丝氨酸蛋白酶A1（精选八篇）
丝氨酸蛋白酶A1 篇1
1资料与方法
1.1临床资料选取2013年1-12月在我院心内科住院治疗的140例老年男性冠心病患者为冠心病组, 平均年龄 (72.48±8.52) 岁, 其中稳定型心绞痛 (SAP) 53例, 不稳定型心绞痛 (UAP) 50例, 急性心肌梗死 (AMI) 37例。对照组为2013年在我院体检的140例健康老年男性, 平均年龄 (71.97±6.16) 岁。
1.2纳入标准 (1) 经冠脉造影示冠脉狭窄≥50%的确诊冠心病患者; (2) 所有患者均排除近期 (2周内) 存在感染性疾病、手术、创伤、心肌炎、心肌病、心内膜炎、风湿性心脏病、自身免疫性疾病、肿瘤及严重的肝、肾疾病, 所有受检者近期均排除服用可能影响Hcy的药物如抗癫痫药物、甲氨蝶呤、多种维生素等。
1.3检测方法所有受检者均禁食12h, 次日清晨空腹静脉采血5ml, 分离血浆, 用美国Beackman AU680生化仪酶法测定同型半胱氨酸 (Hcy) 、尿酸 (UA) 、总胆固醇 (TC) 、甘油三酯 (TG) 、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 、载脂蛋白A1 (ApoA1) 、载脂蛋白B100 (ApoB100) 。
1.4统计学方法采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 两个样本均数间的比较采用t检验, 多组间比较采用ANOVA分析, 两两比较采用LSD检验, 各指标间的相关性分析采用Spearman相关分析, 影响冠心病的因素采用多元回归分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1冠心病组与对照组各项指标水平比较冠心病组Hcy、UA、TC、TG、LDL-C、ApoB100、ApoB/A1等各项生化指标均高于对照组, HDL-C、ApoA1低于对照组, P<0.05, 差异有统计学意义。见表1。
注:与对照组比较, *P<0.05。
2.2冠心病各亚组Hcy等指标比较AMI组较UAP组、UAP组较SAP组Hcy、UA、TC、TG、LDL-C、ApoB100、ApoB/A1明显增高, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。SAP组、UAP组、AMI组两两比较Hcy、ApoB/A1 等指标间存在显著差异性 (P<0.01) 。见表2。
注:与SAP组比较, *P<0.01;与UAP组比较, #P<0.01。
2.3各指标间相关性分析各指标测定值与冠心病病变程度经Spearman相关分析, 发现冠心病病变程度与Hcy、TC、LDL-C、ApoB100、ApoB/A1 呈显著正相关 (P<0.01) 。见表3。
2.4影响冠心病的因素以冠心病为因变量, 以Hcy、血脂、尿酸等观察指标为自变量, 进行多元逐步回归分析, 结果发现Hcy、ApoB100、ApoB/A1为冠心病独立预测因素 (P<0.01) 。
3讨论
冠心病是世界范围内首位死亡原因, 我国近年来冠心病死亡率呈增长趋势, 随着老年人口比例增加, 老年冠心病患者在住院患者中所占比例逐年升高。Hcy是人体内的一种含硫氨基酸, 由蛋氨酸去甲基化而来, 是蛋氨酸分解过程中产生的中间产物。Hcy水平升高被认为是冠心病的危险因素[3]。Hcy作为炎性因子参与动脉粥样硬化等血管慢性炎症和血管损伤的早期发病[4]。Hcy引发冠心病的主要机制包括内皮功能紊乱、平滑肌细胞增殖、促进凝血的发生及脂质氧化等因素[5]。本研究检测冠心病患者Hcy水平明显高于健康对照组, 在冠心病亚组中发现急性心肌梗死组高于不稳定型心绞痛组, 不稳定型心绞痛组高于稳定型心绞痛组, 组间比较有显著差异, Hcy与冠心病病变程度呈正相关, 可预测冠心病病变的严重程度, 这与文献报道一致[6]。通过逐步回归分析发现Hcy是冠心病独立预测因素。Hcy可以作为诊断及预测冠心病的指标。因此, 积极干预患者Hcy水平, 对于冠心病的防治有重要作用。
冠心病与血脂存在着密切关系, 高脂血症在动脉粥样硬化的发生和发展方面起着重要的作用。载脂蛋白是血浆中各种脂蛋白的蛋白质部分, 主要分A、B、C、D、E五类, 基本功能是运载脂类物质及稳定脂蛋白的结构, 激活脂蛋白代谢酶、识别受体, 在脂蛋白代谢上发挥极为重要的作用。ApoA1为HDL-C主要蛋白, 本研究发现冠心病组ApoA1水平低于对照组, 与冠心病发生危险性呈负相关。ApoB为LDL-C主要蛋白, 包括ApoB48和ApoB100, 由肝脏合成。ApoB100代表循环中有致动脉粥样硬化作用的脂蛋白[1]。ApoB100的生理作用: (1) 参与肝脏富含甘油三酯的VLDL的合成、装配和分泌; (2) 是VLDL、IDL和LDL的结构蛋白, 参与脂质转运; (3) 参与LDL的清除。当高甘油三酯血症时, 极低密度脂蛋白增高, 小而致密的低密度脂蛋白增高, ApoB含量较多而胆固醇较少, 出现LDL-C虽然不高, 但血清ApoB增高的所谓以ApoB浓度代表致动脉粥样硬化性脂蛋白的总和, 故对急性冠脉事件危险性的预测价值优于胆固醇和低密度脂蛋白[7]。ApoB/A1是独立的最好的脂蛋白相关风险预测值。Xu W[8]等人研究发现ApoB/A1 能更好的预测冠心病风险。ApoB/A1值越高, 胆固醇越有可能储存于动脉管壁上, 从而诱发动脉粥样硬化形成[9]。Sarah Parish[10]等人对3510例急性心肌梗死患者ApoB、ApoA1、LDL-C、HDL-C等因素进行相关分析, 发现ApoB/A1值与发生急性心肌梗死的相对风险有强的正相关性。 本研究冠心病组ApoB100 水平、ApoB/A1均高于对照组, 且急性心肌梗死组水平高于不稳定型心绞痛组, 高于稳定型心绞痛组, ApoB100、ApoB/A1与冠心病发生危险性呈明显正相关, 检测ApoB100、ApoB/A1 可以预测冠心病病变程度, 且ApoB100、ApoB/A1 为冠心病独立预测因素。
本研究还发现UA、TC、TG、LDL-C冠心病组高于对照组, 且与冠心病病变严重程度正相关, 为冠心病发生发展危险因素, 但不是独立危险因素, 而HDL-C、ApoA1冠心病组低于对照组, 为冠心病保护因子。本研究不足之处在于为回顾性研究, 未对所研究的冠心病患者高同型半胱氨酸及高ApoB/A1值进行干预治疗做后续研究, 需要更深入的研究分析。
综上所述, 联合检测Hcy、ApoB100 及ApoB/A1更有利于冠心病病变程度的预测, 若能及早降低它们的浓度, 将延缓动脉粥样硬化的进展, 有效地预防冠心病的发生发展。
摘要：目的:探讨同型半胱氨酸、载脂蛋白B/A1等因素与冠心病的相关性及与冠心病严重程度的关系。方法:140例老年男性冠心病患者, 按病变程度分为稳定型心绞痛 (SAP, 53例) 、不稳定型心绞痛 (UAP, 50例) 、急性心肌梗死 (AMI, 37例) , 与同期健康体检老年男性140例作对照, 检测各组同型半胱氨酸 (Hcy) 、胆固醇 (TC) 、甘油三酯 (TG) 、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 、载脂蛋白A1 (ApoA1) 、载脂蛋白B100 (ApoB100) 、载脂蛋白B/A1 (ApoB/A1) , 分析其与冠心病及冠心病病变程度相关性。结果:冠心病组Hcy、UA、TC、TG、LDL-C、ApoB100、ApoB/A1等各项生化指标均高于对照组, HDL-C、ApoA1低于对照组 (P<0.05) ;冠心病各亚组Hcy等指标进行比较, AMI组较UAP组、UAP组较SAP组Hcy、UA、TC、TG、LDL-C、ApoB100、ApoB/A1明显增高 (P<0.01) 。SAP组、UAP组、AMI组两两比较Hcy等指标间存在显著差异性 (P<0.01) ;Spearman相关分析示冠心病病变程度与Hcy、TC、LDL-C、ApoB100、ApoB/A1呈显著正相关 (P<0.01) ;多元逐步回归分析显示Hcy、ApoB100、ApoB/A1为冠心病独立预测因素 (P<0.01) 。结论:Hcy、UA、TC、TG、LDL-C、ApoB100、ApoB/A1随冠状动脉病变程度增加呈升高趋势, Hcy、ApoB100、ApoB/A1为冠心病独立危险因素, 联合检测这三个指标可预测冠状动脉病变的严重程度。
关键词：冠状动脉粥样硬化性心脏病,同型半胱氨酸,载脂蛋白,B/A1
参考文献
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丝氨酸蛋白酶A1 篇2
关键词：白玉菇；低温处理；丝氨酸蛋白酶；Spr基因表达；分子特征
中图分类号： S646.909+.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0270-03
白玉菇味比平菇鲜，肉比滑菇厚，质比香菇韧，口感极佳，还具有独特的蟹香味。白玉菇的蛋白质中氨基酸种类齐全，包括8种人体必需氨基酸，其菇体洁白如玉，质地细腻，是一种低热量、低脂肪的保健食品[1]。
在食用菌贮藏过程中，会受到温度、水分、采收时期、气体环境、病原菌感染及有氧呼吸等的影响而出现失重、菌柄生长、菌伞开张、菌褶发育、菌盖伸展、孢子形成与弹射、纤维素化、组织呈水浸状、褐变以及品质下降等现象[2]，这些症状的产生与食用菌的生理代谢及其分子机理密切相关。食用菌储藏过程中，蛋白质的降解会引起细胞结构及生理功能的变化，还会引起氨基酸含量的升高，正是氨基酸含量及组成的变化造成了食用菌风味的变化[3]。丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要蛋白水解酶，广泛分布于植物中，在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用[4-5]。目前已经从芫荽、欧芹、双孢菇等植物中分离到了不同类型的丝氨酸蛋白酶，其活性随着植物生长发育阶段的不同而变化。Azeez等研究发现，在唐菖蒲的衰老过程中丝氨酸蛋白酶的活性不断提高[6]；Roberts等采用蛋白酶单一抑制剂的检测方法在衰老的大麦叶片中和暗诱导衰老的大麦叶片中发现2种丝氨酸蛋白酶[7]。多种植物的衰老过程都与丝氨酸蛋白酶活性的不断提高相关，如大麦、鸢尾、欧芹、月季、木樨和双孢菇等[4-11]。
为延长白玉菇的货架期，本研究对其进行低温处理，并研究在贮藏过程中丝氨酸蛋白酶活性及分子特征的变化。通过对白玉菇丝氨酸蛋白酶活性的测定及Spr基因表达的研究，不仅有助于揭示白玉菇采后品质变化的分子机制，并可为调控白玉菇采后保鲜提供新途径。
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料来自当地超市刚刚上架的白玉菇，并在1 h内拿到实验室，选择没有机械损伤、疾病以及形状、颜色均匀的作为试验材料（图1-a）。试验材料分为2组，每组10个，一组放在4 ℃冰箱，另一组常温放置（25～28 ℃）；分别放置 5 d，每组3次重复。每组的3个重复每天分别取样（菌柄、菌盖、菌褶）后立即用液氮速冻，-80 ℃保存备用。
1.2试验方法
1.2.1丝氨酸蛋白酶活性的测定白玉菇丝氨酸蛋白酶活性的测定具体步骤参照丝氨酸蛋白酶（PRSS）ELISA试剂盒说明。
1.2.2基因组DNA提取采用改良的CTAB-氯仿-异戊醇法进行白玉菇基因组DNA提取[12]。
1.2.3总RNA的提取及cDNA的合成本试验提取RNA所用的离心管、枪头等塑料用品先用0.1%的DEPC水浸泡12 h，再高压蒸汽灭菌20 min（120～126 ℃），烘干。研钵、研棒用三氯甲烷浸泡2 h，用干净手套装好并放入80 ℃烘箱中2 h，烘干。具体步骤参照BioFlux RNA提取试剂盒说明。
取1 μL RNA，加入2 μL溴酚蓝，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现28S、18S 2条带，说明RNA完整，5S带有时也会出现。28S带的浓度是18S带的2倍，说明RNA质量很好（图2）。第1链cDNA合成的具体步骤参照TaKaRa提取试剂盒说明。
1.2.4实时荧光定量PCR（qRT-PCR）用DNASTAR软件设计特异引物ActinF、ActinR、SprF、SprR（表1）。PCR反应体系（25 μL）参照TaKaRa RT-PCR反应体系说明书。在Bio-Rad荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR，PCR反应程
序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。每个样品3次重复，Actin基因为表达分析内标参照，使用2-ΔΔCT法计算待测基因相对表达量，用Excel 2003整理试验数据并作图。
表1特异引物名称及信息
引物碱基序列（5′→3′）ActinFTACTCCGTCTGGATTGGTGActinRGACTCGTCGTATTCTTGCTTSprFGCAAGCGCAGATGGAAATGGACASprRCTGGCGCCGACCGTGATGACT
2结果与分析
2.1白玉菇货架期
白玉菇在低温（4 ℃）处理下可保鲜5 d；在常温（25～28 ℃）下保鲜时间则很短，为1～2 d（图1-c），之后出现菌伞开张、组织失水、褐变及营养物质流失等现象。
2.2丝氨酸蛋白酶的活性
由图3可知，白玉菇在常温贮藏过程中，丝氨酸蛋白酶的活性与贮藏0 d相比，一直处于上升趋势并在贮藏4 d升到最高，之后又下降；在低温贮藏过程中，丝氨酸蛋白酶的活性一直处于下降趋势，直到在贮藏5 d时降到最低点。另外，在整个贮藏过程中，常温处理下白玉菇丝氨酸蛋白酶的活性明显高于低温处理，可见低温处理可以抑制丝氨酸蛋白酶的活性。
2.3丝氨酸蛋白酶基因的表达
应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明，丝氨酸蛋白酶基因在贮藏0 d的白玉菇菌柄中的表达量最大，其次是菌盖，菌褶中的表达量最低（图4）。丝氨酸蛋白酶基因在常温贮藏5 d的白玉菇菌柄中的表达量最大，在菌盖、菌褶中的表达量很低；在低温贮藏5 d的白玉菇菌柄中有少量表达，在菌盖、菌褶中不表达（图5）。丝氨酸蛋白酶基因在常温贮藏的白玉菇菌柄中的表达一直处于上升趋势并在贮藏4 d时升到最高，之后又下降；而在低温贮藏的白玉菇菌柄中一直处于下降趋势；丝氨酸蛋白酶基因在常温贮藏的白玉菇菌柄中的表达量明显高于低温贮藏的（图6）。总体看出，低温处理下，丝氨酸蛋白酶基因的表达受到抑制，这个结果与丝氨酸蛋白酶的活性变化相一致。
3讨论
由于食用菌贮藏过程中极易变质，薄膜气调包装[13]、化学处理方法[14]、辐照处理[15]、温度处理及CO2气调处理[16]等采后处理技术已被广泛用于各种食用菌，以解决其采后腐烂、货架期短及品质劣变的问题。蛋白酶在植物细胞程序性死亡（PCD）及衰老过程中均起重要作用[17-19]，白玉菇采收后，蛋白质会因为蛋白酶或肽酶的作用分解成氨基酸而降解，在一定程度上导致菇体衰老、品质及商品性急剧下降，因此研究白玉菇采后安全、有效的保鲜技术显得尤为重要。
丝氨酸蛋白酶广泛分布于植物中，多种植物的衰老过程都与其活性的不断提高相关联[4-10]。丝氨酸蛋白酶不仅作用于蛋白质的降解，还常常作为一种信号涉及细胞程序性死亡（PCD）或调控细胞自噬[6，20-23]。在贮藏0、1 d的双孢菇菌柄中，丝氨酸蛋白酶的活性比较低；而从贮藏2 d开始，其活性快速升高直到贮藏4 d，到贮藏5 d又下降[10]。在本研究中，白玉菇在常温贮藏过程中，丝氨酸蛋白酶活性的变化与Burton等研究双孢菇的结论[10]基本一致；本研究讨论在低温贮藏过程中，丝氨酸蛋白酶的活性一直处于下降趋势，并且在整个贮藏过程中，低温处理下白玉菇丝氨酸蛋白酶的活性明显低于常温处理，低温能够抑制丝氨酸蛋白酶的活性，从而延长货架期。
Kingsnorth等研究发现，丝氨酸蛋白酶基因在刚采收的双孢菇中不表达，而在采后贮藏1 d的双孢菇中开始表达，并在第3天达到最大值，之后又下降；Kingsnorth等还对双孢菇不同组织中丝氨酸蛋白酶基因的表达进行研究，发现在贮藏2 d的双孢菇菌柄中的表达量最大[24]。Heneghan等应用绿色荧光蛋白和双孢菇Spr1基因启动子技术对该基因在双孢菇中的表达进行了研究，发现在双孢菇子实体中，Spr1基因活动定位于采后衰老的子实体菌柄中[11]。本研究中，在白玉菇3个不同部位（菌柄、菌盖、菌褶），丝氨酸蛋白酶基因在菌柄中的表达量最大；与低温处理相比较，丝氨酸蛋白酶在常温贮藏4 d的白玉菇菌柄中的表达量最大，这些结果与Heneghan等的研究结果[11，24]基本一致。从本研究结果可以看出，低温处理下，丝氨酸蛋白酶的活性和基因的表达均受到抑制，表明丝氨酸蛋白酶的高活性及高表达量在一定程度上导致白玉菇的衰老、品质及商品性急剧下降。本研究有助于阐明白玉菇衰老的分子机制，并可为调控白玉菇采后保鲜以及延长货架期提供重要的理论与实践意义。
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丝氨酸蛋白酶A1 篇3
1 资料与方法
1. 1 一般资料
选取2014 - 09 ~ 2015 - 06 在佳木斯大学第一附属医院妇科收治的术后的病理回报为子宫内膜异位囊肿的病患50 例作为实验组, 取异位和在位内膜组织, 分为异位内膜组和在位内膜组。另选同时期因子宫疾病 ( 排除子宫内膜异位症) , 行手术治疗的患者50 例作为对照组, 取其正常子宫的内膜为对照组。入选患者年龄34 ~ 47 岁, 平均 ( 38. 2 ± 9. 1) 岁, 平均初潮年龄 ( 14. 7 ± 2. 5) 岁, 所有患者月经规律者, 采集标本之日前6 个月内, 未接受过任何激素治疗者, 近6 个月内未有妊娠、哺乳等, 近6 个月内未接受过放疗、化疗、生物治疗者, 近1 年内未使用过宫内节育器者, 病理专家复核确诊病理切片。
1. 2 标本处理
①内膜组织: 将处理干净的病理组织置40g /L甲醛液中固定24h, 制成蜡块, 4℃ 保留; ②血清: 分别抽取所有研究对象手术当天及术后第7 天晨起空腹时外周静脉血2m L至促凝管内, 置水浴箱静止10min, 水浴箱的温度为37℃ , 然后离心8min ( 速度:4000r / min) , 取上清液体置于干燥的无菌管内, 置-80℃ 环境中冷藏保存备测。
1. 3 实验方法
采用SP法检测Htr A1 在各种内膜组织中表达;外周血清中Htr A1 浓度采用ELISA法进行检测。Htr A1 抗体及血清试剂盒均来自于哈尔滨市南岗区赛特生物技术工作室。按试剂的说明进行各项实验操作。
1. 4 结果判定
每个标本做切片3 张, 每张切片在 × 400 倍镜下取4 个互不重叠的视野, 计数100 个细胞, 共400个细胞, 并数出染色细胞的数量, 计算该切片 ( 即该标本) 的染色细胞所占比例= 染色细胞总数/400 ×100% 。Htr A1 染色结果判定: Htr A1 主要在细胞核内表达, 为棕黄色或黄褐色颗粒。阴性- ) : 染色细胞比例≤5% ; 弱阳性 ( + ) : 染色细胞比例在6% ~25% ; 中等阳性 ( ) : 染色细胞比例在26% ~ 50% ;强阳性 ( ) : 染色细胞比例> 50% 。
1. 5 统计学方法
采用SPSS17. 0 软件进行统计学分析, 对计数资料用 χ2检验, 对计量资料用t检验, 所得数据均已均数 ± 标准差的形式表示, P < 0. 05 有显著差异。
2 结果
2. 1 Htr A1 在内膜组织中的表达
经统计学分析显示EMT组Htr A1 在异位及在位内膜的阳性表达率显著低于对照组 ( P < 0. 05) ;且在位的内膜组的阳性表达率显著高于异位的内膜组 ( P < 0. 05) 。见表1, 图1。
2. 2 血清中Htr A1 的表达
Htr A1 在EMT组术前血清中浓度显著低于对照组 ( P < 0. 05) 。术前外周血中Htr A1 的水平均显著低于术后第7 天 ( P < 0. 05) 。见表2。
3 讨论
Htr A家族广泛存在于微生物及动植物组织中, 目前发现在多种病理生理过程中均有该家族成员参与, 如细胞凋亡、生长、衰老及应激反应、癌症、关节炎等[4]。Htr A1 是近年来新发现的丝氨酸蛋白酶家族成员之一, 该因子在原发性肝癌、卵巢癌、宫颈癌及子宫内膜癌中均呈低度表达, 并随肿瘤恶性程度的升高, 其下调性表达越明显, 表明Htr A1 具有肿瘤抑制效应[3~6]。EMT虽为良性病变, 但是生物学行为却具有恶性肿瘤的特征 ( 侵袭性、远处转移等) , 本研究结果显示Htr A1 在EMT患者异位的内膜表达低于对照组, 表明Htr A1 可能参与盆腔内其他部位EMT的进展过程。
本实验结果显示, Htr A1 在EMT患者在位的内膜中表达明显低于对照组别, 经统计学分析差异有意义, 提示从生物学行为的角度, 在位的内膜与正常子宫的内膜具有差别, 在位的内膜的生物学行为可能是EMT发生过程中一个比较重要的因素, 从而验证了“在位内膜决定论”。卵泡抑素 ( follistatin FS) 和Htr A1 的N末端区域具有高度相似性, FS是TGF- β 的拮抗剂, 因此提出Htr A1 是一种新型的TGF- β 拮抗剂[7]。诸多研究提示TGF - β 在EMT异位病灶中表达显著升高, Htr A1 可拮抗TGF - β 信号通路的活化, 抑制细胞增殖, 表现为肿瘤抑制效应。本实验结果表明Htr A1 在异位、在位内膜及对照组中的表达呈上升趋势, 异位病灶的形成涉及了细胞增殖过程, 因此表现为增殖抑制效应的Htr A1的表达受到抑制甚至无表达, 削弱对TGF - β 及TGF - β 介导的信号通路效应, 导致TGF - β 内腹腔内异位病灶处高表达, 促进异位的内膜的增殖以及存活, EMT进展过程起到重要的作用。
本实验还检测了所有患者血清中Htr A1 的浓度, 结果示EMT组低于对照组, EMT组术前血清中Htr A1 的浓度低于术后第7 天, 表明其可能具备血清标志物的特性, 可能具有一定的临床价值, 或许可为EMT的术前诊断及预后随访提供新思路。但本次实验研究样本量较少, 实验数据存在一定误差和局限性, 需待更多严谨的设计, 大量的样本, 多中心进行的临床研究进一步明确其相关临床意义。
综上所述, Htr A1 在EMT患者异位和在位的内膜及血清中表达低于对照组, 但是术后第七天EMT患者薛强中的表达高于术前, 表明从组织学及血清学角度进行分析, Htr A1 可以作为EMT诊断及预后随访的血清标记物, 同时Htr A1 可能在EMT进展过程中起到一定的作用。
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丝氨酸蛋白酶A1 篇4
本实验拟分析丝氨酸蛋白酶抑制因子(Maspin)基因检测在乳腺癌骨髓微转移(bone marrow mi-crometastasis,BMM)诊断中的作用,以指导临床治疗和预后评估。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2010 年12 月-2014 年8 月在湖南省长沙市第一医院行手术治疗的乳腺癌女性患者58 例。中位年龄46 岁。所有患者经病理检查确诊,术前未接受放射及化学治疗,常规检查血清钙、碱性磷酸酶及肝、肾功能,行乳腺钼靶照片、胸片、腹部、盆腔B超及全身发射型计算机断层扫描(emission comput-ed tomography,ECT),以排除远处转移。按照国际抗癌联盟(Union for International Cancer Contro,UICC)2010 年肿瘤TNM分期标准:Ⅰ期12 例,Ⅱ期29 例,Ⅲ期17 例。伴有腋窝淋巴结转移35 例,无腋窝淋巴结转移23 例。按照1982 年WHO乳腺肿瘤组织学类型分类标准:浸润性导管癌53 例,浸润性小叶癌3 例,导管内癌2 例。随机选取乳腺良性肿瘤,并排除合并身体其他部位恶性肿瘤的患者15 例。其中,纤维腺瘤14 例,导管内乳头状瘤1 例;年龄16~63 岁,中位年龄34 岁。健康者(单纯乳腺增生)10 例;年龄20~45 岁,中位年龄35 岁。以15 例乳腺良性肿瘤及10 例健康者骨髓标本为阴性对照组。本研究得到医院伦理委员会批准,所有患者签署知情同意书。
1.2 仪器和试剂
ABI PRISM 7300 荧光定量聚合酶链反应(re-al-time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)仪(美国Ap-plied Biosystems公司),连续光谱荧光酶标仪(美国Thermo Electron Corporation公司),Trizol Reagent(美国Invitrogen公司) 置于4℃冰箱保存,One Step SYB Prime ScriptTMRT-PCR kitⅡ(大连宝生物工程有限公司)置于-20℃冰箱冷冻保存,PCR引物(大连宝生物工程有限公司)。
1.3 研究方法
1.3.1 骨髓取样骨髓取样采用三点取材法(双侧的髂嵴和胸骨),取乳腺癌患者及非乳腺癌患者骨髓血进行研究。
1.3.2RTFQ-PCRRTFQ-PCR检测骨髓血中Maspin m RNA。1引物和探针。Maspin m RNA正向引物:5'-CTGACAACAGTGTGAACGACCAGA-3',反向引物:5'-GACAACGTGGCCTCCATGTTCATC-3',理论产物166 bp;以18 S r RNA作为内参照,正向引物:5'-ACTCAACACGGGAAACCTCA-3',反向引物:5'-AACCAGACAAATCGCTCCAC-3';Taqman荧光探针:5'-CATACCGTCAGTTCTACT-3'。以羧基荧光素作报告集团标记探针5'-,四甲基罗丹明为荧光淬灭集团标记探针3'-。2PCR条件。总RNA抽提后参照大连宝生物工程有限公司的One Step SYB Prime ScriptTMRT-PCR kitⅡ说明书进行逆转录反应,总体积20μl。扩增参数:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40 个循环。反应结束后仪器自动计算样本中的起始浓度(拷贝/ml)。3结果判断。样本检测结果<103拷贝/ml的检测下限为Maspin m RNA低表达(阴性),≥103拷贝/ml为高表达(阳性)。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0 统计软件进行数据分析,计数资料以率表示,并行 χ2检验和Fisher确切概率法,Maspin m RNA与临床病理特征的相关性选用多因素Logistic回归模型分析,纳入自变量用Enter法,P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨髓中Maspin m RNA的表达
本研究构建的RTFQ-PCR检测Maspin m RNA方法特异性较好,熔解曲线未发现非特异性峰,实现定量扩增(见附图)。58例乳腺癌患者骨髓标本中,20例出现Maspin m RNA阳性表达,阳性表达率为34.5%(20/58)。15例乳腺良性肿瘤患者及10例健康者骨髓标本中阳性表达率为86.7%(13/15)和90.0%(9/10),显著高于乳腺癌患者(P=0.000)(见表1)。
2.2 Maspin m RNA在乳腺癌患者骨髓中的表达及与临床病理特征的相关性
Maspin m RNA阳性表达与乳腺癌临床分期、腋窝淋巴结转移呈负相关(P <0.05);与年龄、肿瘤大小、雌激素受体(estrogen receptor,ER) 和孕激素受体(progesterone receptor,PR)的表达无关(P >0.05)。见表2。
例（%）
例（%）
3 讨论
微转移是指采用常规的病理学方法在机体组织、体液及细胞移植物中难以检测到的微量肿瘤细胞,而采用免疫细胞化学法和分子生物学方法可检测到[4,5]。其中最为灵敏的是RTFQ-PCR,其在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程,通过加入已知浓度的标准样本绘制的标准曲线,推算出样本中初始模板的浓度,可定性、定量地检测微量的肿瘤细胞。目前的精度已达到107 个细胞中即能找出1 个肿瘤细胞。
通过检测肿瘤的微转移来监测肿瘤的发展趋势,在肿瘤可能转移的早期就进行干预,消灭潜在的微转移灶,对提高肿瘤患者的总体疗效和改善预后都有重大的意义。骨髓组织具有分子筛的作用,其血管内皮细胞含有许多肿瘤抗原的受体,能够粘附肿瘤细胞使其滞留在骨髓组织。由于骨髓独特的结构和血流特点,往往是肿瘤细胞血行转移最早到达并聚集成灶的组织,因而骨髓微转移的临床研究已引起广泛关注[6]。
骨髓是肿瘤细胞最易到达的部位,一旦出现就预示已发生远处转移。乳腺癌很易发生骨转移,死于乳腺癌的患者尸检中75%有骨转移。淋巴结与骨髓转移相互独立,检测淋巴结转移阴性患者的骨髓微转移有重要的意义。目前越来越多的资料表明,BMM与乳腺癌的生物学特性关系密切,BMM可以作为一个独立的预后因素。乳腺癌表达某些特异性的标志物,为检测骨髓微转移提供可能[7]。多项研究证实,腋淋巴结转移阴性患者中,骨髓微转移阳性者预后差[8,9]。有研究检测307 例患者,81 例骨髓微转移阳性者26 例复发,226 例阴性者34 例复发,骨髓微转移阳性者无病生存期和生存率明显下降[10]。BRAUN等[11]用抗细胞角蛋白单抗和免疫组织化学方法分别检测150 例淋巴结转移阴性Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者的骨髓及淋巴结微转移。结果发现,骨髓微转移阳性率为29%(44/150),淋巴结转移阳性率为9%(13/150),多因素分析证明,骨髓微转移是独立预后因素,建议以此作为分层因素,选取淋巴结转移阴性患者进行术后化疗。目前,国际上也正在进行这方面的随机研究,以明确其相关性。骨髓微转移有望成为腋窝淋巴结转移阴性者术后化疗的参考依据。
Maspin基因位于染色体18q21.3,其蛋白属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族,卵清蛋白亚族,在肿瘤侵袭转移中起重要作用[12]。LELE等[13]研究表明,Maspin在乳腺细胞表达。STATHOPOULOU等[14]用巢式逆转录聚合酶链反应技术对乳腺癌患者Maspin m RNA表达进行研究,认为Maspin m RNA仅在乳腺癌中表达且与细胞角蛋白19 m RNA、癌胚抗原m RNA有相对很高的特异性。近年有研究证明,Maspin m RNA可作为乳腺细胞的特异性标志物[15],并可能成为乳腺癌治疗的特异性靶标。
丝氨酸蛋白酶A1 篇5
1 材料与方法
1.1 材料来源
1.1.1 主要仪器和试剂
美国Bio-Rad PCR仪,Alpha凝胶成像分析系统,Bio-Rad半干电转仪;日本HITACHI分光光度仪。胎牛血清及MEM、DMEM-F12(1∶1)培养基均为美国GIBCO公司产品;Trizol试剂盒为美国Invitrogen公司产品;逆转录试剂盒与2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技(北京)有限公司;引物合成及测序由北京奥科生物技术有限公司完成。全细胞裂解液为碧云天生物技术研究所产品;兔抗人HMGA1、β-肌动蛋白多克隆抗体以及相应的二抗山羊抗兔为英国abcam公司产品;化学发光底物为美国Millipore公司产品。
1.1.2 细胞系和细胞培养
子宫内膜癌细胞系AN3CA,为未分化腺癌,购于中国典型培养物保藏中心;子宫内膜癌细胞系ECC-1和Ishikawa,为高分化腺癌,由第四军医大学基础部免疫学教研室杨安钢教授惠赠。AN3CA细胞和ECC-1细胞分别置于含10%胎牛血清的MEM培养基培养和传代,Ishikawa细胞置于含10%胎牛血清的DMEM-F12(1∶1)培养基培养和传代。
1.1.3 子宫内膜组织标本
选取2006年9月~2008年3月第四军医大学唐都医院妇产科手术切除的子宫内膜癌组织标本21例(研究组),参照国际妇产科联盟(FIGO,2000年)子宫内膜癌手术-病理分期,I期12例,Ⅱ期9例;21例子宫内膜癌组织按肿瘤细胞的分化程度分为高分化癌6例,中低分化癌15例;组织学类型均为子宫内膜样腺癌;21例患者术前未曾进行放疗、化疗。同期随机选取唐都医院妇产科因子宫肌瘤而行全子宫手术切除及生殖医学中心拟行辅助生殖技术进行诊刮的正常子宫内膜组织标本18例(对照组),其中增生期8例,分泌期10例。标本取材后分成2份,1份放入4%多聚甲醛溶液中固定,行病理组织学检查,1份立即用冰冷的磷酸盐缓冲液(含0.01%焦碳酸二乙酯)充分清洗,置液氮中过夜后存于-80℃备用,所有组织标本均经病理检查证实。患者年龄分布:研究组最小年龄40岁,最大年龄62岁,平均年龄为(50.4±6.6)岁;对照组最小年龄30岁,最大年龄56岁,平均年龄为(41.1±7.4)岁,两组平均年龄差异无显著性(P>0.05)。
1.2 方法
1.2.1 逆转录-多聚合酶链反应(R T-PCR)
将3种培养的子宫内膜癌细胞以及各约100 mg的子宫内膜组织标本按Trizol一步法提取总RNA,分光光度仪测定RNA试样的浓度,取5μL RNA试样于1.0%琼脂糖凝胶(含0.5μg/m L溴化乙锭)上电泳鉴定RNA试样的完整性。取3μg RNA反转录成c DNA,具体操作步骤按照相应试剂盒说明进行。HMGA1特异性引物序列参照文献[3],上游引物:5'-CCTGGACAAGGCTAACATCC-3',下游引物:5'-GTGACTGCATCTCCATCACC-3',扩增片断长度为478 bp;人内参β-肌动蛋白(β-Actin)引物序列,上游引物:5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3',下游引物:5'-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3',扩增片断长度为527 bp。PCR反应条件:95℃预变性4 min,95℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1.0min,共30个循环,之后72℃延伸7 min,4℃冰箱保存;反应体系为25μL,PCR产物均以5μL上样于1.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/m L溴化乙锭)电泳,凝胶成像分析系统照相扫描,HMGA1-m RNA的相对表达量以HMGA1与相应β-Actin的灰度值的比值表示。
1.2.2 免疫印迹法
免疫印迹法(Western Blot)提取3种培养的子宫内膜癌细胞以及子宫内膜组织标本的总蛋白,分光光度仪比色法检测试样蛋白含量,配制12%分离胶、5%浓缩胶,分别取40μg试样的总蛋白上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳:开始时60 V恒压,约20 min后溴酚蓝前沿进入分离胶,改用200 V恒压,电泳直至溴酚蓝前沿距离凝胶末端约2.0 cm处时停止,约40 min。半干电转仪恒流0.03 m A,转移17 min,将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜),用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭PVDF膜1 h,然后与一抗兔抗HMGA1(1∶1 000)室温孵育1 h,辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗兔HMGA1(1∶10 000)杂交1 h;充分洗涤PVDF膜后进行化学发光、曝光、显影和定影。洗脱PVDF膜,重复进行封闭液封闭、一抗兔抗β-Actin(1∶10 000)孵育、二抗山羊抗兔(1∶10 000)杂交检测β-Actin蛋白。凝胶成像分析系统照相扫描,分别测定HMGA1与相应β-Actin的灰度值,HMGA1蛋白的相对表达量以两者灰度值的比值表示。
1.3 统计学处理
应用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析,数据用表示,两组比较采用成组双侧t检验,当P<0.05时为差异有显著性。
2 结果
2.1 HMGA1-mRNA在子宫内膜癌细胞系及子宫内膜组织标本中的表达
RT-PCR结果显示,HMGA1-m RNA在AN3CA、ECC-1、Ishikawa细胞系和21例子宫内膜癌及18例正常子宫内膜组织标本中均有表达,条带特异,取AN3CA细胞的PCR扩增产物经双向测序与拟扩增人类HMGA1基因序列片断完全一致(BC015789.1,从第771 bp至1 248 bp)。HMGA1-m RNA在研究组与对照组以及研究组各期间的差异表达量有显著性(P<0.05),在不同分化程度癌组织中的差异表达量无显著性(P>0.05),见图1A、图1B和附表。
2.2 HMGA1蛋白在子宫内膜癌细胞系及子宫内膜组织标本中的表达
Western Blot显示,HMGA1蛋白在子宫内膜癌细胞系AN3CA、ECC-1和Ishikawa中均有表达,在21例子宫内膜癌组织和18例正常子宫内膜组织中均有不同程度的表达,HMGA1蛋白在研究组与对照组以及研究组各期间的差异表达量有显著性(P<0.05),在不同分化程度癌组织中的差异表达量无显著性(P>0.05),与RT-PCR结果基本符合,见图2A、图2B和附表。
3 讨论
HMGA1作为一种小分子量的细胞内核蛋白分子,广泛参与细胞内的多种生理活动,如可诱导基因转录的调控、诱导转化及促进癌细胞扩散等。TES-FAYE等[4]报道,转染HMGA1基因后的雌性裸鼠可患上子宫内膜癌,HMGA1在低度、高度恶性人子宫内膜癌组织和子宫内膜间质肉瘤组织以及子宫平滑肌肉瘤组织中均有不同程度的表达,表明HMGA1基因的表达与人类子宫内膜癌的发生有关。
本实验RT-PCR与Western Blot显示,HMGA1在不同分化程度的子宫内膜癌细胞系AN3CA、ECC-1、Ishikawa以及21例(100%)子宫内膜癌组织中都有表达,与TESFAYE等[4]的研究结果一致。本实验结果还发现,HMGA1在18例(100%)不同时期的正常子宫内膜组织中也有表达,原因不明,目前尚未见HMGA1在正常子宫内膜组织中表达的报道。但进一步统计表明,HMGA1在子宫内膜癌组织中的表达水平显著高于正常子宫内膜组织中的表达水平(P<0.05),并且在不同手术-病理分期中的表达水平也有差异(P<0.05),从正常子宫内膜到Ⅱ期子宫内膜癌,HMGA1的表达水平呈上升趋势。此外,统计还表明,HMGA1的表达水平与子宫内膜癌组织的分化程度无关(P>0.05)。因此,综合HMGA1在两组子宫内膜组织相对表达的结果,提示HMGA1可能不但参与了正常子宫内膜细胞的分裂、增殖,而且HMGA1的过度表达与子宫内膜细胞的癌变有关。随着子宫内膜癌细胞的恶性增殖、侵袭,HMGA1的表达量逐渐上升,并在子宫内膜肿瘤细胞浸润、侵袭过程中可能发挥着重要作用。
目前,子宫内膜癌的发病机制不十分清楚,流行病学表明肥胖、高血压、糖尿病等是子宫内膜癌发病的体质因素。BERMONT等[5]认为,胰岛素与胰岛素受体结合后可调控子宫内膜癌细胞中血管内皮生长因子,从而促进子宫内膜癌血管的生成,另有报道HMGA1能够正调控胰岛素受体基因的转录[6,7],当缺乏HMGA1的表达后会造成人及小鼠的胰岛素抵抗和糖尿病[8],据此推测,HMGA1通过上调胰岛素受体的表达,增加了子宫内膜癌细胞膜与胰岛素的结合位点,从而使子宫内膜癌细胞中血管内皮生长因子表达增加,这可能是HMGA1促进子宫内膜癌细胞侵袭、发展的机制之一,但HMGA1的过度表达与子宫内膜癌等肿瘤发生的机制尚不清楚,有报道[9]HMGA1能够抑制抑癌基因p53的活性,另有报道[10]HMGA1能够阻止正常细胞对DNA损伤的修复,TESFAYE等[4]认为HMGA1导致子宫内膜癌细胞恶性增殖的机制是通过激活环氧化酶-2(Cox-2)途径实现。
综上所述,HMGA1在子宫内膜癌细胞系AN3CA、ECC-1、Ishikawa和子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织中都有不同程度表达,HMGA1的过度表达可能在子宫内膜癌的发生、发展中起着重要作用。
摘要：目的探讨高迁移率族蛋白A1(high mobility group protein A1,HMGA1)在子宫内膜癌细胞系AN3CA、ECC-1、Ishikawa以及子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织中的表达及意义。方法采用半定量RT-PCR和WesternBlot检测子宫内膜癌细胞系AN3CA、ECC-1、Ishikawa以及21例子宫内膜癌组织(研究组)、18例正常子宫内膜组织(对照组)中HMGA1-mRNA与HMGA1蛋白的表达水平。结果HM-GA1-mRNA与HMGA1蛋白在子宫内膜癌细胞系AN3CA、ECC-1、Ishikawa以及两组子宫内膜组织标本中均有不同程度的表达,研究组中HMGA1-mRNA与HMGA1蛋白的平均表达水平显著高于对照组(P<0.05),并与手术-病理分期有关(P<0.05),与子宫内膜癌组织的分化程度无关(P>0.05)。结论HMGA1的过度表达可能参与了子宫内膜癌的发生和发展,在子宫内膜癌细胞的增殖与侵袭中可能发挥重要作用。
关键词：高迁移率族蛋白A1,子宫内膜肿瘤,逆转录-多聚合酶链反应,免疫印迹
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丝氨酸蛋白酶A1 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2013年1月~2014年7月在我院产科门诊建卡产检的妊娠期妇女206例, 年龄21~39 (27.5±3.6) 岁, 孕周24~28 (26.5±2.1) w。所有对象均排除贫血、产前DM、异常血红蛋白病、急慢性感染及内外科相关并发症。其中通过采用2010年国际糖尿病和妊娠研究组 (IADPSG) 新的推荐标准[6]确诊妊娠糖尿病33例, 年龄27.1±5岁, 孕周26.6±2.4w;非妊娠糖尿病妊娠对照组173例, 年龄25.1±2.2岁, 孕周26.5±2.1w。其中经产妇38例, 年龄28.5±3.5岁, 孕周26.1±2.0w;初产妇168例, 年龄25.2±2.8岁, 孕周26.3±2.2w。
1.2 方法
(1) 206例受试者均空腹8h于清晨采集静脉血检测空腹血糖 (FPG) , 结果≥5.1mmol/L为阳性, 同时采集静脉血于EDTA盐抗凝管中检测Hb A1c, 其切点值采用6.0%[7];口服50g葡萄糖1h后采集静脉血检测GCT, 结果≥7.8mmol/L为阳性。 (2) Hb A1c检测为离子交换高效液相色谱法 (H PLC) , 仪器采用日本爱科来全自动糖化血红蛋白分析仪HA￣8180, 试剂为原厂配套;血糖检测为己糖激酶法, 仪器采用罗氏Cobas8000 c701, 试剂为原厂配套。具体检测方法均按实验室操作规程和试剂盒说明书要求进行操作。 (3) 妊娠糖尿病诊断采用IADPSG新的推荐标准:75g OGTT空腹血糖≥5.1mmol/L;1h血糖≥10.0mmol/L;2h血糖≥8.5mmol/L;其中一项达到或超过标准可诊断妊娠糖尿病。
1.3 统计学方法
数据采用SPSS 13.0软件进行统计学处理, 计数资料采用卡方检验。若P<0.05, 则为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两组FPG、GCT及Hb A1c测定结果比较
妊娠糖尿病组均明显高于正常妊娠对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
2.2 3个检测项目在诊断妊娠糖尿病中的效果评价
Hb A1c的灵敏度 (检出真阳性29例, 假阴性4例) 、特异性 (检出真阴性170例, 假阳性3例) 、阳性性预测值 (检出真阴性170例, 假阳性3例) 和阴性预测值 (检出真阴性170例, 假阴性4例) 均最高, 分别是87.9%、96.6%、93.5%、97.7%, 较FPG和GCT有显著差异, 有统计学意义 (P<0.01) , 提示Hb A1c在筛查妊娠糖尿病的检查中效果最好, 见表2。
3 讨论
妊娠糖尿病自20世纪50年代开始被人们关注, 并认为与孕妇及胎儿的不良结局有关[8]。近年来妊娠糖尿病的发病率一直呈上升趋势, 已严重危及孕妇和胎儿的健康和生命安全, 目前针对妊娠糖尿病的筛查主要是通过检测FPG和GCT, 确诊则需要通过OGTT, 前两个检测影响因素多, 一次结果通常不能准确的反映受检者真实的血糖水平, OGTT目前仍是妊娠糖尿病诊断的金标准, 但其多次抽血对受试者的身心伤害较大, 不可避免也会受到一些客观因素的影响。因此在筛查时, 我们还是希望能有更为便捷而有效的检测手段。近年来, 在国际上逐渐推广使用Hb A1c对妊娠糖尿病进行筛查, 既可以弥补空腹血糖反映瞬时血糖值的不足, 又可避免过程相对复杂且重复性差的GCT。糖化血红蛋白可以反映既往8~12w的平均血糖水平, 不受血糖瞬时波动的影响, 受试者不需要提前准备, 随时可以抽血检测。通过笔者研究发现, 在做比较的三种检测方法中Hb A1c的灵敏度、特异性和阳性预测值均最高, 其在妊娠糖尿病的筛查中具有较高的临床价值, 虽然ADA已推荐将Hb A1c≥6.5%作为非妊娠糖尿病的诊断标准之一[9], 但鉴于孕妇生理上的特殊性, 用于妊娠糖尿病的诊断目前还没有形成统一的标准, 因此Hb A1c真正用于妊娠糖尿病的诊断还需要进行大量临床研究和论证。
综上所述, Hb A1c检测简单、快捷、取血量少, 不受饮食等因素影响, 因此笔者认为Hb A1c在妊娠糖尿病的筛查中具有重要的应用价值, 可作为妊娠糖尿病重要的筛查指标, 不久的将来也一定可以在妊娠糖尿病的诊断和治疗监测中发挥更大的作用。
参考文献
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丝氨酸蛋白酶A1 篇7
1 资料与方法
1.1 组织标本
选取2010年2月-2014年1月解放军第二五一医院54例胆管癌手术切除后的蜡块标本为胆管癌组织。其中,男性34例,女性20例,男女比例1.7∶1,年龄43~82岁,平均年龄(60.370±1.249)岁。临床及病理资料齐全,术前均未接受放疗、化疗及其他针对肿瘤的治疗,术后病理组织学诊断均为腺癌。按世界卫生组织分类标准进行组织学分级[5]:高分化22例、中分化24例、低分化8例。临床分期参照美国癌症联合委员会TNM分期2010版[6]进行,其中Ⅰ期9例、Ⅱ期16例、Ⅲ期12例、Ⅳ期17例。选取距离肿瘤边缘≥1 cm经病理证实为不典型增生组织为癌旁组织。同时取15例为非肿瘤胆管组织。胆管损伤、胆管囊肿患者的胆管组织标本。
1.2 血清标本
收集2014年8月-2015年4月间在解放军第二五一医院就诊的胆管癌患者24例为胆管癌组,选取同期在该院就诊胆管结石患者24例为胆管结石组,另外收集24例在该院体检中心经化验各项指标均正常体检者血清为健康组。所有患者在血清标本采集前均未行放疗及化疗,所有病例资料完整。
1.3 试剂
鼠抗人Annexin A1免疫组织化学单克隆抗体(浓缩型),Annexin A1酶联免疫分析试剂盒,鼠抗人CA19-9免疫组织化学单克隆抗体(即用型),CA19-9酶联免疫分析试剂盒均系美国Cloud-Clone Corp公司;Eli VisionTMplus二步法免疫组织化学染色试剂盒,二氨基联苯胺(DAB)显色液均系福州迈新生物技术开发有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1免疫组织化学Eli VisionTMplus二步法
所有组织标本均经10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,免疫组织化学染色步骤按试剂盒说明书进行操作,以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照组,以公司提供的阳性切片作阳性对照组。
1.4.2酶联免疫吸附试验(ELISA)
抽取患者初诊治疗前1天晨起空腹静脉血5 ml,3 500 r/min离心15 min,提取上层血清,置于-20℃冰箱冷冻保存备用,再于患者手术后第10天抽取晨起空腹静脉血5ml,按上述方法保存。标本成批检测,血清无溶血、脂浊。所有操作严格按试剂盒说明书进行操作。
1.5 结果判定
免疫组织化学染色结果通过双盲法评价,确定染色结果。Annexin A1以细胞浆或细胞膜或两者同时出现棕黄色沉着为阳性信号;CA19-9以细胞浆或细胞膜上出现棕黄色沉着为阳性表达,根据阳性细胞显色强度和百分数进行分析,依据阳性细胞显色程度计分:无显色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。依据显色细胞阳性百分比计分:高倍视野下每张切片随机选取5个视野,每个视野计数100个肿瘤细胞,计算阳性细胞数占肿瘤细胞总计数百分比,无或阳性细胞<10%记为0分,10%~25%记为1分,25%~50%记为2分,>75%记为3分。将两个分值相加,0~1分为阴性(-),2~3分为弱阳性(+),4~5分为阳性(++),5分以上为强阳性(+++)。
ELISA试验使用北京普朗公司生产的DNM-9602标准规格酶标仪检测,以标准物浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,选择拟合系数(即“r”值)最好的曲线方程对测得数据进行分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,ELISA试验中多组计量资料用方差分析,术前与术后比较用配对t检验,免疫组织化学中Annexin A1和CA19-9的表达及其与胆管癌临床病理特征分析用χ2检验,Spearman相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Annexin A1和CA19-9在胆管癌不同组织中的表达
在胆管癌、胆管癌旁和非肿瘤胆管3种不同组织中,Annexin A1的阳性表达率分别为70.37%(38/54),33.33%(18/54),6.67%(1/15),各组间比较差异有统计学意义(χ2=25.709,P<0.05);CA19-9的阳性表达率分别为74.07%(40/54),38.89%(21/54),13.33%(2/15),各组间比较差异有统计学意义(χ2=23.192,P<0.05)。见图1、2和表1。
2.2 Annexin A1和CA19-9的表达水平与胆管癌患者临床病理特征关系
54例胆管癌患者中,Annexin A1的表达与肿瘤的分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05),而与患者年龄、肿瘤大小无关(P>0.05);CA19-9的表达则与淋巴结转移有关(P<0.05),而与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤的分化程度、TNM分期无关(P>0.05)。见表2。
2.3 胆管癌中Annexin A1和CA19-9表达之间的关系
38例Annexin A1阳性表达的胆管癌组织中,同时有CA19-9阳性表达32例,共阳率为59.26%,在16例Annexin A1阴性表达的标本中,同时有CA19-9阴性表达8例,共阴率为14.81%。经Spearman相关分析,Annexin A1和CA19-9在胆管癌中的表达呈正相关,两者相关系数差异有统计学意义(r=0.356,P=0.008<0.05)。见表3。
2.4 3组血清标本中Annexin A1和CA19-9的含量
胆管癌组血清Annexin A1、CA19-9表达水平明显高于胆管结石组及健康组,差异有统计学意义(Annexin A1:F=68.525,P=0.000;CA19-9:F=135.333,P=0.000);在胆管结石组血清中Annexin A1的表达水平略高于健康组,两者差异无统计学意义(P=0.660);CA19-9在胆管结石患者血清中的表达水平高于健康组,但两者差异也无统计学意义(P=0.731)。见表4。
A:胆管癌组织;B:癌旁组织;C:非肿瘤胆管组织
A:胆管癌组织;B:癌旁组织;C:非肿瘤胆管组织
2.5 胆管癌组手术前后血清中Annexin A1和CA19-9的含量
胆管癌组患者手术前血清中Annexin A1和CA19-9的含量均高于手术后,差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。
例(%)
3 讨论
胆管癌的发生、发展建立在机体本身遗传因素与环境因素相互作用的基础上,是一个多阶段、多基因协同参与的过程。Annexin A1是一类钙依赖性磷脂结合蛋白,其N-末端含有多个潜在的磷酸化位点,具有调控Annexin A1与其他蛋白相互作用的功能,能够与表皮生长因子受体结合,通过MAPK/ERK信号通路影响蛋白质复合物形成和活性,抑制细胞周期D1期表达,减少细胞增殖[7,8,9]。Annexin A1的异常表达可造成细胞生长紊乱,从而影响肿瘤的发生,而其在多种恶性肿瘤组织中也存在不同的表达[10,11]。Annexin A1在胃食管交界处腺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌中表达增强,在鼻咽癌、头颈部鳞癌、食管鳞状细胞癌、前列腺癌中表达降低,该表达水平迥异未发现明显规律,依目前的研究统计发现,其在鳞状细胞癌中多表达降低,而在腺癌组织中表达多呈升高趋势。本研究中采用免疫组织化学法检测Annexin A1主要表达于胆管癌细胞的胞浆和胞膜中,并且在癌组织中阳性表达率明显高于癌旁不典型增生组织和非肿瘤胆管组织。在Annexin A1与胆管癌的临床病理特征之间的关系中,笔者发现,临床TNM分期越晚的病理Annexin A1阳性率越高;病理分化越低的组织中,Annexin A1表达越高;在伴有淋巴结转移组中,Annexin A1表达高于不伴有淋巴结转移组。提示Annexin A1在正常胆管组织中有一定的生理作用,而且参与正常胆管上皮到恶性肿瘤的演变过程。
CA19-9是一种糖链抗原,由单克隆抗体116NS19-9识别,在血清中表达为黏蛋白糖脂,在组织中表达为单涎酸神经节糖苷脂[12]。可分布在正常人的胰腺、胆管上皮等处,是目前临床上用于诊断胆管癌、胰腺癌最重要的指标,敏感性高[13]。在本研究中发现,胆管癌组织中CA19-9的表达水平由非肿瘤胆管组织、癌旁组织到胆管癌组织呈增强趋势,无淋巴结转移的胆管癌组织中CA19-9表达低于伴有淋巴结转移组,提示CA19-9与胆管癌的发生和淋巴结转移有关。
此外,笔者在对3组不同血清检测发现,胆管癌组中Annexin A1、CA19-9的表达均明显高于胆管结石组和健康组,再次验证两者在胆管癌的发生和发展中起着一定作用。杨尽晖等报道中[14],CA19-9作为胆管癌诊断的一个重要指标,血清中的敏感性为79%,特异性为89%,且在行手术切除后,患者血清中CA19-9明显下降。而目前关于Annexin A1在血清含量及其降解的研究较少。本实验中发现,Annexin A1在胆管癌组术前中的表达高于术后。由此笔者推测两者可作为胆管癌、手术诊断、手术效果判定及肿瘤转移复发的辅助指标。
丝氨酸蛋白酶A1 篇8
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystatin C, Cys C) 是一种低分子量分泌性蛋白质, 所有有核细胞均可合成并很快分泌到细胞外, 无组织特异性, 可分布于肺、肝、肾、胃、肠、胰及胎盘等几乎全身所有脏器组织, 在脑脊液和精液中浓度最高, 受“管家基因”的调节, 产生速率恒定, 最重要的生理功能是参与细胞内外蛋白水解的调控, 保护细胞免受不适当的内源性或外源性蛋白酶水解。目前Cys C的检测方法很多, 包括单向免疫扩散法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法、放射免现自动化分析。
2 Cys C与肾功能
2.1 一项新的肾功能检测指标
理想的估计肾小球滤过率 (glomerular filtration rate, GFR) 的内源血清物质应该具备以下特性:以恒定速率释放入血流, 不受年龄、性别和一些病理状态的影响, 不与蛋白质结合;通过肾小球自由滤过;不被肾小管重吸收入血或分泌;肾脏是唯一排泄途径。Cys C产生速率恒定, 不受性别、年龄、肌肉质量、体表面积、饮食、炎症、肝功能及血脂等因素的影响, 血清中的Cys C几乎全部由肾小球滤过, 不被肾小管重吸收和分泌, 在近端肾小管上皮细胞被分解代谢。因此血清Cys C是诊断早期肾功能损害较理想的标志物。Dharnidharka等[1]总结了46篇有关Cys C研究论文的荟萃分析, 表明其与GFR的相关性、诊断GFR下降的灵敏度、特异性均明显优于肌酐 (creatinine, Cr) 。
2.2 血清Cys C水平的影响因素
由于Cys C受“管家基因”的调节, 生成速率恒定, 目前仅确定少数情况对血清Cys C水平有影响。大量糖皮质激素升高血清Cys C水平, 而中少量糖皮质激素似乎不改变血清Cys C水平。另外, 有报道甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退改变血清Cys C浓度, 因此, 当Cys C作为肾功能标志物时可能要考虑甲状腺因素。甲状腺功能对血清Cys C水平的影响仍是反映GFR的改变, GFR随着基础代谢率改变。
2.3 Cys C与药物剂量调整
调整通过肾脏排泄药物的剂量要依据肾功能的下降程度。因此, 正确估计患者的肾功能以适当调整药物剂量是非常重要的。肌酐清除率 (creatinine clearance rate, Ccr) 和GFR的预测公式广泛应用, 然而, 以往的研究表明用血清Cr浓度作为老年人肾功能的标志时常常高估了肾功能。这会致使临床用药时给予不必要的高药物剂量, 这样治疗成本升高并且可能引起不良反应。因此, Cys C更适合调整主要通过肾脏清除药物的剂量。
3 Cys C与心血管疾病
心血管疾病是目前致死率最高的疾病之一。近年关于血管重构的酶学已逐渐成为研究的热点, Cys C作为其中重要的一种, 在心血管疾病的发生、发展中起着重要的作用。
3.1 Cys C与高血压病
高血压病会引起肾功能损害, 其发生率随病程长短呈逐年增高趋势, 高血压病患者中轻度肾损害较常见, 但现用的肾功能检查指标不能发现早期肾损害。Bhavasar[2]对866例高血压病患者的血清Cys C和Cr进行检测, 得出高血压病患者血清Cys C增高而Cr正常者在所有高血压病患者中所占比例达24.1%。所以, 通过检测高血压病患者的血清Cys C有助于发现血清Cr正常的早期肾功能损害。Watanade等[3]调查研究了血清Cys C水平与原发性高血压患者肾脏、心脏和血管等终末器官损害的关系, 60名原发性高血压患者参与了该研究, 结果显示血清Cys C与24h平均收缩压相关 (r=0.308, P=0.0167) , 与左心室质量指数相关 (r=0.528, P<0.0001) , 与血管内膜-中膜厚度相关 (r=0.539, P<0.0001) , 证明了血清Cys C水平是原发性高血压患者终末器官损害的早期指标。
3.2 Cys C与冠心病
目前基础研究证明动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程, 发病机制涉及细胞外基质降解与血管壁重构。炎症可刺激血管平滑肌细胞分泌组织蛋白酶S、K等, 使这类具有促弹性组织离解特性的半胱氨酸蛋白酶在动脉损伤处过度表达。最近越来越多的研究发现, 在血管平滑肌细胞中有该组织蛋白酶抑制剂Cys C的表达, Cys C可通过人类多核细胞趋化性的抑制而在人类免疫防御中起作用。然而在动脉粥样硬化及腹主动脉瘤的损伤处Cys C的表达则严重减少。为了以蛋白酶/抗蛋白酶比例失衡的观点评价血清Cys C在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用, 董巧玲等[4]探讨了血清期血清Cys C水平 (0.78±0.15) 与不稳定型心绞痛 (0.89±0.22) 、对照组 (0.84±0.21) 相比明显降低 (P=0.028) , 但急性心肌梗死发病1周后 (1.28±0.20) 接近正常, 甚至有所增高 (P=0.04) 。急性心肌梗死患者早期血清Cys C浓度的显著降低, 在一定程度上可为临床诊断急性心肌梗死提供参考。
另外, 在动脉粥样硬化中, 可以发现全身性的活性转化生长因子 (transforming growth factor-β, TGF-β) 减少, 且损伤局部对有活性的TGF-β有依赖性, 这可能解释为什么在损伤局部Cys C浓度较低, 并且通过TGF-β的治疗可以刺激Cys C的分泌, 从而与组织蛋白酶的降解作用相抗衡, 并可以抑制动脉粥样硬化过程的进展。这就引发了临床对TGF-β在心血管疾病中的应用产生极大的兴趣, 有望成为动脉粥样硬化治疗的新方法。TGF-β能抑制血管平滑肌细胞和巨噬细胞的迁移和增殖, 具有抑制动脉粥样硬化过程的特征。直到目前为止, TGF-β是唯一得到证明能刺激血管平滑肌细胞中Cys C转录和分泌的细胞因子, 有人推测可能TGF-β的抗动脉粥样硬化作用归结于Cys C产生的增加, 从而恢复早期动脉粥样硬化病变中组织蛋白酶和它们主要抑制剂之间的平衡。
3.3 Cys C与动脉瘤
如前所说, Cys C在血管损伤后出现血清水平降低, 进一步的研究还发现其浓度与疾病的严重程度呈负相关。Shi等[5]通过超声法观察122例患者颈动脉内膜-中膜厚度及腹主动脉直径, 同时采用免疫染色法与免疫杂交法测定了血清Cys C的水平, 结果发现血清Cys C水平与腹主动脉直径呈负相关, 而与内膜-中膜厚度无相关性, 经过体表面积校正后, 两者负相关关系仍然存在。Lindholt等[6]对151例腹主动脉瘤患者进行了接近3年的随访, 测定了其中142例患者血清Cys C、Cr和C-反应蛋白水平 (C-reactiveprotein, CRP) , 发现血清Cys C的水平与腹主动脉瘤的扩张程度呈负相关 (r=-0.22) , 经年龄、吸烟、舒张压、肾功能、C-反应蛋白水平和腹主动脉瘤瘤体大小校正后, 这种负相关关系仍然存在, 提示可能由于缺乏Cys C导致组织蛋白酶相对占优势, 加速了动脉瘤的进展。这些研究表明了半胱氨酸蛋白酶/蛋白酶抑制剂之间的平衡在动脉瘤形成中起着重要的作用。
3.4 Cys C的预测因子作用
近年来, 有研究发现Cys C对某些心血管疾病的发生发展及预后可能有预测作用。
Luc等[7]开展了一项有关Cys C与冠心病相关性的前瞻性调查研究, 共纳入了9758例50~59岁的非冠心病人群为研究对象, 研究终点为急性心肌梗死、心绞痛发生、心源性死亡, 随访5年期间159例发生急性心肌梗死或心源性死亡, 154例发生心绞痛, 结果发现Cys C水平跟第一次缺血性心血管事件明显相关, 在纠正了传统的冠心病危险因素 (包括年龄、高血压、糖尿病、吸烟、体重指数、血脂) 之后这种相关性仍然存在, 但是在加入了CRP这一因素后这种相关性被弱化;Johnston等[8]曾在健康成年人群中用高敏感性分析仪测量时发现, 轻度升高的血清Cys C和CRP水平之间成正相关, CRP轻度升高正是成人及儿童的动脉粥样硬化和慢性肾功能衰竭相关的慢性炎症状态的特征, Cys C应该参与了动脉粥样硬化的炎症过程。Koenig等[9]则对1033例30~70岁的冠心病患者开展另外一项较大规模的研究, 随访33.5个月, 对比Cr、Ccr、Cys C对第二次冠心病事件发生率的预测价值, 结果发现对出现第二次冠心病事件的患者中仅有Cys C水平与之明显相关, 多因素回归分析表明高Cys C水平可以作为冠心病患者再次发生事件的一个预测因素。
Jernberg等[10]对急性冠状动脉综合征 (acute coronary syndrome, ACS) 人群进行随访调查研究, 以评价Cys C对ACS预后的临床价值, 该研究纳入726例以急性胸痛为症状入院的可疑和确定的ACS明显相关, 提出临床单纯检测Cys C水平对ACS分层有较高的临床价值。Shlipak等[11]开展了另外一项共纳入4637例老年人的队列研究, 结果表明Cys C水平可以作为一项独立于性别、年龄等危险因素之外的预测高龄心血管疾病患者全因死亡率的指标, 同时其对肾功能损伤预测的敏感性明显优于Cr。另外ACS患者肾功能不全的发生对其预后有很大影响, 但是目前Cr和GFR值检测肾功能不全的不敏感性限制了它们作为预测因子的价值。Suwaidi等[12]一项荟萃分析纳入了全球4个大型ACS研究共37925个试验样本, 发现合并肾功能不全的ACS患者跟更高的死亡率和非致死性心肌梗死的发生明显相关, 而Cys C水平正是反映肾功能损伤的一个敏感指标。这可能是Cys C水平可以作为一项ACS患者预后判断指标的重要原因之一。
心力衰竭是多种心血管疾病的最后归宿和主要杀手, 近年来有关Cys C水平对心力衰竭发生及预后的预测价值的研究报道也很多。Shlipak等[13]对高龄心衰患者前瞻性调查, 随访平均6.5年发现Cys C水平每增加0.35mg/L, 心衰患者的死亡率就增加31%, 可以作为该人群预后判断的一种新的有力指标。Lassus等[14]一项关于Cys C水平和急性心衰的研究发现, 与传统预测冠心病患者发生急性心衰的指标相比, Cys C水平大于1.30mg/L可以作为预测患者未来12个月内发生急性心衰或者死亡的一项很有价值的生化指标。因此, Cys C水平跟心衰的关系其实也是Cys C水平可以作为其对多种心血管疾病预后判断的一项指标的机制所在。
4 总结
血清Cys C是一种较理想的评价GFR的指标, 目前其检测分析已实现全自动化且操作简便, 有希望在临床得到广泛应用。Cys C参与了心血管系统疾病诸多的病理、生理过程, 它的作用机制涉及抗炎、抑制酶与激素前体的活性等, 而且由于它产生的恒定性, 有可能在某些心血管疾病中成为诊断与检测的分子指标。当然, Cys C与心血管疾病的关系还需要更深入的研究, 以进一步明确其作用的确切机制。
摘要：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是一种低分子量的肾小球滤过率内源性标志物, 大量研究表明它在体内产生速率稳定, 影响因素极少, 是反映早期肾小球滤过功能受损的一项较理想的指标, 近年来研究发现它在指导许多心血管疾病的诊断及治疗中有潜在的临床意义。