天门冬氨酸酶（精选五篇）
天门冬氨酸酶 篇1
酪氨酸酶 (Tyrosinase) 是广泛存在于人体、动物、植物及微生物中的含铜氧化还原酶[5], 具有奇特的催化作用, 是生物体内黑色素合成的关键酶, 与皮肤的衰老及恶性黑色素瘤的发生有着紧密的关系[6]。酪氨酸酶的活性受到酪氨酸酶抑制剂的抑制, 使生物体内不能正常地合成黑色素。因此, 在医学和化妆品领域中常采用酪氨酸酶抑制剂来预防和治疗色素沉积、黑色素瘤等。此外, 酪氨酸酶抑制剂还可用作果蔬的防腐及害虫的调控剂[7]。当前对酪氨酸酶抑制剂的研究已经引起相关研究学者的高度重视。丝胶蛋白具有抑制酪氨酸酶的活性是由日本学者Kato[8]首先发现。自此之后, 尽管也有丝胶蛋白抑制酪氨酸酶活性的报道, 但是绝大多数所研究的丝胶蛋白都是利用有机溶剂从工业废水中进行提取, 很大程度上制约了丝胶蛋白在皮肤护理产品、食品添加剂等领域的应用[9]。安徽省农业科学院蚕桑研究所陈复生等[10]根据多年的家蚕遗传育种工作, 选育得到全天然丝胶茧, 其天然活性物质—丝胶蛋白不仅含量丰富, 而且对皮肤的刺激性小、乳化性能优良、安全性高, 因而在化妆品和保健食品等行业中具有广阔的发展前景。
本研究以育成的天然丝胶茧为材料, 从中提取丝胶蛋白, 采用多种蛋白酶进行酶解, 从中选取最佳蛋白酶;通过测定丝胶蛋白及其酶解产物的溶解性, 并以多巴为底物, 分析其对酪氨酸酶活性的抑制作用, 为发掘丝胶蛋白这一优质蛋白质的应用潜能提供理论基础和科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料和主要试剂
天然丝胶茧品种:绿S, 由本单位选育并饲养。饲养温度在25℃左右, 常规桑叶育, 化蛹后取茧壳作为实验材料。中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶 (南宁庞博生物工程有限公司) , 十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷、低标准蛋白质分子量 (Takara公司) , 蘑菇酪氨酸酶、L-多巴 (美国Sigma公司) , 其他试剂均为分析纯。
1.2 丝胶蛋白粉的制备
温水洗涤蚕茧, 60℃烘干后剪碎。准确称取5.00g碎茧壳, 加入到含250mL去离子水的烧瓶中, 于高温灭菌锅中125℃煮沸2.5h。室温冷却后采用四层纱布过滤, 将所获得的丝胶溶液进行真空抽滤, 于60℃旋转蒸发至约100mL。将丝胶蛋白浓缩液在-40℃下预冻2h后于-33℃, 压强1Pa条件下进行冷冻真空干燥, 所得丝胶粉末即为丝胶蛋白粉[11]。
1.3 蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果
参照文献[12]的方法选取中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对提取的丝胶蛋白进行酶解。在pH 7.0、反应温度50℃、酶浓度为0.5%、底物浓度10%、反应时间1h的条件下进行酶解。反应结束后立即加热至95℃, 保持5min, 进行灭酶活处理。待溶液冷却至室温, 即可将获得的丝胶蛋白酶解产物采用聚丙烯酰氨凝胶电泳法 (SDS-PAGE, 10%分离胶, 5%浓缩胶) 测定其分子量大小。将所得的丝胶蛋白酶解产物浓缩、冷冻干燥, 研磨成粉末状备用。
1.4 丝胶蛋白及其酶解产物的溶解性
准确称取1.00g丝胶蛋白及酶解产物, 配成质量百分比为10%的悬浮液, 于95℃水浴锅中振荡保温2.5h后, 5000r/min转速下离心30 min, 然后将上清液置于平面皿中烘干 (60℃) , 称取溶出物的质量, 根据以下公式计算溶解率。
其中m为溶出物的干质量, m0为样品的干质量。每个样品平行测定3次。
1.5 酪氨酸酶活性的抑制率测定
在黑色素合成的过程中, 酪氨酸在酪氨酸酶的作用下转化为多巴。多巴又被酪氨酸酶催化为多巴醌。多巴醌是体内黑色素合成的一个中间体, 也是一种有色物质, 可用分光光度计在475nm处测定其含量[13]。
准确吸取丝胶蛋白或酶解产物溶液、磷酸缓冲液 (pH 6.8) 、L-多巴溶液 (0.5mg/mL) 比色管中混合均匀, 25℃下放置约10min, 缓慢加入适量的酪氨酸酶液, 迅速转移到石英比色皿中, 于475nm处测第10min的吸光度。pH6.8的磷酸缓冲液为参比, 总反应体系为5mL。具体各组分含量见表1。
酪氨酸酶活性的抑制率 (%) =[1- (OD3–OD4) / (OD1–OD2) ]×100%
2 结果与分析
2.1 蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果
在蛋白酶 (木瓜/中性/碱性蛋白酶) 浓度为0.5%, pH 7.0, 50℃, 底物浓度10%, 反应时间1h的条件下, 分析这3种蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果。由图1可以看出, 丝胶蛋白的分子量在14~97.2kDa均有分布;丝胶蛋白经木瓜蛋白酶降解后, 其酶解产物的分子量集中分布在14~29kDa;而中性蛋白酶和碱性蛋白酶对丝胶蛋白的水解作用与对照组 (无蛋白酶) 相比几乎没有差别。显而易见, 木瓜蛋白酶对丝胶蛋白的酶解功效优于其他两种蛋白酶。因此, 选取丝胶蛋白的木瓜蛋白酶酶解产物进行下一步研究。
1—对照组 (无蛋白酶) 2—木瓜蛋白酶3—中性蛋白酶4—碱性蛋白酶M—蛋白标准
2.2 丝胶蛋白及酶解产物的溶解性
如表2所示, 酶解产物的平均溶解率 (68.83%) 高于丝胶蛋白 (52.77%) 。猜想原因可能是丝胶蛋白的肽链被木瓜蛋白酶切断, 蛋白质的高级结构受到损坏, 从而使水解产物本身含有的亲水性基团暴露出来, 与外界的水更易结合, 最终使其溶解性增强[14]。
2.3 丝胶蛋白及其酶解产物抑制酪氨酸酶的活性
丝胶蛋白及其酶解产物都具有不同程度的抗酪氨酸酶活性的能力 (图2) 。在相同的浓度下, 酶解产物对酪氨酸酶活性的抑制率要高于丝胶蛋白, 可能是因为酶解产物的分子量较小。随着质量分数的增加, 丝胶蛋白对酪氨酸酶活性的抑制率也随之提高, 说明丝胶蛋白的浓度与酪氨酸酶活性的抑制作用成正相关关系。酶解产物对酪氨酸酶活性的抑制率也出现类似现象, 呈剂量依赖性。
3 讨论
采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性白酶降解高分子量的丝胶, 结果显示木瓜蛋白酶降解能力高于其他两种蛋白酶。SDS-PAGE结果显示使用木瓜蛋白酶在反应条件为反应温度50℃、底物浓度10%、pH 7.0、酶浓度0.5%、反应时间为1h, 可以获得在14~29kDa范围的酶解产物 (图1) 。这是因为木瓜蛋白酶隶属于巯基蛋白酶, 首先分解精氨酸、赖氨酸的羧基端[15]。而丝胶蛋白含有较为丰富的精氨酸, 经木瓜蛋白酶酶解后, 释放出小分子的多肽和游离氨基酸[14]。这就说明了丝胶蛋白经木瓜蛋白酶降解后产物的分子量大幅减少。
丝胶蛋白中含有大量的亲水性氨基酸, 其中绝大多数都能够被人体吸收, 并且含有类黄酮等活性物质[16]。而黄酮类物质已经被证实具有抑制酪氨酸活性的作用[17]。这从理论上阐明了丝胶蛋白抑制酪氨酸酶活性的机制。本研究及前人的研究结果也进一步证明丝胶蛋白能够抑制酪氨酸酶活性[18]。
在本研究中, 丝胶蛋白的酶解产物对酪氨酸酶同样具有抑制作用, 且随着酶解产物浓度的增加, 其对酪氨酸酶的抑制率也随之提高, 呈现一定的剂量依赖性。这是因为丝胶蛋白经木瓜蛋白酶降解后产生了小分子量的丝胶多肽。这些多肽中又含有丰富的羟基、羧基等官能团, 使其与微量元素如铜、铁络合的几率大大提高, 最终抑制了酪氨酸酶的活性[7,8]。
丝胶及其水解产物可以根据其分子量大小应用到不同的领域中。10~70kDa的丝胶多肽与胰岛素共轭结合后添加到糖尿病小鼠中, 结果发现这种经过改良后的药物能够起到缓释作用[19];4~60kDa的丝胶多肽能够头发护理产品中常用的添加剂—水溶性的壳聚糖衍生物以及三甲胺衍生物发生相互作用, 更好地发挥产品的优良性能[12];平均分子量为30kDa的丝胶多肽可以取代哺乳类动物、昆虫细胞培养基中的胎牛血清, 从而大幅度地降低成本[20];低于20kDa的丝胶多肽还可以应用到包括皮肤和头发护理产品的化妆品、保健品和药物中[21]。
注射用门冬酰胺酶说明书 篇2
汉语拼音：Zhusheyong Mendongxian’anmei
【主要成分】注射用门冬酰胺酶主要成分为：门冬酰胺酶
【性状】 注射用门冬酰胺酶为白色冻干块状物。
【药理毒理】
注射用门冬酰胺酶为取自大肠杆菌的酶制剂类抗肿瘤药物，能将血清中的门冬酰胺水解为门冬氨酸和氨，而门冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必需的氨基酸。
正常细胞有自身合成门冬酰胺的功能，而急性白血病等肿瘤细胞则无此功能，因而当用注射用门冬酰胺酶使门冬酰胺急剧缺失时，肿瘤细胞因既不能从血中取得足够门冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白质合成受障碍，增殖受抑制，细胞大量破坏而不能生长、存活。
注射用门冬酰胺酶亦能干扰细胞DNA、RNA的合成，可能作用于细胞G1增殖周期中，为抑制该期细胞分裂的细胞周期特异性药。
【药代动力学】
注射用门冬酰胺酶经肌肉或静脉途径吸收，血浆蛋白结合率约30%，吸收后能在淋巴液中测出，但在脑脊液中的浓度很低。注射注射用门冬酰胺酶后，血中门冬酰胺浓度几乎立即下降到不能测出的水平，说明注射用门冬酰胺酶进入体内后，很快就开始作用。
经肌内注射的血浆t1/2为39～49小时，静注的血浆t1/2为8～30小时。肌注后的达峰时间为12～24小时，但停用注射用门冬酰胺酶后的23～33日，血浆中还可以测出门冬酰胺，注射用门冬酰胺酶排泄似呈双相性，仅有微量呈现于尿中。
【适应症】
适用于治疗急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病及非霍奇金病淋巴瘤、黑色素瘤等。
注射用门冬酰胺酶对上述各种瘤细胞的增殖有抑制作用，其中对儿童急淋的诱导缓解期疗效好，有时对部分常用化疗药物缓解后复发的患者也可能有效，但单独应用时缓解期较短，而且容易产生耐药性，故多与其他化疗药物组成联合方案应用，以提高疗效。
【用法用量】
根据不同病种，不同的治疗方案，注射用门冬酰胺酶的用量有较大差异。
以急淋的诱导缓解方案为例：剂量可根据体表面积计，日剂量500单位/m2，或1000单位/ m2，高可达单位/ m2;以10～20日为一疗程。
【不良反应】
成人似较儿童多见。
(1)较常见的有过敏反应、肝损害、胰腺炎、食欲减退，凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ及纤维蛋白原减少等，过敏反应的主要表现为突然发作的呼吸困难、关节肿痛、皮疹、皮肤瘙痒、面部水肿，严重者可发生呼吸窘迫、休克甚至致死。
在用肌注给药的晚期儿童白血病，虽其轻度过敏反应的发生率较高，但有报告认为其严重过敏反应的发生率较静注给药低。过敏反应一般在多次反复注射者易发生，但曾有在皮内敏感试验(简称皮试)阴性的患者发生。
另有某些过敏体质者，即使注射做皮试剂量的门冬酰胺酶时，偶然也会产生过敏反应。
肝脏损害通常在开始治疗的2周内发生，可能出现多种肝功能异常，包括血清丙氨酸氨基转移酶[ALT(SGpT)]、门冬氨酸氨基转移酶[AST(SGOT)]、胆红素等升高、血清白蛋白等降低，曾有经肝穿刺活检证实有脂肪肝病变的病例
患者如感觉剧烈的上腹痛并伴有恶心、呕吐，应疑有急性胰腺炎，其中暴发型胰腺炎很危重，甚至可能致命。其他尚有恶心、呕吐、腹泻等。
(2)少见的有血糖升高、高尿酸血症、高热、精神及神经毒性等。血糖过高患者有多尿、多饮、口渴症状，其血浆渗透压可能升高而血酮含量正常。高血糖经停用注射用门冬酰胺酶，或给予适量胰岛素及补液可以减轻或消失，但少数严重的可以致死。
高尿酸血症常发生在开始治疗时，由于大量肿瘤细胞快速破坏，致使释放出的核酸分解的尿酸量增多，严重的可引起尿酸性肾病、肾功能衰竭。
精神及神经毒性表现为程度不同的嗜睡、精神抑制、精神错乱、情绪激动、幻觉，偶可发生帕金森综合征等。其他尚有白细胞减少、免疫抑制、口腔炎等。
(3)罕见的有因低纤维蛋白原血症及凝血因子减少的出血、低脂血症、颅内出血或血栓形成、下肢静脉血栓及骨髓抑制等。凝血因子减少与注射用门冬酰胺酶抑制蛋白质合成有关。
(4)其他：尚有血氨过高、脱发、血小板减少、贫血等。
要重视出现的不良反应，对其性质要仔细分析，凡有可能引起严重后果的，应立即停用注射用门冬酰胺酶，并结合具体表现给相应的治疗措施，危急的要积极抢救。
【禁忌症】
下列情况禁用：
①对注射用门冬酰胺酶有过敏史或皮试阳性者;
②有胰腺炎病史或现患胰腺炎者;
③现患水痘、广泛带状疱疹等严重感染者。
【注意事项】
(1)来源于埃希大肠杆菌与来源于欧文菌族Erwinia carotora的门冬酰胺酶间偶有交叉敏感反应。
(2)对诊断的干扰：
①甲状腺功能试验，首次注射注射用门冬酰胺酶的2日内，患者血清中的甲状腺结合蛋白浓度下降，直至后一次注射注射用门冬酰胺酶后的4周内，浓度才恢复正常;
②由于门冬酰胺的分解，血氨及尿素氮浓度可能增加;
③血糖、血尿酸及尿尿酸可能增加;
④在治疗的初3周内，部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间等可能延长，血小板计数可能增加;
⑤由于注射用门冬酰胺酶抑制血浆蛋白的合成，患者的血浆纤维蛋白原、抗凝血酶、纤维蛋白溶酶原、血清白蛋白的浓度可能降低;
⑥如有肝功能异常提示为肝毒性、肝损害的征兆;
⑦血清钙可能降低。
(3)下列情况慎用：
①糖尿病;
②痛风或肾尿酸盐结石史;
③肝功能不全、感染等;
④以往曾用细胞毒或放射治疗的患者。
(4)在治疗开始前及治疗期间随访下列检测：周围血象、血浆凝血因子、血糖、血清淀粉酶、血尿酸、肝功能、肾功能、骨髓涂片分类、血清钙、中枢神经系统功能等。
(5)由于注射用门冬酰胺酶能进一步抑制患者的免疫机制，并增加所接种病毒的增殖能力、毒性及不良反应，故在接受注射用门冬酰胺酶治疗的3个月内不宜接受活病毒疫苗接种，另与患者密切接触者的口服脊髓灰质炎疫苗时间亦应推迟。
(6)给药说明：
①患者必须住院，在对肿瘤化疗有经验的医生指导下治疗，每次注射前须备有抗过敏反应的药物(包括肾上腺素、抗组胺药物、静脉用的类固醇药物如地塞米松等)，及抢救器械。
②凡首次采用注射用门冬酰胺酶或已用过注射用门冬酰胺酶但已停药一周或一周以上的患者，在注射注射用门冬酰胺酶前须做皮试。
皮试的药液可按下列方法制备：加5ml的灭菌注射用水或氯化钠注射液入小瓶内摇动，使小瓶内10000单位的门冬酰胺酶溶解，抽取0.1ml(每1ml含2000单位)，注入另一含9.9ml稀释液的小瓶内，制成浓度约为1ml含20单位的皮试药液。
用0.1ml皮试液(约为2.0单位)做皮试，至少观察1小时，如有红斑或风团极为皮试阳性反应。患者必须皮试阴性才能接受注射用门冬酰胺酶治疗。
③应从静脉大量补充液体，碱化尿液，口服别嘌醇，以预防白血病或淋巴瘤患者发生高尿酸血症和尿酸性肾病。
④由于使用注射用门冬酰胺酶后会很快产生抗药性，故注射用门冬酰胺酶不宜用作急淋等患者缓解后的维持治疗方案。
⑤注射用门冬酰胺酶可经静滴、静注、或肌注给药。静注前必须用灭菌注射用水或氯化钠注射液加以稀释，每10000单位的小瓶稀释液量为5ml。
静注给药时，注射用门冬酰胺酶应经正在输注的氯化钠或葡萄糖注射液的侧管注入，静注的时间不得短于半小时。静滴法给药，注射用门冬酰胺酶要先用等渗液如氯化钠或5%葡萄糖注射液稀释，然后加入氯化钠或5%葡萄糖注射液中滴入。
③肌内注射，先要在含注射用门冬酰胺酶10000单位的小瓶内加入2ml氯化钠注射液加以稀释，每一个肌注部位每一次的肌注量不应超过2ml。不论经静脉或肌内注射，稀释液一定要成澄清才能使用，且要在稀释后8小时内应用。
【孕妇及哺乳期妇女用药】
由于不能排除注射用门冬酰胺酶有潜在的致畸胎、致突变和致继发性癌的作用，妊娠3个月内的孕妇避免使用。由于考虑到注射用门冬酰胺酶对婴儿的危害，在哺乳期间接受治疗的乳母应停止哺乳。
【药物相互作用】
(1)泼尼松或促皮质素或长春新碱与注射用门冬酰胺酶同用时，会增强注射用门冬酰胺酶的致高血糖作用，并可能增多注射用门冬酰胺酶引起的神经病变及红细胞生成紊乱的危险性，但有报告如先用前述各药后再用注射用门冬酰胺酶，则毒性似较先用注射用门冬酰胺酶或同时用两药者为轻。
(2)由于注射用门冬酰胺酶可增高血尿酸的浓度，故当与别嘌醇或秋水仙碱、磺吡酮等抗痛风药合用时，要调节上述抗痛风药的剂量以控制高尿酸血症及痛风。一般抗痛风药选用别嘌醇，因该药可阻止或逆转门冬酰胺酶引起的高尿酸血症。
(3)糖尿病患者用注射用门冬酰胺酶时及治疗后，均须注意调节口服降糖药或胰岛素的剂量。
(4)注射用门冬酰胺酶与硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、环孢素、巯嘌呤、单克隆抗体CD3或放射疗法合用时，可提高疗效，因而应考虑减少化疗药物、免疫抑制剂或放射疗法的剂量。
(5)注射用门冬酰胺酶与甲氨蝶呤同用时，可通过抑制细胞复制的作用而阻断甲氨蝶呤的抗肿瘤作用。有研究说明如门冬酰胺酶在给甲氨蝶呤9～10日前应用或在给甲氨蝶呤后24小时内应用，可以避免产生抑制甲氨蝶呤的抗肿瘤作用，并可减少甲氨蝶呤对胃肠道和血液系统的不良反应。
【规格】10000单位
【贮藏】遮光、，密闭，冷处保存
【批准文号】国药准字H3914
【生产厂家】广州白云山明兴制药有限公司
丙氨酸氨基转移酶为什么会升高 篇3
我是一名糖尿病患者。我的血糖水平一直控制得很好。但最近的一次体检结果显示，我的丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平有了轻度的升高。当时，医生怀疑我得了肝炎，但经过多方面的检查却未能确诊。后来医生说我出现这种情况可能是服用降糖药拜唐平引起的。但是我停止服用该药后，我的丙氨酸氨基转移酶的水平并未恢复正常。请问，人的丙氨酸氨基转移酶为什么会升高，我该怎么办？
山西 秦佳慧
秦佳慧读者：
多年来，丙氨酸氨基转移酶一直是人们进行体检和对肝病进行筛查时的常规检查项目。在我国，在无症状的乙型病毒性肝炎和丙型病毒性肝炎患者中，丙氨酸氨基转移酶升高是一项较为常见的敏感指标。而在国外（如在美国），人们出现丙氨酸氨基转移酶水平异常，其最常见的原因则是患有非酒精性脂肪性肝病。人们使用某些药物时也会出现丙氨酸氨基转移酶水平异常。因此，人们在使用药物的过程中都应注意监测肝功能的变化。如果患者的丙氨酸氨基转移酶的水平升高了，则意味着其可能存在药物性的肝脏损伤。不过，有些药物所致的丙氨酸氨基转移酶的改变往往是可逆的，如人们使用拜唐平、他汀类药物之后出现的丙氨酸氨基转移酶的改变是可以自然恢复的，并不需要停药。
近几年的研究还发现，一些非肝病因素也可以使人们的丙氨酸氨基转移酶发生改变，如男性患有高胆固醇血症、经常饮酒等，女性出现血糖升高、使用避孕药等以及人们的体质指数发生改变、患有高甘油三酯血症等因素都可以使丙氨酸氨基转移酶的水平升高。此外，丙氨酸氨基转移酶升高还与一些全身性疾病如肥胖、代谢综合征以及心血管疾病等密切相关。美国、韩国的科学家们所做的相关研究都发现，在丙氨酸氨基转移酶水平高于或等于100单位/升的人群中，由于患有心血管疾病而死亡的人数明显高于丙氨酸氨基转移酶低于20单位/升的人群。
一个人的丙氨酸氨基转移酶的水平是其健康状况的一种反映。如果已经出现了丙氨酸氨基转移酶水平升高的情况，那么无论是哪种原因引起的，都应该积极地查明原因，及时地予以纠正和进行治疗。
亮氨酸脱氢酶研究进展及其工业应用 篇4
鉴于亮氨酸脱氢酶在催化制备L-亮氨酸、叔亮氨酸等方面的优势, 筛选高活性亮氨酸脱氢酶菌株以及对菌株的改造对于工业化生产具有重要意义。本文主要综述了亮氨酸脱氢酶的研究进展及其在工业化应用中需要解决的难题。
1 亮氨酸脱氢酶研究进展
1.1 亮氨酸脱氢酶简介
亮氨酸脱氢酶 (Leucine Dehydrogenase, LDH.EC 1.4.1.9) 是一种NAD+-依赖型的氧化还原酶, 它可逆地催化L-亮氨酸和一些支链L-氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物 (见图1) 。该酶在芽孢杆菌中有较高表达水平, 主要参与支链L-氨基酸的体内代谢。Sanwal和Zink[4]于1961年首先在芽孢杆菌属的Bacillus cereus发现并纯化了亮氨酸脱氢酶。Hermier等[5]的研究表明其在芽孢杆菌的芽孢形成过程发挥了非常重要的作用。
另外, 亮氨酸脱氢酶可用于支链脂肪酸及其酮酸类似物的测定[6]。该酶用于脲酶-亮氨酸脱氢酶偶联法测定血清尿素, 具有较好的抗内源氨干扰能力[7]。Oki等[8]发现结晶型的亮氨酸脱氢酶对Ehrlich腹水癌显示抗肿瘤活性。
1.2 高活性亮氨酸脱氢酶菌种筛选
高活性亮氨酸脱氢酶菌株已被筛选出来 (见表1[9]) 。Bacillus cereus和Bacillus sphaericus属于常温菌株, 但是从其体内分离得到的亮氨酸脱氢酶仍具有较高的热稳定性[10]。从嗜热菌株中分离的亮氨酸脱氢酶具有更高的热稳定性。来自Clostridium thermoaceticum厌氧嗜热菌中的亮氨酸脱氢酶基因经克隆在大肠杆菌中表达, 相比野生型, 其活性提高了900倍[11]。酶的热稳定为下游分离纯化过程提供了便利, Schutte等[12]从Bacillus cereus菌体出发, 经原液热处理, 双水相萃取, 层析, 酶液产率达到48%和95倍的富集。酶的高稳定性也有利于工业上的连续反应过程, 因为酶活半衰期影响催化过程的经济性。Ohshima等[13]研究比较了常温和高温亮氨酸脱氢酶生产亮氨酸的连续反应过程, 研究显示高温亮氨酸脱氢酶比常温酶的热稳定性更强, 在更宽的pH范围内显示活性。
1.3 亮氨酸脱氢酶酶学性质及动力学参数
四种不同来源的亮氨酸脱氢酶已经被纯化鉴定 (见表2[9]) 。它们在分子量, 亚基数目, 最适温度, 最适pH上略有不同, 这四种酶的有工业应用价值的动力学参数几乎相同。
比活测定, 最佳pH值以4-甲基-2-羰基戊酸为底物。
1.4 亮氨酸脱氢酶的底物特异性
Li等[16]研究了B.sphaericus ATCC4525来源的亮氨酸脱氢酶的底物特异性。在八种酮酸底物中, 该酶对所有脂肪族α-酮酸显示活性, 对芳香族α-酮酸无活性。这个现象与其他已知的亮氨酸脱氢酶类似。脂肪族α-酮酸的结构对酶活影响较大;酶对除天然底物 (L-亮氨酸) 外的其他α-氨基酸也显示活性, 但是支链基团大小和长度对酶活影响非常大。
Kunishige等[17]定点突变亮氨酸脱氢酶中对底物侧链有识别功能的40, 113, 291, 294位氨基酸残基, 其中113, 291位主要识别氨基酸侧链基团大小, 40, 294位主要识别氨基酸疏水性和极性强弱。研究发现, 野生型酶的113位A突变成G, 291位V突变成L后, 对芳香族侧链的底物如L-苯丙氨酸显示了活性。而野生型的40位L突变成K, 294位V突变成S后, 对极性氨基酸如L-天冬氨酸和L-谷胱氨酸显示了活性;40位L突变成D, 294位V突变成S后, 对疏水性氨基酸如L-精氨酸和L-赖氨酸显示了活性。
1.5 亮氨酸脱氢酶基因工程菌构建
不同来源的亮氨酸脱氢酶基因工程菌都已成功构建, 并对其结构和功能进行了研究。Bacillus cereus (DSM 626) 来源的亮氨酸脱氢酶基因长度1 101bp, 编码39.9×103的多肽。经大肠杆菌表达的活性酶占到可溶性蛋白的30%[18]。Bacillus lichniformis来源的酶由8个相同亚基组成, 亚基大小43×103。经克隆在E.coli JM109中表达, 经离子交换层析收率占31%。该酶的最大优点是耐受高浓度的盐溶液[19]。Bacillus sphaericus IFO3525来源的酶亚基大小39.8×103。该酶C末端的6个氨基酸影响酶的八聚体形成, 去除C末端6个氨基酸后, 酶活性丧失[20]。Bacillus stearothermophlius来源的酶由6个亚基组成, 亚基大小49×103。经研究该亚基174-206位为辅酶结合位点, 负责与NADH结合;87-124位为催化位点, 其中的赖氨酸残基对酶催化活性有重要作用。通过对比不同来源的亮氨酸脱氢酶氨基酸序列, 他们之间有较高的同源性[21]。
亮氨酸脱氢酶工程菌的构建为大量获得该酶提供了便利, 有利于进一步研究酶的结构和功能之间的联系。通过蛋白质工程定向改造, 为制备适合工业化生产的亮氨酸脱氢酶提供理论支持。
2 亮氨酸脱氢酶的工业化应用
一般来说, 手性化合物的大规模酶促催化合成需要高效的辅酶原位再生过程。另外, 为了提高昂贵辅酶的利用率, 工业生产要求连续化操作。由于亮氨酸脱氢酶催化的反应需要NADH作为辅酶, 而NADH价格昂贵, 不适合工业添加。所以一个廉价, 高效, 连续的NADH辅酶再生系统可以有效解决亮氨酸脱氢酶的工业应用难题。
2.1 辅酶再生策略
甲酸脱氢酶 (formate dehydrogenase, FDH) 在辅酶再生中的应用己成为辅酶酶法再生研究领域的热点之一[22]。甲酸/甲酸脱氢酶体系是最成功的再生系统, 并己应用于工业生产。其优势在于: (1) 反应不可逆, (2) 甲酸价格低廉并且很多酶对甲酸有很高的耐受性, (3) 此反应只产生一种副产物CO2, 而CO2对大多数酶的活性没有影响;同时CO2作为一种气体, 很容易从反应体系中逃逸出来。
甲酸脱氢酶 (FDH) 与氨基酸脱氢酶 (LDH) 偶联反应如图2[23]所示。
黎舒婷等[24]利用亮氨酸脱氢酶基因工程菌和甲酸脱氢酶基因工程菌进行混合全细胞生物转化反应。探索了以三甲基丙酮酸为底物酶法合成叔亮氨酸的最佳反应条件。
Andrey等[25]构建了包含FDH和LDH基因的重组质粒pFDHLeuDH2, 并在E.coli TG1中共表达FDH和LDH融合蛋白, 催化α-酮酸生成L-氨基酸。重组质粒如图3所示.
FDH和LDH在单个细胞中的同时表达有效促进了NADH循环。研究发现NADH的胞内浓度足以使氨基酸产物终浓度达到0.3mol/L。然而由于存在辅酶降解[26], 氨基酸产量相应地受到限制。
2.2 酶膜反应器
酶膜反应器可应用于多酶系统的同相催化和酶截留。由于辅酶分子量较小, 容易穿过滤膜。Buckmann等[27]介绍了一种高效的辅酶固定修饰方法。通过化学方法把辅酶固定在水溶性的聚合物 (如聚乙二醇) , 超滤膜截留率可达到99.9%。
值得注意的是, 经修饰的辅酶与原酶的亲和力会发生变化进而影响酶活。大部分的研究显示, 经辅酶修饰后, 原酶的Km值变化了一个数量级, 而Vmax变化不大。令人惊喜的是, 经修饰的NADH使甲酸脱氢酶酶活提高了1.5倍[9]。
德国Degussa公司利用Candida boidinii中的FDH实现了大规模生产L-亮氨酸。该工业规模的辅酶再生系统采用了持续超滤膜 (UF) 反应器[28], 原理见图4。
对于L-亮氨酸的生产 (见表3) , 从时空收率和酶消耗上来说, FDH系统明显优于D, L-HmpDH系统[29]。从底物经济性来看, 化学稳定性高, 便宜易得的羟基酸优于酮酸[30]。
3 展望
针对亮氨酸脱氢酶的研究将随着蛋白质工程、基因工程的发展而不断深入, 今后亮氨酸脱氢酶的研究可集中在以下几个方面:
(1) 通过氨基酸定点突变技术进行定向进化, 提高LDH的热稳定性、化学稳定性和操作稳定性, 使LDH适用于有机溶剂催化体系、高温反应体系的工业化的反应模式。
(2) 运用基因工程手段实现LDH的高效表达, 提高LDH的生产效率, 降低生产成本, 实现LDH的广泛应用。
天门冬氨酸酶 篇5
【关键词】 培门冬酶；化疗；淋巴瘤；不良反应
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.03.475 文章编号：1004-7484（2014）-03-1570-02
培门冬酶是一种聚乙二醇化学耦联修饰以后形成的一种新型门冬酰胺酶蛋白制剂，同时它也是治疗急性淋巴细胞性白血病的首选药物[1]。其治疗的临床效果和左旋们冬酰胺酶大体相同，但是该药物的免疫原性较低，药物半衰期延长[2]。我院近两年收治的46例淋巴瘤患者，采用培门冬酶联合化疗治疗，取得了理想的效果，现临床报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料 选取我院2012年5月——2013年5月期间采用培门冬酶联合化疗治疗的46例淋巴瘤患者为本次研究对象，其中男28例，女18例，年龄为（31-43）岁，平均年龄为（35.87±6.39）岁，且所有患者均符合张之南的《血液病诊断及疗效标准》[3]。
1.2 治疗方法 泼尼松每天40mg/m2，口服，每天三次，服用（8-30）天左右；柔红霉素25mg/m2，服用；长春新碱每次1.5mg/m2，服用；门冬酰胺酶6000IU/m2。在化疗之前对患者进行常规检查，结果显示凝血功能、肝肾功能、心电图以及血糖、血淀粉酶都正常。给予患者化疗之前5%的葡萄糖注射液100ml配合葡萄糖酸钙1g、异丙嗪12.5mg、地塞米松10mg，行肌肉注射，有效预防过敏。速效胰岛素6U皮下注射在化疗后能够有效防止血糖升高，在化疗前后静脉注射托烷司琼5mg，能够有效减轻胃肠道反应。注意在用L-ASP的前3天左右停止用药（3-5）天能够减少胰腺炎的发生概率，口服服用嘌呤能够预防尿酸性肾病。
1.3 观察指标 化疗之前检查所有患者的骨髓象，待化疗结束3个星期后复查1次，以后每隔3个月复查1次，观察患者的病情缓解情况。在治疗期间每隔1周监测一次血糖、血常规、血尿淀粉酶以及生化、凝血等、密切观察患者的不良反应。
1.4 统计学分析 选用SPSS20.0统计学软件对本次研究所得数据进行统计分析，计数资料用X2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
46例患者中，其中NK/T细胞淋巴瘤患者31例，淋巴母细胞淋巴瘤患者15例。治疗总有效率达到73.9%（34/46），完全缓解率达到39.1%（18/46），部分缓解率达到34.8%（16/46）。并且发生的不良反应仍旧是骨髓抑制，其发生概率达到78.3%（36/46），其中有。12例（26.1%）患者出现低白蛋白血症，11例（24.0%）患者发生高脂血症，8例（39.1%）患者发生纤维蛋白原下降。所有患者均无过敏反应、或者出现急性胰腺炎、血栓等。
3 讨 论
培门冬酶联合化疗治疗淋巴瘤患者，不需要让患者进行过敏试验，但是过敏反应发生概率是天然L-天门冬酰胺酶的30%左右。在给患者用药之前必须详细询问其过去是否发生过培门冬酶过敏，以做好过敏反应的急救准备，在用药之后要密切观察患者1小时左右。按照变应原皮肤测试原理，把培门冬酶稀释到10kU/L，选取其中的0.1mL进行皮内试验[4]。在（0.5-1）个小时内观察结果。如果患者局部皮肤出现红晕，寿命测试为阳性。针对皮试阳性以及在治疗过程中发生过敏发硬的患者，需要進行脱敏治疗。采用皮内试验与脱敏治疗方法可以尽最大限度减少过敏反应的发生概率，促使患者顺利完成化疗。
选用培门冬酶治疗很容易引起患者的消化道发生不良反应，主要表现为腹痛、恶心、呕吐等不良症状，故在治疗的（0.5-2）小时之内给予患者注射托烷司琼等药物[5]。根据药效半衰期的长短，每隔（6-8）小时给一次药，暂停进食，并且及时清理患者的呕吐物，保持其口腔洁净。其次，在化疗过程中，患者的骨髓造血功能会受到严重的损害，细胞与体液的免疫功能有所下降，这是非常容易发生感染的高度危险人群。因此，在化疗之前必须多所有患者进行严格的检查，及时有效处理原来的感染灶，把患者置于单间或者是卫生条件较高的病房，尽可能减少探视陪同人员，保持患者病房空气的清新、干净，温度、适度适当。同时，还要定期采用消毒液擦拭患者室内家具地面，利用紫外线的照射进行消毒。
本次研究结果表明：培门冬酶联合化疗治疗淋巴瘤治疗总有效率达到73.9%（34/46），说明了其良好的治疗效果。总之，培门冬酶联合化疗治疗淋巴瘤的临床治疗效果较好，患者的耐受性良好，值得临床推广应用。
参考文献
[1] 王岳，李学荣.培门冬酶治疗儿童急性淋巴细胞性白血病的不良反应观察[J].现代生物医学进展，2011，7（14）：132-133.
[2] 平凌燕，郑文，王小沛等.培门冬酶联合化疗治疗淋巴瘤的安全性分析[J].中华医学杂志，2012，92（46）：224-225.
[3] 张之南.血液病诊断及疗效标准[M].北京：科学出版社，1999：184-194.
[4] 李宜亮，郭君武.原发性脑淋巴瘤的MRI表现与病理对照分析[J].当代医学，2011，7（24）：163-164.