L-半胱氨酸盐酸盐（精选七篇）
L-半胱氨酸盐酸盐 篇1
1 实验药品
1.1 供试品
L-鸟氨酸盐酸盐 (无锡某氨基酸有限公司, 批号:0130601、0130602、0130603, 规格:原料药, 包装:每袋5 g) 。
1.2 鲎试剂 (TAL)
TAL1:湛江安度斯生物有限公司, 批号:1209271, 规格:0.5 ml, 标示灵敏度λ=0.25 EU/ml;TAL2:湛江博康海洋生物有限公司, 批号:1305251, 规格:0.5 ml, 标示灵敏度λ=0.25EU/ml;TAL3:湛江安度斯生物有限公司, 批号:1305132, 规格:0.1 ml, 标示灵敏度λ=0.06 EU/ml;TAL4:湛江博康海洋生物有限公司, 批号:1304190, 规格:0.1 ml, 标示灵敏度λ=0.06 EU/ml。
1.3 细菌内毒素工作标准品
中国食品药品检定研究院, 批号:150601-201174, 每支含细菌内毒素160 EU。
1.4 细菌内毒素检查用水 (BET水)
湛江安度斯生物有限公司, 批号:1103110, 规格:50 ml, 内毒素含量<0.003 EU/ml。
2 方法与结果
按《中国药典》2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法项下凝胶法[2], 以及《中国药品检验标准操作规范》2010年版进行试验[3]。
2.1 供试品细菌内毒素限值 (L) 的确定
L-鸟氨酸盐酸盐主要用于生产复方氨基酸注射液, 目前尚无单方注射用制剂, 因此, 不能采用《中国药典》2010年版二部附录ⅪE规定的方法确定其细菌内毒素限值。目前国外药典亦无该产品的细菌内毒素检查方法。
经查阅《中国药典》2010年版二部, 用于生产复方氨基酸注射液的各种氨基酸原料药的细菌内毒素限值大致在6 EU/g (组氨酸) 至50 EU/g (色氨酸) 。为保证临床用药安全, 并结合生产厂家的产品质量控制能力, 将本品的细菌内毒素限值 (L) 定为5 EU/g。
2.2 鲎试剂灵敏度复核
按细菌内毒素检查法项下方法进行, 结果TAL1的灵敏度测定值λC为0.125EU/ml, TAL2的λC为0.25 EU/ml, TAL3和TAL4的λC均为0.06 EU/ml。4批鲎试剂的λC均在0.5λ~2λ范围内, 均符合规定, 可用于试验[2,3]。
2.3 供试品干扰试验
2.3.1 预实验
目前市售鲎试剂灵敏度λ在0.5~0.03 EU/ml。由公式c=λ/L计算, 供试品溶液的浓度范围应为100~6 mg/ml[3]。
取3批供试品, 用BET水配制成浓度分别为100 mg/ml、50 mg/ml、25 mg/ml、12.5 mg/ml、6.25mg/ml的供试品溶液 (NPC系列) 。另加入细菌内毒素标准溶液, 配制成供试品浓度分别为100mg/ml、50 mg/ml、25 mg/ml、12.5 mg/ml、6.25mg/ml, 细菌内毒素浓度为0.5 EU/ml (2λ) 的供试品阳性对照溶液 (PPC系列) 。分别用TAL1和TAL2进行实验, 每个供试品浓度的稀释液重复2管, 同时设阴性对照 (NC) 及阳性对照 (PC) , 见表1、2。
注:阴性对照NC--, 阳性对照PC++
注:阴性对照NC--, 阳性对照PC++
根据预实验结果, 初步认为供试品浓度25 mg/ml对细菌内毒素检查无干扰, 以该浓度进行正式干扰试验。
2.3.2 干扰试验1
取3批供试品, 用BET水分别制成25 mg/ml的供试品溶液, 再用BET水及供试品溶液将同一支细菌内毒素工作标准品制成0.5 EU/ml、0.25EU/ml、0.125 EU/ml、0.06 EU/ml的系列浓度。分别用TAL1和TAL2进行实验[2,3], 每一内毒素浓度重复4管, 同时设阴性对照 (NC) , 见表3。
注:Es:反应终点浓度 (水) , Et:反应终点浓度 (供试品)
TAL1的Es在0.5λ~2λ范围内, 批号为0130602、0130603的供试品的Et在0.5 ES~2 ES范围内, 但批号0130601的Et不在0.5 ES~2 ES范围内;TAL2的Es在0.5λ~2λ范围内, 3批供试品的Et均在0.5 ES~2 ES范围内。干扰试验1结果表明, 25 mg/ml浓度的供试品溶液对鲎试剂有干扰, 应对供试品进行更大倍数的稀释。
2.3.3 干扰试验2
取3批供试品, 用BET水分别制成12.5 mg/ml的供试品溶液, 其余同干扰试验1, 见表4。
TAL1、TAL2的Es均在0.5λ~2λ范围内, 3批供试品的Et均在0.5 ES~2 ES范围内。干扰试验2结果表明, 12.5 mg/ml浓度的供试品溶液对鲎试剂无干扰作用, 即供试品的最大不干扰浓度为12.5 mg/ml, 确定供试品在不大于该浓度下可进行细菌内毒素检查。
2.4 供试品的细菌内毒素检查
2.4.1 鲎试剂灵敏度的选择
由公式c=λ/L, c=12.5mg/ml、L=0.005 EU/mg, 计算得λ为0.06 EU/ml。即可选用的鲎试剂灵敏度不能低于0.06 EU/ml。
2.4.2 检查及结果
按细菌内毒素检查法, 采用TAL3、TAL4, 按L=5 EU/g限值, 对3批供试品进行细菌内毒素检查, 见表5。
3 结论
根据上述实验结果, L-鸟氨酸盐酸盐可采用细菌内毒素检查法 (凝胶限度试验) , 采用灵敏度0.06EU/ml以上的鲎试剂进行检测, 最大不干扰浓度为12.5 mg/ml, 细菌内毒素限值为5 EU/g, 即L-鸟氨酸盐酸盐采用细菌内毒素检查法 (鲎试剂法) 是可行的。
摘要：目的 建立L-鸟氨酸盐酸盐的细菌内毒素检查方法。方法 确定L-鸟氨酸盐酸盐的细菌内毒素限值, 按《中国药典》2010年版二部的规定, 通过干扰试验, 确定其最大不干扰浓度。结果 L-鸟氨酸盐酸盐的细菌内毒素限值为5 EU/g, 最大不干扰浓度为12.5 mg/ml。结论 L-鸟氨酸盐酸盐采用细菌内毒素检查法 (鲎试剂法) 是可行的。
关键词：L-鸟氨酸盐酸盐,细菌内毒素,干扰试验,鲎试剂
参考文献
[1]查锡良.生物化学[M].7版.北京:人民卫生出版社, 2008:190-195.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典 (二部附录) [S].北京:化学工业出版社, 2010.
L-半胱氨酸盐酸盐 篇2
关键词：马铃薯；苹果；甘薯；多酚氧化酶；L-半胱氨酸；金属离子
中图分类号： TS201.2+5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0375-03
收稿日期：2014-11-12
基金项目：河南省教育厅项目（编号：12B180002）。
作者简介：廖春丽（1980—），女，河南信阳人，硕士，讲师，从事微生物发酵研究。Tel：（0375）2089072；E-mail：liao20130427@163.com。多酚氧化酶（PPO） 是广泛存在于生物体内的含铜氧化还原酶，它包括单酚氧化酶、双酚氧化酶和漆酶[1]。它在动植物体酶促褐变、体内色素合成的过程中起了关键作用[2]，更是果蔬酶促褐变过程中起重要作用的一种酶[3-4]。它能将酪氨酸羟化，产生3，4-二羟基苯丙氨酸（L-多巴），然后再将多巴氧化成多巴醌，多巴醌自发集合且和细胞内蛋白质的一些氨基酸基团发生反应，产生黑色和褐色的物质，导致组织酶促褐变[5]，因此PPO 是引起褐变的关键酶。褐变问题一直是很多果蔬收获后保藏、加工等过程中导致质量下降，经济价值降低的一个非常重要的问题，因此研究防止褐变的PPO抑制剂是农产品加工需要解决的主要问题。L-半胱氨酸（L-半胱氨酸）作为一种高效安全的PPO抑制剂，在食品保鲜中的应用已有研究[6]。本研究以马铃薯、苹果和甘薯为研究对象，探讨L-半胱氨酸和金属离子对马铃薯、苹果和甘薯PPO 活性的调控，为防止果蔬贮运加工过程中褐变提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料
无花号马铃薯、红富士苹果、甘薯（市售）。
1.2方法
1.2.1PPO的分离纯化将在4 ℃冰箱中预冷的马铃薯、苹果、甘薯洗净后去皮，分别切块，称取100 g加入300 mL冷冻丙酮（-20 ℃），匀浆2 min，然后抽滤，滤饼再用冷冻丙酮提取，反复3次抽滤至无色，继续抽干至无丙酮味，即制得马铃薯丙酮干粉。制得干粉置于冰箱中于-20 ℃冷冻保存，使用时分别称取5 g干粉，以1 g ∶8 mL的比例溶于在4 ℃冰箱中预冷的0.2 mol/L磷酸缓冲溶液（pH值6.8）中，搅拌10 min（整个试验操作都在冰上进行），然后用冷冻离心机（4 ℃）于15 000 r/min离心 15 min，吸取上清液，即得3种作物的PPO粗酶液[7]。粗酶液进一步用40%饱和度硫酸铵盐析（缓慢加入并搅拌，直至完全溶解），然后用冷冻离心机（4 ℃）于 6 000 r/min 离心20 min，弃除沉淀，向收集到的上清液中加入70%饱和度硫酸铵（缓慢加入并搅拌，直至完全溶解），最后在冷冻离心机（4 ℃）中，于 6 000 r/min 离心 20 min，收集沉淀，沉淀用4 ℃预冷的PBS溶解，得纯化的PPO酶液。
1.2.2PPO活性的测定参照Franceso等的方法[8-9]，作部分修改。总反应体系9.5 mL，在6 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH值6.8）的反应体系中，加入1 mL 0.1 mol/L的邻苯二酚溶液为底物，置于30 ℃恒温水浴锅中保温10 min，再加入0.5 mL纯化的PPO酶液和不同量的L-半胱氨酸，30 ℃间隔1 min在475 mn波长下测定吸光度D475 nm，测定5次，每次重复3次。以不加L-半胱氨酸为对照，各处理取4 mL样品提取液进行比色。
1.2.3PPO活性的计算本试验以邻苯二酚为底物，在PPO催化下生成有色产物。其显色物质在475 nm处有最大吸收，吸光度在单位时间内的变化和单位酶活性成正比。制作D475 nm随时间变化的曲线，根据曲线的初始线性部分计算1 min 吸光度变化值ΔD475 nm，然后以1 g鲜质量果蔬样品1 min 吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位（U）[10] ，相关公式为：
PPO活性= ΔD475 nm×VΔt×Vs×m。
式中：ΔD475 nm为反应混合液的吸光度变化值；Δt为酶促反应时间，min；V为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所取样品提取液体积，mL；m为样品质量，g。
1.2.4金属离子对酶活性的影响为了测定金属离子对PPO的影响，按表1所示组成反应体系，按“1.2.2”节方法测定PPO活性，按“1.2.3”节方法计算PPO活性，最后按下面公式计算PPO相对活性：
PPO相对活性=测定组PPO活性-对照组PPO活性对照组PPO活性×100%。
2结果与分析
2.1L-半胱氨酸对马铃薯PPO活性的影响
L-半胱氨酸对马铃薯中PPO活性的抑制作用也非常强，随着浓度越大，酶活性降低越多（图1）：当添加 0.05 mmol/L
2.2L-半胱氨酸对苹果PPO活性的影响
从图2中看出，L-半胱氨酸对苹果中的PPO活性有明显的抑制作用，随着浓度越大，酶活性降低越多：当添加 0.10 mmol/L L-半胱氨酸，1 min时苹果中PPO活性抑制率为50%；当L-半胱氨酸添加量为0.05 mmol/L，反应2 min，苹果中PPO活性抑制率为50%；添加0.20 mmol/L L-半胱氨酸，苹果中PPO活性抑制率为90%～97%，而且随着时间的延长，最大抑制率变化不大。加入抑制剂之后PPO活性几乎没有增长，这说明L-半胱氨酸对PPO活性的抑制作用是属于不可逆的。
nlc202309030022
2.3L-半胱氨酸对甘薯PPO活性的影响
甘薯是一种淀粉含量较高的蔬菜，洗净去皮的甘薯在空气中30 s内表面就能变黑，所以说甘薯中PPO活性非常高。由图3可见，L-半胱氨酸对甘薯中PPO活性的抑制作用也非常强，浓度越大，酶活性降低越多：当添加0.10 mmol/L L-半胱氨酸，甘薯中PPO活性抑制率为50%；当添加0.20 mmol/L L-半胱氨酸，甘薯中PPO活性抑制率为 96%～97%。随着时间的延长，最大抑制率变化不大。
2.4金属离子对马铃薯、苹果和甘薯PPO活性的影响
从表2可知，无论是马铃薯、苹果还是甘薯，Mn2+和 Fe3+对它们的酶活性不仅没有抑制，反而是激活作用，且随着离子浓度的增加，激活越明显。 Ca2+、Na+和Cu2+对酶活性有一定的抑制作用，其中对马铃薯、苹果和甘薯PPO活性抑制作用最强的是Cu2+，随着Cu2+浓度的增大，PPO的活性逐渐下降。在Cu2+浓度为3.0 mmoL/L时对马铃薯PPO活性抑制率达到49.1%，对苹果PPO活性抑制率达到60.8%，对甘薯PPO活性抑制率达到69.7%。
3结论与讨论
L-半胱氨酸的浓度在0.20 mmol/L以内对马铃薯、苹果、甘薯3种蔬果中的PPO活性都产生抑制作用，而且随着L-半胱氨酸浓度的升高，抑制作用也更加明显，0.20 mmol/L L-半胱氨酸对3种蔬果中的PPO，活性有最大抑制作用，分别使甘薯、苹果、马铃薯PPO的活性下降44.5%、39.1%、44.8%，也就是说L-半胱氨酸对3种蔬果的抑制作用表现为：马铃薯>甘薯>苹果。
PPO属于蛋白酶，其在发生作用时需要金属离子的参与，金属离子作为酶的辅基，是不可或缺的，能使酶行使正常的功能，所以在酶存在的环境中，人为地加入一些金属离子，势必会对PPO的活性造成影响，不同的金属离子对PPO有不同的影响。因为Cl-、SO2-4 2种阴离子在一定的浓度范围内，对PPO的活性没有影响[11]，所以向反应体系中加入1 mL不同浓度的CaCl2、NaCl、CuSO4、MnCl2、FeCl3 溶液，对PPO的影响都是由于溶液中阳离子的影响。Cu2+的浓度在3.0 mmol/L以内对3种作物都有明显的抑制作用，而且都是随着Cu2+浓度的升高，对3种蔬果中的PPO的抑制作用也越来越明显，3.0 mmol/LCu2+对马铃薯、苹果、甘薯的PPO有最大的抑制作用，分别使马铃薯、苹果、甘薯PPO活性下降49.1%、60.8%、69.7%。3种蔬果对Cu2+的敏感程度表现为：甘薯>苹果>马铃薯。
在3.0 mmol/L的浓度以内，随着Na+和Ca2+浓度的升高，3种作物中的PPO活性都表现为逐渐下降，但下降的幅度不大。Ca2+、Na+在3.0 mmol/L的浓度时，马铃薯PPO活性分别下降32.0%、36.7%，苹果PPO活性分别下降30.9%、34.3%，甘薯PPO活性分别下降27.7%、29.7%；3种作物对Ca2+和Na+的敏感程度表现为：马铃薯>苹果>甘薯。Fe3+和Mn2+在3 mmol/L的浓度以内对3种作物中的PPO有激活作用，两者的激活作用表现为：Fe3+>Mn2+；3种作物对 Fe3+和Mn2+的敏感程度表现为：甘薯>苹果>马铃薯。
参考文献：
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L-半胱氨酸盐酸盐 篇3
关键词：双极膜,成对电合成,L-半胱氨酸,L-磺基丙氨酸
我国毛发资源十分丰富, 胱氨酸供应充足。而L-半胱氨酸在药品、化妆品和食品添加剂等方面均有广泛的用途。生产L-半胱氨酸的方法主要有:化学合成法、酶法和电化学还原法等。其中, 电化学还原法以L-胱氨酸为原料, 具有生产成本低、收率高、产品质量好等诸多优点 [1]。另外, L-磺基丙氨酸在医药、化妆品、洗涤剂等行业应用十分广泛。目前, 制备L-磺基丙氨酸的主要方法有:化学氧化法和间接电化学氧化法。而间接电氧化法以HBr为氧化媒质氧化L-胱氨酸制备L-磺基丙氨酸, 具有工艺简单、成本低、产品纯度高、无“三废”污染等优点[2,3]。
双极膜 ( Bipolar Membrane, BPM) 是一种新型的离子交换复合膜, 它是由阴离子交换膜 (AM) 和阳离子交换膜 (CM) 复合而成[4]。当将双极膜置于阴、阳两极之间时, 在直流电场作用下, 双极膜中间界面层中水将发生解离, 生成H+离子和OH-离子。随后, H+离子和OH-离子分别向阴、阳两极转移进入阴、阳两极室[5,6,7]。由于双极膜具有许多优良的性能[8], 已在诸多领域得到广泛的应用[9,10]。 酞菁 (Pc) 及其衍生物具有独特的结构和优良的性能, 已在许多前沿领域得到广泛应用。利用四磺酸基铜酞菁 (CuTsPc) 和四氨基铜酞菁 (CuTAPc) 对海藻酸钠 (SA) /壳聚糖 (CS) 双极膜进行改性, 金属酞菁衍生物在双极膜中间界面层形成高荷电区, 催化中间层水解离, 提高水解离效率, 降低双极膜的膜阻抗和电阻压降 (IR降) [11,12], 从而减少电槽副反应的发生, 降低能耗。
本研究以自制的CuTsPc-SA/CuTAPc-CS双极膜为电槽隔膜, 成对电解L-胱氨酸合成L-磺基丙氨酸和L-半胱氨酸, 较原先单独电合成L-磺基丙氨酸或L-半胱氨酸可大大提高电流效率, 降低生产成本。
1 实验部分
1.1 试剂和仪器
壳聚糖 (化学纯, 脱乙酰度≥90%) 、25% (体积分数) 戊二醛 (生化试剂) 、均苯四甲酸二酐 (化学纯) 、4-硝基邻苯二甲酰亚胺 (化学纯) 、四磺酸基铜酞菁 (化学纯) 、氢溴酸 (分析纯) 、邻苯二甲醛 (分析纯) 、甲醇 (色谱纯) 、N-N二甲基甲酰胺 (化学纯) 、钼酸钠 (分析纯) 均由上海国药集团化学试剂有限公司提供;L-胱氨酸、β-巯基乙醇均为分析纯试剂, 上海伯奥生物科技有限公司提供;磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、乙酸钠均为分析纯试剂, 天津福晨化学试剂厂提供;硼酸、氢氧化钠、硫酸均为分析纯试剂, 泉州东海试剂有限公司提供。实验用水为二次蒸馏水。
ProStar210型高效液相色谱, 美国Varian公司;DF1720SB5A型直流稳压电源, 宁波中策电子有限公司;721型分光光度计, 上海第三分析仪器厂;DF101S/101T型集热式恒温加热磁力搅拌器, 上海华岩仪器设备有限公司;B-260恒温水浴锅, 上海亚荣生化仪器厂;圆筒型两室电解槽, 自制。
1.2 CuTsPc-SA/CuTAPc-CS双极膜的制备
CuTsPc-SA阳膜的制备参见文献[11], CuTAPc-CS阴膜液的制备参见文献[12]。
将制备的墨绿色CuTAPc-CS粘稠阴膜液, 流延于制备的CuTsPc-SA阳离子交换膜上, 在室温下风干成膜, 即得CuTsPc-SA /CuTAPc-CS双极膜。
1.3 L-半胱氨酸和L-磺基丙氨酸浓度测定
L-半胱氨酸浓度的测定方法参见文献[13]。L-磺基丙氨酸浓度的测定方法参见文献[14]。
1.4 L-胱氨酸成对电合成L-半胱氨酸和L-磺基丙氨酸反应机理
L-胱氨酸成对电合成L-半胱氨酸和L-磺基丙氨酸电解槽和反应机理如图3所示。阴极和阳极均为铅电极, 电极面积为4cm2, 阴极液为一定浓度的L-胱氨酸溶液, 阳极液为一定浓度的L-胱氨酸和氢溴酸混合溶液, 阴极液和阳极液均为200mL。
阴极室主要反应方程式如下:
阳极室主要反应方程式如下:
在直流电场作用下, CuTsPc和CuTAPc催化双极膜中间界面层水发生解离, 生成的H+离子透过阳膜层进入阴极室, 补充L-胱氨酸电还原生成L-半胱氨酸时H+离子的损耗, 生成的OH-离子透过阴膜层进入阳极室, 中和L-胱氨酸电氧化制备L-磺基丙氨酸时产生的H+离子, 保持阳极液pH值的稳定, 促进反应正向进行。
2 结果与讨论
2.1 电流密度对成对电合成电流效率的影响
表1是电槽的电流密度对成对电合成电流效率的影响 (阴极室L-胱氨酸初始浓度为0.65mol/L, 阳极室L-胱氨酸初始浓度为0.1mol/L, 氢溴酸浓度为3.5mol/L, 反应时间为2h) , 从表中可知, 阴极电还原生成L-半胱氨酸和阳极间接电氧化生成L-磺基丙氨酸的电流效率均随着电流密度的增大而降低。
不过, 电流密度越大, 相同时间内生成的产物量就越多, 电合成时的时空产率就越大。综合考虑阴极室和阳极室的电流效率和产量两个因素, 电解时电流密度以35mA/cm2为宜。
2.2 L-胱氨酸初始浓度对电还原生成L-半胱氨酸电流效率的影响
图4是L-胱氨酸初始浓度对电还原生成L-半胱氨酸电流效率的影响 (电流密度为35mA/cm2) 。从图中可知, L-胱氨酸初始浓度对电还原电流效率影响不大。不过, 提高L-胱氨酸的初始浓度有利于提高生产能力, 从而提高电槽的时空效率, 但是, L-胱氨酸的初始浓度太高, 会导致L-胱氨酸不容易溶解。所以, L-胱氨酸的初始浓度以0.65mol/L为宜。
2.3 氢溴酸浓度对间接电氧化生成L-磺基丙氨酸电流效率的影响
图5是阳极液中氢溴酸浓度对间接电氧化生成L-磺基丙氨酸平均电流效率的影响 (L-胱氨酸初始浓度为0.35mol/L, 电流密度为35mA/cm2) 。从图中可以看到, 随着阳极液中氢溴酸浓度的增大, 平均电流效率逐渐增大, 当氢溴酸浓度为3mol/L时, 平均电流效率达到最大值, 为85.1%。当氢溴酸浓度继续增大时, 平均电流效率开始缓慢下降。阳极液中氢溴酸最佳添加量以3mol/L为宜。
3 结 论
(1) 以自制的CuTsPc-SA/CuTAPc-CS双极膜作为电槽隔膜, 成对电解L-胱氨酸在阳极室和阴极室同时生成L-磺基丙氨酸和L-半胱氨酸, 提高了电流效率, 降低了生产成本。
(2) 提高电流密度有利于提高电槽的时空产率, 但会在一定程度上降低电流效率, 研究表明电流密度以35mA/cm2为宜。
L-半胱氨酸盐酸盐 篇4
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
1.1.1 主要仪器
AFS-9130型双道氢化物发生原子荧光光度计，附带专用Sn编码空心阴极灯。
1.1.2 试剂
(1)Sn标准溶液(国家标准物质研究中心):100μg/ml。(2)2.0%KBH4-0.20%KOH溶液(临用现配):称取0.20 g KOH溶于100 ml纯水中，溶解后加入2.0 g KBH4，溶解备用。(3)2.5%L-半胱氨酸:称取2.5 g L-半胱氨酸，加纯水溶解后定容至100 ml。(4)2.0%HCl:吸取4.0 ml盐酸于少量纯水中，加水至200 ml。(5)实验用水均为超纯水。(6)所用酸均为优级纯，其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器分析条件
负高压:245 V;原子化器高度:8 mm;灯电流:65 m A;载气流速:400 ml/min;屏蔽气流速:800 ml/min;读数时间:12 s;延迟时间:1.0 s;测定方式:标准曲线法;读数方式:峰面积。
1.3 实验方法
吸取Sn标准使用液(1.00μg/ml)1.0 ml于10.0 ml比色管中，加水至刻度，另取10.0 ml试样，1 ml 2.5%L-半胱氨酸，放置10 min后，以2.0%HCl溶液为载流，2.0%KBH4-0.20%KOH溶液为还原剂，按1.2工作参数进行测定。
2 结果与讨论
2.1 KBH4浓度对Sn测定的影响
以5μg/L Sn标准溶液和2.0%HCl为酸介质，2.5%L-半胱氨酸为预还原剂，对KBH4浓度进行实验，实验结果表明，随着KBH4浓度的增加，荧光强度增高，当KBH4浓度达2.0%以后，荧光强度的变化逐渐平缓，故选择2.0%的KBH4和0.2%KOH浓度的溶液作为还原剂。结果见图1。
2.2 反应介质及酸度对Sn测定的影响
以HCl、H2SO4、HNO3溶液为反应介质，研究了酸度对锡测定的影响。实验表明H2SO4、HNO3空白值高，并且随着酸度的增加荧光强度不稳定，HCl的空白值较低，且荧光强度稳定。本实验采用盐酸作为介质。以2.0%HCl作为载流时，荧光强度最高。结果见图2。
2.3 预还原剂的选择及其浓度对Sn测定的影响
在相同仪器条件下，对10μg/L Sn标准溶液分别加入硫脲-抗坏血酸溶液及L-半胱氨酸溶液进行试验。试验结果表明，采用L-半胱氨酸溶液，Sn测定的荧光强度提高了2倍，见图3。而采用硫脲-抗坏血酸对样品和载流要求的酸度较高，并且抗坏血酸反应速度慢，容易褐变，必须临用现配。而含Sn的L-半胱氨酸溶液较稳定，且要求的酸度大大降低，这样可以降低空白值和检出限。因此，选用在L-半胱氨酸溶液的存在下测定Sn。
在相同条件下对硫脲-抗坏血酸、L-半胱氨酸3种预还原剂进行试验，实验表明L-半胱氨酸预还原作用最好，在室温下10 min即可使Sn(Ⅴ)完全还原为Sn(Ⅱ)，并发现L-半胱氨酸溶液稳定时间长，加入了L-半胱氨酸的试样稳定，放置1周后再测定所得到的荧光信号几乎无变化。
本试验在2.0%HCl介质中，以不同浓度的L-半胱氨酸作为预还原剂进行实验，L-半胱氨酸浓度为2.5%时，荧光强度最大，灵敏度最高，结果见图4。
2.4 共存元素的干扰试验
在50μg/L Sn标准溶液分别加入了各种可能产生干扰的离子，测定其荧光强度。结果如下;100mg/L Fe3+、Pb2+、Zn2+，200 mg/L Cr6+、Mn2+、Se4+、Hg+、As3+，500 mg/L Cu2+、Cd2+对测定均无干扰。
2.5 工作曲线及检出限
在本实验条件下，吸取Sn标准使用液(1.00μg/ml)1.00 ml于10 ml比色管中，并盐酸溶液定容至刻度，2.5%L-半胱氨酸1.0 ml，放置10 min后测定。标准曲线由仪器自动稀释配制，其标准系列质量浓度分别为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0μg/L Sn。其标准曲线回归方程为:Y=17.7 C+39.1,r=0.999 7。以低浓度溶液连续测定20次，按DL=3 SD/K计算Sn的检出限为0.71μg/L。
2.6 精密度
分别对5、50、200μg/L的Sn标准溶液连续测定11次，相对标准偏差分别为3.07%、3.40%、2.15%，结果符合《工作场所空气中毒物检测方法的研制规范》的要求[3]，可用于工作场所空气中Sn的测定。
2.7 回收率试验
对样品进行加标回收试验，结果见表1。
3 结论
用氢化物发生-原子荧光光谱法，在L-半胱氨酸存在下，测定工作场所空气中的Sn，本方法具有检出限低、灵敏度高、重现性好、线性范围宽及干扰少等特点，该方法试剂用量少，污染小，精密度和回收率均能满足工作场所空气中Sn分析的要求。
参考文献
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[2]GBZ/T 160.22—2004.工作场所空气中锡及其化合物的测定方法[S].
L-半胱氨酸盐酸盐 篇5
L-半胱氨酸是是一种重要的含硫氨基酸, 由于广泛应用于医药、化妆品、食品领域其生产得到众多学者的关注[1]。早在上世纪70年代日本就对酶法转化DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸 (DL-ATC) 合成L-半胱氨酸有了初步探索[2]。由于微生物菌种的多样性, 野生菌假单胞菌F12产酶特性不同于已报道菌株, 能够高效地转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶的合成是将之应用亟需解决的环节。本文对假单胞菌F12在不同培养基中生长菌体的L-半胱氨酸合成能力进行测定和分析, 对产酶的最佳培养基进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
假单胞菌Pseudomonas sp.F12, 作者实验室分离并保藏[3]。
1.1.2 试剂
DL-ATC购自天津化学试剂有限公司;甘油购自国药集团化学试剂有限公司;胰蛋白胨和酵母抽提物购自Oxoid公司;葡萄糖购自上海科欣生物技术研究所。所有试剂均为分析纯。
1.1.3 仪器
气浴摇床 (THZ-031) , 上海申能博彩生物科技有限公司;高效液相色谱仪 (LC-10AT) , 日本岛津公司;可见分光光度计 (721) , 上海精密科学仪器有限公司;5-L发酵罐 (BIO-TECH-BG-5) , 上海保兴生物设备有限公司。
1.1.4 培养基
无机盐溶液 (g/L) :KH2PO450, Mg SO4·7H2O 25, Mn SO4·H2O 0.5, Fe SO4·7H2O 0.35。
斜面培养基和种子培养基:DL-ATC 3 g, 甘油10 g, 无机盐溶液20 m L, Na OH调p H至7.0, 去离子水配制, 斜面培养基中加有2%琼脂, 定容至1 L。
发酵培养基 (1) :同种子培养基。
发酵培养基 (2) :DL-ATC 2, 酵母抽提物 (Oxoid) 5, 胰蛋白胨 (Oxoid) 5, Na Cl 5, 甘油10, 配成1 L溶液, Na OH调节p H到7.0。
1.2 方法
1.2.1 菌种的制备[3]。
1.2.2 分析方法
菌体浓度、L-半胱氨酸和DL-ATC的分析分别采取比浊法、茚三酮法、HPLC法[3]。
1.2.3 L-半胱氨酸转化方法
将摇瓶培养后收集的细胞重悬到含有1.5 m L的10 g/L DL-ATC磷酸缓冲液 (p H 8.0) 中, 在42℃水浴中反应2 h。
1.2.4 酶活定义及测定方法[3]。
1.2.5 不同培养基合成L-半胱氨酸能力的对比
将种子培养液1m L分别接种到装有30 m L发酵培养基 (1) 和 (2) 的三角瓶中, 30℃转速为220 r/min的摇床上培养24 h。收集细胞进行转化。
1.2.6 在简单培养基中的生长及产酶曲线分析
将种子培养基接种到装有30 m L发酵培养基 (1) 的250 m L三角瓶中, 在相同培养条件下培养6 h并取样进行检测和转化。
1.2.7 DL-ATC对酶的诱导作用的确定
将发酵培养基 (1) 中3 g/L的DL-ATC分别减少到1.5 g/L和0 g/L, 其中不加DL-ATC的培养基代之以添加30 mmol/L的NH4Cl, 以发酵培养基 (1) 作为对照, 培养6 h后进行检测和转化。
1.2.8 葡萄糖对诱导的影响的确定
将种子培养液接种到含有40 g/L葡萄糖和0.16 g/L氯化铵及基础盐溶液的培养基 (5-L罐) 中培养到葡萄糖耗完 (用氨水调节p H到7.0) , 8 000×g无菌离心, 重悬于10 g/L葡萄糖、10 g/L DL-ATC以及基础盐溶液构成的培养基的三角瓶中, 以只含有10 g/L DL-ATC的基本培养基为对照, 相同条件下培养并在不同时间进行取样测定和转化。所有摇瓶实验每组2个平行。
2 结果与分析
2.1 在不同培养基中的生长与产生L-半胱氨酸能力对比
假单胞菌F12在不同的培养基中菌体生长及菌体合成L-半胱氨酸能力差异很显著 (表1) 。与在基本培养基中生长的菌体相比, 在复合培养基上的细胞的单位菌体的转化能力约为1/5, 表明在复合培养基中获得的菌体转化DL-ATC的酶的活性较低。
2.2 在简单培养基的生长与产酶关系
用发酵培养基 (1) 来考察假单胞菌F12的特性 (图1) 。在培养6 h时, 菌体浓度迅速增加, 培养基中DL-ATC含量急剧下降, 而甘油浓度基本保持不变, DL-ATC用作碳氮源被消耗。继续培养菌体开始利用甘油。所得菌体合成L-半胱氨酸的量不断下降, 主要与发酵液中DL-ATC的消耗殆尽有关。
2.3 DL-ATC对合成L-半胱氨酸酶的诱导作用
通过改变培养基中DL-ATC的含量来考察其作用 (表2) 。DL-ATC浓度减少后菌体终浓度和合成L-半胱氨酸的能力明显下降, 当不含DL-ATC时细胞不能合成L-半胱氨酸。因此DL-ATC诱导酶的产生。
2.4 葡萄糖对酶诱导的影响
图2考察了葡萄糖是否有利于假单胞菌F12中酶的产生。加入葡萄糖后DL-ATC的代谢速率较慢, 其菌体比酶活也明显低于无葡萄糖时的结果。DL-ATC是L-半胱氨酸合成酶中的诱导物, 对葡萄糖存在条件下DL-ATC的消耗速率进行对比 (表3) 。诱导初始阶段, 加入葡萄糖的酶比生产速率为1.90 U/ (mg DCW·h) , 明显高于对照中的数值1.28 U/ (mg DCW·h) , 表明DL-ATC作为氮源能够高效诱导酶的产生。随着诱导的进行, 对照中比酶活增长速率的增加幅度很大, 而加入葡萄糖导致酶的比生产速率不断下降。因而以DL-ATC为碳氮源的基本培养基更有利于酶的诱导。
3 讨论
在已报道的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的菌株中L-半胱氨酸酶为诱导酶[4]。怀丽华等[5,6]曾经在含有葡萄糖、尿素和DL-ATC的培养基中进行假单胞菌培养, 同时诱导L-半胱氨酸合成酶的产生得到了较好的效果, 表明除了诱导物外葡萄糖的存在对酶的产生是有利的。Yoshiharu Tamura[7]等将假单胞菌AJ3865利用发酵培养基 (2) 生长得到细胞, 测得酶活性远高于生长在只含有DL-ATC的基本培养基中所得细胞酶活。而假单胞菌F12却并得到相反的结果, 表明两个菌株中DL-ATC对L-半胱氨酸合成酶的诱导机制的不同。假单胞菌F12中DL-ATC对L-半胱氨酸酶的诱导可能受到严格调控。Fernando Rojo对假单胞菌中碳源代谢抑制现象进行分析认为该代谢抑制现象存在于不同的环境下[8], LB中的酪蛋白氨基酸或其代谢物与该抑制作用有关。葡萄糖的代谢也对酶活有一定抑制。在假单胞菌中碳代谢抑制调控系统 (Cbr AB-Crc Z-Crc) 起了重要的作用[9,10,11], 使得对碳源的利用有一定选择性, 因而导致在DL-ATC下最利于酶的诱导。
参考文献
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[3]Fan C L, Li Z M, Ye Q.Two-stage cultivation of Pseudomonas sp.F12for the production of enzymes converting DL-2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine[J].Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 168 (7) :1867-1879.
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[6]怀丽华, 陈宁.溶氧对假单胞菌TS1138生产L-半胱氨酸合成酶系的影响[J].食品科学, 2010, 31 (3) :182-184. Huai Lihua, Chen Ning.Effect of dissolved oxygen on production of L-cysteine synthetase by Pseudomonas sp.TS1138[J].Food Science, 2010, 31 (3) :182-184. (in Chinese) .
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L-半胱氨酸盐酸盐 篇6
1 材料与方法
1.1 原理
空气中气溶胶态锑及其化合物用微孔滤膜采集, 消解后, 用原子荧光光谱法测定。
1.2 仪器与试剂
AFS-9130型原子荧光光谱仪, 北京吉天仪器有限公司;锑空心阴极灯;纯水机, 美国密理博Milli-Q, 电阻率18.2 MΩ·cm。锑标准溶液 (100 mg/L, 国家标准物质研究中心) ;硼氢化钾 (20 g/L) -氢氧化钾 (2 g/L) 溶液, 临用现配;L-半胱氨酸溶液 (2.5 g/L) 。试剂均为分析纯。盐酸溶液 (0.24 mol/L) , 盐酸溶液 (0.12 mol/L) , 优级纯, 临用现配;消化液:高氯酸 ∶硝酸 =1 ∶9, 高氯酸、硝酸均为优级纯。试验用水为超纯水。
1.3 样品的采集和保存
短时间采样:在采样点, 将微孔滤膜安装在采样夹内, 以5 L/min的流量采集15 min空气样品;长时间采样:以1 L/min的流量采集2～8 h空气样品。采样后将滤膜的接尘面朝里折叠后置于清洁袋内保存。
1.4 仪器工作条件
灯电流:60 mA;负高压:280 V;原子化器高度:8 mm;屏蔽气和载气均为氩气, 流速分别为800 ml/min和400 ml/min;测量方式:标准曲线法;读数方式:峰面积;进样量:1 ml;载流:盐酸溶液 (0.24 mol/L) ;载流进入反应圈体积:3.7 ml;还原剂:硼氢化钾 (20 g/L) -氢氧化钾 (2 g/L) 溶液;还原剂进入反应圈体积:2.2 ml。
1.5 分析步骤
1.5.1 样品处理
将采过样的微孔滤膜放入烧杯中, 加入2 ml消化液, 在电热板上加热消解至透明近干时取下放冷后, 用盐酸溶液 (0.12 mol/L) 溶解残渣并稀释至50 ml[2]。摇匀, 供测定。
1.5.2 工作曲线的绘制
取6只烧杯, 各放入1张微孔滤膜, 分别加入0.00、0.75、1.50、2.50、3.50、5.00 ml锑标准溶液, 同样品处理操作, 制成50 ml样品溶液, 配成0.0、1.5、3.0、5.0、7.0、10.0 μg/ml锑标准系列。向标准管及样品溶液中加入0.50 ml HCl、1 ml L-半胱氨酸 (2.5 g/L) , 放置10 min后, 以0.24 mol/L HCl溶液为载流, 20 g/L KBH4-2 g/L KOH溶液为还原剂, 按1.4仪器工作条件进行测定。
2 结果与讨论
2.1
分析条件的选择
2.2 硼氢化钾浓度的选择
试验表明, 随硼氢化钾浓度的增大, 锑的荧光强度亦逐渐增加, 在20 g/L时, 荧光强度达最大值, 继续增大其浓度, 生成过多的氢气稀释氢化物, 荧光强度降低, 因此, 硼氢化钾浓度选用20 g/L。
2.3 载流的选择
据文献报道, 测定锑的最佳酸度为0.1 mol/L左右[1]。试验了相同酸度的盐酸、硝酸、硫酸作为载流对测定结果的影响。硫酸作为载流时, 锑测定的荧光强度均较硝酸和盐酸的低, 而且硫酸腐蚀性较硝酸和盐酸大, 很容易腐蚀仪器。盐酸作为载流时, 锑的灵敏度最高, 标准曲线的线性较好, 因此选择盐酸作为载流, 本文测定了不同酸度的盐酸作为载流对测定结果的影响, 结果见图1。结果表明, 酸度在0.12～0.24 mol/L时, 锑的荧光强度处于高平台区, 大于0.24 mol/L时锑的荧光强度显著降低, 因此选用0.24 mol/L盐酸作为载流浓度。
2.4 预还原剂的选择及其浓度对锑测定的影响
在相同条件下对碘化钾-抗坏血酸、硫脲-抗坏血酸、L-半胱氨酸 3种预还原剂进行试验, 实验表明L-半胱氨酸预还原作用最好, 在室温下10 min即可使Sb (V) 完全还原为Sb (Ⅲ) , 且测定的荧光强度显著增加, 增敏作用非常明显。而采用硫脲-抗坏血酸对样品和载流要求的酸度较高, 并且抗坏血酸反应速度慢, 容易褐变, 必须临用现配。而含锑的L-半胱氨酸溶液较稳定, 且要求的酸度大大降低, 这样可以降低空白值和检出限。因此, 选用在L-半胱氨酸溶液的存在下测定锑。
在相同条件下, 本试验以不同浓度的L-半胱氨酸作为预还原剂进行实验, L-半胱氨酸浓度为2.5 g/L时, 荧光强度最大, 灵敏度最高, 结果见图2。
2.5 方法检出限
按照国际纯理论的应用化学联合会 (IUPAC) 规定计算检出限 (以3 σ计) , 以空白溶液测得的标准偏差的3倍计, 求得方法的检出限为0.40 μg/L。
2.6 回收率及精密度试验
在微孔滤膜上加入不同量的锑标准溶液, 配成3种不同浓度的样品, 分别进行了6次测定, 计算其相对标准偏差, 结果见表1。由表1可见, 3种浓度测定的结果重现性良好, 相对标准偏差为2.0%～4.5%, 回收率为93.3%～101.7%, 符合《车间空气中有毒物质监测研究规范》的要求。
试验结果表明锑的回收率为93.3%～101.7%, 相对标准偏差为2.0%～4.5%。
2.7 共存元素的干扰试验
试验了工作场所中常见的共存元素及其他过渡元素对锑测定的干扰。其测定结果如下:20 mg/L Fe3+、Pb2+, 30 mg/L Cu2+、Mn2+、Zn2+、Sn2+、Se4+、Hg+、As3+、Bi3+, 10 mg/L Cr6+、Cd2+对锑的测定均无干扰。
3 结论
应用原子荧光光谱法测定车间空气中锑及其化合物, 以L-半胱氨酸溶液作为预还原剂, 操作简便快速, 干扰少, 方法检出限低, 方法各项指标均达到《车间空气中有毒物质监测研究规范》的要求。
参考文献
[1]陈恒武, 何巧红.氢化物原子光谱法的新增效试剂L-半胱氨酸[J].分析化学, 2000, 28 (3) :368-373.
L-茶氨酸的性能及合成研究 篇7
关键词：L-茶氨酸,L-谷氨酸,三苯氯甲烷
1 L-茶氨酸的性能及特点
茶氨酸是茶叶中的特有成分, 是茶叶中含量最多的氨基酸, L-茶氨酸又名谷氨酰乙胺, 英文名L-Theanine, 在绿茶新茶中含量丰富, 占干茶质量的1%~2%, 其分子式为C7H14N2O3。L-茶氨酸为白色晶体粉末, 熔点为214~215℃, 极易溶于水, 茶氨酸具有焦糖香和类似味精的鲜爽味, 能缓解苦涩味, 增加茶汤的香甜味, 还可以抑制其它食品的苦味和辣味, 达到改善食品风味的目的。L-茶氨酸有以下作用和特点:
1.1 茶氨酸对中枢神经递质活性的影响
研究发现茶氨酸可以明显促进脑中枢多巴胺 (dopamine) 释放, 提高脑内多巴胺生理活性。多巴胺是一种活化脑神经细胞的中枢神经递质, 其生理活性与人的感情状态密切相关。尽管目前人们对茶氨酸在大脑中枢神经系统的作用机制并不是十分清楚。但茶氨酸对精神和感情的影响无疑部分是来自对中枢神经递质多巴胺生理活性的作用。
1.2 茶氨酸的降压作用
一般认为人体血压的调节是受中枢和末梢神经递质儿茶酚胺及5-羟色胺分泌量的影响。近年来的一些研究证明茶氨酸能有效降低大鼠自发性高血压。Kimura等人认为茶氨酸的这一降压效果可能是来自对脑内中枢神经递质5-羟色胺分泌量的调节作用。茶氨酸显示出的降低高血压效果在一定程度上也可以被看作是一种安定作用。而这种安定作用则无疑会有助于身心疲劳的恢复。
1.3 茶氨酸对学习、记忆的影响
Chu等人报导过他们曾在Operanttest的研究中发现每天经口服用180 mg茶氨酸的大鼠与对照组相比学习能力有一定的提高。另外, 在Avoidance test的研究中也确认了茶氨酸可以增强大鼠的记忆能力。
1.4 茶氨酸旷怡身心作用
早在1975年, 木村等人曾报告过茶氨酸具有缓和咖啡因引起中枢过度兴奋的作用。虽然, 茶叶中的咖啡因含量多于咖啡和可可, 但由于茶氨酸的存在使人们在饮茶时享受到一种咖啡和可可没有的旷怡身心的感觉。
1.5 茶氨酸是21世纪的安全的健康食品
目前的保健食品市场上多数是为成人防病或改善作用的品种。像茶氨酸这种既不具有催眠, 又可以解消疲劳、降低血压和提高学习记忆能力的保健食品实为少见, 引人注目。
从茶叶中提取L-茶氨酸的生产成本很高, 无实际生产意义。目前, 国外报道的主要是化学合成、微生物发酵和植物细胞培养法生产L-茶氨酸, 国内在这方面的研究尚处于起步阶段。化学合成法具有价格低、成本低、易于工业化的优点。目前化学合成法是:先使谷氨酸脱水, 再与乙胺反应制得茶氨酸, 即谷氨酸-乙胺合成法。以下是对该方法的改进初探。
2 L-茶氨酸合成实验
2.1 试剂和仪器
L-谷氨酸, 乙胺, 丙酮, 三苯基氯甲烷, 氯化亚砜, 无水乙醇, 无水甲醇, 乙酸, 浓硫酸, 浓盐酸等。
水浴锅, 冰箱, 搅拌器, 三口烧瓶, 抽滤器, 布氏漏斗等。
2.2 实验流程
2.3 反应机理
(1) 方法一:酯化反应在酸催化下进行, 由于氨基对相邻羧基的作用以及它的空间位阻效应, 酯化反应主要发生在离氨基较远的羧基上, 对氨基保护是L-茶氨酸的难点, 本实验采用三苯甲基来保护氨基, 而且它能在较温和条件下以固态物质被脱除。本实验用36%的乙酸溶液来除去三苯甲基。
(2) 方法二:L-谷氨酸用乙醇酯化较为困难, 本方法改为用氯化亚砜使L-谷氨酸酰化, 酰化后L-谷氨酸更容易与乙胺发生反应, 然后再用三苯基氯甲烷保护氨基。
2.4 实验步骤
方法一: (1) 在250m L三口烧瓶中加入40 mL无水乙醇和7.35 g谷氨酸, 加入几滴浓硫酸, 放在水浴中控制温度50℃在电动搅拌的情况下反应4 h, 得到浅黄色溶液。
(2) 冷却至室温, 抽滤得到L-谷氨酸-乙基酯的盐酸盐约5 g。
(3) 用50mL甲醇溶解上步产物后, 先用氢氧化钠, 再用碳酸钠溶液调节至中性, 抽滤得5.05 g产物产率为57.7%。
(4) 将上步产物加热完全溶解在50 mL丙酮中, 加入7.5 g三苯基氯甲烷, 在50℃水浴中加热搅拌反应3 h, 溶液分3层, 上层浅黄色, 中层为绿色, 下层是白色沉淀。
(5) 冷却后, 溶液为浅绿色, 生成大量晶状白色沉淀, 抽滤得产物
(6) 加入30 mL 60%~70%的乙胺, 在50℃搅拌下, 反应3h, 使溶液均一, 再在水浴中加热10 min, 除去过量的乙胺, 残留物为n-三苯基-L-谷氨酸-r-乙酰胺。
(7) 冷却后, 加入30 mL 36%的乙酸, 在水浴中加热至沸腾, 并保持5 min, 脱去三苯甲基, 再加入20 mL水, 抽滤得到黄色溶液。
(8) 上步溶液蒸出溶剂, 在溶液中加入10 mL无水乙醇, 24 h后, 析出白色沉淀, 抽滤得到最终产物。
方法二: (1) 在250 mL三口瓶中加入2.94 g L-谷氨酸, 40 mL丙酮, 4 mL氯化亚砜, pH=1。
(2) 水浴蒸馏用碳酸钠溶液调节pH=7, 再减压蒸馏约15 min得到黄色溶液。
(3) 加入40 m L吡啶加热使上步产物完全溶于吡啶中, 加入4.5 g三苯氯甲烷, 温度控制在40℃, 在装有冷却回流装置的三口烧瓶中搅拌反应12 h, 反应后溶液呈淡黄色, 透明。
(4) 蒸馏出部分溶剂, 向其中加入60%~70%的乙胺15 mL, 在室温下反应12 h, 溶液呈淡黄色。
(5) 将溶液转移至烧杯中, 加入36%的乙酸30 mL, 在水浴中加热至100℃保持5 min。
(6) 冷却后抽滤, 得到淡黄色滤液。
(7) 在滤液中加15 mL无水乙醇, 放置24 h结晶, 得到少许产物。
3 实验结果与检测
3.1 定性检测
量取本品的水溶液 (1+1000) 5 mL, 加入茚三酮溶液 (1+1000) 1 mL, 加热8 min, 显紫色。
3.2 液相色谱分析
以异硫氰酸苯酯作衍生剂, 醋酸钠缓冲液与乙氰梯洗脱, C18柱分离, 紫外243 nm检测。色谱条件:Hypersil ODS柱 (water) , 检测波长243 nm, 柱温25°C, 流动相:A:H2O;B:0.14 mol·L-1醋酸钠, 0.5 mol·L-1三乙胺, 以冰醋酸调节p H为6.4;C:乙氰;A∶B∶C=18∶54∶28.1, 流速:1 mL·min-1。
衍生剂:乙醇∶水∶TEA∶PITC=0.35 mL∶0.05mL∶0.05 mL∶0.05 mL, 定容于50 mL水。
从茶氨酸标样和样品的高效液相色谱图的对比可以看出, 样品中生成了茶氨酸。
4 结论
(1) 本实验在采用文献的化学方法合成L-茶氨酸的基础上, 在催化剂选择, 反应时间, 反应条件等方面进行了改进和研究, 实验得到了目的产物, 但重复性不好。
(2) 本实验易溶于水的产物较多, 应在干燥的环境下进行。但由于实验条件的限制, 没能达到要求, 如通入干燥的酸催化效果更好, 乙胺用99.5%的较好, 因此, L-茶氨酸的收率受到限制, 产率不高。
(3) L-茶氨酸可以用作多种食品添加剂, 且国内在此方面的研究处于初级阶段, 因此, L-茶氨酸的合成研究在我国有广阔的应用前景。
参考文献
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