丙氨酸转氨酶

丙氨酸转氨酶（精选七篇）

丙氨酸转氨酶 篇1

关键词：乙型病毒性肝炎肝炎,AST/ALT比值,肝硬化,肝纤维化

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的常见传染病, 具有传染性强、传播途径复杂、流行面广、发病率较高等特点。慢性乙型肝炎病程迁延, 如得不到及时的治疗, 将会发展为肝硬化甚至肝癌, 严重危害人类健康。只有采取以切断传播途径为主的综合防治措施, 做好易感人群的保护, 才能减少疾病发生。急性肝炎患者大多在6个月内恢复, 乙型病毒性肝炎易变为慢性, 少数可发展为肝纤维化、肝硬化。本文探讨了血清丙氨酸转氨酶 (ALT) 、天门冬氨酸转氨酶 (AST) 在肝炎患者治疗中的变化, 并结合临床资料进行了分析, 判断其对肝炎所致肝损害的临床意义。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本院2003年1月至2008年12月住院和门诊慢性乙型病毒肝炎患者187例, 其中男162例, 女25例, 年龄13~64岁。均经肝活检病理证实, 其中慢性肝炎轻度89例、中度58例、重度19例以及活动性肝硬化21例, 健康对照者11例。按纤维化程度进行分期, S0~S3期153例, S4期34例。诊断分型按2000年全国第六次寄生虫与传染病学术会议制定的病毒性肝炎防治方案。

1.2 检测方法

肝活检标本切片分别由两位病理医师阅片进行肝组织病理学炎症分级、纤维化分期。肝穿当天清晨空腹采静脉血3 ml, 2 h内离心取血清250ul, 当天测定每份标本。采用奥林巴斯AU2700全自动生化分析仪和罗氏电化学发光2010化学分析仪, 严格按程序操作。

1.3 统计学方法

测定结果经χ2检验, 以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

活动性肝硬化患者血清AST/ALT比值为:1.7~1.8/1, 明显高于其余各组的比值, 差异有非常显著性 (P<0.01) 。当AST/ALT比值≥1时, 诊断早期肝硬化 (S4) 具有较强的意义, 与诊断肝硬化的金标准肝组织学检查比较其灵敏度为82.6%, 特异度为81.2%。

AST/ALT比值随着肝纤维化程度的加重而逐渐上升, 但S0~S3各期之间为:0.5~0.8/1差别没有统计学差别, S4期为:0.7~1.1/1, 与其他各期差异有显著性 (P<0.05) 。

慢性肝炎重度、中度、轻度血清AST/ALT比值为:0.4~0.8/1, 与正常肝组织之间血清AST/ALT比值0.6/1没有显著性差异。

3 讨论

病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的常见传染病, 具有传染性强、传播途径复杂、流行面广泛, 发病率较高等特点。血清酶测定常用者有丙氨酸转氨酶及天门冬氨酸转氨酶。具有临床意义是酶活性升高。各种肝脏疾病患者和一些肝外疾病患者, 其血清转氨酶活性均可升高。ALT活性增高提示肝细胞破坏、细胞膜通透性增强;AST活性增高常提示线粒体损伤。二者是监测病毒性肝炎的敏感指标。常在临床症状出现之前血清转氨酶活性已经增高, 故检测ALT、AST可以发现早期的急性肝炎和隐性肝炎病毒感染, 是目前诊断肝病应用最普遍的酶学检查项目。血清转氨酶活性的高低与肝细胞受损的程度一致, 故有助于病情估计、疗效观察和预后判断:ALT显著增高, 见于各种肝炎急性期、药物性肝损害;中度增高, 见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎、酒精性肝病及心肌梗死;轻度增高, 见于脂肪肝、阻塞性黄疸及胆道炎症。AST显著增高, 可见于心肌梗死急性发作、各种严重的病毒性肝炎、药物性肝损害及酒精性肝病;中度升高, 见于肝癌、患有重型肝炎时, 若出现胆红素迅速升高, 转氨酶反而下降, 称为酶胆分离, 提示预后不良。测定AST/ALT比值可用于判断肝细胞损害程度和肝病类型。肝纤维化、肝硬化的诊断主要靠活检肝组织病理学、影像学及血清学指标, 其中病理学是诊断的金标准, 但由于肝活检有创伤性, 患者不易接受, 而B超的灵敏度较差等局限性, 人们一直致力于其他指标来判断肝纤维化的程度。本文就血清AST/ALT比值与肝脏病理学进行了对照研究, 结果显示慢性乙型病毒性肝炎患者中活动性肝硬化患者血清AST/ALT比值明显高于正常人及慢性肝炎轻度、中度和重度患者。肝脏病理检查肝纤维化程度S4期以上的患者血清AST/ALT比值高于S0~S3期的患者血清AST/ALT比值, 差别有显著性意义。表明血清AST/ALT比值对肝脏纤维化程度的判断有一定的临床指导意义, 尤其是晚期肝纤维化可能有一定的参考价值。

丙氨酸转氨酶高的原因 篇2

转氨酶是临床上常用的检查肝脏功能的一项指标，转氨酶的正常与否，其实并不能代表肝功能的好坏，转氨酶的高低也不是与肝脏功能状态呈比例的，转氨酶不过是肝细胞里面的一种成分而已，相比较而言这种成分在肝细胞中的含量比较高，肝细胞一旦遭到打击和破坏，转氨酶就被释放到了血液。而在这个时候，如果损害的肝脏细胞不多，肝脏完全能够正常工作。通常，体检中主要检查的转氨酶是丙氨酸转氨酶(ALT)。1%的肝脏细胞损害，可以使血中ALT的浓度增加1倍。因此，ALT水平可以比较敏感地监测到肝脏是否受到损害。一般情况下，转氨酶水平在0—40之间是正常的。如果超出正常范围，只表示肝脏可能受到了损害。很可能因为长期酗酒导致酒精肝，或饮食结构不合理导致脂肪肝，造成转氨酶高。

劳累也可能让转氨酶升高。所以说对于健康人而言，转氨酶水平在正常范围内升高或降低，并不意味着肝脏出了问题，因为转氨酶非常敏感，健康人在一天之内的不同时间检查，转氨酶水平都有可能产生波动。另外，健康人的转氨酶水平也有可能暂时超出正常范围。剧烈运动、过于劳累或者近期吃过油腻食物，都可能使转氨酶暂时偏高。如果在检查转氨酶前一晚加班工作，没睡好觉，或是体检前早餐时吃了油炸的东西，检查结果可能就会超出正常范围。一个人刚刚在操场上跑了几圈，就立刻检查他的转氨酶水平，结果也可能会高出正常范围。因此如果是由于这些情况导致转氨酶升高的，只要好好休息，过一段时间转氨酶自然会恢复到正常水平。还有一种会造成转氨酶升高的情况就是生病时吃了会损伤肝脏的药物，比如红霉素、四环素、安眠药、解热镇痛药、避孕药，还有半夏、槟榔、青黛等中药。但是在停用这些药物一段时间后，转氨酶水平也会很快恢复正常。

丙氨酸转氨酶 篇3

1 对象与方法

1.1 对象

2014年5—8月,由北京市房山区疾病预防控制中心对房山区89家企业职工1 613人ALT进行血清学监测。选取接触有害因素人员1 275人为接害组,选取不接触有害因素的行政后勤人员338人为对照组。作业人员有固定(户口在本区)和流动人口(户口不在本区),文化程度初中及以下人员比例较大。接害人员主要分布在机械加工、家具制造、制药、印刷、建材、石化、服装加工等行业,不同程度地接触粉尘、化学毒物、高温和噪声等有害因素。选择接触苯系物、臭氧、二氧化氮、二氧化硫、溶剂汽油、锰及其化合物、盐酸、乙酸乙酯、粉尘者为化学因素组,接触高温和噪声者为物理因素组,同时接触物理、化学因素者为混合因素组。89家企业1 613名职工的一般情况见表1和表2。

1.2 方法

1.2.1 研究方法

按照房山区疾病预防控制中心设计的职工健康检查表,由专业医师询问和填写健康检查人员的基本信息、职业接触史和生活习惯方式等。然后按照项目进行检查,血液采集3 h内送至实验室检测。用现况研究方法,对资料分别进行整理筛查、分类统计、汇总、判断和分析。

1.2.2 ALT的检测及判断标准

空腹12 h后采集前臂静脉血3 ml,静置60 min,分离血清,采用连续监测法于TBA-40FRACCUTE型全自动生化仪检测ALT,检测同时作室内质控,试剂来源于上海荣盛生物药业有限公司,质控品来源于英国朗道公司。根据检验科手册[4],ALT正常参考值为5~40 U/L,ALT>40 U/L为异常。

1.2.3 有害因素监测及评价

依据《工作场所空气中有害物质监测的采样规范》[5],2014年5—8月对89家企业作业场所进行采样监测,依据国家标准《工作场所有害因素职业接触限值》[6]进行评价。

1.3 统计学分析

建立excel数据库,对资料进行整理和汇总,并用SPSS 19.0软件进行分类统计。计数资料以率(%)表示,比较采用χ2检验;计量资料以±s表示,比较采用u检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 职业有害因素监测结果

共监测89个作业场所,分别对喷漆房、树脂车间、电焊车间、加油站、镀锌车间、复膜机出入纸车间、木工车间、喷砂、发酵、修膜、冲床、磨光、整烫等车间工人工作位进行监测,检测苯系物、臭氧、二氧化氮、二氧化硫、溶剂汽油、锰及其化合物、盐酸、乙酸乙酯、粉尘、噪声和高温等项目,监测结果均未超过国家标准,见表3。

注:水泥尘和煤尘中游离Si O2含量均<10%。

2.2 接害组与对照组ALT水平及异常率比较

接害组ALT水平和异常率明显高于对照组,差异均有统计学意义(u=3.50,χ2=6.73,均P<0.01),见表4。

2.3 接害组不同接害工龄ALT水平及异常率比较

随接害年限的增加,ALT水平和异常率随之升高,差异均有统计学意义(u=2.30,χ2=5.79,均P<0.05)。见表5。

2.5 不同接害组ALT异常率的性别分布

混合因素组ALT异常率明显高于单纯物理、化学因素组(χ2=25.70,P<0.01),物理因素组最低。性别分布,ALT异常率男性明显高于女性(χ2=18.92,P<0.01);男性和女性的ALT异常率均为混合因素组高于单纯物理、化学因素组(χ2=19.66,P<0.01,χ2=7.51,P<0.05)。见表6。

注:ALT—丙氨酸转氨酶。

注:ALT—丙氨酸转氯酶。

注:ALT—丙氨酸转氨酶。

3 讨论

ALT是人体的一种主要酶类,主要作用是催化氨基酸与酮酸之间的氨基转移,是维持生命反映的必要酶类[7]。当肝细胞受损时肝细胞膜通透性增加,胞质内ALT释放入血致使血中ALT活力升高[8]。造成ALT偏高的因素很多,除肝胆疾病、心血管疾病外还有生理性、药物和毒物[2]。本研究接触有害因素人群ALT水平和异常率明显高于未接触人群,而且随接害年限增加而升高。提示职业有害因素对人体肝脏有间接损害作用,接害年限增加则接害的剂量强度相对增大,对机体的损害程度俞加严重。

作业环境中常存在多种有害物质,虽然每种毒物的监测浓度都不超过国家职业接触限值,但也不可忽视其产生的联合作用对作业工人健康的影响[9]。生产作业环境的监测数据并不能准确全面地代表机体接触的实际情况及健康损害作用,尤其不能代表体内蓄积到一定量后产生的变化,对于低剂量接触者实际意义不大[10]。当工作场所中存在多种职业危害因素时,对人体健康可表现为协同、加强、拮抗的交互作用和独立、相加的非交互作用等联合作用形式[11]。本研究结果显示,接触混合因素人群ALT异常率明显高于接触单纯物理、化学因素人群,多种职业病危害因素同时作用于靶器官,对人体健康的影响可能存在协同加强的联合作用。分析认为,在存在有害因素的作业环境中,如果排毒设施不健全,个人防护不到位,毒物在高温下可加速挥发性毒物的挥发而使环境空气中毒物浓度明显增高,毒物在低气压条件下难以扩散排出,极易被人体经呼吸道、消化道或皮肤吸收。由于消化道血液循环的特点,从胃和肠吸收到局部血管的物质都要汇入肝-门静脉,在肝脏中进行代谢转化后再进入体循环。肝肠循环使某些毒物再次吸收,使其在体内停留时间延长,毒性作用增强。随着接触时间和剂量的增加,毒物在体内蓄积到一定剂量强度,肝脏负荷过大,肝细胞受损,血清中ALT升高。同时接触多种职业危害因素,每种危害因素均对身体产生一定的危害效应,多种有害物质被人体同时吸收后,还可能产生更为复杂的混合作用[12],关于多种职业危害的剂量-效应关系还有待进一步探讨。

房山区89家企业接触职业危害人群ALT异常率(15.29%)较高,高于2012年北京市昌平区职业人群(11.2%),男性高于女性与2012年北京市昌平区[3]报道一致。职业危害因素接触概率较高的是原料的开采与提炼、材料搬运与储藏、粉碎与研磨等工种,多由男性承担,男性接害的机会多于女性。再加上男性多有吸烟、嗜酒等不良生活习惯。有报道,ALT活力的升高与酒类摄取、体重指数、运动、疲劳,乃至生活方式和饮食习惯等多种非病理性因素密切相关[13]。本研究的男性职工大部分是流动人口。某资料显示,2005年全国有毒有害企业超过1 600万家,受到各种职业危害的人群超过2亿人,流动工人占90%[14]。受教育水平低、以体力劳动为主是流动工人的显著特点[15]。他们劳动强度大,文化水平低,职业病防护知识欠缺,职业卫生观念淡薄,饮食结构不合理,缺乏适当的健身运动。多种因素叠加导致男性ALT异常水平高于女性。

针对这种潜在的职业危害,应加强用人单位对职业人群的健康监护管理,定期健康检查,对ALT升高者适当增加检测项目,查清ALT升高的原因,以便隔离或治疗。职能部门应定期监测作业环境,同时考虑危害因素的毒性、暴露强度、接触时间、防护水平和接触人数,多种职业危害因素的联合作用,进行综合评估;检查作业场所中的警示设备、防护设施和个体防护用品的合理利用程度;改进工艺流程,确保作业环境通风设施完好有效,减少工人的接害机会和作用剂量强度。作业人员应提高自我防护意识,做好必要防护,养成良好的生活方式和职业卫生习惯,降低职业危害。

作者声明

本文无实际或潜在的利益冲突

摘要：目的 探讨职业病有害因素对作业人员肝脏健康的影响,为控制职业危害提供依据。方法 选取北京市房山区89家企业接触有害因素人员1 275名为接害组,同时选取未接触有害因素人员338名为对照组,用连续监测法检测丙氨酸转氨酶(ALT)。结果 接触有害因素人员ALT水平及异常率(15.29%)明显高于未接触人员(9.76%),差异有统计学意义(u=3.50,χ2=6.73,均P<0.01);随接害年限的增加ALT水平及异常率随之升高,差异有统计学意义(u=2.30,χ2=5.79,均P<0.05);接触物理、化学混合因素人员ALT异常率明显高于接触单纯物理、化学因素人员,差异有统计学意义(χ2=25.70,均P<0.01);接害组男性ALT异常率明显高于女性(χ2=18.92,P<0.01)。结论 房山区相关企业作业人员ALT异常率较高,职业病有害因素对肝脏有一定间接损害作用,应加强用人单位健康监护管理,做好必要防护,降低职业危害。

丙氨酸转氨酶 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

我院2006年6月至2011年6月传染科治疗的慢性丙型肝炎患者68例, 其中男性39例, 女性29例;年龄22～63岁, 平均年龄 (41.63±6.58) 岁。

1.2 诊断标准

所有患者均符合中华医学会肝病学分会、全国传染病寄生虫病学会制定的《丙型肝炎防治指南》中慢性丙型肝炎的诊断标准;所有患者初诊时丙型肝炎病毒RNA定量均大于最低检出限;并排除合并有其他心肺肾疾病;无脂肪肝病史;无饮酒史。

1.3 治疗方法

所有患者均给予干扰素和利巴韦林治疗。干扰素选择Peg-IFN-α-2b肌内注射, 50µg/次, 每周注射1次;利巴韦林使用剂量为800～1000mg/d。疗程为48周。

1.4 检测方法

所有患者均用促凝采血管采取静脉血, 分别检测血清丙氨酸转氨酶和丙型肝炎病毒RNA含量。

血清丙氨酸转氨酶采用美国雅培公司的全自动免疫分析仪, 使用酶法进行测定。

丙型肝炎病毒RNA采用PCR定量检测, PCR仪由美国罗氏公司提供, 试剂为PCR仪配套试剂。采用Taqman模式的水解探针, Taqman探针同时带有荧光发光分子和荧光淬火分子, 完整的Taqman探针在激光激发下, 样品检测无荧光, 而在PCR扩增过程巾, Taq酶分子降解, 使得荧光发光分子与荧光淬灭分子分开, 从而在激光激发下产生特定波长的荧光, 这种荧光随着PCR扩增过程而动态增强, 定量PCR仪通过全过程动态检测, 可以得到每一种特定模板RNA的拷贝数。

1.5 患者的分组

分别根据患者的血清丙氨酸转氨酶和丙型肝炎病毒RNA含量对患者进行分组。血清丙氨酸转氨酶水平>正常值2倍的患者42例, 血清丙氨酸转氨酶水平<正常值2倍的患者26例;丙型肝炎病毒RNA含量≥106copes/mL者为高滴度者42例, 丙型肝炎病毒RNA含量<106copes m L者为低滴度者26例。

1.6 疗效判定

生化应答:患者的血清丙氨酸转氨酶水平恢复正常;病毒学应答, 也叫治疗末应答 (ETR) :在治疗结束后, 患者的丙型肝炎病毒RNA含量<最低检出限。持续应答 (SR) :治疗结束后, 随访24周, 丙型肝炎病毒RNA含量<最低检出限。无应答:在治疗结束后, 患者的丙型肝炎病毒RNA含量>最低检出限。复发 (Relapse) :治疗结束后, 丙型肝炎病毒RNA含量<最低检出限, 随访24周, 丙型肝炎病毒RNA含量>最低检出限。

1.7 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行数据的统计与分析, 数据资料用t检验, 组间对比用χ2检验, P<0.05为差异有显著性, 具有统计学意义。

2 结果

68例患者中, 血清丙氨酸转氨酶>正常值2倍的患者与血清丙氨酸转氨酶<正常值2倍的患者相比, 干扰素的疗效无明显差异 (P>0.05) ;丙型肝炎病毒RNA含量<106copes/m L的患者的干扰素疗效明显优于丙型肝炎病毒RNA含量>106copes/m L的患者 (P<0.05) , 但两组患者随访24周时, 干扰素的疗效无明显差异 (P>0.05, 见表1) 。

3 讨论

慢性丙型肝炎的患者多数有持续性的血清丙氨酸转氨酶升高, 丙型肝炎病毒的复制会造成患者肝脏的损伤, 从而导致患者的血清丙氨酸转氨酶升高。但血清丙氨酸转氨酶水平的增加幅度与患者的疾病程度无明显的关系。但对于不同血清丙氨酸转氨酶水平的慢性丙型肝炎患者, 干扰素的疗效无明显差异[1]。本组研究中, 血清丙氨酸转氨酶>正常值2倍的患者与血清丙氨酸转氨酶<正常值2倍的患者相比, 干扰素的疗效无明显差异。

丙型肝炎病毒RNA含量检测是目前诊断丙型肝炎、判断患者体内病毒复制情况和评价患者治疗效果的直接依据[2]。而目前应用最广泛的实时荧光PCR法是目前丙型肝炎病毒RNA含量检测中灵敏度高同时具有很好特异性好的最可靠方法。本研究中, 丙型肝炎病毒RNA含量测定结果>106copes/mL为阳性, 表示患者体内丙型肝炎病毒RNA正在大量的复制。实时荧光PCR不仅可以对丙型肝炎病毒RNA含量定性, 同时可以通过测定体内丙型肝炎病毒RNA的具体含量, 可以对药物治疗丙型肝炎的疗效进行评价[2]。

本组研究中, 只是针对单一剂量的干扰素的疗效进行的研究, 如果要对干扰素的疗效进行全面的评价, 还需要进一步对不同剂量的干扰素以及不同的丙型肝炎病毒RNA含量患者进行研究。

综上所述, 慢性丙型肝炎患者血清丙氨酸转氨酶水平与干扰素的疗效无明显关系, 而丙型肝炎病毒RNA含量与干扰素的近期疗效相关, 但与远期疗效无明显关系, 因此可以根据慢性丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒RNA含量选择适当的干扰素治疗。

摘要：目的 分析慢性丙型肝炎患者血清丙氨酸转氨酶水平、丙型肝炎病毒RNA定量对干扰素疗效的影响。方法 我院传染科治疗的慢性丙型肝炎患者68例, 所有患者均给予干扰素和利巴韦林治疗。结果 68例患者中, 血清丙氨酸转氨酶>正常值2倍的患者与血清丙氨酸转氨酶<正常值2倍的患者相比, 干扰素的闻道无明显差异 (P>0.05) ;丙型肝炎病毒RNA含量<106copes/mL的患者的干扰素疗效明显优于丙型肝炎病毒RNA含量>106copes/mL的患者 (P<0.05) , 但两组患者随访24周时, 干扰素的疗效无明显差异 (P>0.05) 。结论 慢性丙型肝炎患者血清丙氨酸转氨酶水平与干扰素的疗效无明显关系, 而丙型肝炎病毒RNA含量与干扰素的近期疗效相关, 但与远期疗效无明显关系, 因此可以根据慢性丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒RNA含量选择适当的干扰素治疗。

关键词：慢性丙型肝炎,丙氨酸转氨酶,丙型肝炎病毒RNA定量,干扰素疗效

参考文献

[1]张琳, 苗亮, 韩峰, 等.慢性丙型肝炎患者血清细胞因子水平的变化及意义[J].细胞与分子免疫学杂志, 2011, 27 (3) :301-303.

丙氨酸转氨酶 篇5

虽然通过基因克隆技术构建氨基酸产生菌,可以大幅度提高菌株产酸水平,但目前,工业生产使用的绝大多数产生菌主要是通过诱变方法结合原生质体融合方法选育获得的。通过传统诱变育种选育不仅可得到遗传性稳定的高产菌株,而且操作条件和技术要求不高,实验操作也较为容易,因而使其在工业微生物育种中占有绝对优势的地位[4]。

原生质体诱变是一种在细胞原生质体化后进行诱变的育种技术,细胞被脱去细胞壁之后,使诱变剂更加容易诱发细胞的遗传基因发生突变,从而以更高的突变率产生各种突变菌株,通过一定的筛选方法即可选育出需要的菌株,此法已得到广泛的应用,并取得丰硕的成果[5,6,7]。

本文以大肠杆菌XJ-1为出发菌株,采用紫外和He-Ne激光以及复合诱变原生质体,以筛选高产天冬氨酸转氨酶菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种:

大肠杆菌XJ-1 来自淮北原野生物工程有限公司

1.1.2培养基(g·L-1)

斜面培养基:蛋白胨7,氯化钠溶液0.5,牛肉浸膏10,无水硫酸镁溶液0.2,磷酸二氢钾溶液0.4,富马酸 10,琼脂 21.7, 蒸馏水定容, 氨水调pH为7.0+,0.1MPa 20 min。

种子培养基:蛋白胨 7.5,氯化钠5,无水硫酸镁 0.22,磷酸二氢钾1,富马酸 11.7,玉米浆17.5,蒸馏水定容,氨水调pH为7.0-,0.1MPa 灭菌20 min。

发酵培养基:富马酸 10,玉米浆 22,氯化钠溶液1.5,无水硫酸镁溶液 0.2,磷酸二氢钾溶液0.4,蒸馏水定容,氨水调pH为7.0+,0.1MPa 灭菌20 min。

平板培养基:在斜面培养基的基础上加入指示剂,0.1MPa 灭菌20 min

再生培养基:大肠杆菌RM 用SMM稳定液配置, 0.1MPa 灭菌20 min。

SMM缓冲液:蔗糖171,MgCl2 4.1,顺丁烯二酸2.32,pH6.5,0.1MPa 20 min。

1.2 分析方法

1.2.1菌体浓度的测定[8]

菌体浓度的测定方法(即菌体生物量):通过发酵液在640 nm处吸光值体现。

1.2.2酶活力定义

每小时每毫升酶液所转化底物富马酸的毫克数。

1.2.3天冬氨酸转氨酶活力的测定

吸取5 mL酶液,加入15 mL底物,37℃,180 r·min-1反应1 h,测定反应前后富马酸浓度的变化即可算出底物富马酸的克数[9]。

计算酶活方法:

undefined总

C0-富马酸初始浓度,C1-反应终止时富马酸的浓度,V总- 反应液的总体积,V酶-发酵液体积,M- 富马酸的分子量

1.2.4 富马酸标准曲线

紫外光谱法是基于价电子吸收一定波长范围的紫外光而产生的分子吸收光谱来反映不饱和基团的性质,紫外光谱不仅能识别分子中不饱和基团的性质而且可以测定不饱和化合物含量,由于富马酸分子中有不饱和键,在紫外区有强吸收[9]。

通过紫外波长的扫描,工作曲线在0.1~10 mg·L-1范围内线性关系良好,发现富马酸在207 nm处有最大吸收值,其吸收值越大,则说明富马酸含量越高,也说明L-天冬氨酸含量越小。依据这一原理,可以用标准富马酸样品配制成若干梯度的溶液,分别通过实验,测定207 nm下A值,通过多次实验,绘制得到富马酸标准曲线,见图1

1.3 原生质体的制备与再生

将大肠杆菌接到斜面培养基,37℃恒温培养16 h,待菌体长好时,用10 mL无菌水洗脱至无菌管,充分振荡即为菌悬液(同时做3个平行,以下实验同)。

1.3.1原生质体的制备

将制好的菌悬液3000 r·min-1离心10 min,再用一定浓度的SMM在同样条件下反复洗涤3次。无菌过滤后加入最终浓度一定的溶菌酶,混合均匀,置于一定温度下酶解,定时取样镜检,至大部分菌体形成原生质体时停止酶解。

1.3.2原生质体的再生

酶解结束后用3000 r·min-1离心10 min,用SMM反复洗涤3次以清除酶液,将洗涤后的原生质体分别用高渗溶液和水梯度稀释,分别涂布于再生培养基上,培养再生,并将剩余的原生质体重新悬浮于SMM液中。

1.4 紫外和激光的诱变

1.4.1紫外诱变

将准备好的原生质体悬液稀释至含量约为每毫升106个,取3 mL悬液于直径为90 mm平皿中,于15 w的紫外灯下照射,照射距离为30 cm,照射时间选择5、15、30、45、60、75 s,另设对照(CK)为0 s。将诱变后的原生质体悬液采用SMM液系列稀释,涂布于含有指示剂的再生平板上培养,37℃避光倒置培养。观察、记录再生单菌落,计算致死率和正突变率。

致死率 = [1-(各辐照时间生长菌落数/对照生长菌落数)]×100%

正突变率 = 菌圈比大于出发菌株的菌圈比的菌落数/对照生长菌落数×100%

1.4.2激光诱变

将0.2 mL释至含量约为每毫升106个的原生质体悬液置于数个灭菌的小试管中进行照射,He-Ne激光(λ=632.8 nm)的输出功率为15 mw,扩束光斑直径0.3 cm,照射距离30 cm,照射剂量分别为5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min,另设对照(CK)0 min。后续操作同紫外诱变。

1.4.3紫外-激光复合诱变

取制备好的大肠杆菌原生质体先后在选定的最佳紫外和激光诱变剂量下诱变处理,后续操作同激光诱变。

1.5 突变株的筛选

斜面培养:将分离后的菌株接于斜面培养基,在温度37℃,恒温培养16 h。

种子培养:接一环生长良好的斜面种子至装有50 mL种子培养液的250 mL三角瓶培养,摇瓶转速为180 r·min-1,37℃恒温培养16 h。(三组平行,同一条件下操作,后继实验均如此)。

发酵培养 :将培养好的种子液以10%的接种量接入发酵培养基中,在温度37℃摇床转速180 r·min-1的条件下培养16 h,发酵结束后,分别测定并记录pH、菌浓OD640和207 nm 下吸光值。将平板筛选获得的正突变株转接和活化,通过斜面、种子、发酵培养,测发酵液中天冬氨酸转氨酶的活力,确定高产稳定株。

2 结果与分析

2.1 紫外和He-Ne激光分别诱变原生质体最佳照射剂量的确定

由图2得知,紫外线诱变原生质体,随着照射时间的延长,致死率不断上升,但是当照射时间达到45 s时,再延长照射时间,致死率变化不大,而正突变率却有所下降。因此,紫外诱变的最佳照射时间为45 s,此时致死率为95.27%,正突变率为9.4%。

由图3可以看出,在激光诱变中,趋势同紫外线诱变。确定激光照射最佳照射时间为40 min,此时致死率为72.7%,正突变率为14.1%。

2.2 紫外-He-Ne激光复合诱变的效果

由表1可以看到,在复合诱变中(紫外照射45 s,激光为40 min),通过平板初筛和计数得到致死率为91.54%,正突变率为18.2%,比激光照射的致死率有较大提高,比紫外照射的致死率略低,但是正突变率得到较大程度的提高。依据以在诱变培养过程中,各单菌落变色圈形成的先后以及变色圈与菌圈比大小,挑取菌株百余株,通过摇瓶复筛得到17支产量相对较高的诱变菌株,其中XJ-1-45、XJ-1-86和XJ-1-99 3菌株酶活力最高,较之出发菌株,分别提高了12.82%、17.37%和26.23%。结果见表2

2.3 突变株的传代实验

将复合诱变所筛选的3株高产突变株XJ-1-45、XJ-1-86和XJ-1-99分别传代5次,通过酶活力测定得知,突变株具有较好的遗传稳定性,3株突变株5次传代酶活力的测定如图4。

由图4可以看到,突变株XJ-1-86和XJ-1-99的5代产酶量始终在98 mg·mL-1·h-1和91 mg·mL-1·h-1左右,产酶性质稳定。突变株XJ-1-45在传代过程中,酶活力有所下降,其酶活下降出现在第2代。此后,酶活力均保持比较稳定。5次传代以后,XJ-1-99的产酶量仍然最高,为98.5 mg·mL-1·h-1, 酶活力只降了1.4%,比出发菌株(79.10 mg·mL-1·h-1)提高24.5%。

3 结论

原生质体经过紫外诱变正突变率较低,激光诱变正突变率较好;而采用紫外-激光的复合诱变方法,致死率较紫外有所变小,但正突变率得到一定程度的提高。究其原因,大概是经紫外照射的菌株在激光的照射下,进行了一定的修复作用。但由于激光本身也是一种诱变源,同样能够杀死微生物。在修复和致死的双重作用中,有着复杂的作用机理,不同于单一因素诱变,有助于获得很好的诱变效果。诱变所筛选的3株突变株中,XJ-1-45 、XJ-1-86和XJ-1-99在传代过程中,产酶量有小幅度的下降。随后遗传性质比较稳定,最终产酶最高的是XJ-1-99,酶活为98.5mg·mL-1·h-1,较出发菌株(79.10 mg·mL-1·h-1)提高24.50%。

摘要：对天冬氨酸转氨酶产生菌大肠杆菌XJ-1原生质体进行紫外-激光复合诱变筛选,结果表明,复合诱变对该菌的原生质体有明显的致死作用。以致死率和正突变率为指标,确定了紫外和He-Ne激光照射的最佳时间分别为45 s和40min。在此条件下对大肠杆菌原生质体进行紫外-激光复合诱变,得到3株高产菌株,分别命名为XJ-1-45、XJ-1-86和XJ-1-99,酶活较出发菌株XJ-1分别提高了12.82%、17.37%和26.27%。传代培养表明突变株生产性能稳定。

关键词：紫外线,He-Ne激光,天冬氨酸转氨酶,原生质体,复合诱变

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丙氨酸转氨酶 篇6

植物抗病反应是一个复杂的代谢过程。超氧化物歧化酶 (Su-peroxide dismutase, SOD) 、过氧化物酶 (Peroxidase, POD) 、过氧化氢酶 (Catalase, CAT) 、多酚氧化酶 (Polyphenolox-idase, PPO) 和苯丙氨酸解氨酶 (Phenylalanine ammonialyase, PAL) 等是植物体内重要的一些防御酶, 参与活性氧清除及酚类、木质素和植保素等抗病相关物质的合成, 能抵御活性氧及氧自由基对细胞膜系统的伤害, 增强植物对病害的抵抗能力[2]。PAL是连接生物初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶, 是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶[3]。PAL存在于所有绿色植物中, 真菌、藻类和细菌中也同样存在[4]。PAL与植物的抗病性直接相关, 植物受病菌侵染后, 通常PAL酶活性有所提高, 同时随木质素、绿原酸等抗菌物质合成的增加, 在植物抗病过程中起着化学屏障作用[5], 本研究分别在白掌的抗病品种和感病品种上接种病原菌, 之后对根部PAL酶的变化进行了初步的研究, 旨在了解白掌根茎腐病发病过程中植株体内PAL酶的变化与其抗病性的内在联系, 为进一步全面揭示白掌根茎腐病感病机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

感病品种:S.‘Parrish’抗病品种:S.cannifolium。

1.2 供试菌

根茎腐病病原菌:由广东省农业科学院环境园艺研究所观赏植物中心分离所得。

1.3 病原培养基的配制

马铃薯100g;葡萄糖5g;琼脂8.5g;水500m L。马铃薯洗净去皮, 切块称取100g, 称取葡糖糖5g, 琼脂8.5g, 马铃薯倒入锅中加入500m L自来水, 煮沸20分钟, 倒出用纱布过滤, 加入琼脂, 加热使其充分溶解, 再加入葡糖糖混合均匀后补足到500m L, 灭菌锅灭菌20分钟。

1.4 病原菌的活化

在无菌条件下用接种环挑取菌丝在PDA培养基上, 6~7天用刀片刮伤菌丝, 促进孢子产生, 再过7天刮下孢子用无菌水配成105个孢子/ml孢子悬浮液待用。

1.5 接种与培养

用注射器注射50m L孢子悬浮液灌于植株根部, 放入人工培养箱培养。光照/黑暗各12小时, 温度22~28℃。保持盆土湿润, 不加悬浮液为对照。

1.6 苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 活性测定

于接种后第2、3、4、5、7、9天分别取材1次, 共6次。取材是把植株的根部全部取下, 每次每品种取4株, 洗净、擦干、剪碎、混匀。保存在低温冰箱 (-80℃) 中待测。

1.6.1 酶液提取:

取材料0.5g, 加液氮研磨至粉末状, 加聚乙烯吡咯烷酮PVP 0.05g混匀, 转入装有5m M巯基乙醇硼酸缓冲液 (p H值8.8) 2m L的离心管, 离心 (10000r/min, 15min, 4℃) , 上清液即为酶液, 取样枪取出上清液, 放入5m L离心管, 剩余物加少量缓冲液冲洗后, 再次离心 (10000r/min, 10min) , 取上清液, 如此重复3次, 直到酶粗提液补足5m L, 将酶液放入4℃冰箱中保存备用, 重复取材3次。

1.6.2 活性测定:

取酶液0.2m L, 0.02m L-苯丙氨酸1m L及p H值8.8的硼酸缓冲液2m L, 作为反应体系, 以0.2m L蒸馏水+1m L 0.02m L-苯丙氨酸+2m L p H值8.8的硼酸缓冲液作为对照, 摇匀后转入石英比色皿中, 立即在分光光度计 (UV-2102 PCS) 上测定起始OD290值, 并精确计时, 然后各测定液倒回试管于37℃恒温水浴锅中保温30min, 冰浴中停止反应, 再转入石英比色皿测定OD290值, 将第2次测得的OD290值减去第1次测得的OD290值, 可得到反应的酶活性。以每小时在290nm处吸收变化0.01所需酶量为一单位, 相当于每1m L反应液中形成1μg肉桂酸。

PAL活性=A290×V/ (a×0.01×w×t)

公式中:V为提取粗酶液总体积, a为测定时取用粗酶液体积, W为样品重量, t为反应时间。

2 结果分析

通过接种根茎腐病病原菌于白掌抗病品种S.cannifolium和感病品种S.‘Parrish’上, 由图1和图2可以得出以下结论:

2.1 PAL酶活性品种间的差异

接种前感病品种PAL酶活性高于抗病品种。

2.2 抗病品种接种病原菌后PAL酶活性变化

抗病品种经病原菌侵染后PAL酶活性显著升高, 接种与未接种之间PAL酶活性有极显著性差异, 经差异分析, P=0.00<0.01, 表明抗病品种经病原菌侵染后PAL酶活性极显著高于对照。

2.3 感病品种接种病原菌后PAL酶活性变化

感病品种经病原菌侵染后PAL酶活性升高。经差异分析, P=0.03<0.05, 表明感病品种经病原菌侵染后PAL酶活性显著高于对照。

2.4 接种病原菌后PAL酶活性动态变化

抗病品种接种病原菌后PAL酶活性逐渐上升, 接种后第3天PAL酶活性和净增加值达到最大峰值, 分别为2.68U/min.g FW和2.32U/min.g FW, 第4天下降, 第5天达到另一个峰值, 为1.98U/min.g FW, 随后又逐渐下降。感病品种接种病原菌后PAL酶活性也逐渐上升, 第4天PAL酶活性和净增值达到最大峰值, 分别为2.18U/min.g FW和1.46U/min.g FW, 之后逐渐下降。接种病原菌后, 抗病品种PAL酶活性基本上都大于感病品种, 只在第4天低于感病品种。

3 讨论

在植物抗病机制中, 植物受病原菌侵染后, 体内发生一系列较复杂的生理生化变化, 以抵抗病原菌的侵入和危害。植物的防御体系包括与苯丙烷类代谢有关的酶, PAL是苯丙氨酸类代谢的第一个关键酶, 催化苯丙氨酸脱氨后产生肉桂酸, 并最终转化为木质素。木质素通过加强细胞壁, 增加组织木质化的程度, 形成病原菌入侵的机械屏障[11]。汤会君等研究发现, PAL活性与烟草呈正相关, 其活性在感病后明显升高[12];陈学平等通过烟草感染TMV的实验发现, PAL活性在感染TMV后, 抗病种明显高于感病种[13]。一般认为, 受到病害感染后, 植物体内PAL活性升高, 抗病品种高于感病品种[10]。

本实验选取白掌抗、感病品种在接种根茎腐病病原菌后不同时间, 分别测定根部细胞中苯丙氨酸解氨酶活性的变化, 发现其活性呈现动态变化, 趋势大体为先上升后下降。其中抗病品种出现了2个峰值。前期对抗病种S.cannifolium和感病种S.‘Tyler Green进行抗病机理研究, 发现抗病品种与感病品种体内PAL活性在接种病原菌前就有显著性差异, 接种后抗感品种酶活性都明显提高, 与对照组差异显著。

(1) 感病品种本身PAL酶活性高于抗病品种, 这有可能是因为不同品种之间其本身的木质素含量不同, 合成的PAL酶量也有所不同。

(2) 抗、感病品种接种病原菌后, PAL酶活性均高于其对照组。这有可能是由于植株在病原菌侵染时, 自身机制会进行一系列防御措施, 其中就会诱导植物合成大量的PAL酶来抵御病原菌的侵染。

(3) 接种病原菌后, PAL酶活性有着动态变化, 这种变化可能是由于植株在侵染后, 产生了大量的PAL酶, 使酶活性增加到峰值, 之后酶活性有所下降, 可能是有足够的PAL酶调节次生代谢产物的产生, 然后继续消耗一部分PAL酶, 从而再一次诱导了酶的激活和合成。

(4) 接种病原菌后, 抗病品种PAL酶活性明显高于感病品种, 以及抗病品种出现峰值的时间早于感病品种, 可能是因为抗病品种较感病品种对病原菌的侵染更为敏感, 较快做出一系列反应, 以产生抗病作用。

丙氨酸转氨酶 篇7

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取我科于2014年3月至2014年11月确诊为缺氧缺血性脑病的患儿53例为观察组, 其中男26例, 女27例, 体重 (3.15±0.23) kg, 日龄0~3 d, 轻度28例, 中度15例, 重度10例。同时选取我院产科同期出生的母亲正常, 无窒息史的健康新生儿31例作为对照组。

1.2 病例入选标准:

(1) 所有患儿均于出生后12 h入院, 胎龄37~40周, 出生体重2.5-4.0 kg, (2) 符合邵肖梅等主编的《实用新生儿科学》第4版新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准: (1) 有明确的可导致胎儿宫内窘迫的异常产科病史, 以及严重的胎儿宫内窘迫表现 (胎心〈100次/min, 持续5 min以上;和或羊水Ⅲ度污染) , 或者在分娩过程中有明显窒息史; (2) 出生时有重度窒息, 指Apgar评分1 min≤3分, 并延续至5 min时仍≤5分, 和或出生时脐动脉血气PH≤7.0; (3) 出生后不久出现神经系统症状, 并持续至24 h以上, 如意识改变 (过度兴奋、嗜睡、昏迷) , 肌张力改变 (增高或减弱) , 原始反射异常 (吸吮、拥抱反射减弱或消失) , 病重时可有惊厥, 脑干征 (呼吸节律改变、瞳孔改变、对光反应迟钝或消失) 和前囟张力增高; (4) 排除电解质紊乱、颅内出血和产伤等原因引起的抽搐, 以及宫内感染、遗传代谢性疾病和其他先天性疾病所引起的脑损伤。 (3) 同时排除感染性疾病、神经系统先天畸形、先天性心脏病等疾病。

1.3 方法

将所有缺血缺氧性脑病患儿作为观察组, 于患儿入院12 h内抽取其静脉血3 m L, 促凝后, 3 500 r/min的离心机进行离心处理, 离心3 min后, 取上层血清进行实验室测定。对照组新生儿于出生断脐同时采集脐血3 m L, 检测方法同观察组。血标本均采用全自动生化分析仪, 分别测定两组新生儿的胆碱酯酶、腺苷脱氨酶及胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量, 测定结果均采用统计软件进行统计数据分析处理, 并得出结果进行比较。

1.4 统计分析

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理分析, 计量资料组间比较均应用t检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

两组新生儿在性别、平均体重、日龄等方面比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。胆碱酯酶活性测定结果比较, 观察组的胆碱酯酶活性水平较对照组的水平明显下降 (P<0.05) , 两组比较, 观察组腺苷脱氨酶及胱氨酸蛋白酶抑制剂的测定水平明显高于对照组 (P<0.05) 。

3 讨论

新生儿缺氧缺血性脑病是由于缺氧窒息导致的脑血流改变所致脑损伤, 当缺氧缺血发生时, 除了脑部之外, 全身各个脏器包括肝、肾等重要脏器亦发生缺血-再灌注损伤, 造成严重的肝肾功能损害, 各种酶学指标也随之发生改变。肝功能检测的指标包括有丙氨酸氨基转移酶、谷氨酰转移酶等已被证实是肝功能的标志性酶, 但目前胆碱酯酶、腺苷脱氨酶二者在缺氧缺血性肝损害中的作用被越来越多的重视。肾发生缺氧缺血性损伤后, 胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的变化也成为一种重要的酶学改变指标。

胆碱酯酶是由肝细胞合成的一种水解酶, 其在肝细胞生成后即分泌入血, 故能够对肝实质细胞损害的具体情况进行反应[1]。正常人体血清的胆碱脂酶以拟胆碱脂酶和乙酰胆碱酯酶两种形式存在, 其中前者含量最多, 目前临床上实验室采用的检测方法检测到的均是拟胆碱酯酶, 拟胆碱酯酶主要由肝细胞代谢产生, 当肝功能受损后, 其合成减少, 活性降低, 故其能够敏感地反映肝细胞的合成功能[2]。研究显示拟胆碱酯酶水平下降并不仅是原发性肝病引起的, 任何类型肝损害的分解代谢状态均可引起拟胆碱酯酶水平下降[3]。

腺苷脱氨酶 (ADA) 是嘌呤代谢中重要的酶类之一, 在核苷酸代谢中起脱氨基作用, 催化腺苷转变为次黄嘌呤腺苷。腺苷脱氨酶同工酶有3种, 分别为ADA1, ADA1+CP和ADA2。其中ADA1+CP在肝组织重分布最广, ADA活性是反映肝损伤的敏感指标, 现在已经做为肝功能测定项目之一, 与ALT或GGT等组成肝酶谱能较全面地反映肝脏病的酶学改变, 其较ALT、GGT更能反映急性肝功能损害程度。

肾小球滤过率 (glomerular filtration rate, GFR) 是直接反映肾滤过功能, 确定是否肾损害的重要指标, 临床上多以Scr、Uree等指标的测定结果作为依据, 进行判断[4]。但Scr受患者年龄、性别的影响较大, 在检查过程中受到溶血等因素的干扰, 对于那些生命体征不稳定的患者, 过多的因素会影响到Scr的检测结果, 导致其不能够准确地反映出肾小球滤过率的变化[10]。胱氨酸蛋白酶抑制剂C是一种非糖基化的碱性蛋白质, 分子量为12.3×103, 由于其表达时受其它影响因素作用较小, 故含量较恒定, 且能被肾小球完全滤过, 不被肾小管重吸收和分泌, 最终在近端肾小管被分解代谢, 所以能够很灵敏地反应肾小球滤过功能。即肾损伤的变化。

本研究中胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、血清胱抑素C在观察组及对照组间比较差异具有统计学意义, 这有助于指导儿科医生在临床工作中, 将这三个生化学指标与其他标志性酶联合运用, 及时发现早期肝、肾损伤的指征, 尽早进行干预、治疗, 避免和减轻缺氧缺血性脑病合并症的发生。

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