间。
1.4.4 小鼠血小板计数（PLC） 取小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，分组给药均与1.4.2方法相同，末次给药后30min，用毛细取血管在小鼠眼内眦球采血10μL用血小板稀释液稀释100倍，普通光学显微镜下计数（PLC）。
1.5 统计学方法 数据采用SPSS 20.0软件进行分析处理，数据以（x[TX-*3]±s）表示，对数据进行双样本t检验和方差分析，P<0.05表示有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 对小鼠出血（BT）时间的影响 与空白生理盐水组比较，乌纠的石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位、水提取部位和云南白药组均能显著缩短小鼠出血时间，且具有统计学意义（P<0.05），其中水提取部位的效果最佳，出血时间为（93.75±37.39）S。
2.2 对小鼠凝血时间（CT）的影响 和空白生理盐水组对比，石油醚提取部位、正丁醇提取能明显缩短小鼠凝血时间，并且有统计学意义（P<0.05）。而乙酸乙酯提取物部分对小鼠凝血时间效果不明显。小鼠凝血时间见表2。
2.3 对小鼠血小板计数（PLC）的影响 由表3可见，与空白生理盐水组比较，乌纠的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物均能显著加快血小板的凝聚作用，其促凝作用最大的为乙酸乙酯部位，其中水提取物部分的效果最佳。
3 讨论
小鼠断尾出血时间和玻片凝血时间由于方法直观，操作简便，广泛用于止血中药活性的筛选。出血时间是指皮肤受特殊刺破后出血并自动停止所需的时间，常用于评价皮肤毛细管的止血能力，也是观察受试药物对凝血机制有无影响的第一步[8]。实验结果表明，乌纠提取物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和水提取部位均能显著缩短小鼠出血时间；凝血时间是指血液离开机体后到完全凝固所需要的时间，它的长短反映血液中参与凝血的各种凝血因子的含量以及它们的功能，其中血小板的数量和功能以及毛细血管功能是决定性因素，在凝血时间的实验中，只有乙酸乙酯部位对小鼠凝血效果不明显，石油醚、正丁醇和水提取物均对小鼠凝血效果明显，且能有效降低小鼠的血小板数量。石油醚部位的出血时间、凝血时间与云南白药的实验数据接近，说明乌纠提取物中石油醚部位的止血效果最好，其凝血活性成分、凝血机制有待进一步研究。
根据出血时间（BT）和凝血时间（CT）实验结果发现，乌纠的石油醚部位和水提取部位具有良好的止血和凝血活性，证明了苗药乌纠是一味止血良药，也为进一步探究苗药乌纠的止血活性成分分析及止血机制奠定了基础。
参考文献
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[2]于永明.披针观音座莲和半边铁角蕨的化学成分及生物活性研究[D].中国医学科学院博士学位论文，2009：21-38.
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[4]石磊，李昌勤，廉婷婷，等.见血飞对小鼠出血时间和凝血时间的影响[J].中国药房，2010，21（47）：2243-2244.
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[6]刘晨，柳佳，郑传柱，等.侧柏炭止血作用活性部位筛选[J].中国中药杂志，2014，39（16）：2152-2157.
[7]石朗，杜冰，张婷婷，等.鸡冠花不同提取部位止血作用研究[J].医药导报，2013，32（9）：1122-1124.
[8]梅兴国，万国晖，周国强，等.火棘提取物对血液凝固的影响[J].中药材，2001，24（12）：874-875.
藤梨根抗病毒活性部位的初步筛选 篇3
关键词：藤梨根,活性部位,抗病毒作用
藤梨根为猕猴桃科植物猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.)的干燥根,始载于《开宝本草》。中华本草记载藤梨根含熊果酸(ursolic acid)、齐墩果酸(oleanolic acid)、琥珀酸(succini acid)、胡萝卜甙[1](daucosterol)、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸及Fe、Cu、Mn、Se等微量元素。藤梨根的药用价值高,中医认为其性甘、咸寒、微涩,能清热利尿、活血消肿、祛风利湿,主要用于治疗肝炎、食道癌、肝癌、消化不良、腹泻、水肿、风湿性关节痛、带下、疮疖、淋巴结结核等症[2]。
现代医学认为其具抗突变、抗畸变、抗肿瘤、抗氧化、护肝及增强免疫的作用[3,4,5]。藤梨根的研究多集中于抗肿瘤活性的分析,而关于藤梨根抗病毒活性部位群的筛选尚未见报道,这大大限制了该味中药的临床应用。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
旋转蒸发器(RE-5298A)购自上海比朗科学仪器有限公司,CO2细胞培养箱为美国SHEL-LAB公司生产,酶标仪(ELx-800型)为Bio-Rad公司生产,离心机(KA-1000型)为上海安亭科技仪器生产。
藤梨根购自邵东县药材公司,经邵东县药检所鉴定。Hep G2.2.15细胞购自中南大学细胞培养中心。G418为Gibco公司生产,胰蛋白酶(Trypsin)由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供,HBe Ag和HBs Ag酶联检测试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司,泛昔洛韦片(0.125g/片)为北京嘉林药业股份有限公司生产。
1.2 实验方法
1.2.1 藤梨根的提取、分离研究
精密称取藤梨根干粉30 g,分别用300 m L和240 m L的石油醚加热回流提取。合并两次提取液。浓缩回收石油醚得浸膏(即石油醚提取部分)。将挥干溶剂后的药渣按上法依次用乙酸乙酯、乙醇和水提取,分别得乙酸乙酯、乙醇和水提取部分。
根据相似相溶原理,石油醚提取物极性低,且干膏得率仅0.175%,而据文献[6,7,8,9,10]报道藤梨根有效成分的极性较大,与之相差较大,故暂不作分离。称取乙酸乙酯提取物干膏0.27 g,溶解于20 m L氯仿中。以氯仿∶甲醇∶水作为洗脱剂分离,薄层鉴别。所得馏分挥干溶剂制成干膏保存备用。称取乙醇提取物干膏0.95 g及水提取物干膏1.95 g,也按上法分离并制成干膏保存备用。
1.2.2 藤梨根抗乙肝病毒活性部位的筛选
藤梨根对Hep G2.2.15细胞的活力影响:将对数生长期的Hep G2.2.15细胞按1×105个/m L接种于96孔细胞培养板,每孔200μL。试验设试验组、阳性对照组(泛昔洛韦)和阴性对照组(10%DMSO)。泛昔洛韦组和实验组设3个浓度:2.0 mg/m L、1.0 mg/m L、0.5mg/m L。加5 mg/m L的MTT溶液20μL,继续培养4 h后,加入150μL DMSO,于490 nm处测OD值。按下式计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验孔A值/对照孔A值)×100%。
藤梨根对HBs Ag和HBe Ag的抑制作用研究:按上法培养Hep G2.2.15细胞,试验分组与上面相同。加入样品后,在第3天、6天、9天吸取上清液并更换含药培养液。将所取上清液合并按HBs Ag和HBe Ag的检测试剂盒操作,于450 nm处测定各孔的OD值。试验重复4次。按下式计算对HBs Ag、HBe Ag的抑制率(%):抑制率=(10%DMSO对照孔A值-药物孔A值)/(10%DMSO对照孔A值-阴性血清A值)×100%。
治疗指数(TI)=TC50/IC50。TC50(50%毒性浓度)即试验孔存活细胞为对照孔50%时的药物浓度。IC50(50%抑制浓度)为HBs Ag或HBe Ag抑制率为50%时的药物浓度。当TI>2时为有效,TI=1时为低效高毒,TI<1时为无效。
1.3 统计学分析
采用SPSS11.0统计分析软件,对实验数据进行多因素的方差分析,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 藤梨根的提取、分离
各提取部分干膏分别称重,计算干膏得率(见附表)。
干膏得率=干膏重量/原药材重量×100%。
乙酸乙酯部分得到一个组分为Y,称重得44.28mg。乙醇部分分离得到5个组分为:A1、A2、……、A5。水提部分分离得到5个组分为:W1、W2、……、W5。所得干膏重量及含量见图1。
干膏含量(%)=分离组分干膏重量/提取部分干膏重量×100%。
乙酸乙酯部分总干膏重量为250.14 mg,干膏百分比17.70%;乙醇部分总干膏重量为650.8 mg,干膏百分比为95.29%;水提部分总干膏重量610.6mg,干膏百分比为54.02%。
2.2 藤梨根抗乙肝病毒活性部位的筛选
藤梨根对Hep G2.2.15细胞活力影响见图2,对HBs Ag和HBe Ag的抑制率结果见图3。
注:覮与阳性对照组比较,P<0.05,差异有显著性
阳性对照组对HBe Ag的TI为0.04774<2;对HBs Ag的TI为3.28472>2。A1对HBe Ag的TI为5.2823>2;对HBs Ag的TI为2.7444>2。Y对HBe Ag的TI为4.2225>2;对HBs Ag的TI为3.0645>2。W5对HBe Ag的TI为1.1264<2;对HBs Ag的TI为1.8988<2。W2对HBe Ag的TI为0.6614<1;对HB-s Ag的TI为7.02>2。
结果表明:藤梨根提取物对Hep G2.2.15细胞存活率的影响比阳性对照组小,其中乙酸乙酯提取部分(Y)和乙醇提取部分(A1)对HBV的HBe Ag、HB-s Ag均有抑制作用;W2和阳性对照组只对HBs Ag有抑制作用。
3 讨论
乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科,为长约3.2 kb的部分双链环状DNA病毒。HBV的抵抗力较强,在65℃中10 h、煮沸10 min或高压蒸气才可被杀灭。它具有很强的感染性,危害大,可引起各种急、慢性病毒性肝炎及肝硬化等病,并与肝癌有密切关系。
Hep G2.2.15细胞株系重组载体p Do LTHBV-1转染人肝癌细胞株Hep G2、经G418筛选后获得的可产生高水平HBs Ag和HBe Ag的细胞克隆。它不仅支持HBV-DNA的复制,且支持Dane样颗粒的包装与分泌,稳定且可靠,现已成为申报肝炎新药必备的体外筛选模型,普遍用于抗乙肝病毒药物研究。吴淑坤等[13]利用Hep G2.2.15细胞模型,采用终点稀释PCR和MTT实验等技术,建立了一种操作简便,灵敏度高且可半定量的体外初筛抗HBV药物实验方法。彭立生等[14]选用了Hep2.2.15细胞考察叶下珠提取物对乙肝病毒及乙肝病毒X基因的抑制作用。李丹等[15]以该细胞株为模型,应用酶联免疫法观察了胸腺因子D的不同浓度对HBs Ag、HBe Ag和HBV DNA的抑制作用,综合评价胸腺因子D的体外抗HBV效果。
本实验采用目前成熟的抗病毒体外筛选模型Hep G2.2.15细胞模型,初步确定了藤梨根的活性部位,进行了藤梨根抗病毒作用的体外筛选。据文献报道[11,12],藤梨根的主要活性化学成分为三萜皂苷类,接下来可进行体内抗病毒活性成分的验证,活性部位的结构解析,为进一步开发藤梨根奠定基础。
我国是猕猴桃的优势产区,药用资源非常丰富。由于猕猴桃属植物的药理活性和营养价值都很高,该属植物的根、茎、果实等都具有优良的药理作用,如抗突变、抗畸变、抗肿瘤等。近年来我国已加强对该属植物的研究,希望从中发掘出用于预防及治疗肿瘤和肝炎等疾病的天然药物。其研究与开发的潜力是巨大的,值得深入研究。
活性部位 篇4
菝葜在目前临床上常单用或与其它药物配伍用于各种炎症性疾病,尤其是妇科盆腔炎症及炎症性包块的治疗,但对其治疗盆腔炎、慢性盆腔炎等妇科疾病相关的药理学没有进行过系统全面的研究,以致疗效不甚理想,影响了其在临床上的进一步推广应用。因此有必要对相关的药理学进行深入、全面和系统的研究,进行二次开发以进一步提高疗效。
菝葜(金刚藤)临床上虽早已用于治疗妇科盆腔炎症及炎症性包块等疾病,并研制出了一系列产品如胶囊、糖浆、颗粒、片剂等,采用的是传统提取技术——水提醇沉工艺。为了给临床用药及对其进行进一步深度开发利用提供理论与实验依据,本实验采用了炎症不同阶段、不同机理的多种相应动物炎症模型及细胞模型, 对其抗炎作用及其机理进行了较为系统的探讨研究。
1 材料与方法
1.1 实验仪器
UNICTM-UV-2102PC型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司产品);电热恒温水浴锅(武汉琴台医疗仪器有限公司);真空旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);101C-2型电热鼓风干燥箱和ZKF030电热真空干燥箱(上海实验仪器有限公司);SWCJCO型超净工作台(苏州净化仪器设备有限公司);Z323K型冷冻台式高速离心机(HERmLE Corporation, Germany);CO2培养箱(New Brunswick Scientific Corporation, USA);BCD-223G低温冰箱(Ronshen Corporation,USA);毛细管放大体积测定仪(自制);YXQ-SG41-280电热手提压力蒸汽消毒器(上海医用核子仪器厂);电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)和超滤杯。
1.2 化学试剂
细菌脂多糖(LPS) Sigma公司产品;小牛血清、RPMI-1640 为Gibco (USA)产品;NO测定试剂盒(南京建成生物工程公司产品);花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、TBX和PGE2放免试剂盒(苏州大学医学院血拴室提供);卵磷脂(PC)(北京海淀区微生物制品厂生化试剂);Evans Blue 和印度墨汁购自上海化学试剂采购供应站;链霉素、氨苄青霉素是重庆第六制药厂产品;乙酰水扬酸 (Acetylsalicylic acid,ASA) 、吲哚美辛(indomethacin)、醋酸、乌来糖、琼脂、甲醛、二甲苯、DMSO、甘氨酸、硼酸和去氧胆酸钠等均为国产分析纯试剂。
1.3 实验材料
菝葜药材(根茎),产于湖南,由湖北午时药业有限公司提供。
1.4 实验动物
健康纯种雌性昆明小鼠,体重(21±1.5)g,健康纯种雌性Sprague-Dawley大鼠,体重(230±20)g,均由武汉市卫生防疫站医学实验中心实验动物房提供,饲养于12h/12 h明暗循环的房间,并保持25℃恒温及55%的相对湿度。
1.5 动物分组
蛋清抗炎实验中,取体重(230±20) g健康纯种的Sprague-Dawley雌性大鼠,将其随机分组,每组8只(n=8),各组大鼠于实验前禁食18 h。正常对照组1(Control group):灌胃(i.g)生理盐水(0.9%, 10 mL/kg);乙酰水扬酸阳性对照组2(Acetylsalicylic acid 200 mg/kg i.g.);实验组3、4依此为剂量50g生药/ kg i.g 和 100 g生药/kg i.g.的菝葜水提醇沉物组。其它抗炎实验中,均取健康纯种雌性昆明小鼠,体重(21±1.5) g,将其随机分组(同上),每组10只(n=10),饲养及处理同上。
1.6 实验方法
1.6.1 新鲜鸡蛋清诱发大鼠足跖炎症模型的制备与检测
参考文献[5,6,7]所述方法稍加修改,将32只Sprague-Dawley雌性大鼠随机分为4组(n=8),各组动物每天分别给药1次,连续7 d。每鼠左后脚爪正面上端用记号笔作一清晰横线,以排水法测鼠爪体积,末次给药l h后,在小鼠的右足跖皮下注射10%新鲜鸡蛋清溶液(0.10 mL/只)致炎,然后于0.5、1、2、3、4和5h测定致炎足的足容积。肿胀程度表示为致炎前与致炎后的右足容积差,肿胀抑制率以下式表示:
肿胀抑制率undefined
以肿胀程度和药物对肿胀的抑制率为指标评价炎症效果。
1.6.2 二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀模型的制备与检测
参考文献[8,9,10]所述方法稍加修改,将40只雌性昆明小鼠随机分为4组(n=10),各组动物每天分别给药1次,连续7 d,末次给药l.5 h后,将20μL二甲苯均匀涂抹于小鼠右耳廓两面致炎,以左耳作对照。0.5 h后将小鼠脱颈椎处死,沿耳廓基线剪下两耳并以直径9 mm打孔器分别在左右耳对称部位打下圆形耳片,电子天平称重,计算肿胀度和肿胀抑制率,小鼠耳廓肿胀程度以每鼠左右耳片重量之差平均值来表示,肿胀抑制率以下式表示:
肿胀抑制率undefined
1.6.3 甲醛致小鼠足肿胀模型的制备与检测
参考文献[11,12]所述方法稍加修改,将40只雌性昆明小鼠随机分为4组(n=10),各组动物每天分别给药1次,连续7d,末次给药l h后,小鼠右足注射0.05 mL 2.5%甲醛致炎,以左足作对照。致炎1 h后将小鼠脱颈椎处死,沿踝关节上0.05mm处剪下双足,电子天平称重,计算肿胀度和肿胀抑制率,小鼠足肿胀程度以每鼠左右足重量之差平均值来表示,肿胀抑制率以下式表示:
肿胀抑制率undefined
1.6.4 腹腔注射醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高模型的制备与检测
参考文献[13,14]所述方法稍加修改,将40只雌性昆明小鼠随机分为4组(n=10), 将各组动物每天分别给药1次,连续7 d。末次给药l.5h后,每只小鼠尾静脉注射2% Evans Blue生理盐水水溶液0.1 mL/20g,并立即腹腔注射0.7%醋酸溶液(0.1 mL/10g)致炎,30 min后颈椎脱臼处死小鼠。剖开腹部,用5 mL生理盐水反复冲洗腹腔,吸管吸出洗涤液,合并洗涤液后再以生理盐水稀释,最后定容到10 mL,摇匀、1000r/min离心10 min,取上清,在590 nm处测定其吸光度值(A590值),对小鼠腹腔毛细血管通透性增高的抑制率表示如下:
抑制率undefined
1.6.5 琼脂植入致小鼠肉芽肿形成模型的制备与检测
参考文献[15,16]所述方法稍加修改,将40只雌性昆明小鼠随机分为4组(n=10)。给药lh后,在每小鼠背中线同一部位将毛剪尽,再浅麻(腹腔注射10%乌来糖0.15 mL/20g),背部皮下无菌快速注射0.2 mL 2%琼脂,各组动物每天分别给药1次,连续9 d。第9天将小鼠断头处死,仔细剥离并取出各组动物的琼脂肉芽组织,剔除结缔组织,电子天平称重,其重表示肉芽肿重量,对肉芽肿的抑制率以下式表示:
undefined
1.6.6 菝葜对血小板COX-1活性的影响
血小板制备及COX-1活性测定参照文献[17,18,19]方法稍加修改。
血小板制备:大鼠心脏抽血(14:1-0.1M EDTA抗凝),1000 r/min离心8 min,吸取富含血小板血浆,3000 r/min离心10 min,去上清,沉淀用EDTA-PBS洗涤,2500 r/min离心10 min,去上清,血小板用PBS悬浮。
提取物对血小板COX-1活性的影响:离心后的血小板用PBS调整浓度为106个l/mL,再接种96孔培养板(0.2 mL/孔),每处理组重复3孔,1号为空白组:只加溶剂;2号为吲哚美辛组:终浓度1g/mL;3-5号依次为1、10、100 g/mL的提取物组。接着置37℃, 5%CO2下培养10 min,再加钙、镁离子溶液各2 μL,AA 2 μL,继续培养40 min,加20 μL 冰乙酸终止反应,1000 r/min离心10 min,上清-20℃保存待测,用TXB2放免试剂盒测COX-1代谢产物TXB2含量,对COX-1活性的抑制率以下式表示:
抑制率=
undefined
1.6.7 菝葜对腹腔巨噬细胞COX-2活性的影响
鼠腹腔巨噬细胞的制备及COX-2活性的测定参照文献[20,21,22,23,24]方法稍加修改。
鼠腹腔巨噬细胞的制备:大鼠颈椎脱臼处死,75%乙醇浸泡3 min,腹腔注射6mL D-hanks 液,再轻揉腹部5 min,吸取腹腔液,1000 r/min离心10 min,去上清,再用PBS溶液洗涤,1000 r/min离心10 min,去上清,沉淀即为腹腔巨噬细胞。
巨噬细胞的培养及处理:离心后的腹腔巨噬细胞加无血清RPMI-1640培养液,调整细胞浓度为106 cell/mL,再接种96孔培养板(0.2 mL/孔),37℃, 5%CO2下培养4 h,吸去培养液,用5%血清RPMI-1640完全培养液洗涤,去上清,再加5%血清RPMI-1640完全培养液0.2 mL/孔,每处理组重复3孔,1号为空白组:只加溶剂;2-6号分别加LPS(终浓度均为1 g /mL ),其中2号为对照组,3号为吲哚美辛组:终浓度0.4g/mL, 3-6号依次为1、10、100 g/mL的提取物组。
(1)提取物对 COX-2蛋白表达的影响。
经上述处理后,37℃, 5%CO2下培养6 h,再加花生四烯酸2 μL,继续培养40 min,1000 r/min离心10 min,上清液-20℃保存待测,用PGE2放免试剂盒测COX-2代谢产物PGE2含量,对COX-2蛋白表达的以下式表示:
undefined
(2)提取物对 COX-2蛋白表达的影响。
各组加入DMSO、LPS后(未加待测物),先37℃,5%CO2下培养6 h,加各提取物,继续培养40 min,再加花生四烯酸2 μL,继续培养40 min,1000 r/min离心10 min,上清液-20℃保存待测,用PGE2放免试剂盒检测COX-2代谢产物PGE2含量(按试剂盒说明操作),对COX-2蛋白表达后活性的抑制率以下式表示:
undefined
1.7 统计学处理
所有实验结果均以undefined表示,组间差异的显著性分析采用t检验法,当P<0.05时,则认为两数据间有显著性差异。
2 结果
2.1 菝葜对急性炎症的影响
2.1.1 菝葜对新鲜鸡蛋清诱发大鼠足跖炎症的影响
对足跖肿胀的抑制率结果见图3.1,结果显示:菝葜低剂量组自100min后对足跖肿胀的抑制率一直高于阳性对照(SW1自100 min至240 min),而高剂量组自致炎后对足跖肿胀的抑制率就一直明显高于阳性对照,抗炎效果突出。
本研究实验结果表明提取物各剂量均能显著抑制蛋清性足跖肿胀,有十分明显的抗炎作用,且显著强于阳性对照组;菝葜提取物对足跖肿胀抑制效果在不同剂量组之间表现出一定的剂量依赖效应。
2.1.2 菝葜对二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀的影响
药物对二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀的作用以耳廓肿胀程度、肿胀抑制率为指标来进行。菝葜对二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀的影响结果见表1。
与生理盐水组比较,菝葜提取物组以及阳性对照小鼠耳廓肿胀程度均有较大幅度下降(22.31%～54.62%),差异显著,其中高剂量(100 g生药/kg)组有极显著差异。结果表明提取物均能显著抑制二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀,并有显著的剂量依赖效应,其中高剂量的抑制率高达到50.77%。
2.1.3 菝葜对甲醛致小鼠足肿胀的影响
菝葜对甲醛诱导小鼠足肿胀的抑制作用以足肿胀程度、肿胀抑制率为指标进行评价。菝葜对甲醛致小鼠足肿胀的影响见表2。
与生理盐水组比较,菝葜各组以及阳性对照小鼠足肿胀程度均有较大幅度下降(27.27%～58.36%),差异显著,其中菝葜高剂量(100 g生药/kg)差异极显著。实验结果表明提取物能显著抑制甲醛诱导的小鼠足肿胀, 并有显著的
剂量依赖效应。
2.1.4 菝葜对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响
腹腔注射0.7%醋酸使小鼠腹腔毛细血管通透性增高,Evans Blue自毛细血管透入腹腔的量就会增多,其吸光度也会相应增大。菝葜各组对醋酸诱导毛细血管通透性增高的抑制作用以吸光度A590、透性增高的抑制率为指标来进行评价。菝葜对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响结果见表3。
与生理盐水组比较,菝葜组以及阳性对照组的A590均有较大幅度降低(20.22%～41.57%),并有显著性差异,其中高剂量(100g生药/kg)组差异极显著,对小鼠腹腔毛细血管通透性的抑制甚至比阳性对照还高。
Table实验结果显示:提取物能明显抑制醋酸诱导的小鼠腹腔毛细血管通透性增高,剂量增高1倍,其相应的抑制效果也增加1倍以上。
2.2 菝葜对慢性炎症的影响——对琼脂植入致小鼠肉芽肿形成的影响
皮下注射2%琼脂以诱导肉牙肿的形成,生理盐水对照组形成肉牙肿的诱导作用较明显。各给药组高剂量(100 g生药/kg)及阳性对照组琼脂肉牙肿则明显减轻。菝葜对肉牙肿形成的抑制作用结果见表4。
菝葜对肉牙肿形成的抑制作用以琼脂肉牙肿重量及对肉牙肿增重的抑制率为指标来进行评价。
与生理盐水组比较,阳性对照组小鼠琼脂肉牙肿重量减轻较明显,达到极显著程度,菝葜低剂量组琼脂肉牙肿重量虽有减轻,然而没有显著性差异,但统计学分析表明高剂量(100g生药/kg)组能显著减少琼脂肉牙肿重量, 说明菝葜提取物对慢性炎症有显著的抑制作用。
2.3 菝葜对组织细胞中环氧化酶(COX)的影响
2.3.1 菝葜对血小板COX-1活性的影响
菝葜提取物对COX-1活性的抑制作用以所检测的血小板中花生四烯酸代谢产物的衍生物TXB2的量及对它的抑制率为指标来进行评价。菝葜对血小板中TXB2 含量/COX-1活性的影响结果见表5。
与生理盐水组比较,经统计学分析表明:吲哚美辛阳性对照组的TXB2平均含量降低十分明显,达到极显著程度,菝葜组TXB2也极显著降低:1 g/mL剂量即能极显著抑制COX-1活性,10 g/mL剂量即可抑制COX-1 51.32%的活性, 100 g/mL时抑制率高达73.39%,并呈明显的剂量依赖效应。
2.3.2 菝葜对腹腔巨噬细胞COX-2活性的影响
(1)提取物对
COX-2蛋白表达的影响。菝葜提取物对COX-2蛋白表达的抑制作用以所检测的大鼠腹腔巨噬细胞中COX-2催化的花生四烯酸代谢产物PGE2的量及对它合成的抑制率为指标来进行评价。菝葜对血小板中PGE2含量/COX-2蛋白表达的影响结果见表6。
与生理盐水组比较,经统计学分析表明:吲哚美辛及菝葜组均能极显著降低巨噬细胞中LPS诱导的PGE2合成;菝葜提取物1 g/mL及以上剂量即能极显著抑制COX-2蛋白表达,10 g/mL剂量其抑制率达50.0%以上,100 g/mL剂量时则高达74.0%以上, 提取物抑制COX-2蛋白表达呈明显的剂量依赖效应。
(2)提取物对 COX-2蛋白表达后活性的影响。
菝葜对COX-2蛋白表达后活性的抑制作用以所检测的大鼠腹腔巨噬细胞中PGE2的量及对它合成的抑制率为指标来进行评价。菝葜对血小板中PGE2含量/COX-2蛋白表达后活性的影响结果见表7。
与生理盐水组比较,经统计学分析表明:吲哚美辛虽能降低巨噬细胞中LPS诱导的PGE2合成,但降幅很小,没有显著性差异;但菝葜各组均能显著降低巨噬细胞中PGE2合成:菝葜提取物1g/mL及以上剂量即能显著抑制COX-2蛋白表达后的活性,10 g/mL及以上剂量极显著,抑制率超过55.0%,100 g/mL剂量时更为强烈,抑制率高达70.0%以上, 提取物对COX-2蛋白表达后活性的抑制呈明显的剂量依赖效应。
3 讨论
炎症是活体组织对损伤因子所发生的防御反应,外源性和内源性损伤因子均可引起机体组织细胞各种各样的损伤性变化,与此同时机体的局部和全身也发生一系列复杂反应,以局限和消灭损伤因子,清除和吸收坏死组织细胞,并通过实质和间质细胞的再生修复损伤,这种机体的损伤和对损伤的复杂反应构成炎症现象。其病理变化首先是致炎因子引起局部组织变质,炎性介质活化,毛细血管扩张及通透性增大,炎症部位出现渗出、水肿;随后炎症部位发热、致痛;最后炎症区域肉芽组织增生和修复[25]。
炎症早期主要以毛细血管扩张和通透性增高、渗出水肿等病理变化为主[26]。足跖肿胀炎症模型是模仿研究此期病理变化的常用抗炎模型,多种化学物质如蛋清、甲醛、等均可刺激小鼠导致足爪红肿,根据其发展、消退的快慢常分为急性、亚急性或慢性足肿胀,急性者于数十分钟至几个小时内炎症迅速发展又迅速消退;慢性者数日至十日以上才达到炎症高峰,持续数十日;而亚急性介于二者之间,持续数日。为了研究菝葜的抗炎作用,了解其抗炎机理,本文利用与炎症过程发展阶段相应的多种动物炎症模型及细胞模型对其进行了探讨。
新鲜鸡蛋清性大鼠足肿胀炎症模型和甲醛致小鼠足肿胀炎症模型均为研究早期炎症病理的常用模型,其病理变化主要为急性炎性渗出水肿,炎症十几分钟即发展到高峰,而且对药物反应灵敏,并有较好的重现性,大鼠足表现出的红肿(毛细血管扩张、渗出)、热(血流加速)、痛(水肿及炎性介质的刺激)等常与临床某些炎症很相似。醋酸会引起毛细血管扩张及通透性增加,小鼠腹腔内注射0.7%醋酸溶液,H+将刺激腹腔内毛细血管使其通透性增高,血管内一些血液液体成分就会渗入腹腔,当静脉内注射 Evan'2 Blue染料时,它就与血浆蛋白瞬间结合,并渗入腹腔,腹腔洗出液中染料浓度(A590大小)即可反映毛细血管的通透性,可以间接表示毛细血管透性的高低。二甲苯性小鼠耳廓肿胀属非特异性炎症,其强烈的局部刺激作用导致毛细血管通透性亢进,主要表现为肿胀、渗出,也是一种急性炎症模型。
蛋清致炎实验和甲醛致炎实验结果表明:菝葜提取物均能显著抑制大鼠蛋清性足跖肿胀和甲醛诱导的小鼠足肿胀;醋酸致腹膜炎和二甲苯致耳肿胀模型也表明菝葜对醋酸诱导的小鼠腹腔毛细血管通透性增高及二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀有显著抑制作用,并有显著的剂量依赖效应。上述抗炎实验有力地说明菝葜提取物对急性、早期炎症具有很好的抗炎作用。
纤维组织增生和肉芽屏障的形成是晚期炎症的特征之一,琼脂致肉芽模型就是一种筛选抑制炎症后期(增殖期)药物的慢性炎症动物模型,皮下注射琼脂主要诱导产生与炎症后期病理变化相似的肉芽组织增生,实验证明菝葜提取物不同剂量均显示了不同程度的抑制琼脂诱导的小鼠肉芽肿形成,其中高剂量的抑制作用较为显著,进一步表明菝葜对炎症晚期(慢性炎症)也有一定的抑制作用。
菝葜对炎症反应的多种环节,如炎性渗出、炎性介质的释放均有影响,能较强抑制多种致炎剂所致的早期急性渗出性炎症反应,减轻组织损害,控制炎症发展;同时能抑制肉芽组织增生,提示菝葜对炎症过程的3个阶段均有较好的抑制效果,具有十分明显的抗炎效应。 急性炎症的血管扩张、透性增加和白细胞渗出的发生机制,是炎症发生机制的中心环节,这些炎症反应主要是通过一系列炎症介质的介导来实现的,本实验的巨噬细胞和血小板培养实验结果显示:提取物能显著抑制COX-1活性,从而强烈抑制TXB2等炎性介质的产生;对COX-2,各提取物既能显著抑制COX-2蛋白表达,又能强烈抑制COX-2蛋白表达后的活性,由于对COX-2的强烈抑制,因而大大降低了巨噬细胞对PGE2的合成和释放,使炎症部位PGE2的量显著减少, 由于对花生四烯酸代谢这一关键环节的抑制,最终大大减少了炎症部位炎性介质的量,从而减轻炎症反应,达到抗炎作用。
摘要：目的:研究菝葜水提醇沉物及其膜分离物对急性、慢性炎症的抗炎作用。方法:采用蛋清致足肿胀、甲醛致足肿胀、二甲苯致耳肿胀和醋酸致腹膜炎模型对菝葜不同提取物对急性、早期炎症的抗炎作用进行了研究。结果:在100g.生药/kg剂量下,提取物能显著降低蛋清诱导的大鼠足跖肿胀程度,明显抑制甲醛诱导的小鼠足肿胀程度、小鼠腹腔毛细血管通透性增高和二甲苯诱导的耳廓肿胀,对炎症晚期(慢性炎症)也有一定的抑制作用。结论:菝葜对急性、早期炎症具有明显的抗炎作用,对炎症晚期(慢性炎症)也有一定的抑制作用。
活性部位 篇5
目前关于南瓜叶的研究报道很少,国内研究主要集中在对南瓜叶中黄酮类化合物的提取工艺及含量测定上[7,8,9]。熊建华等[10]研究了南瓜不同部位的抗氧化活性,结果表明,南瓜叶总提取物具有较强的抗氧化性。本研究采用清除二苯代苦味酰基(DPPH)、羟基自由基(·OH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)及总还原能力四种体外模型,综合评价南瓜叶不同极性部位的抗氧化能力,旨在为南瓜叶的提取和南瓜叶综合开发利用提供理论参考。
1 材料与仪器
1.1 材料
南瓜叶采自慈溪市鸣鹤镇双湖村农田,由浙江医药高等专科学校王和平教授鉴定为南瓜叶,50℃鼓风干燥24 h以上,粉碎后备用;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,C18H12N5O6,相对分子质量394.3,纯度97%):日本东京化成工业株式会社;ABTS(C18H24N6O6S4,相对分子质量548.68,纯度99.4%):阿拉丁试剂有限公司;石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、双氧水均为市售的分析纯。
1.2 仪器
LABOROTA 4000旋转蒸发仪:德国海道夫公司;UV-1240紫外可见分光光度计:日本岛津公司;数显恒温水浴锅:郑州长城科工贸有限公司;超声波清洗器:Sigma仪器有限公司;AL204型万分之一电子天平:梅特勒托利多仪器有限公司。
2 方法
2.1 南瓜叶乙醇提取不同溶剂萃取物的制备
准确称取140 g的南瓜叶粉末置于2000 m L圆底烧瓶中,用70%的乙醇溶液进行提取,其中料液比为1∶6(g/m L),提取温度为60℃,提取时间为2 h,将提取物减压过滤,再重复2次,减压浓缩得到南瓜叶的乙醇提取物。将南瓜叶乙醇提取物加水混悬,分别依次用石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇进行萃取,直到有机层无色为止。减压浓缩后,分别得到石油醚部分浸膏(Ⅰ)3.89 g、乙酸乙酯部分浸膏(Ⅱ)1.00 g、氯仿部分浸膏(Ⅲ)0.47 g、正丁醇部分浸膏(Ⅳ)4.13 g、水层浸膏(Ⅴ)4.15 g。所得的萃取物均冷藏备用。
2.2 抗氧化活性评价方法
2.2.1 ABTS自由基的清除作用[11,12]
用蒸馏水将ABTS溶解,配制成浓度为7 mmol/L的ABTS,然后加入过硫酸钾使其浓度为2.5 mmol/L,将该溶液在室温下避光反应12~16 h,制成ABTS+·储备液。临用前用p H=7.4的磷酸盐缓冲液稀释至适当浓度,使其在波长734 nm条件下的吸光度值为0.7左右,得到ABTS自由基工作液。在试管中加入1.0 m L不同质量浓度样品溶液,再加入2.0 m L的ABTS自由基工作液,混合、摇匀,在室温下反应6 min后,在波长734 nm条件下测定其吸光度(Ai),以不同质量浓度的抗坏血酸(VC)溶液作为阳性对照。用95%的乙醇代替样品溶液测得吸光度(A0);2.0 m L的95%乙醇溶液代替ABTS溶液,测得吸光度(Aj),ABTS自由基清除率的计算公式如下:
2.2.2 总还原能力的测定
分别称取南瓜叶不同溶剂萃取物,用少量二甲亚砜溶解后,用70%乙醇进行定容,配制成一系列浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/m L的待测溶液,参照Apáti等[13]的方法测定待测溶液的还原能力。
2.2.3·OH的清除作用[14,15]
以水杨酸作为Fenton试剂反应产生的·OH的捕捉剂,对南瓜叶不同极性部位的抗氧化活性进行筛选。分别向试管中加入南瓜叶不同极性部位不同质量浓度的样品溶液2.0 m L,然后再分别加入1.8 mmol/L硫酸亚铁溶液2.0 m L和1.8 mmol/L水杨酸-乙醇2.0 m L,最后加入双氧水(0.03%)0.1 m L用以启动反应,用振荡器混合均匀,37℃水浴保持30 min,在波长为510 nm下测量各自的吸光度Ai,用蒸馏水代替双氧水所得到的吸光度为空白对照A0,以70%乙醇代替样品溶液作为本底液吸光度Aj,南瓜叶不同极性部位不同质量浓度的样品溶液对·H的清除率按式(1)计算,并用VC代替样品做阳性对照,每组做3个重复,求其平均值。
2.2.4 DPPH自由基清除作用[16,17]
取南瓜叶不同质量浓度的样品和VC溶液1.0 m L,分别加入2.0 m L 0.1 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液中,暗处室温反应30 min,以95%乙醇溶剂做空白对照,测量其在波长517 nm处的吸光度(Ai)。测定2.0 m L DPPH 95%乙醇溶液与1.0 m L 95%乙醇混合后在波长517 nm处的吸光度(A0);测定2.0 m L 95%乙醇溶液与1.0 m L样品溶液在波长517 nm处的吸光度(Aj)。按式(1)计算其清除率,并计算其半清除率浓度(IC50)。
3 结果
3.1 南瓜叶不同极性部位对ABTS自由基的清除作用
各提取部位对ABTS自由基均有一定的清除作用,但均低于同质量浓度VC的清除率。其中三氯甲烷部分清除效果较差,石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分及水提部分清除ABTS自由基效果较明显。清除率大小依次为水提物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物>三氯甲烷提取物(图1)。其中水提部分在浓度为0.1 mg/m L时,其清除率为89.08%。根据表1的回归方程可得到,乙酸乙酯部分和水提部分的IC50的值分别为0.0389、0.0272 mg/m L。
3.2 南瓜叶不同极性部位总还原能力的测定
在实验测定范围内随着样品浓度的增大,南瓜叶乙醇提取物不同极性部位还原力均不断增强,但在相同浓度下,还原能力始终弱于VC。其中水提部分的还原能力明显高于其他极性部位,还原能力大小依次为水提物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物>三氯甲烷提取物(图2)。根据表1的相关性分析可知,石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、三氯甲烷提取物、正丁醇提取物以及水提物的质量浓度与吸光度的相关系数(R2)分别为0.9994、0.9972、0.9899、0.9953,0.9981,表明南瓜叶不同极性部位还原能力与质量浓度之间有良好的相关性。
3.3 南瓜叶不同极性部位对·OH的清除作用
随着南瓜叶不同极性部位质量浓度的增加,南瓜叶不同极性部位提取物对·OH清除能力也随之提高,但始终低于相同质量浓度VC的清除率。当质量浓度为0.5 mg/m L时,乙酸乙酯极性部位对·OH的清除率达到65.40%,水提物的清除率也达60.39%(图3)。由表1可知,乙酸乙酯提取物和水提取物的IC50值为0.2731、0.3474 mg/m L,南瓜叶不同极性部位清除·OH的能力由强到弱依次为乙酸乙酯提取物>水提物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物。
3.4 南瓜叶不同极性部位对DPPH自由基清除活性研究
在实验测定范围内,南瓜叶不同极性部位提取物对DPPH自由基的清除能力随着样品质量浓度的增加而提高,但均低于同质量浓度VC的清除率。当样品质量浓度为0.5 mg/m L时,乙酸乙酯部分、水提部分的清除率分别达到88.08%、72.17%。三氯甲烷部分在质量浓度为0.5 mg/m L时,清除率仅为26.22%(图4)。由表1可知,乙酸乙酯提取物、水提物的清除DPPH自由基的IC50分别为0.1847 mg/m L和0.1876 mg/m L,根据IC50值评价南瓜叶不同溶剂提取物清除DPPH自由基能力的强弱,IC50值越小,清除能力越好。南瓜叶不同极性部位对DPPH自由基清除能力大小依次为乙酸乙酯提取物>水提物>石油醚提取物>正丁醇提取物>三氯甲烷提取物。
4 讨论
越来越多的医学研究报告证明,许多慢性疾病包括心血管、消化、内分泌、呼吸等方面的疾病,都与人体内累积了过多的自由基有关[18,19,20,21]。天然抗氧化植物化学物来源广,副作用小,其“药食同源”的优势符合现代营养免疫学理念,具有无限的开发前景和广阔的需求市场。
注:ABTS:2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐;DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼;·OH:羟基自由基
本研究通过对南瓜叶乙醇提取物不同极性部位抗氧化能力的比较,得出南瓜叶不同极性部位均具有一定的抗氧化活性,其中乙酸乙酯极性部位和水提部分的抗氧化能力最强。在实验测试范围内,抗氧化能力随着样品质量浓度的增大而增强。这表明,乙酸乙酯极性部位和水极性部位与南瓜叶中大多数抗氧化性物质的极性接近,可以作为南瓜叶抗氧化活性成分研究的主要极性部位进行深入研究。下一步的研究中,笔者将以抗氧化活性为导向,继续对乙酸乙酯部位和水提部位进行活性成分分离与结构鉴定,试图找到真正起抗氧化作用的活性物质。本研究为南瓜叶的开发和利用提供实验数据,也为深入挖掘南瓜叶在食品医学领域的应用提供一定的参考依据。
摘要：目的 研究南瓜叶不同极性部位的体外抗氧化活性。方法 采用系统溶剂法将南瓜叶的乙醇提取物分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水等5种不同极性溶剂萃取得到5种萃取物,以抗坏血酸为阳性对照,测定各萃取物的总还原能力、二苯代苦味酰基(DPPH)自由基清除能力、羟自由基清除能力和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除能力,通过比较半清除率浓度(IC_(50))的大小判断各萃取物的抗氧化能力强弱。结果 南瓜叶不同极性部位均具有一定的抗氧化性,其中乙酸乙酯极性部位和水提部位的抗氧化能力最强,清除ABTS自由基的IC_(50)分别为0.0389 mg/mL和0.0272 mg/mL,清除羟基自由基的IC_(50)分别为0.2731 mg/mL和0.3474 mg/mL,清除DPPH自由基的IC_(50)分别为0.1847 mg/mL和0.1876 mg/mL,在总还原能力上,乙酸乙酯极性部位和水提部位明显强于其他三个极性部位。同一提取物在不同的评价体系中表现出不同的抗氧化能力,可能与其所含成分及活性氧的性质有关。结论 南瓜叶提取物的乙酸乙酯相和水相的抗氧化作用强,是天然抗氧化剂的良好来源。
活性部位 篇6
1 材料
1.1 实验动物
ICR雄性小鼠, 由上海斯莱克实验实验动物有限责任公司提供。
1.2 药物
多枝柽柳:采自新疆吐鲁番中科院吐鲁番沙漠植物园, 经第二军医大学生药学教研室秦路平教授鉴定为柽柳属植物多枝柽柳 (Tamarix ramosissima Ledeb) 的干燥嫩枝叶。各提取物的制备:多枝柽柳药材8kg, 自然干燥后粉碎, 过80目筛, 用95%乙醇热回流提取1次, 再用80%乙醇热回流提取2次, 减压回收乙醇, 浓缩后的提取液得到总提物 (ET) 。总提物留样以水混悬, 依次用石油醚 (PET) 、乙酸乙酯 (ACT) 、正丁醇萃取 (BT) , 萃取剩余部分为水部分 (WT) 。回收溶剂至干, 依次得多枝柽柳石油醚部位提取物 (PET) 19.6g、乙酸乙酯部位提取物 (ACT) 78.8g、正丁醇部位提取物 (BT) 121.9g和水溶性部位 (WT) 517.6g。总提物及各部分提取物干浸膏以少量0.5%CMC-Na分别溶解后, 加去离子水配成悬浮液给药。醋酸地塞米松片:上海医药 (集团) 有限公司信谊制药总厂, 批号:090701;吲哚美辛肠溶片:上海辛帕斯制药有限公司, 批号:100309;抗坏血酸 (ascorbic acid) :Sigma Chemical CO。
1.3 试剂
二甲苯 (AR级) :国药集团化学试剂有限公司;乙酸 (AR级) :国药集团化学试剂有限公司;DMSO (二甲基亚砜) :上海博光生物科技有限公司 (AMRESCo, 进口分装) ;DPPH (1, 1-二苯基苦基苯肼) 自由基:Sigma Chemical Co.;邻苯三酚 (pyrogallol) :Sigma Chemical CO。
1.4 仪器
UV-1100紫外分光光度计:上海天美科学仪器有限公司;HWS24恒温水浴箱:上海一恒科技有限公司;微量可调加样器:德国Eppendorf公司:ELX800酶联免疫检测仪:美国BIO-TECH公司;分析软件:华鑫酶联免疫检验分析系统;96孔板:美国Corning公司。
2 方法与结果
2.1 多枝柽柳抗炎活性部位筛选 (二甲苯耳肿胀法)
将70只雄性小鼠按体重随机分成7组, 每组10只, 在致炎前60分钟灌胃给药0.2ml/20g, 给药剂量如表1所示, 空白对照予等量0.5%CMC-Na水溶液。参考文献方法[5], 以左右耳重量之差为其肿胀度, 计算抑制率。各组肿胀度与空白组比较, 进行组间t检验。结果见表1。
(±s, n=10)
与空白组比较*P<0.05, **P<0.01
2.2 多枝柽柳镇痛活性部位筛选
参考文献方法[3]。将ICR小鼠按体重随机分组, 雌雄各半, 每组10只。分组及给药剂量见表2。小鼠灌胃给药1小时后, 腹腔注射0.6%～0.7%的醋酸溶液0.1ml/10g。记录15分钟内小鼠的扭体次数, 计算抑制率。各组间数据统计处理采用t检验。结果见表2。
(±s, n=10)
与空白组比较*P<0.05, **P<0.01
2.3 多枝柽柳抗氧化活性部位筛选
2.3.1 多枝柽柳对DPPH自由基的清除作用
受试物同2.1。将1mg/ml的待测样品倍量稀释, 分别得到浓度为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml的一系列溶液。以抗坏血酸 (VC) 作为对照品, 同样品法配成一系列浓度, 实验方法参考文献[4], 计算出半数清除率EC50。结果乙酸乙酯部位 (ACT) 半数清除率为26.4μg/ml, 正丁醇部位 (BT) 半数清除率为48.1μg/ml, 水部位 (WT) 半数清除率为119.6μg/ml, 抗坏血酸半数清除率为21.5μg/ml, 因为溶解度的问题, 石油醚部位的EC50值未作测定。
2.3.2 多枝柽柳对超氧阴离子自由基的清除作用
受试物同2.1, 样品浓度为0.5mg/ml, 参考文献方法[5], 测定吸光度。结果乙酸乙酯部位 (ACT) 对超氧阴离子自由基清除率为62.7%, 正丁醇部位 (BT) 清除率为43.2%, 水部位 (WT) 清除率为8.4%, 因为溶解度的问题, 石油醚部位的清除率未作测定。
3 结论
本文对多枝柽柳80%乙醇提取物 (ET) 、石油醚 (PET) 、乙酸乙酯 (ACT) 、正丁醇提取物 (BT) 和水部位 (WT) 进行抗炎活性研究结果表明, 小鼠的耳肿胀度抑制率分别为30.55%、9.36%、55.74%、21.87%、5.28%;对多枝柽柳80%乙醇提取物 (ET) 、乙酸乙酯 (ACT) 、正丁醇提取物 (BT) 和水部位 (WT) 镇痛活性研究结果显示, 小鼠扭体次数抑制率分别为29.51%、34.75%、23.28%、6.56%;抗氧化作用活性实验结果显示乙酸乙酯部位 (ACT) 对DPPH自由基的半数清除率 (EC50) 为26.4μg/ml, 对超氧阴离子自由基清除率为62.7%。说明多枝柽柳乙酸乙酯部位有较强的抗炎、镇痛、抗氧化活性。
参考文献
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[4]丰永红, 于淑娟, 李国基, 等.DPPH法测甘蔗提取物抗氧化活性研究.甘蔗糖业, 2003, 32 (1) :31.
活性部位 篇7
关键词：板蓝根,抗炎作用,药理学机制
通常称为的板蓝根是由板蓝根植物加工成的复方板蓝根制剂。板蓝根为我国一种传统的中草药, 分为南板蓝根与北板蓝根, 一般指十字花科植物菘蓝 (Isatis tinctoria L.) 和草大青 (Isatis indigotica Fort) 的根, 中医辩证具有清热、解毒、凉血、利咽等药效, 现代研究表明复方板蓝根制剂具有抗病毒、抗炎症, 抗癌作用, 抑制单胺氧化酶作用, 免疫调节及抗内毒素等较广泛的临床药理作用[1,2]。根据临床经验, 板蓝根常用于预防感冒, 治疗流感病毒感染疾病, 炎症性咽喉不适, 细菌感染性肺部疾病等。复方板蓝根制剂作为中成药, 具有副作用小, 成本低廉, 药理作用广等系列特性, 加之现代研究不断证实其作用广泛, 因此板蓝根的临床应用价值得到更高的体现。基于板蓝根的特性及突出的抗炎性作用, 借鉴目前的研究成果, 笔者进一步总结和探讨板蓝根的抗炎活性部位抗炎作用的药理机制。
1 板蓝根的抗炎活性部位及有效化学成分
在SARS和各型流感流行期间, 板蓝根的抗病毒和抗炎性作用得到经验上的肯定, 因此对板蓝根具有该方面的作用研究不断深入。目前, 一些研究证实板蓝根相关制剂在抗炎症反应确实有效。
对于板蓝根制剂抗炎性作用的有效化学成分是研究的焦点, 但目前对于板蓝根制剂中含有的化学成分研究仍然没有具体的结果。通过现代提取工艺, 应用不同物质对板蓝根中的有机化合物进行提取研究, 取得一定的成果。郑汝[3]等人通过研究发现, 板蓝根水提部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、氯仿部位及石油醚部位均具有一定的抗菌作用, 而萃取后部位则没有抗菌作用。该研究证实, 板蓝根的有机化学成分确实存在抗菌作用, 那么其抗炎性作用也得到证实。在程妍[4]等人的研究中, 运用化学萃取技术, 分别提取出板蓝根中总苯丙素部位、总有机酸部位、总生物碱部位等有机成分, 应用这些有效部位进行抑菌及解热活性实验, 结果表明均有抑菌和解热药效。该研究还证实不同有效部位组合后对抑菌和解热的药效存在不同。说明板蓝根是其本身含有多种化学成分, 并基于板蓝根自身含有化学物质量的组合生物特性, 而表现出的特定药理作用。
据较早的研究表明, 板蓝根的化学成分主要含有1-硫氰酸-2-羟基-3-丁烯, (+) 5-乙烯噁唑烷-2-硫酮, 腺苷, 棕榈酸, β-谷甾醇, 蔗糖、靛蓝、靛玉红及精氨酸等[5]。其抗炎活性可能与板蓝根中具有这些化学物质有关。近年来研究进一步表明, 板蓝根中含有3- (2′-羟基苯基) -4 (3H) -喹唑酮、4 (3H) -喹唑酮、丁香酸、邻氨基苯甲酸、水杨酸、苯甲酸等, 丁香酸具有半体内抗内毒素的作用。板蓝根基于这些化学成分, 表现出抗炎性作用。但究竟是其哪种化学成分或几种化学成分具有抗炎性作用还有待进一步的研究。
2 板蓝根抗炎症反应的药理机制
目前对板蓝根抗细菌的研究已经取得相当多的成果, 研究基本均表明板蓝根提取物活性成分具有广谱抗菌作用。板蓝根对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、卡他球菌、白色念珠球菌具有一定的抑制或灭火作用, 从而达到抗炎症的作用[7]。为进一步研究板蓝根的抗炎性作用效果及在体内的抗菌效果, 在动物实验中, 用二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致大鼠足趾肿复制感染模型, 高欣[8]等人发现, 板蓝根具有抗炎作用, 对二甲苯所致小鼠耳肿胀和角叉菜所致的大鼠足趾肿均表现出明显的抑制作用。也就是说, 板蓝根在动物炎症模型中发挥出药理作用。
板蓝根制剂表现出广泛抗菌谱及对动物模型抗炎效果的特性, 说明板蓝根的抗炎症反应药理作用确实存在。根据研究表明, 板蓝根含有的化学活性物质有许多类和种, 其中水杨酸可显著抑制LPS诱导HL-60细胞释放IL-8, 采用LPS预刺激、LPS后刺激、LPS与板蓝根多糖同时刺激J744.a.1小鼠巨噬细胞珠, 最终实验发现板蓝根多糖在上述3种情况均可抑制LPS刺激引起的NF-kB与DNA结合活性的升高[9]。该研究直接反应板蓝根抗炎症反应的物质基础和药理机制。板蓝根中的化学活性物质还具有多种, 其对抗炎症反应可能还具有物质基础, 因此还具有很大的研究价值。
3 板蓝根抗炎性作用在临床的应用及价值
板蓝根在抗炎症反应方面表现出明显的优势, 且因板蓝根是传统的中草药, 副作用小的特点更使得其在临床上广泛应用。目前, 复方板蓝根制剂在治疗细菌性消化系统疾病, 细菌性和病毒性呼吸系统疾病以及细菌性皮肤性疾病均有一定的疗效。特别是在近年来流感流行期间, 各种复方板蓝根制剂作为经验性预防和辅助治疗有着一定的效果, 因此得到极大的推广和运用。
板蓝根的清热解毒功效使得其具有抗炎性作用, 而且板蓝根还具有多种药理作用, 其经济、高效、便利等诸多优点使得板蓝根备受关注, 有关板蓝根的抗炎症反应的物质基础和药理机制有待进一步研究。
参考文献
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[3]郑汝, 梁锦丽.板蓝根不同提取部位抗菌活性的实验性研究[J].海峡药学, 2010, 22 (4) :32-34.
[4]程妍, 李祥, 许金国, 板蓝根有效部位的抑菌解热药效研究[J].中药新药与临床药理, 2010, 21 (6) :589-592.
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[8]高欣, 董瓅瑾, 金鑫, 等.板蓝根抗炎活性部位筛选的初步研究[J].武警医学院学报, 2010, 19 (9) :709-711.
活性部位 篇8
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞BV-2小胶质细胞系购自中国医学科学院细胞中心。
1.1.2药物枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子和淫羊藿均购自北京同仁堂。
1. 1. 3试剂与仪器胎牛血清( 美国Gibco公司) 、 DMEM培养基( 美国Hyclone公司) 、NO化学法试剂盒( 中国南京建成生物公司) 、二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide,DMSO) 、氯化硝基四氮唑蓝 ( nitrotetrazolium blue chloride,NBT) 、溴化噻唑蓝四氮唑( thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT) 、二氢乙锭 ( dihydroethidium,DHE) 荧光染料、4',6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐( 4',6-Diamidino-2-phenylindole,DAPI) ( 美国Sigma公司) 、兔抗大鼠i NOS,COX-2和 β-actin多克隆抗体( 美国CST公司) 、辣根过氧化物酶( horseradish peroxidase,HRP ) 标记的羊 抗兔Ig G ( 美国Vector公司) 、电化学发光 ( electrochemical luminescence ECL) 试剂盒( 美国Pierce公司) 、牛血清白蛋白( bovine serum albumin,BSA) ( 中国北京鼎国昌盛生物技术有限公司) 、荧光显微镜( 日本奥林巴斯公司) 、2200 PRO凝胶成像分体系统( 美国伊斯曼柯达公司) 、Sunrise-Basic酶标仪( 瑞士帝肯公司) ,UV-2401PC紫外分光 光度仪 ( 日本岛津 公司) 。
1.2加味五子衍宗方及其活性部位的提取和测定
( 1) 枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子、 淫羊藿按质量比8∶ 8∶ 4∶ 1∶ 2∶ 8混合,为提高药物提取率,溶剂采用70% 乙醇,用10倍和5倍量微沸提取2遍,每遍1小时。( 2) 大孔树脂柱分离: 将复方提取液过大孔树脂柱,分别用4倍柱体积纯净水、 20% 乙醇、50% 乙醇、70% 乙醇和2倍柱体积95% 乙醇洗脱,收集各洗脱液。( 3) 将各部分洗脱液60℃ 低温减压浓缩,冷冻干燥成粉末,4℃ 避光保存, 使用时用培养液或DMSO溶解( 终浓度为5‰) ,用0. 2 μm滤膜除菌后作用于细胞。( 4 ) 分离组分成分鉴定: 总多糖含量检测用酚硫法,葡萄糖为标准品,紫外分光光度仪490 nm处测定; 总黄酮含量检测用氢氧化钾显色法,芦丁为标准品,紫外分光光度仪216 nm处测定。
1.3细胞培养和处理
BV-2小胶质细胞系37℃ 、5% CO2的培养箱中培养,加入高糖DMEM培养基( 含10% 胎牛血清, 100 U / L青霉素和100 μg / L链霉素) ,每1天传代1次。
将细胞分为空白对照组,炎症模型组和药物治疗组。其中MTT细胞存活率检测时药物治疗组分为复方组,水提组,20% 醇提组,50% 醇提组,70% 醇提组和95% 醇提组6组,其余抗炎机制研究实验药物治疗组分为复方组,水提组,20% 醇提组,50% 醇提组4组。LPS诱导炎症模型的浓度为1 μg /m L, 药物浓度设置为200 μg /m L。药物治疗和LPS同时处理细胞,方法参照本课题组前期实验[3]。
1.4MTT细胞活性分析
BV-2小胶质细胞系以5 × 104/ 孔密度接种于48孔板,培养过夜,空白组采用上述高糖DMEM培养基换液,模型组用LPS诱导炎症,药物组LPS与药物同时处理细胞,刺激维持24小时,弃上清,加MTT染色,温箱孵育4小时,弃上清,加入500 μL DMSO,酶标仪570 nm处检测光密度( optical density,OD) 值。
1.5细胞上清液NO含量测定
BV-2小胶质细胞系接种于48孔板,密度为5 × 104/ 孔,空白组换液,模型组用LPS诱导炎症,药物组加药和LPS处理,刺激维持24小时,用NO化学法试剂盒检测NO浓度,按照说明书操作: 吸取300 μL培养液上清,加试剂1和2 ( NO化学法试剂盒提供) ,6000 rmp离心10分钟,取160 μL上清,加入显色剂,酶标仪570 nm波长检测OD值。
1.6Westernblot蛋白分析
将细胞接种于ф100 mm培养皿中,培养过夜, 空白组换液,模型组用LPS处理细胞,药物组LPS协同药物处理细胞,刺激维持24小时后收集细胞, 用RIPA裂解液( 内有Cocktail蛋白酶抑制剂) 裂解细胞,获取总蛋白。将总蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,用半干转膜仪将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上,5% 脱脂奶粉封闭5分钟。兔抗鼠i NOS,COX-2和 β-actin一抗 ( 1∶ 1000) 室温孵育2小时,充分洗涤,加入HRP标记的羊抗兔二抗( 1∶ 1000) 室温孵育1小时,充分洗涤后加入ECL液,室温反应5分钟,在凝胶成像系统上拍照。
1.7免疫荧光检测核转录因子-κB核转位情况
在24孔板中铺入显微镜盖玻片,多聚赖氨酸包被后,接种密度为10 × 104细胞于玻片上,药物预处理30分钟后加LPS诱导,温箱孵育1小时,4% 多聚甲醛包被,封闭液( 0. 2% triton X - 100 + 5% BSA) 室温孵育30分钟,加一抗( 1∶ 200稀释) ,4℃过夜,PBS充分洗涤,加二抗( 1∶ 200稀释) ,室温摇床1小时, PBS充分洗涤,DAPI ( 50 μg / m L) 37℃ 避光处理30分钟,PBS充分洗涤,甘油-PBS封片剂封片,用荧光显微镜拍照。
1.8免疫荧光检测ROS的产生
将细胞接种于铺有盖玻片的24孔内,10 ×104/ 孔, 多聚赖氨酸包被后,药物处理24小时后,PBS冲洗1遍,1 μmol / L ROS荧光探针 ( DHE ) 温箱处理30分钟,PBS充分洗涤,DAPI处理,充分洗涤,封片,荧光显微镜拍照。
1.9统计学处理
统计学方法数据用均数 ± 标准差( ± s) 表示。 采用SPSS 16. 0统计学软件进行单因素方差( Oneway ANOVA) 分析。组间两两比较采用LSD检验, P < 0. 05认为差异有统计学意义。
2结果
2.1各分离部位总多糖和总黄酮含量
本实验中总多糖以葡萄糖为对照品,苯酚浓硫酸方法检测,总黄酮以芦丁为对照品,紫外分光光度法检测。本次实验中的总方提取物含 ( 62. 35 ± 0. 05) % 总多糖成分,( 0. 08% ± 0. 03) 总黄酮成分,抗炎效果最 好的50% 醇提组中含 ( 46. 66 ± 0. 04) % 总多糖成分,( 4. 66 ± 0. 12) % 总黄酮成分,其中各洗脱成分组中,含总黄酮量最多的为70% 醇提组,含总多糖量最多的为水提组,具体见表1。
2.2各分离组分对BV-2小胶质细胞系存活率的影响
加味子五子衍宗方水提组、20% 醇提组和50% 醇提组对细胞存活率没有明显影响,70% 醇提组和95% 醇提组对细胞毒性较大,经LSD检验,与空白组相比P < 0. 01。因此在后续实验中主要针对总提取物、水提组、20% 醇提组和50% 醇提组的抗炎机制进行了研究,具体见表2。
注: 模型组与空白组相比,aP < 0. 01; 各药物治疗组与模型组相比,bP < 0. 05,cP < 0. 01。
2.3加味五子衍宗方及其各活性部位对细胞上清液中NO的影响
NO与炎症反应关系密切,炎症反应中大量产生的NO具有细胞毒性,是炎症反应造成正常组织损伤的原因之一。加味五子衍宗方及其各活性部位均能降低NO产生,经LSD检验复方组和50% 醇提组与空白对照组相比有统计学差异( P < 0. 01) , 且50% 醇提组要优于其他组分和复方组,可能是神经炎性保护的主要物质基础,见表3。
2.4加味五子衍宗方复方及其各活性部位对炎症相关蛋白表达的影响
一氧化氮合 成酶 ( inducible nitric oxide synthase,i NOS ) 和环氧合酶-2 ( cyclooxygenase-2,COX2) 是核转录因子-κB( nuclear factor-κB,NF-κB) 调控的2个重要的炎症相关蛋白,在炎症反应中具有非常重要的作用。NO和PGE2等炎性因子分别是i NOS和COX-2合成的产物,用Western blot检测此两种蛋白表达,可以帮助阐明细胞炎症激活和药物的抗炎机制。MWP复方及其各活性部位可降低i NOS和COX-2的表达,其中50% 醇提组的抑制作用最明显且优于复方组,见图1。
2.5加味五子衍宗方及其活性部位对激活BV-2小胶质细胞系NF-κB核转移的影响
NF-κB一种多效性的转录因子,当细胞处于非激活状态,NF-κB存在于细胞浆,外界信号( 氧化应激、LPS或细胞因子) 刺激细胞后,NF-κB从细胞浆转移到细胞核,促进相应基因转录表达,参与炎症因子的生成。如图2所示: NF-κB被绿色荧光标记, DAPI染色细胞核为蓝色,空白组细胞核内几乎没有绿色荧光标记,荧光标记在核外周的细胞浆,模型组细胞内NF-κB绿色荧光与蓝色荧光有重叠现象, 说明NF-κB从细胞浆转移至细胞核,加味五子衍宗方及其活性部位组细胞核内绿色荧光减少,说明核转位现象被抑制,具体见图2。
2.6加味五子衍宗方及其活性部位对激活BV-2小胶质细胞系ROS含量的影响
活性氧( reactive oxygen species,ROS) 参与细胞多种生理和病理形成机制,高浓度的ROS能通过氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至坏死。DHE是ROS的荧光探针,可透过细胞膜被ROS氧化产生红色荧光,根据细胞中红色荧光的产生可判断ROS的含量。DAPI染色细胞核为蓝色,如图3所示: 模型组DHE红色荧光产生明显,说明LPS可激发BV-2产生大量ROS,空白组和药物组细胞红色荧光产生均不明显,其中50% 醇提组红色荧光略高于其他组, 说明MWP及其活性部位能有效抑制激活细胞ROS的产生,50% 醇提组抗氧化能力较其他组弱,具体见图3。
3讨论
随着全世界人口老龄化速度的加快,老年期痴呆已成为全球性公共健康问题。AD在老年期痴呆中发病率最高,对AD的研究已成为热点。加味五子衍宗方经过多年的临床观察和实验研究发现其有良好的临床抗痴呆和神经保护作用。AD的病因复杂,涉及诸多病理生理过程[4],单一靶点药物往往不能有效抑制病程发展,并且存在毒副作用[5],中药毒副作用小且在防治痴呆方面有悠久的历史[6,7],特别是针对像AD这种的多因素相关的复杂性疾病,更能显示出其多靶点,多途径的治疗优势。