活性研究

活性研究（精选十篇）

活性研究 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

于2015年在黑龙江省兰西县采集瑞香狼毒根,洗净后烘干,采用小型粉碎机粉碎,过50目筛,装入塑料袋,置于阴凉处备用。

在白粉病盛发期(7月下旬至9月下旬),从哈尔滨市糖业研究所南瓜试验田内采集南瓜白粉病病叶标本,每月采集1次,每次采集5份,共采集15份病叶标本,置于5℃冰箱。

1.2 方法

称取瑞香狼毒根100g,放入棕色广口瓶中加入400mL无水乙醇,采用超声提取法,提取温度30℃,超声提取0.5h后,置于避光处(20~25℃),浸提24h过滤出溶剂,滤渣采取同样的方法进行处理,共重复3次。合并3次滤液,用旋转蒸发仪在55℃条件下减压浓缩至无溶剂蒸出,提取称重,计算提取率。后用乙醇定容至含干物质5g·mL-1,密封后放入4℃冰箱中备用。

采用硅胶柱层析和TLC检测进行活性组分的分离与鉴定。石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇这4种溶剂作为萃取剂进行柱层析分离粗提物,依次加入混合洗脱剂,梯度洗脱,流速控制在0.5mL·min-1。TLC检测时,采用聚酰胺薄膜层板,点活性馏分于其上,展开剂根据活性组分确定,样品溶剂为无水乙醇,初步确定已筛选出的活性组分所含单物质的数目,并根据所选植物及提取方法,参考已报道文献,选择标准品与活性组分同时点样进行比对。

生物测定选用叶盘占药法。在南瓜长至3叶1心时,将第一片叶用打孔器打成直径1cm的离体叶盘放于9cm的玻璃培养皿,每皿放10片,已配制好的药液10mL置于培养皿中,设置空白对照,每处理设3个重复。施药12h后,接种浓度为5×105个·mL-1的白粉菌液10 mL至叶面上(治疗作用则先接种白粉菌液至叶面上,3d后施药),置于26℃,湿度60%,光照2级,无光/有光=8h/16h的人工气候箱中,接种后7d,空白对照充分发病,调查单叶片病斑数,记录各叶片发病情况,计算病情指数,防治效果。

2 结果与分析

抑制南瓜白粉病活性物质最佳溶剂是石油醚(见表1)。石油醚组分防治南瓜的防治效果最显著,其相对防效达到82.01%;其次是氯仿,抑制南瓜白粉病的相对防效为68.13%;相对防效最低的是正丁醇,仅为23.32%。

取生测活性较高的石油醚浸膏,用200~300目硅胶干柱层析,梯度洗脱(石油醚与乙酸乙酯比例分别为5个梯度,即1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1),收集得到176馏分,然后根据色带切割柱并用甲醇洗脱各带,TLC检测,紫外灯显色合并。最后得Fl~F12这12种组分,将其对南瓜白粉病分别进行离体法活性测定,最终得到5个活性组分(F4、F5、F7、F9、F10)效果显著,其相对防效均大于70%(见表2)。

3 结论与讨论

在医药领域,瑞香狼毒的化学成分、药用价值开发研究已相对明确,在农用活性上,抑菌活性成分许多人开展了相关的研究工作,但对于其防治白粉病的研究鲜见报道,针对这一状况,本研究以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇为萃取剂,得到萃取液进行室内生物测定,结果石油醚得到萃取剂的防治效果最好,相对防治效果为82.01%,石油醚萃取剂进一步柱层析分离,选用石油醚和乙酸乙酯为展开剂,对瑞香狼毒根石油醚萃取液梯度洗脱,得到的176个馏分,结合TLC点板,合并相同馏分,得到12个不同组分,这些组分分别对南瓜白粉病进行生物测定试验,最终鉴定5种组分为活性组分,这5种组分的获得为筛选防治南瓜白粉病的天然活性化合物奠定基础。从植物中寻找活性化合物和先导化合物是新农药创新的主要途径之一,而我国的瑞香狼毒资源丰富,原料易得,若将之开发为一种新型的植物源杀菌剂,可以变害为宝,不仅可以充分利用该植物资源,也可将其作为退化草原的优势种被清除,进而为草原生态环境的保护作贡献。

摘要：为寻找抑制南瓜白粉病新型的植物源抑菌剂,对瑞香狼毒根进行分离。采用乙醇提取法对瑞香狼毒根进行粗提取,所得粗提物溶入水溶液后,分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇这4种溶剂萃取。结果表明:石油醚萃取液对南瓜白粉病的活性最高。进一步对石油醚萃取液分离,并根据TLC点板结果,得到12种馏分(F1~F12),将其对南瓜白粉病分别进行活性测定,最终得到5个活性组分(F4、F5、F7、F9、F10)。

关键词：南瓜白粉病,瑞香狼毒,活性组分

参考文献

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活性污泥法处理苯胺废水研究 篇2

活性污泥法处理苯胺废水研究

研究了以苯胺好氧降解菌及硝化类细菌构成的活性污泥降解苯胺,考察了污水处理过程中浓度,处理时间,温度,pH值,重金属等对苯胺降解效率的影响.结果表明,微生物对苯胺降解代谢的`最佳pH范围是6.6～7.8,重金属离子,尤其是汞离子,通常会对活性污泥的代谢活性产生抑制作用.

作 者：杨占文 YANG Zhan-wen  作者单位：菏泽市环境保护局,山东,菏泽,274000 刊 名：山东化工 英文刊名：SHANDONG CHEMICAL INDUSTRY 年，卷(期)：2007 36(12) 分类号：X783.031 关键词：活性污泥   苯胺   废水处理  

猴头菇活性成分研究进展 篇3

摘 要 猴头菇是一种营养价值极高的食用药用真菌，其所含丰富的多糖、多肽、萜类、甾醇类等活性成分使其具有抗肿瘤，降血糖，降血脂等诸多功效。介绍猴头菇所含活性成分及其功能性。

关键词 猴头菇；多糖；活性成分；功能

中图分类号：S646 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2016）12--03

猴头菇（Hericium erinaceus），又叫猴头菌，外形酷似猴头。属担子菌纲，多孔菌目，齿菌科，猴头属，菌伞表面长有毛茸状肉刺，长1～3 cm，子实体圆而厚，基部狭窄或略有短柄，上部膨大，直径3.5～10 cm。猴头菇营养价值很高，具有抗溃疡和炎症，增强免疫力，抗肿瘤，降血糖、血脂，抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗突变，抑菌，保肝，提高机体耐缺氧能力，抗疲劳等作用[1-2]。这些功能主要是蛋白、多肽、多糖、萜类、甾醇类等活性成分作用的结果，本文将重点介绍国内外猴头菇活性成分的相关研究，以期为后来研究者提供参考。

1 多糖及其功能性研究

多糖来自于高等动植物细胞膜和微生物细胞壁，是自然界天然大分子物质之一，含量丰富，对维持生物的生命活动至关重要[3]。猴头菇多糖是由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物，存在于菌丝、子实体和发酵液中，是目前研究最多的猴头菇活性成分之一。大量的研究表明，猴头菇多糖具有提高免疫力、降血脂、抗肿瘤、抗衰老等功能，猴头多糖制成的药品和保健品市场欢迎度很高，前景广阔。

常见提取猴头菇多糖的方法有热水提取法[4-6]，超声波提取法[7-8]，酶法提取[9-10]等。张素斌[11]等采用热水提取法、超声波法、纤维素酶法、木瓜蛋白酶法、果胶酶法、复合酶法和超声复合酶法分别提取了猴头菇多糖，并通过比较发现多糖提取率分别为5.80%，6.41%，10.20%，9.77%，7.94%，10.89%，15.59%，超声与复合酶法的协同作用可极大的提高多糖提取率，超声功率为500 W，最佳提取条件为料液比1∶30，酶解时间90 min，超声时间40 min。吴美媛[12]等通过响应面法发现微波提取的最佳条件是料液比1∶50.5（g/mL），微波功率405 W，微波处理时间9.5 min，此时其平均提取率为（13.92±0.13）%。杨凤杰[13]等发现猴头菇多糖在60 ℃，液料比为20∶1的情况下超声时间为35 min，提取2次，提取率为7.48%。吴美媛[14]等利用复合酶纤维素酶和木瓜蛋白酶提取猴头菇多糖，发现pH5.5，温度50 ℃，酶和底物比为1∶10，时间90 min，其提取率为9.55%。和法涛[15]等利用响应面法发现热水阀浸提猴头菇多糖的最佳条件为料液比1∶33（g/mL），浸提温度92 ℃，时间134 min，其提取率为4.98%。

现代医学和药理学的很多研究发现猴头菇多糖具丰富的功能：提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂等。其中抗癌是多糖类化合物的重要生物活性，具毒副作用小、与化疗药物联用有协同效应的特点。刘重芳[16]等发现，猴头多糖能可增加免疫功能低下的小鼠的胸腺和脾重，升高其白细胞的作用。罗珍[17]等发现，猴头菇子实体多糖能显著增加免疫功能低下的小鼠的胸腺系数，增强小鼠迟发型变态反应并提高淋巴细胞的增殖能力。韩伟[18]等发现，猴头菇多糖是一种免疫调节剂：一定剂量的猴头菇多糖可以增强LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，增加IL-2诱导的淋巴细胞的增殖。郭焱[19]等发现，猴头多糖可使TGF-β1抑制的人T淋巴细胞功能有所恢复，增强人体的细胞免疫。林志强[20]等发现，猴头菇多糖可提高小鼠大脑和肝脏中的SOD、CAT含量，降低小鼠大脑和肝脏的MDA含量，说明猴头菇多糖可以提高抗氧化和耐缺氧能力。黄萍[21]等发现，将猴头多糖作用于大鼠，可使大鼠的急性，慢性溃疡指数明显降低，对大鼠胃溃疡有明显抑制作用，也可以一定程度的抑制大鼠胃酸分泌。殷关英[22]等发现，猴头多糖有明显的降血脂，抑制实验性血栓形成和抗凝血作用，对防治心血管疾病有积极意义。杨雪[23]等发现，猴头菇多糖能显著延长小鼠负重游泳时间，提高小鼠体内肝糖原的储备量，降低小鼠血乳酸和血清尿素氮含量，表明猴头菇多糖可提高小鼠抗疲劳性。郑乃珍[24]等发现，猴头多糖单独或协同ConA、LPS可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。姜慧慧[25]等研究发现，猴头菇多糖可以缓解番鸭感染番鸭呼肠孤病毒的临床症状，保护其消化道形态结构，降低病死率。Wang[26]等发现，猴头多糖有抗人造肺转移性肿瘤的作用，且能增加细胞和巨噬细胞数量。Wang Jinchyi[27]等发现，猴头菇多糖能明显降低血糖浓度，并对血清中甘油三酸酯和总胆固醇含量有明显效果。

2 蛋白、多肽及其功能性研究

猴头菇活性蛋白具有免疫调节作用，而活性肽则有抗氧化功能。每100 g猴头菌干品中含蛋白质26.3 g，含氨基酸多达17种，其中人体所需的占8种。李巧珍[28]等发现，猴头菌子实体中的粗蛋白含量随着生长发育的进行，总体上呈下降趋势。李巧珍[29]等通过国际通用评价方法测得猴头菌成熟后期的必需氨基酸占总量的52.42%，达到最高值，小菌刺期则最低，为48.02%，蛋白质化学评分在分裂期高达57.18。田敏爵[30]等研究发现用NaOH溶液浸提，可以提高猴头菌硒蛋白的提取量，且最佳提取条件为：温度60 ℃，料液比1∶20，NaOH浓度0.1 mol/L，提取8 h，3次，提取量可达到67.47%。陆武祥[31]等比较了猴头菇，金针菇，杏鲍菇，鸡腿菇和香菇的菌丝蛋白含量，发现猴头菇的菌丝蛋白含量为17.6 mg/g，菌丝蛋白超氧阴离子自由基清除率则低于金针菇，菌丝蛋白羟自由基清除率最高，菌丝蛋白DPPH自由基清除率低于金针菇，菌丝蛋白还原力最高。猴头菇菌丝蛋白的抗氧化活性最高，其抗氧话活性的综合评价值为3.82，远远高于金针菇、香菇、杏鲍菇、鸡腿菇等其他常见菌类；他还发现，不同食用菌中含有不同的多糖和蛋白，且同一食用菌菌丝多糖和蛋白对不同自由基清除能力也不同。且通过其实验数据可以看出相同质量的猴头菇由于其蛋白质含量更高，而体现出较多糖更强的抗氧化活性。苑广信[32]等发明了一种含有猴头菇的多肽组合物可以改善老年痴呆小鼠的学习能力。徐艳[33]等人研究表明，猴头菌丝抗氧化肽对超氧阴离子自由基，羟基自由基和DPPH自由基均有良好的清除能力。

3 其他活性成分及其功能性研究

除了多糖，蛋白和多肽，猴头菇还含有其他多种活性成分。谢婓君等从猴头菇中还分离到了其他两类化合物：一类为4-氯-3，5二甲氧基苯甲酸及其脂类：另一类为齐墩果酸甙类。钱伏刚[34]等又根据其理化性质和波谱分析鉴定了以齐墩果酸为甙元的5个三萜皂以及4个结晶和一个液态化合物。曹瑞敏[35]等通过GC-MS-DS 法测定的猴头菌实体中3种脂肪酸成分， 分别为亚油酸、十六烷酸已脂、已基亚油酸，已有研究表明猴头菌脂肪酸含量与其降血脂和降血压的功效相关。宋慧[36]从小刺猴头菌中分离到了18中脂肪酸及其衍生物，以及赤藓糖醇，葡萄糖醇和木糖醇，翟凤艳[37]同样分离到赤藓糖醇和木糖醇，且还分离到了阿拉伯糖醇，Kawagishi H[38，39]等从猴头菌中分离到了酚类化合物HericenonesA，B，C，D，E，F，J，3-hydroxyhericenone F，8-酮-9，10-二羟基-12-烯基十八碳酸，二萜类化合物Erinacine A，B，C，D，E，F，G，K，吡喃酮类化合物ErinapyroneA，B，其中酚类化合物HericenonesA和B可以杀死宫颈癌细胞，Hericenones C，D，E具神经生长因子合成促进作用，而神经生长因子又可用于治疗智力衰退，神经衰弱等问题。二萜类化合物Erinacine B，C具有抗菌活性。Kenmoku H等从猴头菌中分离到了（-）-cyatha-3，12-diene和Erinacine P。梁永波[40]从小刺猴头菌中分离到了豆甾醇和28ξ-羟基-豆甾-4-烯-3-醇，马福[41]也从小刺猴头菌中分离到了两种新的麦角甾醇，研究表明麦角瑙醇在人体内可转化为维生素D2，维生素D2在调节生命代谢功能上有重要作用[42]，陈宇[43]从小刺猴头菌中分离到了三种甾酮类化合物，而甾醇类物质对胃黏膜有保护作用。李洁莉[44]发现猴头菌丝体中存在着较高含量的腺苷4.79 mg/g，腺苷可以舒张血管，降血压，降低心率，增加cAMP，刺激肾上腺生成甾体激素，抑制血小板凝集，镇静和抗惊厥等多种作用[45]。

4 小结与展望

目前，人们对猴头菇的功效已做了很多研究，特别是猴头菇多糖的应用价值已受到人们的普遍关注。但由于研究的系统性不足，对多糖活性成分决定性的作用部位和机理研究尚不深入。猴头菇中含量最多的成分是蛋白质，但现有的猴头菇活性成分的功能性研究仍然以多糖为主，对多肽及其他活性物质的研究远远不足。根据前人对其他食用菌的研究表明，食用菌多肽的清除氧自由基能力和抑菌能力都很强，由于猴头菇中含有大量多肽，十分有必要进一步对猴头菇多肽的功能性进行研究，为后期的深精加工产品的生产及推广打下良好基础。

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活性研究 篇4

1原材料与方法

1.1材料与试剂

原料:毛竹叶于2009年5月采摘于西华大学第一教学楼后花园竹林。菌种:为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、,枯草芽孢杆菌(Bacillus subti)、,大肠杆菌(Escherichia coli),以上菌种均由西华大学生物工程学院微生物实验中心提供。实验所用试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

78-1C型磁力搅拌器(郑州市亚荣仪器有限公司)、ZN-200A型高速中药粉碎机(长沙市岳麓区中南制药机械厂)、Centrifuge5810R型低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、SFG-9075A型电热恒温干燥箱(上海一恒科技有限公司)、pHS-3C酸度计(成都世纪方舟科技有限公司)。

1.3试验方法

1.3.1毛竹叶多肽蛋白粗提物的制备

新鲜毛竹叶→清洗→干燥→打粉→浸提→盐析→透析→浓缩储备待用

将竹叶洗净,置于电热鼓风干燥箱35℃下杀青15 min,再调至65℃干燥24 h,用粉碎机将干燥的毛竹叶粉碎过40目筛保存备用。称取毛竹叶粉末50g,以竹叶粉:磷酸缓冲液=1:20的比例于冷柜中磁力搅拌器下搅拌24h。过滤后在8000 r/min冷冻离心20分钟,取上清液分别用30%和60%的梯度进行盐析,盐析悬浮液于8000 r/min冷冻离心20分钟,下层沉淀用缓冲液溶解后装于截留分子量3000D的透析袋置于磷酸缓冲外液中透析48h,浓缩后将提取物保存于4℃冰箱备用。

1.3.2毛竹叶多肽蛋白粗提物的抑菌实验

待测菌培养活化→制备菌悬液→制备平板培养基→涂布接种→滤纸片浸液→恒温培养→测定抑菌圈直径→结果分析

1.3.2.1牛肉膏蛋白胨培养基的制备。牛肉膏蛋白胨液体培养基和固体培养基按照周德庆著《微生物实验手册》提供的方法配制[6,7]。

1.3.2.2菌悬液的制备。以大肠杆菌为例,在无菌室中用接种环刮取适量的大肠杆菌于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上,37℃培养24 h,使菌种活化,然后将活化的大肠杆菌取一环接种于1.0 ml的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,37℃培养8h。取菌液0.1 ml于100 ml的小烧杯中,并加牛肉膏蛋白胨液体培养基至1000 ml充分搅拌,稀释1000倍,制成菌悬液[3,4,5,8,9]。

1.3.2.3抑菌作用测定法。采用滤纸片法测定抑菌作用[10]。用打孔器把滤纸打成直径7mm滤纸片,灭菌后分别在30%盐析多肽蛋白液、60%盐析多肽蛋白液中浸泡24h,将上述3种供试菌悬液各取0.2ml涂平板,制成含菌平板。分别将30%盐析多肽蛋白、60%盐析多肽蛋白提取液滤纸片贴在各含菌平板上,以无菌水浸泡的滤纸作为空白对照,滤纸片在每个平皿内间隔均匀的距离,沿皿壁方向环绕以等边三角形顶角位置,每皿三片,各滤纸间距离均等,每种处理重复三次。各平皿放入37℃恒温培养箱中培养24h[11,12,13]。培养完成后,取出,观察抑菌圈,用十字交叉法测量抑菌圈直径,取平均值。

2结果与分析

由图1、图2、图3三组对照图可以看出,在30%和60%饱和度盐析下的多肽蛋白对金黄色葡萄球菌、,枯草芽孢杆菌、,大肠杆菌三种菌种均有一定的抑制作用。

注:“——”表示无抑菌圈

综合表1和图4可以看出,在30%和60%饱和度盐析下的多肽蛋白对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌三种菌种均有很强的抑制作用,三种菌种中,对大肠杆菌的抑制作用最强,并且在60%饱和度盐析下的多肽蛋白比在30%饱和度盐析下的多肽蛋白抑菌能力更强。

3讨论与结论

观察实验现象,结合测量所得数据,对本实验盐析法浸提竹叶多肽蛋白进行定性分析,可以确定:本实验所提取到的竹叶多肽蛋白,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)的生长,有一定的抑制作用。对大肠杆菌抑制作用最强,其抑菌圈平均直径达到12.552mm和14.201mm;对枯草芽孢杆菌的抑制作用其次,其抑菌圈平均直径为9.025mm和10.210mm;金黄色葡萄球菌对此天然生物活性肽耐性最高,其抑菌圈平均直径仅为7.365mm和9.275mm。实验表明:无菌水对三种常见菌的生长均无明显抑制作用,可排除多肽蛋白液中无菌水对实验结果的影响。在60%(NH4)2SO4浓度下沉淀析出的多肽蛋白,其对三种细菌的生长抑制作用普遍高于在30%(NH4)2SO4浓度下沉淀析出的多肽蛋白。说明在60%(NH4)2SO4浓度下沉淀析出的多肽蛋白具有更强的抑菌生物活性。

活性炭微波辅助溶剂再生研究 篇5

活性炭微波辅助溶剂再生研究

摘要：采用微波辅助溶剂再生的方法,对吸附邻硝基苯酚的粒状活性炭的再生过程进行了研究.结果表明:当以乙醇为再生剂时,达吸附平衡的活性炭可在累计数分钟的.微波辐照下完成再生,再生率达96%以上.再生时,活性炭局部表面形成的“电弧”,使活性炭再生损失增加,但远低于传统热再生;比表面积、微孔容积和平均孔径增大,提高了再生炭的吸附和传质能力.作 者：韩永忠 谌伟艳 陈金龙 张全兴 HAN Yong-zhong CHEN Wei-yan CHEN Jin-long ZHANG Quan-xing 作者单位：污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京,210093期 刊：环境科学与技术 ISTICPKU Journal：ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY年，卷(期)：2006,29(8)分类号：X132关键词：硝基苯酚 活性炭 微波 再生

44种花卉抗氧化活性研究 篇6

关键词 花卉 ；自由基清除能力 ；还原力 ；多酚含量 ；黄酮含量

中图分类号 TS201.2 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.003

人体中的氧化还原代谢失调是自由基大量产生的主要途径，对人体健康产生负面影响。随着人民生活水平的日益提高，人们对食品的保健作用要求越来越高，希望其能代替药品来促进健康和防止衰老。添加抗氧化剂或自由基清除剂能有效抑制或缓解自由基对机体的不利影响[1]。因此，对药用植物抗氧化活性的研究也越来越多[2]。我国植物资源丰富，开发和利用花卉特别是花器官已是人们关注的热点。本实验通过比较44种花卉的抗氧化活性、還原力、多酚和黄酮含量，并分析二者之间的相关性，以筛选出活性好的花卉，为开发天然抗氧化剂提供依据，具有一定的理论价值与商业前景。

矿粉活性激发研究综述 篇7

矿渣是工业废弃物,在每年钢材高产的情况下,若将其弃之不顾,必然会占用大量的土地资源,造成环境污染。矿粉中含有成分与水泥熟料的成分十分相似。若将矿粉大量甚至完全替代水泥,不仅解决了矿渣本身带来的污染问题,还促进钢铁企业和水泥企业的转型升级。若钢铁企业将矿粉投入生产线,不仅能给企业增加效益,还能激发企业建设绿色钢厂的动力,为二氧化碳的减排作出贡献。若水泥企业转型开始生产矿粉,必能节约大量能源,保护大气环境,为我国发展循环经济作出贡献。

1 矿粉的活性来源

矿粉中含有大量的Ca O、Si O2和A2O3,这些成分的存在主要是因为矿渣的矿物组成有:钙长石、钙镁黄长石、钙铝黄长石和硅酸二钙。其中,钙镁黄长石、钙长石、钙铝黄长石的水硬性非常差,硅酸二钙在常温下水硬性也十分缓慢。矿渣晶体有以下两部分组成:一是不稳定的玻璃相,二是稳定的结晶相。玻璃相具有一定的活性,而结晶相不具有活性,所以可以认为矿粉的主要活性来源是矿渣中的玻璃体。

蒲心诚[1]研究发现矿渣中的玻璃体同时存在着两相状态,即硅相和钙相。硅相是非连续相,内部的粒子晶体大多数时候呈现出柱状或者球状,较为稳定;钙相是连续相,具有不稳定性,在碱性条件作用下易与水发生反应。所以矿粉中钙相越多,矿粉就越容易与水发生反应。此外,矿粉的活性除了与玻璃体中的钙相有关系外,还与玻璃体自身的结构有关系[2]。矿粉中的玻璃体含有Ca-O键、Si-O键和AlO键,其中比较稳定,这是因为Si-O键以四面体的形式而存在,而Ca-O键和Al-O键则不太稳定,三者之间的键能关系为:Si-O键>Al-O键>Ca-O键。键能越小,越容易遭到破坏,所以矿粉中含钙量越大,矿粉的活性就越大。

2 钢渣的活性激发

当矿粉中钙相含量很多时,矿粉的活性较大,但其与水反应却很缓慢,说明矿粉的活性是潜在的。矿粉能够在水中保持相对稳定,说明矿粉分子间的作用比水分子间的作用强,水不足以激发出矿粉的活性,所以必须采取辅助措施来激发矿粉的活性。目前常用的矿粉激发方法分为两类:物理激发和化学激发。其中物理激发可以分为机械激发和热力激发,化学激发则分为酸激发、碱激发和盐激发。

2.1 机械激发

对于同一种矿粉,矿粉越细,矿粉所表现出来的活性就越多,也就越容易与水发生反应。但是,当矿粉颗粒过于细小,会影响硬化体强度的发展。有研究表明,矿粉的最佳细度应控制在比表面积450~600 m2/kg。当矿粉的比表面积相同时,矿粉所表现出来的活性也不一定相同,此时矿粉的活性跟矿粉的粒径分布有关。当矿粉的粒径小于10μm时,矿粉所表现出的活性最高,但粉磨工艺只能将其研磨至10μm,再细便不可能了。矿粉中大多数活性成分的粒径大约在5~20μm之间,当矿粉粒径超过50μm时,矿粉只能作为微集料来使用[3]。因此,矿粉细度并不是唯一影响其外在活性的因素。

虽然粒径达到10μm的矿粉不能被磨得更细,但是增加矿粉的粉磨时间,依然会提高矿粉的外在活性。机械粉磨的过程中,矿粉微粒之间会相互碰撞挤压,可能会使得矿粉内部原有的原子排列出现变异,而这种变异的结构具有更高的能量且不稳定,这其实就是机械能转化为矿粉内能的过程。当这种变异结构的数量越多,矿粉所表现出来的外在活性就越高。因此,通过改善矿粉的粒径或者增加矿粉的研磨时间,矿粉的外在活性就能得到提高,但长时间的粉磨必然会消耗大量的能源,这不仅不经济,还有违发展绿色循环的初衷。

2.2 热力激发

热力激发也叫高温激发,通过提高矿粉水化反应所处的环境,来提高水化反应的速率。Zhou Huanhai研究发现,矿渣掺量为50%时,矿渣水泥在常温条件下发生水化反应,会出现两个放热峰:水泥反应加速期的放热峰和矿渣反应加速期的放热峰。两条放热峰的峰值与环境温度有关,温度越高峰值越大,且随着温度的提升,两条峰慢慢地趋于重合。F.Puertas将矿粉以95%的量替代水泥胶砂中的水泥,对比标准养护和蒸汽养护条件下的胶砂强度,发现蒸汽养护的胶砂强度更高,胶砂内部结构比较紧密。A.R.Brough以50%的矿粉替代水泥,研究了两种不同养护制度下的胶砂强度变化,先蒸汽养护后标准养护(总共养护28 d)的胶砂在前期强度增长很快,后期强度发展十分缓慢;最终强度也与标准养护28 d的胶砂强度相差不了多少。

其实,热力激发就是将外在的热能转化为矿粉内能的过程,在外在热力的作用下,矿粉微粒中玻璃体的Ca-O键和Al-O键会发生断裂,使得玻璃体解散,从而激发出矿粉的活性。

2.3 化学激发

化学激发是指采用酸、碱、盐等化学激发剂激发矿粉的活性。化学激发剂可以使矿粉中玻璃体解散,促使水化产物聚集在一起形成稳定的凝胶团结构,从而保证了水硬体的强度。

(1)酸激发

酸激发一般使用的是强酸激发剂,在拌制混凝土之前,使用强酸对矿粉进行预处理,将强酸和矿粉混在一起一段时间后,强酸会使得矿粉微粒结构变得疏松,从而激发出矿粉的活性。常用的酸性激发剂有HCl和H2SO4,经过处理后的矿粉一般含有:硅酸、氯化铁、氯化铝、硫酸铝、硫酸铁等,这些成分都有可能与水和水化产物发生反应,生成稳定的凝胶网络结构。但是矿物熟料生成的凝胶都只能在碱性条件下保持稳定,所以酸性激发剂只适合激发矿粉的早期活性。

在众多的酸性激发剂中,H2SO4的激发效果最好,H2SO4不仅能够改变矿粉微粒结构,还能够给水化反应体系提供SO42-,SO42-可以与水化产物C3A反应生成硫铝酸钙。但是H2SO4也不宜用量过多,SO42-会与水化产物产生大量的钙矾石,过量的钙矾石会引起体积安定性不良,使得硬化体内部产生裂缝,反而不利于强度的发展。另外,强酸的价格一般比较昂贵,会增加生产成本,所以一般在实际生产中不会选择强酸作为激发剂。

(2)碱激发

矿粉活性的激发需要碱环境作支撑,因为碱溶液中含有大量的氢氧根离子,氢氧根离子会使矿粉中的钙相解体,具体反应如下:

一般情况下,硅相存在于钙相之中,钙相随着氢氧根离子的增加会逐步分解完毕释放出硅相,此时,硅相便于氢氧根离子发生反应,反应式如下:

因为Si-O键的键能大于Ca-O键的键能,所以上述反应(1)将优先于后者发生。另外,硅相本身就很稳定,硅相的解散程度也没有钙相大。因此,矿粉水化反应前期主要钙相的解体,释放出来的硅相会逐步形成C-S-H凝胶。随着反应的进一步加深,硅相会发生(2)和(3)的反应,且反应比较缓慢,能保证后期强度的逐步提升。

蒲心诚[1]认为矿粉-水泥经历过碱激发后生成的C-S-H凝胶只有在特定的部位才是规则结构,大多数是不规则的,不规则的C-S-H凝胶面积比较大。C-S-H凝胶是主要的水化产物,其次要的水化产物与矿粉的化学组成、试块养护温度和激发剂的种类有关系。常温养护且不加激发剂时,次要的水化产物为:Ca(OH)2、C4AH13、C2ASH8和CS2H;当使用碱性激发剂时次要水化产物为:C4AH13、C2ASH8;当激发剂中含有硫酸根离子时,便会有AFt(即钙矾石)产生;当采用高温养护时,次要水化产物明显与常温时有差异,会有硬硅钙石、钠沸石等产生;当温度超过700℃时,会出现云母、黄长石等晶体。

Hubler[4]研究发现,经过碱激发的矿粉-水泥的水化产物在前期主要是C-S-H凝胶和氢氧化钙,后期主要为含碱金属的沸石类硅酸盐。

Darko[5]研究发现,矿粉-水泥经碱激发后,其水化产物C-S-H凝胶的钙硅比较低。若激发剂使用的是Na2SO3,则水硬体中含有低硫型水化硫铝酸钙的结晶相;当以75℃高温蒸养14 d后,水硬体中就没有低硫型水化硫铝酸钙的结晶相,并且结构密实。

M.Ben[6]将矿粉-水泥经碱激发后,水化产物外部为C-S-H凝胶,是粗大的层状结构。而内部水化产物既有C-S-H凝胶,又有含镁和铝的结晶物,结晶物垂直于水化物表面排列。外部C-S-H凝胶的钙硅比没有内部高,但铝硅比高于内部。

综上所述,矿粉-水泥经碱激发后水化产物一般含有低钙硅C-S-H凝胶、沸石类硅酸盐、铝相。其中铝相到底是由凝胶形式存在,还是结晶石的形态存在,目前尚无定论。另外,有研究者提出钠离子对矿渣的活性有一定的激发作用,因为钠离子带有正电荷,C-S-H凝胶会吸引钠离子以平衡电荷。

(3)盐激发

常用的盐类激发剂主要是一些强碱强酸盐,例如硫酸盐、氯盐等。

硫酸盐宜溶于水且在水中比较稳定,所以单纯的硫酸盐不能激发矿粉的活性,但由于矿粉的水化反应过程中会生成氢氧化钙使得溶液呈碱性,在碱性条件下硫酸盐才能显现出它的激发效果,所以硫酸盐对矿粉的激发能力是潜在的。在氢氧化钙中的氢氧根离子和硫酸盐中的硫酸根离子的共同作用下,矿粉微粒中的玻璃体会解体,生成新的水化物,新的水化物不断聚集直至形成稳定的网络结构,随后网络结构会不断增厚密实,最终形成坚硬的水硬体。

常用的氯盐激发剂有氯化钠和氯化钙,这两种激发剂均易溶于水,在水中电离出氯离子。因为氯离子的扩散能力很强,所以可以深入渗透到矿粉微粒的内部,与活性物质发生反应生成水化氯铝酸钙。此外,氯化钙还可能与氢氧化钙反应生成稳定的氧氯化钙,有利于水硬体系强度的发展。但氯盐一般还是不用于做矿粉混凝土的激发剂,因为大量的氯离子会引起钢筋锈蚀,影响混凝土的耐久性。

(4)复合激发

复合激发是指用以上几种激发方式或几种激发剂共同激发矿粉的活性。一般情况下,复合激发的效果优于单独激发的效果。王培铭[7]曾经用水玻璃、氢氧化钠和碳酸钠分别激发某种矿粉的活性,没有出现明显效果,但是当将三种激发剂复合共同激发矿粉的活性时,便有明显的效果。崔崇曾经采用了物理激发和化学激发相结合的方式,他先将矿粉磨得更细,然后使用碱激发和硫酸盐激发的方式,发现可以显著提高矿粉的活性,增加水硬体的强度。袁泽洋[8]曾经使用过三种激发剂进行复合激发,通过添加氧化钙、硫酸钠和半水石膏进行激发矿粉的活性,发现复合激发剂的引入增加了水化反应产物的种类,可以弥补单一激发剂的不足,能够最大限度地激发出矿粉的活性。一方面,氧化钙与水反应放热并生成了大量氢氧化钙,氢氧化钙本身就能够激发矿粉活性;另一方面,硫酸钠和半水石膏提供了大量的硫酸根离子,促进了单硫型水化硫铝酸钙的生成。

3 矿粉混凝土的抗氯离子渗透性研究现状

目前,针对掺加矿粉的混凝土,国内外学者也做了大量的的抗氯离子渗透性研研究。Zibara[9]和Arya[10]等曾经用矿渣取代部分水泥,将矿渣水泥净浆试件放在氯盐环境中,发现在混凝土中掺入矿粉有利于抵抗氯离子侵入。于震发现,混凝土中掺加矿粉后,混凝土的内部结构将会得到改善,比如混凝土的密实度较好,能够提高抗氯离子渗透性。当水胶比小于0.5时,高性能混凝土在掺加一定掺量的矿粉后,利用NEL法测得的氯离子比较低,抗氯离子渗透性随着矿粉掺量的增大而不断提高[11]。余红发等以矿粉的掺量为变量,研究了矿粉掺量与矿粉混凝土对氯离子的总结合能力、化学结合能力和物理结合能力的影响。结果表明,在矿粉和水泥的总量以及水胶比不变的情况下,随着矿粉掺量的不断增加,总结合能力和化学结合能力曲线先升高,当达到某一峰值后,又开始下降。但物理结合能力却与矿粉掺量几乎无关。Dhir等认为矿粉中含有比较多的铝相,铝相的存在有助于提高氯离子化学结合能力,容易生成Friedel’s盐。但Arya[10]等却认为掺加矿粉后可能提高了氯离子的物理结合能力,从而提高抗氯离子渗透性。此外,Xu[12]等发现矿粉水泥浆中的氯离子结合能力还可能与硫酸根离子的含量有关,当硫酸根离子的含量达到一定值时,氯离子结合能力会出现下降的现象。

4 发展趋势

矿粉得益于自身的优良性质,是理想的水泥替代品。目前,在实际工程中,矿粉的应用倾向于作为外加剂或者掺合料添加到混凝土中,用以改善混凝土的某一方面的性能。但用矿粉替代大量水泥甚至全部水泥的研究尚未成熟,未能应用到实际工程中。因此,在保证混凝土强度及综合性能特别是耐久性能的条件下,最大限度地用矿粉替代水泥应是矿粉混凝土未来发展的必然趋势。

参考文献

[1]蒲心诚.碱矿渣与水泥混凝土[M].北京:科学出版社,2010:18-21.

[2]徐彬,蒲心诚.矿渣玻璃体分相结构与矿渣水玻璃活性本质的关系探讨[J].硅酸盐学报,1997,25(6):728-733.

[3]周焕海,唐明述,吴学权.粒化高炉矿渣的细度对其水硬活性和浆体强度的影响[J].水泥·石灰,1993(1):2-4.

[4]Mija H.Hubler,Jeffrey J.Thomas.Influence of nucleation seeding on the hydration kinetics and compressive strength of alkali activated slag paste[J].Cement and Concrete Research,2011,41(8):842-846.

[5]Darko Krizan.Effects of dosage and modulus of water glass on early hydration of alkali-slag cements[J].Cement and Concrete Research,2002,32(8):1181-1188.

[6]M.Ben Haha.Influence of slag chemistry on the hydration of alkali-activated blast furnace slag[J].Cement and Concrete Research,2012,42(1):74-83.

[7]王培铭,金左培,张永明.碱矿渣胶凝材料复合激发剂的研究[C].第一届全国化学激发剂材料研讨会论文集.南京:南京工业大学出版社,2004:255-259.

[8]袁泽洋.高强蒸养混凝土中大掺量矿粉的化学激发研究[D].西安:西安建筑科技大学,2013.

[9]Zibara H.Binding of External chloride by cement pastes[D].Toronto:University of Toronto,2001.

[10]Arya C,Buenfeld N R,Newman J B.Factors influencingchloride-binding in concrete[J].Cement and Concrete Research,1990,20(2):291-300.

[11]于震.大掺量矿粉抗氯盐高性能混凝土试验研究[J].商品混凝土,2009,(5):33-37.

活性研究 篇8

1实验材料与仪器

1.1样品来源及鉴定

水芫花样品于2010年8月采自海南省西沙永兴岛, 经浙江海洋学院食品与医药学院海洋药物研究所所长曲有乐教授鉴定为千屈菜科水芫花属植物水芫花Pemphis acidula的枝茎, 凭证标本存放在浙江海洋学院海洋药物综合实验室 (海科楼108-2室) , 标本编号:水芫花20100809。

1.2试剂与仪器

试剂:无水乙醇 (国药集团化学试剂有限公司, 分析纯, 批号:20140121) 、石油醚 (国药集团化学试剂有限公司, 分析纯, 批号:20140115) 、氯仿 (国药集团化学试剂有限公司, 分析纯, 批号:20120810) 、乙酸乙酯 (国药集团化学试剂有限公司, 分析纯, 批号:20130428) 、丙酮 (国药集团化学试剂有限公司, 分析纯, 批号:T20060815) 、抗坏血酸 (国药集团化学试剂有限公司, 分析纯, 批号:20130801) 、铁氰化钾 (国药集团化学试剂有限公司, 分析纯, 批号:F20101214) 、氯化钠 (国药集团化学试剂有限公司, 分析纯, 批号:F20080310) 、Tris·HCL (国药集团化学试剂有限公司, 批号:20131212) 、营养琼脂 (国药集团化学试剂有限公司, 生化试剂, 批号:20111228) 、蛋白胨 (国药集团化学试剂有限公司, 生化试剂, 批号:F20101012) 、牛肉浸膏 (国药集团化学试剂有限公司, 生化试剂, 批号:20131212) 、红霉素软膏 (安徽新和成皖南药业有限公司, 批号:130709) 。

仪器:中药粉碎机 (DFY-400, 温岭市林大机械有限公司) 、超声波清洗机 (WF-180E, 宁波海曙五方超声波设备有限公司) 、旋转蒸发仪 (N-1100, 上海爱朗仪器有限公司) 、电子天平 (BSA323S, 赛多利斯科学仪器 (北京) 有限公司) 、冷冻干燥机 (FD-1E, 北京德天佑科技发展有限公司) 、低速离心机 (TD5K, 长沙东旺实验仪器有限公司) 、紫外分光光度计 (UV-1100, 上海美谱达仪器有限公司) 、超净台 (JB-CJ-1FXS, 苏州佳宝净化工程设备有限公司) 、恒温培养箱 (LHS-250HC, 上海慧泰仪器制造有限公司) 、全温培养摇床 (HZQ-B, 金坛市华城开元实验仪器厂) 、酶标仪 (SM800, 上海永创医疗器械有限公司) 。实验菌种:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血孤菌, 实验菌种均为浙江海洋学院食品与医药学院水产加工工程实验室提供。

1.3实验方法

1.3.1材料预处理

水芫花→粗粉→烘干→粉粹→过筛→保存备用。

1.3.2系统溶剂提取物的制备

取粉碎的水芫花粉末20g至500m L锥形瓶中, 依次加入各提取溶剂400m L, 在50℃, 80W功率条件下超声45min, 重复提取3次, 离心取上清液混合, 用旋转蒸发仪减压浓缩, 各浓缩液取液经减压浓缩得石油醚浸膏、氯仿浸膏、乙酸乙酯浸膏和水提浸膏, 将上述浸膏水浴挥干溶剂, 称量重量, 计算浸膏得率, 放干燥器保存备用[3]。

1.3.3不同溶剂提取物的体外抗氧化活性研究

1.3.3.1供试品和阳性对照品溶液的配制

准确称量0.25g各溶剂提取浸膏和Vc, 分别用无水乙醇溶解于50m L的容量瓶中, 经半量稀释法分别制备成6个浓度梯度的各样品溶液和Vc阳性对照品溶液, 浓度梯度分别为:5.000mg·m L-1、2.500mg·m L-1、1.250mg·m L-1、0.625mg·m L-1、0.313mg·m L-1、0.156mg·m L-1。

1.3.3.2对DPPH自由基清除率的测定[4]

用移液枪移取不同浓度的各供试品溶液1m L加入10m L离心管中, 再加1m L的320μmol·L-1的DPPH-乙醇溶液, 用无水乙醇稀释至4m L充分混匀, 常温下避光反应30min后, 在517nm处测吸光度A1, 以无水乙醇代替供试品溶液测量A0, 计算公式如下:

式中:A0-未加入抗氧化物质时测得的溶液平均吸光度值;

A0-加入抗氧化物质后测得的溶液平均吸光度值。

1.3.3.3对羟基自由基 (·OH) 清除率的测定

取10m L离心管分别加入6mmol·L-1Fe SO4溶液、6 mmol·L-1水杨酸溶液和供试品溶液各1m L, 混匀, 最后加入1m L 6 mmol·L-1H2O2启动反应, 常温下避光静置30min后于510nm处测定吸光度A1, 以蒸馏水和无水乙醇混合物代替供试品溶液测定A0[5,6]。羟基自由基清除率计算公式同上。

1.3.3.4对超氧阴离子自由基 (O2-·) 清除率的测定

操作顺序如下:取4.5m L Tris-HCl缓冲溶液 (p H=8.2) →25℃静置30min→加入1m L供试品溶液→加入0.4m L邻苯三酚溶液→混匀→30℃水浴5min→加入1m L 8mol/L Hcl→终止反应→299 nm测定吸光度A1、以0.1mol·L-1HAc代替供试品溶液测定A0[7]。按2.3.2项下公式计算清除率。

1.3.3.5还原能力的测定

用移液枪移取1m L各供试品溶液于10m L离心管中, 分别加入2.5m L的磷酸缓冲溶液 (p H=6.6) 和2.5m L 1%铁氰化钾溶液, 混匀, 于50℃水浴反应20min, 再加入2.5m L的10%三氯乙酸溶液, 混匀, 低速离心10min, 移取上清液、蒸馏水、0.1%Fe Cl3 (按上清液:蒸馏水:0.1%Fe Cl3=5:5:1) 于玻璃试管中常温反应5min, 于700nm处测定吸光度, 以吸光度大小来衡量各供试品的还原能力[8]。

1.3.4水芫花提取物抑菌活性研究

1.3.4.1菌悬液的制备

用接种环取少量细菌于装有50m L液体牛肉膏蛋白胨培养基中, 37℃下摇床培养24h, 涂布平板, 检测备用[9]。

1.3.4.2提取物抑菌活性测定

分别取不同溶剂萃取物, 用二甲亚砜溶解并稀释至质量浓度为100 mg·m L-1的样品溶液, 在每个直径为9cm培养皿中接种各菌液150μL, 将已灭菌的不烫手的营养琼脂倒平板, 与菌液混合均匀。待培养基完全凝固后, 用0.8cm打孔器在培养皿上等距离打三个孔, 除去孔内培养基。用移液枪往各孔内注入120μL的样品溶液, 空白对照组各孔内注入等量的二甲亚砜溶液, 各组均置37℃, 70%湿度条件下培养24 h, 十字交叉法测定抑菌圈直径[10,11]。

1.3.4.3光密度法测定不同提取物的最小抑菌浓度 (MIC)

根据2.4.2实验结果, 选择丙酮提取物、无水乙醇提取物和蒸馏水提取物3种极性较大的提取物, 进行抑菌率实验, 取一定量的质量浓度为100mg·m L-1的各提取物溶液 (用0.22μm滤膜除菌) , 与高压灭菌的肉汤液体培养基等体积混合, 半量稀释法制备浓度梯度如下的各样品:50mg·m L-1、25mg·m L-1、12.5mg·m L-1、6.25 mg·m L-1、3.125mg·m L-1、1.563mg·m L-1取10μL各菌悬液与200μL各样品溶液于96孔板混合, 以相同浓度的红霉素软膏溶液为阳性对照, 37℃培养24h, 以肉汤液体培养基和生理盐水混合液为空白调零, 测定样品在630nm处的吸光度值 (A样品) , 同时测定样品空白和对照组的吸光度值。样品空白 (A空白) 不加菌悬液, 其余条件相同;对照组 (A对照) 用生理盐水代替各提取物, 其余条件相同。每个样品平行3次, 计算各提取物的抑菌率[12~14]。计算公式如下:

2结果

2.1系统溶剂对水芫花的萃取率

见表1。

由表1可以看出不同极性的各溶剂对于水芫花提取率差异较大, 丙酮和无水乙醇对水芫花的提取率较高, 分别达11.92%和11.26%, 蒸馏水次之, 其次为氯仿和乙酸乙酯, 石油醚提取率最低, 提取率仅为2.11%。

2.2不同溶剂提取物的体外抗氧化活性

2.2.1各提取物对DPPH自由基的清除作用

见图1。

由图1可以看出, 各溶剂提取物对DPPH自由基的清除能力强弱不同, 在实验浓度范围内, 各提取物随着浓度的增加, 对DPPH自由基的清除能力也不断增强, 表现出较好的量效关系, 其中乙醇提取物、丙酮提取物和乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的能力较强和VC相近, 并且其浓度在达1.250mg·m L-1之前, 对于DPPH自由基的能力随浓度变化较大, 在浓度为1.250mg·m L-1~5.000mg·m L-1范围内, 对于DPPH自由基的能力随浓度略有变化但不明显;石醚和氯仿提取物对于DPPH自由基的能力较前面三者次之, 且对于DPPH自由基的能力随浓度变化略微平缓, 水提物清除DPPH自由基的能力最差, 随浓度变化趋势与石醚和氯仿提取物相近。

2.2.2各提取物对羟基自由基 (·OH) 的清除作用

见图2。

羟基自由基 (·OH) 是已知的最活泼的活性氧自由基, 也是毒性最大的自由基, 由图2可以看出, 各溶剂提取物对羟基自由基 (·OH) 均有一定的清除作用, 但与阳性对照Vc组相比差距较大, 各提取随浓度变化物对羟基自由基 (·OH) 清除率不断增加, 但变化趋势并不是太明显, 尤其是蒸馏水提取物对羟基自由基 (·OH) 清除率随浓度变化最为平缓, 各提取物乙醇和丙酮提取物对羟基自由基 (·OH) 的清除作用最大, 在实验浓度范围内分别达73.61%和69.23%, 氯仿提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物次之, 水提取物清除能力最差, 最大仅为28.75%。

2.2.3各提取物对超氧阴离子自由基 (O2-·) 的清除作用

见图3。

由图3可以看出, 各溶剂提取物对超氧阴离子自由基 (O2-·) 均有一定的清除作用, 但与VC相比有一定的差距, 各溶剂提取物对超氧阴离子自由基 (O2-·) 的清除率与浓度存在一定的量效关系, 且对超氧阴离子自由基 (O2-·) 清除率随浓度变化趋势及其相近, 在浓度达1.250mg·m L-1前, 对超氧阴离子自由基 (O2-·) 清除率随浓度变化较大, 之后变化趋势较为平缓。

2.2.4各提取物的还原能力

见图4。

由图4可以看出, 各溶剂提取物随浓度的不断增加, 还原力也显著增强, 表现出较好的量效关系, 且各变化曲线较为分散, 基本没有出现变化曲线交叉或重叠现象, 其中乙醇提取物和丙酮提取物还原能力最强, 且随浓度不断增加, OD值变化较大, 在浓度超过2.5mg·m L-1时与VC的还原能力相差不大;乙酸乙酯提取物还原能力较前两者次之, 但还原能力随浓度的变化趋势与其相近, 石油醚提取物、氯仿提取物、蒸馏水提取物还原能力随浓度的变化趋势交前面三者较为平缓;各溶剂提取物的还原能力大小依次为:乙醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>氯仿提取物>水提取物。

2.3水芫花提取物抑菌活性

2.3.1提取物抑菌活性

由图5可知, 各提取物对3种供试菌均有一定的抑制作用, 其中乙醇提取物、丙酮提取物对各供试菌的抑菌圈直径最大;水提取物与乙酸乙酯提取物的抑菌圈次之;乙酸乙酯提取物对副溶血孤菌的抑菌圈直径明显强于对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用;石油醚提取物和氯仿提取物对各供试菌的抑菌圈直径最小。

2.3.2不同提取物最低抑菌浓度 (MIC) 测定

见表2。

注:-表示没有抑菌作用。

由表2可知, 各提取物的抑菌活性明显小于阳性对照组, 各提取物对三种供试菌的抑制作用, 随浓度的降低而降低, 呈现良好的量效关系;同时可以看出, 丙酮提取物、无水乙醇提取物对于大肠杆菌的最小抑菌浓度在6.250~3.125mg·m L-1, 蒸馏水提取物对于大肠杆菌的最小抑菌浓度在6.250~3.125mg·m L-1;丙酮提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度在6.250~3.125mg·m L-1, 无水乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度<1.563mg·m L-1, 蒸馏水提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度在3.125~1.563mg·m L-1;同理可以看出, 丙酮提取物、无水乙醇提取物、蒸馏水提取物对副溶血孤菌的最小抑菌浓度分别为在3.125~1.563mg·m L-1、<1.563 mg·m L-1, <1.563mg·m L-1。

3讨论

活性研究 篇9

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)是一类由金黄色葡萄球菌产生的细菌超抗原蛋白质,此类蛋白质分子结构相关,序列具有高度同源性[1]。作为一类典型的细菌超抗原,SE在极低的浓度下便可激活体内大量的T淋巴细胞,释多种细胞因子,并对主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(MHCⅡ)阳性的肿瘤细胞产生毒性杀伤。因此SE已经被越来越多地应用于抗肿瘤研究中[2]。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)是肠毒素家族中特殊的一类,因其较好的免疫刺激活性和相对较低的毒性,已经广泛地应用于肿瘤的临床治疗并取得了一定的治疗效果。为了分析SEC2不同结构区域对其活性的影响,并进一步提高其成药性,作者实验室前期对野生型SEC2蛋白分子的氨基端和羧基端分别进行了截短改造。研究发现,截短SEC2的羧基端导致蛋白亲水性严重降低,不利于后续纯化,难以成药。而截短氨基端的蛋白SEC14-239,保持了较好的亲水性,利于成药,但其超抗原活性较野生型SEC2有所降低[3,4]。

已有报道结果对SEC2分子晶体的研究发现,分子中的α3到α5螺旋结构主要决定其超抗原活性,而氨基端α1和α2螺旋及羧基端β11和β12折叠并没有直接参与MHCⅡ或T细胞受体(TCR)的结合[5,6]。在SEC2的α3至α5结构域中,第20、22及26位氨基酸残基对于形成SEC1和SEC2的专一性抗原决定部位十分重要,并且这些氨基酸残基暴露于肠毒素分子表面可能参与了受体的结合[3,6]。王小刚等人将野生型SEC2中20和22位Thr和Gly分别替换为Leu和Glu后,突变蛋白的超抗原活性较野生型SEC2显著增强[7]。

因此,为得到一种分子量较小、可溶性好和超抗原活性高的改构SEC2分子,我们在前期的研究基础上通过基因工程技术对截短蛋白SEC14-239进行改造,利用基因工程方法将SEC14-239中7和9位Thr和Gly分别替换为Leu和Glu,构建一种截短突变蛋白SEC14-239M。体外生物活性分析结果显示,SEC14-239M的超抗原活性明显高于SEC14-239,这表明以定点突变的方式增强SEC2截短蛋白的活性是可行的。并且,SEC14-239M造成的刺激T细胞增殖活性和抑瘤活性增强的程度不同,暗示了超抗原诱导的T细胞增殖和肿瘤细胞抑制作用并不完全关联。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

产SEC2金黄色葡萄球菌0165菌株(CGMCC 0165)由沈阳协和生物制药股份有限公司提供;表达载体pET-28a为Invitrogen公司;小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞株由作者实验室保存[3];野生型 SEC2 蛋白纯品由作者实验室表达纯[8]; 6～8w龄雌性BABL/c小鼠购于辽宁长生生物技术有限公司。

1.1.2 试剂

T4 DNA连接酶为Takara大、Pyrobest DNA聚合酶、核酸限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ及DL2000 DNA分子量Marker均购自Takara大连公司;Ni-NTA亲和层析柱为Novagen公司产品;卡那霉素、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)均为Sigma公司产品;胰蛋白酶为北京索莱宝科技有限公司产品;RPMI-1640细胞培养基和胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品;胶回收试剂盒和Super-Bradford蛋白定量试剂盒和购自北京康为世纪生物科技有限公司;引物由上海生工生物工程技术服务公司合成;DNA测序由北京华大技术服务公司完成;其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 仪器

PTC-200型PCR仪(美国MJ Research公司);Soniprep 150型超声波破碎仪(日本SANYO公司);NJ-2100型酶标仪(美国InterMed公司);IM型倒置显微镜(日本Olympas公司);WJ-3型加湿CO2培养箱(日本Harasawa公司)。

1.1.4 培养基

细菌培养基:LB培养基;细胞培养基:加10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基。

1.2 方法

1.2.1 SEC14-239M表达载体的构建

接种含重组质粒pET-28-sec14-239的工程菌接种于LB液体培养基(含60 μg /ml 卡那霉素)37℃培养过夜,取适量的菌液按照质粒DNA提取试剂盒说明书提取包含有sec14-239 DNA片段的重组质粒pET-28-sec14-239。以质粒pET-28-sec14-239为模板,应用over-lap PCR技术构建获得含有突变位点的sec14-239m基因[7],使用引物见表1,端引物SEC2 F和SEC2R由作者实验室前期设计[4]。将经over-lap PCR构建得到的sec14-239m基因片段经切胶纯化后用EcoRⅠ 和XhoⅠ内切酶进行双酶切,与经同样酶切处理的表达载体pET-28a进行过夜连接,所得连接产物转化感受态细胞 BL21(DE3),LB平板(含60μg/ml卡那霉素)筛选阳性克隆,并将阳性克隆测序。

a氨基酸替换情况;b下划线部分代表氨基酸替换位点。a Amino acid substitution;b The substituted amino acids are indicated underlined.

1.2.2 SEC14-239M蛋白的表达纯化

将测序正确的阳性克隆菌E.coli BL21(DE3)接种于LB液体培养基中(含60 μg/ml 卡那霉素),37℃继续培养到菌液OD600约为0.6时,按体积比为1:1 000加浓度为1mol/L 的IPTG,并30℃诱导表达4h。菌液于5 000r/min 离心10min收集菌体,菌体重悬于平衡缓冲液(10mmol/L imidazole,500mmol/L NaCl,50m mol/L NaH2PO4,pH 8.0)中超声破碎,至菌液清亮后10 000r/min离心25min收集上清。上清通过 Ni亲和层析纯化获得SEC14-239M蛋白纯品,于透析液(PBS缓冲液,pH 7.4)中充分透析除盐,收集纯化蛋白,并以SDS-PAGE分析其纯度。纯化后的蛋白按照Super-Bradford蛋白定量试剂盒测定方法测定蛋白浓度。过滤除菌后保存于-70°C待用。

1.2.3 体外诱导小鼠脾细胞增殖活性的检测

6～8w龄的实验小鼠劲椎脱臼处死,75%酒精浸泡消毒min,取脾脏、研磨于200目钢丝网过滤,1 000r/min离心10min离心弃上清。加入无菌红细胞裂解液(Tri-NH4Cl溶液)裂解红细胞,用RPMI 1640 培养液洗涤,离心收集细胞。用RPMI 1640培养液(含10% 胎牛血清)调整细胞密度为1×107个/mL。以100μl /孔加入96孔细胞培养板中。经梯度稀释后的SEC14-239、SEC14-239M蛋白及野生型SEC2以100 mL/孔加入上述各孔,使终浓度分别为10ng/ml、100ng/ml和1 000ng /ml。以10%胎牛血清的RPMI 1640培养基做阴性对照,每个蛋白浓度3次重复。

将上述培养板在37℃、5% CO2 条件下培养72h。待到达培养时间后,向各孔中加无菌的MTT溶液(5mg/ml),孵育4h,离心弃上清,以120μl/孔加 DMSO并在室温振荡10min溶解结晶颗粒。通过酶标仪以测定波长570nm和参比波长630nm 测定各实验孔的吸光值(OD)。计算细胞增殖能力,以增殖指数(proliferation index,PI) 表示:PI =试验组OD值/阴性对照组OD值

1.2.4 体外抗肿瘤活性的测定

将脾淋巴细胞和小鼠肝癌细胞Hepa1-6以20:1的效靶混合(细胞浓度分别为5×105 个/孔和2.5×104个/孔)接种到96孔培养板,每种蛋白分别以不同浓度加入96孔培养板,体积最终为200μl/孔。同时做本底释放组(加入与实验孔相同量的淋巴细胞和蛋白样品),肿瘤细胞对照组(仅加Hepa1-6肿瘤细胞) 及空白对照组(仅加RPMI 1640)。同样方法以牛血清白蛋白(BSA) 为阴性对照,每样3次重复。将96孔细胞培养板置于37℃、 5% CO2 的细胞培养箱中培养72h,然后向各实验孔中加入30μl无菌的MTT溶液(5mg/ml),连续孵育4h,将培养板离心弃上清,以120μl/孔加 DMSO并在室温振荡10min溶解结晶颗粒。

用酶标测定仪于570nm处测定吸光值,蛋白抑制肿瘤生长程度以肿瘤生长抑制率表示。

肿瘤生长抑制率(Tumor growth inhibition %) = 100-[(试验组-本底释放组)/(肿瘤细胞对照组-空白对照组)]× 100。

2 结果与分析

2.1 SEC14-239M蛋白的构建及表达纯化

为了将SEC14-239蛋白的7和9位Thr和Gly分别替换为Leu和Glu,构建SEC14-239M蛋白。本研究先通过PCR技术构建获得了sec14-239m基因片段,并连接表达载体pET-28a,最终构建了含有编码SEC14-239M蛋白基因sec14-239m的重组表达质粒pET-28-sec14-239m。

重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,用含有卡那霉素抗性培养基筛选和DNA测序,最终确认获得正确的阳性克隆,用于SEC14-239M的表达纯化。纯化后的蛋白经过15%SDS-PAGE电泳检测纯度达到95%以上(图1),可用于后续实验。

1,SEC2;2,SEC14-239M;3,SEC14-239。

M,protein molecular weight standards;Lane 1,SEC2;Lane 2,SEC14-239M;Lane 3,SEC14-239.

2.2 体外刺激小鼠脾淋巴细胞活性检测

用MTT法检测各蛋白刺激小鼠脾淋巴细胞增殖能力。研究结果显示,SEC2、SEC14-239M和SEC14-239都可以在体外剂量依赖性的诱导淋巴细胞的增值。蛋白SEC14-239M的刺激T细胞增值能力较SEC14-239显著增强(P<0.05,图2),尽管弱于野生型SEC2,但与SEC2相比没有显著性差异(P>0.05)。结果初步说明通过替换SEC14-239中7和9位氨基酸残基而构建成的SEC14-239M蛋白,其超抗原活性有显著提高。

2.3 体外抑瘤活性

本实验以小鼠脾淋巴细胞和小鼠肝癌细胞Hepa1-6分别作为效应细胞和靶细胞(效靶比为20:1),检测各蛋白在体外诱导淋巴细胞对肿瘤细胞生长的抑制活性。研究结果显示,与阴性对照BSA相比,SEC2、SEC14-239M和SEC14-239均能诱导显著的抑制肿瘤细胞生长活性(P<0.01),并且呈剂量依赖性(图3)。同等剂量条件下,与SEC14-239相比,SEC14-239M的肿瘤细胞抑制活性显著提高(P<0.05),但也显著低于野生型SEC2(P<0.01),进一步说明7和9位氨基酸的定点替换增强了SEC14-239M的超抗原活性,尽管与野生型SEC2完整分子相比仍有显著差异。

3 讨论

Turner T N等人研究发现,SEC1中第20位的Leu和22位的Glu对SEC1与TCR的结合可能起到决定性的作用。而SEC2的第20位和22位氨基酸分别为Thr和Gly,这可能是导致SEC1较 SEC2超抗原活性高的主要原因[9,10]。

Bohach G A等人发现删除SEC1氨基端的1～13位氨基酸残基并不影响其T细胞刺激能力,而进一步的删除则导致SEC1活性的显著降低[11]。在此文献基础上,周隽逸等人利用基因工程技术对SEC2蛋白的氨基端和羧基端分别进行了删除改造。结果显示,截短SEC2的羧基端会导致蛋白的亲水性严重降低,不利于后续纯化,成药性很低。而截短氨基端的蛋白SEC14-239,保持了较好的亲水性,具有相当的可溶性表达能力,但其超抗原活性较野生型SEC2有所降低。主要原因可能是氨基端1～13位的截短影响了与之相邻的α3-螺旋的空间构象,使其发生改变,而α3-螺旋对于SEC2与TCR的结合起关键作用,该区域的结构变化导致SEC2结合TCR的能力降低,进而影响其超抗原活性[3]。

我们推测,增强SEC14-239的TCR结合能力将能够提高其超抗原活性。结合文献报导和前期研究基础,本研究中,我们将SEC14-239的第7位Thr和第9位Gly(即野生型SEC2中的20位Thr和22位的Gly)分别替换为Leu和Glu,得到截短突变蛋白SEC14-239M。生物学活性检测结果表明,SEC14-239M刺激T细胞的增殖能力和抑瘤活性均高于SEC14-239。这与文献报道的研究结果相似,证明通过定点突变技术来增强超抗原活性的方法同样适用于截短后的小型化蛋白。

同时,我们发现虽然SEC14-239M刺激T细胞增殖活性和野生型SEC2相当,但是前者的抑瘤活性却显著低于后者,这暗示了超抗原蛋白刺激T细胞增殖和诱导肿瘤细胞抑制并不完全关联。在T细胞增殖中,起决定作用的T细胞亚群主要为CD4+T细胞,增殖同时伴随大量细胞因子的释放[12]。而在超抗原诱导的肿瘤细胞抑制中,起主要作用的除了CD4+T细胞诱导的细胞因子作用外,还有CD8+T细胞介导的细胞毒性作用。通过CD8+T细胞介导的细胞毒性作用,超抗原可以实现对MHCⅡ阳性的肿瘤细胞产生毒性杀伤[13,14]。我们推测,尽管被删除的1～13位氨基酸不存在已经报道的MHCⅡ分子结合区域,但截短蛋白SEC14-239的MHCⅡ结合能力还是受到一定影响。SEC14-239M较SEC14-239相比,虽然增强了对TCR的结合能力,诱导激活了大量的CD4+T细胞,导致细胞增殖,但是并未增强与MHCⅡ分子的结合能力,因此在体外抑瘤实验中显示出低于野生型SEC2的结果。以上假设还需进一步的研究进行验证。

摘要：目的:分析金黄色葡萄球菌肠毒素C2的截短蛋白SEC14-239中7和9位氨基酸对其超抗原和抗肿瘤活性的影响。方法:利用基因工程方法将SEC14-239中7和9位Thr和Gly分别替换为Leu和Glu后,获得截短突变蛋白SEC14-239M。体外细胞学实验对其超抗原活性和抗肿瘤活性进行分析。结果:突变蛋白SEC14-239M体外刺激小鼠T细胞增值活性较SEC14-239显著增强(P<0.05),与未截短的SEC2相当(P>0.05)。在相同剂量条件下,SEC14-239M诱导的抗肿瘤活性尽管低于SEC2(P<0.01),但要显著高于SEC14-239(P<0.05)。结论:截短蛋白SEC14-239的第7和9位氨基酸突变后能显著增强其超抗原活性和抗肿瘤活性,但二者增强程度有差异。这一结果说明以定点突变改造SEC2截短体的活性是可行的,同时也暗示超抗原的T细胞增殖和诱导肿瘤细胞抑制并不完全关联。

煤矸石煅烧活性的研究 篇10

1 实验原料与方法

1.1 实验原材料

采用七台河地区的煤矸石作为实验原料, 其化学成分:SiO2为50%～55%, Al2O3为25%～30%, CaO为5%～10%, SO3为0.2%～7%。SiO2在橡胶中起增量补强作用, 可部分代替炭黑、白炭黑;Al2O3和CaO在橡胶中起增量作用, 可代替特种碳酸钙。

1.2 试样的制备

按一定方法[2]进行采样、缩分后, 首先将煤矸石粉碎至320目, 然后再用空气射流粉碎机进行超细粉碎, 初步制得样品。根据李永峰[3]等人的研究结果, 煤矸石的相变温度为518℃、610℃、952℃和982℃, 因此实验设计了3个煤矸石的煅烧热处理活化温度, 分别为500℃、700℃和1000℃, 经灼烧后得3个试样。

1.3 实验方法

对试样进行X射线 (XRD) 、扫描电子显微镜 (SEM) 和红外吸收光谱 (IR) 分析, 了解经不同温度煅烧后的矿物组成。

2 实验结果及讨论

2.1 煤矸石煅烧过程中的组成及结构变化

不同煅烧温度下煤矸石的XRD图见图1、图2和图3。从图中可以看出, 700℃煅烧煤矸石与500℃煅烧煤矸石样相比, 发生了以下变化:石英的衍射峰 (d=2.2046nm) 强度明显增加, 这可能是因为煤矸石中残留炭的燃烧, 生成了无定形的SiO2, 造成了石英含量相对提高;另一种高岭石的衍射峰 (d=2.5420nm) 逐渐消失, 这可能是因为矿物中的结构水脱出, 晶体结构受到了严重破坏, 形成结晶度很差的非晶态相, 高岭石向偏高岭石转变。随着温度的升高, 高岭石的衍射峰进一步下降;在1000℃条件下煅烧的煤矸石中已无明显高岭石衍射峰, 说明高岭石的结构已被完全破坏, 石英的衍射峰强度也下降, 说明石英的结构也开始遭到破坏。所以在选择煤矸石煅烧温度时可以选择700℃。

2.2 SEM分析结果

为了进一步了解煤矸石煅烧过程中的结构变化, 利用SEM来测定煅烧前后煤矸石的微观结构, 如图4、图5所示。从图中可以看出, 未煅烧煤矸石的结构比较致密, 而经700℃煅烧后的煤矸石则比较松散。这是由于在煅烧过程中伴有成分挥发、结构膨胀, 使煅烧后的煤矸石多微孔、多断键、多可溶物 (如SiO2、Al2O3) 、内能更高。经实验, 发现700℃煅烧的煤矸石力学性能最佳。

2.3 红外光谱分析

红外吸收光谱 (IR) 是研究物质成分和物质结构的有效测试手段。实验采用法国塞来斯生产的Arid-zone TM型傅立叶变换红外光谱仪分析不同温度下所煅烧煤矸石的成分变化情况, 结果见图6、图7、图8。从图中可以看出, 三种煅烧煤矸石在3600cm-1附近均有吸收峰, 而700℃和1000℃条件下煅烧后的煤矸石在该处的O-H键伸缩振动吸收峰已经消失, 说明煤矸石在700℃之前已经脱去烃基、发生了相变。

煅烧是激发活性的一种有效手段, 旨在利用高温下煤矸石微观结构中各微粒产生剧烈的热运动, 脱去矿物中的结合水, 使钙、镁、铁等阳离子重新选择填隙位置, 使硅氧四面体和铝氧三角体不能充分地聚合成长链, 质点无法再按照一定规律排列, 形成处于热力学不稳定状态玻璃相结构, 从而使烧后的煤矸石中含有大量的活性氧化硅和氧化铝, 达到活化的目的。

从结构上看, 煤矸石中的高岭石是由硅氧四面体和铝氧八面体构成的1∶1型层状硅酸盐类矿物, 层间以氢键结合, 无水分子和离子。当温度在700℃附近时, 高岭石开始脱去羟基, 脱羟基后仍然保持原有的层状结构, 但原子间已发生很大的错位, 开始向偏高岭石转变[4,5]。偏高岭石中原子排列不规则, 呈现热力学介稳状态, 是一种具有火山灰活性的矿物。从红外光谱分析也可以验证X射线分析的偏高岭石的生成。

3 结 论

(1) 煤矸石煅烧后产生的偏高岭石是煤矸石活性的来源。煅烧可以破坏煤矸石的结构, 形成具有活性的SiO2。

(2) 经测试不同温度下煤矸石样添加橡胶中的力学性能, 发现700℃为最佳煅烧活化温度。

摘要：采用X射线衍射 (XRD) 、扫描电镜 (SEM) 、红外光谱 (IR) 等分析方法研究了不同温度煅烧后煤矸石的活化情况;结果表明:经过一定温度的煅烧后, 煤矸石的矿物组成和微观结构都发生了较大的变化, 从而活性也得到明显改善。

关键词：煤矸石,煅烧,活性研究

参考文献

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