人Ⅰ型精氨酸酶的聚乙二醇修饰条件探索

自上个世纪80年代以来,FDA批准了第一个PEG化药物聚乙二醇修饰的酰苷脱氨酶(PEG-ADA),PEG修饰技术在长效药物的制备研究中已经取得了很大的进展,成为近年来医药领域研究的热点之一。目前,已经上市的聚乙二醇药物包括PEG化天冬酰胺酶(PEG-L-asparaginase)[4],以及重组人粒细胞集落刺激因子(Pegfilgrastim)等蛋白质药物[5]。

对于精氨酸酶的聚乙二醇修饰研究,已经取得了很大成果和进展。目前已有产品完成了临床前实验,为5k D线形单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(NHS-m PEG)修饰[6],其体外活性保留为未修饰蛋白的50%,活性下降很多。

为了解决以上问题,本研究采用10k D单甲氧基聚乙二醇丙醛(m PEG-ALD)修饰剂对精氨酸酶进行了修饰,通过控制反应条件,希望能够获得半衰期更长的PEG化精氨酸酶产物。通过考察不同的修饰条件来寻找最佳的修饰办法,为进一步考察其特性奠定基础。

1 材料和方法

(1)材料。原料:单甲氧基聚乙二醇丙醛(北京凯正生物),重组人精氨酸酶(Escherich ia c oli表达)。主要试剂:牛血清白蛋白(SIGMA),丙烯酰胺(SIGMA),甲叉丙烯酰胺(SIGMA),其余试剂均为国产分析纯试剂。(2)方法。修饰反应:在低温4℃,将重组人精氨酸酶透析到所需缓冲溶液中。使用BCA法进行蛋白浓度测定,调整蛋白浓度至实验所需值,按照摩尔配比(修饰剂/蛋白质)加入修饰剂及还原剂,混合均匀,4℃反应,结束后,使用甘氨酸终止。蛋白质浓度的测定:使用BCA法进行蛋白质浓度测定[7]。

2 结果与讨论

为考察对单修饰产物转化率影响的各种因素,固定反应温度为4℃,探讨了p H值对单修饰产物体外活性保留的影响,以及离子类型、离子强度、蛋白质浓度、修饰剂/蛋白质配比、反应时间等条件对修饰转化率的影响。

(1)在修饰剂类型、分子量固定的情况下,修饰反应条件对单修饰产物体外活性保留的影响主要取决于修饰位点。只有修饰位点远离蛋白质活性部位的时候,修饰蛋白才能得到较高的活性保留。不同氨基酸残基,其p Ka值不同,因而在不同的p H值条件下,其亲核性有较大差别。因而溶液的p H值影响了蛋白质的修饰位点,是影响修饰产物活性的最主要要因素。图1显示了p H对单修饰产物活性保留的影响。可以看出,单修饰产物体外活性随着p H值的增大先增大后减小,在p H5.5时单修饰产物活性最高。推测可能由于在p H=5.5的条件下,m PEG-ALD主要修饰在蛋白N端氨基酸上,从而保留了较高的体外生物学活性(见图1)。

(2)修饰反应条件对单修饰产物转化率的影响。1)离子类型和离子强度:实验在相同p H值下(p H5.5),考查了不同离子类型对单修饰转化率的影响。选取了磷酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液3种缓冲体系,发现离子类型对单修饰转化率的影响并不明显,在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系中,修饰转化率略大于其它两种溶液。为继续考查离子强度对对单修饰产物转化率的影响,选取了5、20、35mmol/L四个离子强度,发现单修饰产物的转化率随着离子强度变化较小,20mmol/L之后基本不变。2)蛋白浓度:蛋白浓度对单修饰转化率的影响见图2。单修饰产物的转化率随着蛋白质浓度的增加而增大。但是由于过高浓度下蛋白质很不稳定,容易聚集沉淀,因此选择蛋白浓度10mg/m L作为最佳反应条件(见图2)。

(3)反应时间。反应时间对修饰转化率的影响见图3。单修饰和多修饰产物均随着反应时间的增大而增加,10h后,单修饰产物的增加不加明显。反应到10h的时候,单修饰产物的含量不再增加。因此,选择10h作为最佳反应条件(见图3)。

(4)修饰配比。饰配比对单修饰转化率的影响见图4。可以看出,单修饰产物的转化率随着修饰剂/蛋白配比的增加而增大。对修饰剂/蛋白配比进行进一步的探讨:随着修饰剂/蛋白配比的逐渐增加,多修饰蛋白的转化率逐渐增加,单修饰产物转化率先增大后减小,在4:1的条件下存在最大值。可能原因是由于蛋白质浓度以及修饰剂/蛋白质配比的增加,使得蛋白质和修饰剂分子的碰撞机会增大,从而促进了修饰反应的进行(见图4)。

综上所述,得到10k D聚乙二醇丙醛修饰精氨酸酶的优化修饰条件,即在4℃下,在20mmol/L,p H5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中,蛋白浓度为10mg/m L时,修饰剂/蛋白摩尔配比为4∶1的情况下,反应10h。该种条件下,单修饰产物的转化率可达50%。

3 结语

本研究采用分子量为10000的单甲氧基聚乙二醇丙醛对精氨酸酶进行了修饰,探讨了各修饰反应条件的影响,得到优化的反应条件,即在4℃下,在20mmol/L,p H5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中,蛋白浓度为10mg/m L时,修饰剂/蛋白摩尔配比为4∶1的情况下,反应1 0 h。在最佳反应条件下,单修饰转化率可达到50%。本研究的修饰反应,为进一步的实验奠定了基础。

摘要：精氨酸酶,又名L-精氨酸尿素水解酶,是一种将精氨酸水解成鸟氨酸和尿素的水解酶,本身为内源性蛋白酶,在人体内尿素循环中起到重要作用。工业上可利用其水解活性以精氨酸生产鸟氨酸。另外,精氨酸酶还有着显著的抑制肿瘤细胞分裂的作用[1～2]。但是,在临床应用中,存在以下缺点:体内循环半衰期短,易被循环系统清除,需要多次给药等问题,给患者的日常生活带来很大的不便。而聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)化学修饰能够降低蛋白免疫原性以及有效延长药物半衰期,是解决上述问题的有效途径之一[3]。

关键词：人Ⅰ型精氨酸酶,聚乙二醇

参考文献

[1] 李大力,郑迎迎.人工型精氨酸酶基因的克隆及其酵母表达[J].化学与生物工程,2008,23:47～49.

[2] 杨成丽,郑迎迎,柯前进,李大力.人工型精氨酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J].化学与生物工程,2007,24:53～55.

[3] Pool R.Hairy enzymes stays in the blood.Science,1990,248:305.

[4] Abuchowski A,Kazo GM,Verhoest CR.Cancer therapy with chemically modified enzymes.Cancer Biochem Biopys,1984,7(2):175～186.

[5] Chinese Pharmacopoeia,appendix29.Chinese Pharmacopoeia Committee,2005.中华人民共和国药典2005版,附录29.国家药典委员会,2005.