慢病毒颗粒

慢病毒颗粒（精选四篇）

慢病毒颗粒 篇1

目前进行基因治疗较为常用的病毒载体是Ad和AAV等[1,2], 但都只能实现治疗基因的瞬时表达, 难以形成稳定表达而发挥长效功能。慢病毒载体 (Lentiviral vectors) 是以人类免疫缺陷病毒-1 (human immunodeficiency virus1, HIV-1) 来源为主要代表改造而来的一类病毒载体, 携带有外源基因的慢病毒载体可通过感染活体组织或细胞, 可使外源基因在活体组织或细胞中形成稳定表达[3]。另外, 慢病毒载体是以假病毒颗粒的形式携带外源基因的, 同时对机体具有很低免疫原性, 可减少病毒载体对外源基因在体内表达和反应的干扰, 可有效避免机体对重组病毒的免疫清除, 可使目的基因高效地整合入靶细胞的基因组中, 在体内组织形成稳定表达并有效发挥生物学功能, 是目前进行体内外基因转导和稳定表达研究的较为有效的病毒载体, 也是进行转基因动物[4]、基因工程动物、基因治疗和基因稳定表达细胞株构建等研究的理想工具[5]。但重组慢病毒包装时的滴度往往较低, 成为了慢病毒载体在体内基因治疗的广泛运用的一大障碍[6,7]。因此, 熟练掌握一种高滴度的慢病毒包装技术不仅可建立一个成熟的慢病毒包装的技术平台, 也可为基因治疗研究对慢病毒载体的应用提供基础实验数据。所以, 本实验拟以增强绿色荧光蛋白 (e GFP) 基因为重组慢病毒的目标基因, 利用Lv105-e GFP重组慢病毒质粒通过293Ta慢病毒包装细胞系, 包装携带e GFP基因的慢病毒颗粒, 预期能有效提高重组慢病毒的滴度, 并用不同剂量的重组慢病毒感染H1299细胞, 通过荧光显微镜直接观察目标基因在细胞中转导能力和绿色荧光蛋白在细胞中表达效率。从而建立一个慢病毒包装的技术平台。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌Stbl3和H1299细胞购自Gene Copoeia公司, 慢病毒重组质粒载体Lv105-e GFP、HEK293Ta均为中国医学科学院医学生物学研究所保存。

1.1.2 试剂

质粒提取试剂盒 (购于Omega公司) ;病毒RNA提取试剂盒 (购于Ta KaRa公司) ;逆转录试剂盒 (购于Thero公司) ;Opti-MEM (购于Gibco公司) ;慢病毒包装试剂盒、浓缩试剂盒 (购于Gene Copoeia公司) ;Polybrene (购于Sigma公司) ;SYBRGreen (ROX) 荧光染料试剂 (购于Roche公司) ;慢病毒滴度测定的实时定量PCR (real-time quantitative PCR, q PCR) gag引物P1:5’-GGAGCTAGAACGATTCGCAGTTA-3’, P2:5’-GGTTGTAGCTGTCCCAGTATTTG-3’由Ta KaRa公司合成。

1.1.3 仪器

恒温箱 (上海一恒) ;恒温摇床 (Thermo MAXQ4000) ;离心机 (Thermo MICRO 21R) ;二氧化碳培养箱 (Thermo 311) ;荧光显微镜 (OLYMPUS CX31-32L02) ;透射电镜 (日立7650) ;定量PCR仪 (ABI 7500) 。

1.1.4 培养基

DMEM、胎牛血清均购于Gibco公司, 双抗购于碧云天公司;细胞培养基为89%DMEM+10%胎牛血清+1%双抗;转染培养基为90%DMEM+10%灭活胎牛血清;病毒包装培养基为94%DMEM+5%胎牛血清+1%双抗。

1.2 方法

1.2.1 Lv105-e GFP重组慢病毒质粒的转化扩增及鉴定

将慢病毒重组质粒Lv105-e GFP经过大肠杆菌Stbl3转化, 用SOB Amp+培养基涂板、挑取单克隆菌至SOC Amp+中摇菌过夜, 提取质粒并送由Ta KaRa公司测序鉴定。

1.2.2 携带e GFP重组慢病毒的包装和转染效率观察

根据包装试剂盒说明书, 将293Ta细胞接种到15 cm圆碟中, 在37℃5%CO2中用细胞培养基培养, 待细胞单层长至70%即可用于转染。按照说明书步骤把混合液加入293Ta的转染培养基中, 37℃培养8 h后更换为病毒包装培养基, 在转染48 h至72h之间收获病毒原液。同时, 用荧光显微镜在48h和72h观察e GFP基因在包装细胞中的转染效率。

1.2.3 携带e GFP重组慢病毒原液的浓缩

将收获的15m L慢病毒原液转入离心管, 4℃、500 g离心10 min, 再将上清转入新管并以5:1体积加入病毒浓缩液, 轻轻混匀, 4℃孵育8 h, 4℃、3 500 g离心25 min, 小心移去上清, 避免碰到沉淀干扰病毒, 加入100μL DMEM重悬并转入-80℃保存。

1.2.4 携带e GFP重组慢病毒颗粒的电镜检测

将浓缩的e GFP重组慢病毒送由中国医学科学院医学生物学研究所电镜室进行检测, 通过磷钨酸盐等重金属盐直接做负染而后观察是否存在慢病毒颗粒。

1.2.5 q PCR法测定慢病毒滴度

根据Genecopoeia公司标定后提供的标准品Ex-EGFP-Lv105和推荐的方法, 用q PCR进行e GFP重组慢病毒滴度的测定。其原理是以编码HIV的主要结构蛋白Gag的gag基因作为跟踪对象, 标准品Ex-EGFP-Lv105 1.0ng标定为1.0×108VG。按说明书步骤, 以e GFP重组慢病毒原液和浓缩液的c DNA为模板, 采用SYBRGreen (ROX) 荧光染料试剂进行q PCR, 体系为:SYBRGreen (ROX) 12.5μL、慢病毒c DNA 2μL、P1和P2各1.5μL、水7.5μL, 反应条件为:95℃4 min, 95℃15 s、58℃30 s、72℃40 s、40个循环, 以后为常规融解曲线程序, 绘制标准曲线, 读取结果。根据q PCR读取的样品的结果, 通过换算病毒滴度为vector gene (VG) /m L。

1.2.6 携带e GFP重组慢病毒感染H1299细胞及不同剂量荧光强度的检测

用0μL、1μL、5μL、30μL、100μL不同剂量的e GFP重组病毒液原液感染24孔板H1299细胞, 72 h后用荧光显微镜观察e GFP在H1299细胞中的表达, 并进行不同剂量的e GFP重组慢病毒在H1299细胞中表达效率和荧光强度的初步比较。并初步筛选携带e GFP基因慢病毒感染靶细胞的合适剂量, 为后续慢病毒载体的运用提供基础数据。

2 结果与分析

2.1 Lv105-e GFP重组慢病毒质粒的转化扩增及鉴定结果

经大肠杆菌Stbl3感受态细胞转化扩增Lv105-e GFP重组慢病毒质粒, e GFP核苷酸序列测序结果与Gen Bank报道的完全一致, 说明e GFP基因的序列在重组质粒转化扩增过程中未出现突变, 可用于下游的实验。

2.2 携带e GFP重组慢病毒包装过程中不同时段的转染效率观察结果

在慢病毒系统组件转染到包装细胞293Ta细胞后, 分别在转染后48h和72h用荧光显微镜观察e GFP基因在包装细胞中转染和表达效率, 结果在48h时最高, 同时随包装时间的增加和病毒颗粒的产生与释放, 293Ta的细胞病变效应 (CPE) 在72h时较为显著, 观察结果见图组1 (图A、B、C、D) 。

2.3 携带e GFP重组慢病毒颗粒的电镜检测结果

电镜检测结果表明, 携带e GFP基因的重组慢病毒液可观察到具有病毒颗粒形态的慢病毒颗粒, 病毒颗粒形态见图2。

2.4 e GFP重组慢病毒的滴度检测结果

用q PCR方法进行慢病毒液滴度分析结果表明, 标准品和病毒原液与浓缩液样品以gag引物扩增特异性较好, 扩增曲线 (见图3) 、融解曲线 (见图4) 、标准曲线 (见图5) 。根据200μL病毒液提取总RNA对各步所用体积对应的比例进行滴度换算, 报告基因e GFP重组慢病毒原液的滴度为4.4×107VG/m L、浓缩液的滴度为2.68×1010VG/m L。

2.5 e GFP重组慢病毒感染H1299细胞及不同剂量荧光强度的检测结果

用不同剂量的e GFP重组病毒液原液感染24孔板H1299细胞, 72h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的荧光强度, 1μL的病毒原液就有e GFP的表达, 随着剂量的增加荧光强度逐渐增强, 剂量到100μL时重组病毒的感染率在99%以上, 几乎所有靶细胞均有较强的绿色荧光, 观察结果见图组6 (图A、B、C、D、E、F、G、H、I、J) 。结果说明, e GFP重组慢病毒对H1299细胞具有较高的感染效率, 可使报告基因有效转导并高水平表达绿色荧光蛋白。

3 讨论

因为, 运用重组慢病毒展开基因转导研究, 不仅利于外源基因稳定表达细胞株的筛选[8], 更利于基因治疗时目的基因在机体内形成稳定表达[9], 可避免注射重组蛋白药物时半衰期短需重复给药的缺陷。本实验通过对e GFP重组慢病毒颗粒的包装和感染H1299细胞后对绿色荧光蛋白表达的观察与检测, 初步证明e GFP重组慢病毒的假病毒颗粒具有一定的感染能力并可有效转导外源目的基因。通过电镜检测重组病毒颗粒的报道较为少见, 本实验观察到明显的重组慢病毒假病毒颗粒, 其假病毒颗粒具有显著的病毒颗粒形态, 可为慢病毒颗粒的形态学特征提供初步的参考数据。以慢病毒载体质粒的gag基因作为跟踪对象, 经过q PCR方法测定重组慢病毒的滴度, 病毒原液的滴度达到4.4×107VG/m L、浓缩液的滴度也高达2.68×1010VG/m L。说明此方法包装的慢病毒浓缩液具有较高的病毒滴度, 已经达到了文献报道的利用慢病毒载体进行体内基因治疗的滴度要达到108VG/m L要求[10,11,12]。分别用不同剂量的e GFP重组慢病毒原液感染H1299细胞, 1μL剂量的病毒原液感染24孔板的H1299细胞就有明显的绿色荧光蛋白表达, 5μL、30μL、100μL剂量感时绿色荧光蛋白表达随剂量的增加而增强, 到100μL剂量时24孔板99%以上的H1299细胞均表达绿色荧光蛋白, 说明本实验已经成功包装了重组e GFP慢病毒颗粒, 并有效提高了重组病毒的滴度。

4 结论

本实验的结果证明, 已经初步建立了一种高滴度慢病毒包装的技术平台, 不仅可为课题进一步运用慢病毒载体进行基因功能研究、稳定表达细胞株的筛选等工作的开展, 也可进行相关疾病动物模型的基因治疗研究。

参考文献

[1]Machitani M, Sakurai F, Katayama K, et al.Improving adenovirus vector-mediated RNAi efficiency by lacking the expression of virus-associated RNAs[J].Virus Research, 2013, S0168-1702 (13) :313-314.

[2]Chen SJ, Sanmiguel J, Lock M, et al.Biodistribution of AAV8 vectors expressing human LDL receptor in a mouse model of homozygous familial hypercholesterolemia[J].Human Gene Therapy Clinical Development, 2013 Sep 26.[Epub ahead of print].

[3]Ulrike B, Luigi N, Tal K, et al.Highly efficient and sustained gene transfer in adult Neurons with a lentivirus vector[J].American Society for Microbiology, 1997, 71 (9) :6641-6649.

[4]陈泽, 林冬, 王敏.PIG7慢病毒表达载体的构建[J].生物技术, 2006, 16 (4) :13-15.

[5]胡雄贵, 肖定福, 邓缘, 等.利用Gateway技术构建慢病毒载体及其在鸡囊胚细胞中的表达[J].生物技术, 2007, 17 (4) :18-21.

[6]Segura MM, Mangion M, Gaillet B, et al.New developments in lentiviral vector design, production and purification[J].Expert Opinion on Biological Therapy, 2013, 13 (7) :987-1011.

[7]Farazmandfar T, Khanahmad SH, Haghshenas MR, et al.Use of integrase-minus lentiviral vector for transient expression[J].Cell Journal, 2012, 14 (2) :76-81.

[8]朱华宇, 张翔, 张晓, 等.miR-203真核表达载体的构建和重组慢病毒的制备及其对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响[J].细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29 (6) :589-592.

[9]张敬之, 郭欲冰, 谢书阳, 等.用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白 (GFP) 转基因小鼠[J].自然科学进展, 2006, 16 (5) :571-577.

[10]Ramsubir S, Nonaka T, Girbés CB, et al.In vivo delivery of human acid ceramidase via cord blood transplantation and direct injection of lentivirus as novel treatment approaches for Farber disease[J].Mol Genet Metab, 2008, 95 (3) :133-141.

[11]Romain Z, Thomas D, Ronald J.M, et al.Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery[J].American Society for Microbiology, 1998, 72 (12) :9873-9880.

慢病毒颗粒 篇2

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠80只, 雌雄各半, 体重129～163g;由浙江省实验动物中心[许可证号SCXK (浙) 2008-0001]提供。

1.2 药物

温郁金免煎颗粒:三九中药免煎系统提炼。

1.3 动物分组与给药

将大鼠随机分组, 分别为A、B、C、D 4组, 雌雄各半。根据《农药登记毒理学试验方法 (GB15670-1995) 》的规定[1]和厂家提供的大鼠急性经口LD50的剂量 (47mg/kg) , A、B、C给药剂量分别为5.785、2.938、1.469mg/kg·d-1 (1/8、1/16、1/48LD50) ;每日经口灌胃1次, 连续90天;D组给予等量玉米粉。

1.4 观察指标

(1) 实验期间每周用电子称称量大鼠体重, 每日观察大鼠的活动、进食情况、中毒症状、毛色、对外反应、粪便等方面的变化, 并进行详细记录。 (2) 90天后检测大鼠血常规和血生化指标, 测定白细胞 (WBC) 、红细胞 (RBC) 、血红蛋白 (Hb) 、红细胞压积 (PCV) 、丙氨酸转氨酶 (ALT) 、天冬氨酸转氨酶 (AST) 、γ-谷氨酰转肽酶 (γ-GT) 、碱性磷酸酶 (AKP) 、尿素氮 (BUN) 、肌酐 (BCr) 、总蛋白 (TP) 、总胆红素 (T-BiL) 、直接胆红素 (D-BiL) ; (3) 并测定脏器系数 (心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、睾丸、卵巢) , 并对上述脏器进行常规病理学检查。

1.5 统计学方法

应用SPSS13.0软件进行统计分析, 所有数据以undefined表示, 对样本进行t检。

2 结果

2.1 一般情况

各组动物在行为、活动、毛色、对外反应、粪便等方面未见明显改变。

2.2 各组大鼠体重比较

见表1。

与其他3组比较*P<0.05

2.3 各组大鼠各脏器系数比较

见表2。

与其他3组比较*P<0.05

2.4 各组大鼠血实验室生化指标的变化

见表3。

与其他3组比较*P<0.05

2.5 尿常规检查

尿检结果显示, A组尿液的外观、pH值、蛋白、糖、隐血和沉淀物镜检结果与C、B、D组间比较均有显著差异 (P<0.05) , C、B、D组间比较均无显著差异 (P>0.05) 。

2.6 大体解剖及组织病理学观察

A组肾小管上皮变性, 肝脏汇管区炎症浸润, 子宫内膜上皮颗粒样、空泡状变性, 部分出现细胞核溶解、坏死;C、B、D组各脏器组织病理均未见异常。

3 讨论

温郁金为多年生宿根草木。主要分布在飞云江中下游冲积平原, 集中在瑞安陶山、仙降、马屿等地, 顺泰、梅屿等也有少量种植。温郁金含有酚性成份和挥发油及生物碱、糖、甾醇类、多肽类、微量元素等。酚性成份主要有姜黄甲素、姜黄乙素 (去甲氧基姜黄素) 、姜黄丙素 (双去甲氧姜黄素) ;挥发成份主要以莪术醇、莪术酮和β-榄香烯醇为主, 另有莪术双酮、吉马酮、莪术稀醇、异呋吉马烯、吉马烯、芳姜酮等20多种萜类和倍半萜类化合物。莪术油很好的抗病毒能力在2003年抗击非典过程中得以承认, 使温郁金的药用价值再次引起医药界的关注。温郁金茎和叶中有些微量元素与根中相差不大, 并具有潜在的降压作用[2]。徐毅[3]等采用MTT法测定温郁金的水提物、醇提物、醚提物在体外均能抑制胃癌细胞SGC-7901增殖, 且醇提物>醚提物>水提物。但很少有关于温郁金慢亚毒性的临床或实验报道。

文献报道[4], 实验动物在生长发育期体重的增长情况是综合反映动物健康状况最基本的灵敏指标之一。因此, 我们用大鼠对温郁金的慢亚毒性进行了实验研究, 对大鼠的体重及生化指标等进行了观察。发现实验剂量给药大鼠均未出现死亡, 而A组的体重、脏器系数、肝肾功能指标, 肝、肾、卵巢病理出现异常 (P<0.05) , 其他3组均未出现异常。故初步确定温郁金对大鼠90天亚慢性经口最大阈剂量, 雌雄大鼠均为5.875mg/kg, 最大无作用剂量, 雌、雄大鼠均为2.938mg/kg。温郁金免煎颗粒对大鼠毒性靶器官为肾、肝脏和子宫内膜, 免煎颗粒其主要毒性作用为肝脏汇管区的炎症浸润, 肾小管上皮、子宫内膜变性, 对其它脏器均无明显毒性作用。因此我们建议温郁金临床应用中, 尽可能对患者进行肝、肾功能及子宫内膜的检测, 以减少毒性事件的发生。限于动物种属及个体耐受能力的差异及其它因素的影响, 其毒性最大阈剂量和最大无作用剂量及靶器官可能存在差异, 故有待于更多的实验来验证。

参考文献

[1]国家技术监督局.农药登记毒理学试验方法.GB15670-1995.中华人民共和国国家标准, 1995:10.

[2]刘英杰.温郁金的研究进展.浙南新医药, 2007, 4 (1) :57.

[3]徐毅, 吕宾, 丁志山, 等.不同温郁金提取物抑制胃癌细胞SGC-7901增殖和诱导凋亡的实验研究.浙江医学, 2004, 26 (7) :503.

慢病毒颗粒 篇3

1 猪圆环病毒2型结构蛋白

ORF2基因是PCV2的第二大开放阅读框, 位于基因组的互补链上, 通常全长为702个碱基, 编码233个氨基酸, 分子量约为30 k Da, 编码的病毒的核衣壳蛋白又称Cap蛋白, 为病毒的主要结构蛋白。NawagitgμL等将ORF2基因克隆后在昆虫细胞中进行表达, 表达产物的分子量为30 k D, 与从纯化的病毒粒子中监测到的蛋白大小相似, 电镜观察发现表达产物可自动组装成类圆环病毒样颗粒, 从而进一步证实ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白为猪圆环病毒的主要结构蛋白。Cap蛋白位于细胞核中, 其N端的前41个氨基酸高度保守并含有丰富的精氨酸及碱性氨基酸, 是其核定位信号区域, 可以使Cap蛋白正确地定位在核上, 通过定点诱变发现其中12-18位 (R-H-R-P-S-H) 和34-41位 (H-R-Y-R-W-R-R-K) 氨基酸残基对ORF2基因的定位起着至关重要的作用。

Truong C通过合成肽及重叠肽技术分析发现, PCV2Cap蛋白在65-87aa, 113-139aa和193-207aa区域内可能存在3个或3个以上的PCV2型特异性表位;69-83aa和117-131aa是2个PCV2特异性的线性B细胞表位, Truong C还发现, 所有实验接种猪均产生针对117-131aa的抗体, 该位点可作为PCV2感染的血清学检测标志。

目前对于PCV研究较深入的是ORF1和ORF2, 由于ORF2的以上特性, 其编码产物就成为分子水平上诊断PCV的理想抗原, ORF2也成为研制基因工程疫苗的首选基因。因此, ORF2的研究已成为PCV2研究的焦点。

2 PCV2疫苗研究

目前针对PCV2病毒设计的疫苗主要有两类, 一类是全病毒灭活疫苗, 一类是亚单位疫苗。在全病毒灭活疫苗方面, 国外已有两个产品成功上市, 一个是Merial公司研制的全病毒灭活疫苗Circovac, 另一个是Fort Dodge公司研制的PCV-1与PCV-2嵌合全病毒灭活疫苗Suvaxyn PCV2 one dose。前者主要用于母猪免疫接种;后者主要适用于仔猪的免疫接种, 且能在不受母源抗体影响的情况下激发免疫应答, 可有效降低仔猪体内的病毒含量, 减少淋巴组织的损伤, 降低死亡率。国内也有两种全病毒灭活疫苗上市, 但PCV2在细胞内增殖度很低, 而且灭活疫苗对机体刺激时间较短, 需要多次接种后才能达到一定的保护效果。在亚单位疫苗研究方面, 目前国内还没有关于圆环病毒亚单位疫苗成功上市的报道。由于猪圆环病毒基因具有高度的变异性, 而现阶段的猪圆环病毒疫苗只能刺激机体针对病毒中的一种毒株产生抗体, 且病毒在细胞内增殖滴度低, 需多次接种才能达到一定的保护效果, 故很难较快、较灵活的应对猪圆环病毒变异株所致的爆发性疫情。因此, 一种安全、快速、有效的疫苗具有很大的发展前景。

PCV2 Cap蛋白被认为是主要免疫原性蛋白, 且与PCV1Cap蛋白无交叉保护性, 因此, 国内外许多学者均将PCV2Cap蛋白单独表达以研制能有效防治PCV2感染的亚单位疫苗。常用的表达系统为杆状病毒表达系统, 利用杆状病毒在昆虫细胞中表达的Cap蛋白能自我组装成类病毒粒子, 免疫动物后可诱导高水平的抗体及PCV2特异性的淋巴细胞增殖反应。

3 类病毒颗粒 (VLPs) 概述

类病毒颗粒 (VLPs) 是一种多聚蛋白复合物, 与天然病毒有着相似的结构与构象, 但是没有病毒基因组, 因此是一种非常安全的疫苗候选者。VLPs的可重复性、表面的高密度抗原表位能有效诱导机体的免疫应答, 使得VLPs成为一种用来生产预防各种疾病疫苗的有效方法之一。病毒样颗粒也可以通过修饰VLP基因的序列来作为呈递外源抗原表位的“平台”, 这一技术在过去20年被人们大量的探索用来生产安全、有效的疫苗。

4 利用BEVS表达PCV2 VLPs

用来表达VLPs的表达系统主要有大肠杆菌表达系统及BEVS。大肠杆菌表达系统具有表达产物较稳定、周期短、收益大、操作简便的优点, 缺点是表达基因的相对分子量不宜过大, 对表达产物不能进行糖基化等翻译后加工、修饰等。BEVS中, 杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子, 大小约80~160kb, 其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内, 而核衣壳具有较大的柔韧性, 可容纳较大片段的外源DNA插入, 因此是表达大片段DNA的理想载体;可为表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、搭配二硫键、形成寡聚物等提供良好的环境, 从而使表达产物在结构及功能上更接近天然蛋白;具有对蛋白质糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除等完整的翻译后加工能力, 修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致。对比实验证明, 在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致, 但修饰的寡糖种类却不完全一样, 这种不一致对不同目的蛋白的活性影响不同, 所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型;此系统另外一个最突出的特点就是能获得高水平的重组蛋白表达, 最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50%;杆状病毒表达系统还可通过不同的重组病毒同时感染细胞的形式或者在同一转移载体上同时克隆两个外源基因的方式在同一细胞内同时表达多个基因的能力, 表达产物通过加工可形成具有活性的异源二聚体或多聚体;此系统还有对重组蛋白进行定位的功能, 能将核蛋白转送到细胞核上, 膜蛋白则定位在膜上, 分泌蛋白则可分泌到细胞外等;此外杆状病毒对脊椎动物无感染性, 现有研究也表明其启动子在哺乳动物细胞中没有活性, 因此是一个非常安全的蛋白表达系统, 尤其是在表达有潜在毒性的蛋白时候。

BEVS安全性好, 表达水平高, 可进行翻译后加工及表达产物的异源性小, 是一种非常理想的真核表达系统。由于该系统独特的性质, 使其被广泛地应用于基因工程、药物开发、疫苗生产、表达免疫活性分子和某些致瘤病毒蛋白以及基因表达调控研究等多个领域中。NawagitgμL等人利用BEVS的优点, 表达出PCV2的结构蛋白Cap蛋白, 并经实验验证通过BEVS表达的Cap蛋白的VLPs具有很强的免疫原性, 并可引起感染猪产生很高的抗体水平。

5 结束语

PCV2 Cap蛋白基因经BEVS表达后, 能够形成VLPs。VLPs保留天然病毒粒子的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位, 具有较强的免疫原性。VLPs进入机体后, 由于其高度结构化且大小适合被抗原提呈细胞 (antigen presenting cell, APC) 摄取, 进行加工处理后能够以抗原肽-MHC I类分子复合物的形式将抗原信息提呈给CD8+T细胞, 发挥CTL特异性地杀伤靶细胞的功能, 同时VLPs能够被B细胞受体所捕获, 刺激B细胞其产生特异性抗体, 所以病毒样颗粒不仅能够激发机体的体液免疫而且可以激发细胞和粘膜免疫, 是最具有发展前景的基因工程疫苗。

摘要：圆环病毒 (Porcine Circovirus, PCV) 是一类无囊膜、单链环状DNA病毒, 能引起多系统衰竭综合征 (Postweaning Mμ Ltisystemic Wasting Syndrome, PMWS) , 给整个养猪业造成严重损失。杆状病毒表达载体系统 (Bacμ Lovirus Expression Vector System, BEVS) 具有表达水平高、能进行翻译后加工修饰等优势, 表达的猪圆环病毒2型结构蛋白能自动组装成无基因组、安全、具有免疫原性的类圆环病毒颗粒 (Virus-like Particals, VLPs) , 类圆环颗粒疫苗是一类非常有潜力的圆环病毒候选疫苗。本文对猪圆环病毒2型结构蛋白表达及其类病毒颗粒疫苗研究作以简洁综述。

关键词：猪圆环病毒,杆状病毒表达载体系统,类病毒颗粒

参考文献

[1]Chae C A review of porcine circovirus2-associated syndromesand diseases[J].Vet J, 2005, 169 (3) :326-336.

[2]Liu J, et al.The ORF3protein of porcine circovirus type2interacts with porcine ubiquitin E3ligase Pirh2and facilitates p53expression in viral infection[J].J Virol, 2007, 81 (17) :9560-9567.

[3]吕建伟.猪圆环病毒Ⅱ型新疫苗可预防猪圆环病毒Ⅱ型相关疾病[J].国外畜牧学, 2007, 27 (4) :38.

[4]邢海云, 等.猪2型圆环病毒疫苗的研究进展[J].中国生物制品学杂志, 2009, 22 (3) :305-308.

[5]Tiago Vicente, et al.Largescale production and purifi-cation of VLP-based vaccines[J].Journal of Invertebrate Pathology, 2011, 107:s42-48.

[6]黄红亮, 等.猪圆环病毒2型疫苗研究进展[J].动物医学展, 2010, 31 (2) :90-95.

[7]Bachmann A S, et al.A simple method for the rapid purification of copia virus-like particles from Drosophila Schneider2cells[J].Virol.Methods, 2004, 115, 159-165.

[8]Tiago Vicente, et al Lagrge scale production and purifi cation of VLP-based vaccines[J].Journal of Invertebrate Pathlolgy, 2011, 107:s42-s48.

[9]Izquierdo Useros N, et al.Capture and transfer of HIV-1particles by mature dendritic cells converges with the exosome dissemination pathway[J].Blood, 2009, 113 (12) :2732-2741.

慢病毒颗粒 篇4

1993年,Lee等在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现能够时序调控胚胎后期发育的第一个microRNA分子-lin-4[1]。在此后,大量的研究逐渐证实,microRNA是一类广泛存在于动植物体内,长约21—25个核苷酸片段(bt)的非编码小分子RNA。在转录后水平,通过与靶m RNA的3'非翻译区(3'-untranslated regions,3'-UTRs)互补,形成基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),引起靶基因m RNA的降解或抑制其翻译[2]。mi R-NAs参与了包括细胞发育、分化、凋亡等生理过程和心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤等病理过程[3]。本实验以人hsa-mir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体,运用引物延伸法以此引物二聚体为模板进行PCR扩增,将扩增产物酶切后插入线性化的慢病毒表达载体p GCSIL-GFP中,重组质粒经酶切及测序鉴定后与慢病毒包装质粒Helper 1.0、Helper 2.0共转染包装细胞293T,收集病毒上清,并测定其滴度。用构建好的慢病毒表达载体感染人胃癌细胞MKN-28,qPCR检测细胞内mi R-218表达。本实验为进一步研究mi R-218功能及作用机制建立良好的实验基础。

1材料与方法

1.1材料

p GCSIL-GFP慢病毒载体、包装质粒p Helper1.0、p Helper 2.0、polybrene购自上海吉凯公司,Trizol、LA Taq DNA聚合酶、Lipofectamine 2000购自invitrogen公司,Hind III、BamHI限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司,胎牛血清、DMEM培养基购自Hyclone公司,质粒抽提试剂盒购自TaKaRa公司,琼脂糖凝胶回收试剂盒购自mi R-218qPCR,引物试剂盒购自美国AB公司,DH5а、胃癌MKN-28细胞由本实验室保存。

1.2设计引物

搜索mirbase数据库(http://www.mirbase.org),得到mi R-218成熟序列及其前体pre-mir-218-2序列,以其前体序列pre-mir-218-2设计具有末端部分互补的引物,并引入Hind III、BamHI的酶切位点和保护碱基。所得正向引物为:

反向引物为:mir-218-2-R:

框前是保护碱基,框代表酶切位点,斜体代表目的序列,阴影代表引物重叠配对区,框加阴影代表LOOP环。

1.3 mir-218-2慢病毒表达载体p GCSIL-GFP-mi R-218-2的构建与鉴定

我们使用引物延伸法,以引物mir-218-2-F、mir-218-2-R为模板,进行退火形成引物二聚体,得到具有黏性末端的双链DNA序列:

阴影加下划线代表互补区。以此双链DNA为模板进行PCR扩增,反应体系为25μL。其中mir-218-2-F+mir-218-2-R 2μl,10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μL,10 mmol/L d NTPs 0.25μL,Taq DNA polymerase 0.25μL,Nuclease free water 18μL。反应条件:95℃变性5 min,然后开始PCR循环:95℃20 s;67.1℃20 s,72℃15 s,共35个循环,72℃延长3 min,4℃保存。所得双链DNA两条链为:

将所得扩增序列进行1%琼脂糖凝胶电泳,按琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。所得片段进行Hind III+BamHI酶切,并与线性化的慢病毒表达载体p GCSIL-GFP质粒连接,连接反应条件为:酶切后的产物1μL,线性化质粒载体1μL,10×Ligase Buffer 1μL,T4 DNA Ligase 1μL,Nuclease free water 6μL;22℃水浴反应过夜。各取5μL过夜连接产物转化感受态细胞DH5,分别涂布于含Kanar抗性(终浓度为30μg/m L)的LB平板上,37℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3 m L含Kanar抗性(终浓度为30μg/m L)的LB培养液中,37℃恒温摇床(250 r/min)培养过夜。取1 m L菌液送Invitrogen公司测序。用小规模质粒提取试剂盒小量提取质粒,并分别用Hind III+BamHI做酶切鉴定:反应条件为:DNA 17μL,10×K Buffer 2μL,Hind III 0.5μL,BamHI 0.5μL.37℃水浴反应3 h。

1.4慢病毒表达载体的包装与滴度测定

转染前一天,在10 cm培养皿中接种2.5×106个293T细胞,37℃、5%CO2培养箱内培养24 h,使用于初期转染的细胞密度达70%～80%时即可用于转染。将DNA混合溶液(p GCSIL-GFP-mir-218-2-LV载体20μg,p Helper 1.0载体15μg,pHelper 2.0载体10μg)与相应体积的DMEM混合均匀,使总体积为2.5 m L,在室温下温育5 min。取100μL Lipofectamine 2000试剂与2.4 m L DMEM混合,在室温下温育5 min。把稀释后的DNA混合溶液与Lipofectamine 2000进行混合,轻轻混匀,在室温下温育20 min,转移至293T细胞的培养液中,混匀,于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养,8 h后弃去含有转染混和物的培养基,加入含10%血清的细胞培养基20 m L,于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48 h。收集转染后48 h的293T细胞上清液,于4℃,4 000 g离心15 min,除去细胞碎片,以0.45μm滤器过滤上清液并分装。使用梯度稀释法测定病毒滴度。测定前一天,在96孔板中接种293T细胞,每孔加4×104个细胞,共十孔,体积为100μL。取10个无菌Ep管,在每个管中加入90μL的无血清培养基,取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中,混匀后,取10μL加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。选取所需的细胞孔,吸去90μL培养基,丢弃。加入90μL稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。24 h后,加入完全培养基100μL,4 d后观察荧光表达情况,并计算。病毒滴度计算公式为:病毒滴度(Tu/m L)=(GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数)/0.1。根据上述方法及公式,计算得本次所构建病毒滴度为1×109TU/m L。

1.5慢病毒表达载体感染MKN28细胞及q PCR鉴定mi R-218表达

实验前一天在24孔板接种MKN-28细胞,密度为5×104/m L,培养基体积为500μL,实验当天,细胞扩增一倍,密度为1×105/m L,稀释病毒滴度为1×108TU/m L,MOL=100。实验分组为:第一组:细胞+培养基(400μL)+稀释后的表达mi R-218的慢病毒载体50μL+Polybrene(50μL,5μg/m L);第二组:细胞+培养基(400μL)+慢病毒空载体50μL(滴度为1×108TU/m L)+Polybrene(50μL,5μg/m L)。在水平方向轻轻拍打培养板,使培养基和病毒等试剂充分混匀,然后把细胞板放回培养箱孵育。(8—12)h以后观察细胞状态,弃去细胞上清,更换为新鲜培养基。感染(3—4)d后,观察荧光表达情况,可适当延长观察时间,中途换液(1—2)次。以同样方法构建cel-miR-67表达载体作为阴性对照,正反向引物见表1。将感染后的MKN-28细胞扩大培养,收集细胞提取总RNA,qPCR检测mi R-218表达水平,采用mi R-218 q RT-PCR引物试剂盒。具体方法为:首先以细胞总RNA为模板,进行mi R-218逆转录反应,反应体系为:d NTP mix(100m M total)0.15μL,MultiscribeTMRT enzyme(50U/μL)1.0μL,10×Buffer 1.5μL,RNase inhibitor(20 U/μL)0.19μL,Nuclease free water 4.16μL,primer 3.0μL,RNA 5μL;反应条件:16℃,30 min,42℃,30 min,85℃,5 min,4℃保存。反应结束后,取15μL逆转录产物进一步进行PCR反应,反应体系为:TaqMan MicroRNA Assay(20×)1.0μL,product from RT reaction(Minimum 1:10 Dilution)20μL,TaqMan2×Universal PCR Master Mix 10μL,Nuclease free water 7μL;反应条件为:95℃,10 min酶激活,开始PCR循环,95℃变性15 s,60℃延伸60 s,共40个循环。通过2-△△CT法计算mi R-218表达载体转染细胞和cel-miR-67表达载体转染细胞间mi R-218的表达差异。

2结果

2.1重组质粒pGCSIL-GFP-miR-218-2的酶切鉴定

设计引物时,引物两端分别也设计了HindIII+BamHI的酶切位点,所以PCR产物用HindIII+BamHI酶切后连接表达载体

pGCSIL-GFP,用HindIII+BamHI作酶切鉴定,可被切出110 bp的条带(图1),说明目的基因片段miR-218-2已经插入到质粒载体pGCSIL-GFP里。

2.2慢病毒载体pGCSIL-GFP-miR-218-2的测序鉴定

经酶切分析正确的单克隆菌液送公司测序,结果完全符合设计要求。大规模提取插入has-pre-mir-218-2的质粒,经检测,产品符合质量要求。

2.3感染细胞的miR-218表达鉴定qPCR鉴定

使用qPCR相对定量的2-△△CT法对检测结果进行计算,pGCSIL-GFP-miR-218-2载体与pGCSIL-GFP-cel-miR-67载体感染的MKN-28细胞表达miR-218差异,得2-△△CT=4.97。即pGCSIL-GFP-miR-218-2载体感染细胞后miR-218表达水平升高了近5倍。如图2所示。

3讨论

2010年9月10日,Sanger microRNA序列数据库(miRBase)升级至16.0版,新版本涵盖共计142个物种,发夹前体序列15 172条;其中人类前体序列1 048条,共产生1 366个microRNA成熟分子。miroRNA参与各种生物体的生理和病理功能[4]。约30%的蛋白编码基因受其调控[5],但大部分的microRNA其功能和机制尚不清楚。在众多microRNA分子中,microRNA与肿瘤已被证明有着密切的关系[6],并且得到了广泛的研究,其中miR-218在胃癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌中都有显著的低表达[7,8,9,10],并且通过slit-robo1通路抑制胃癌侵袭和转移[11],同时也通过slit-robo通路影响血管发生过程中的组织构成[12]。然而MiR-218的功能与机制尚未完全明确,仍需进一步研究。

目前研究microRNA功能及机制的方法较多, 但基本上分为过表达或抑制表达两种方式。过表达又包括运用体外合成的microRNA化学类似物进行瞬时转染,或构建表达载体两种方式。本试验采用引物延伸法,以人hsa-mir-218-2前体序列,设计末端部分互补的引物,进行引物退火反应,形成引物二聚体,进行PCR扩增,然后以此DNA双链为模板进行PCR扩增,得到的产物经过酶切后定向插入到线性化的慢病毒表达载体pGCSIL-GFP中,经过酶切及测序鉴定,与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,进行慢病毒的包装。我们用构建好的慢病毒表达载体PGCSIL-GFP-miR-218-2感染人胃癌细胞MKN-28,并对miR-218在细胞内的表达进行相对定量qPCR鉴定,结果显示,经感染后的细胞miR-218表达明显升高,说明所构建的miR-218-2慢病毒表达载体pGCSIL-GFP-miR-218-2成功,符合设计要求。

通过上述过程构建microRNA表达载体并感染目的细胞,进入细胞的microRNA表达载体再转录为具有“茎环”结构的hsa-miR-218-2,被胞内的RNaseIII类核酸酶DICER切割为成熟的 22个核苷酸片段的双链miRNA-218分子,其中一条被降解,另外一条成为可调控靶基因的成熟miR-218分子。这一过程与microRNA的生理合成过程相符,并且方法简便,经济。慢病毒表达载体感染后所获得的稳转细胞基因表达稳定、持续时间长,避免了瞬时转染每次试验均需重复操作的试验过程,而且也避免了瞬时转染时所需转染试剂对实验的影响。

本实验成功构建了miR-218-2慢病毒表达载体,经双酶切分析及转化菌液测序,符合设计要求,质量合格,感染细胞后能显著升高miR-218在细胞内的表达。可用于进一步研究miR-218功能及作用机制的研究,并为其研究打下了良好的实验基础。

参考文献

[1] Lee R C,Feinbaum R L,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.Cell,1993;75(5):843—854

[2] Stark A,Brennecke J,Bushati N,et al.Animal microRNAs contributeto gene expression and have a significant impact on 3 UTR evolution.Cell,2005;123(6):1133

[3] Bartel D P.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism and func-tion.Cell,2004;116(2):281—297

[4] Williams A E.Functional aspects of animal microRNAs.Cell Mol Life Sci,2008;3:226—239

[5] Lewis B P,Burge C B,Bartel D P.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets.Cell,2005; 120(1):15—20

[6] Esquela-Kerscher A,Slack F J.Oncomirs-microNRAs with a role in cancer.Nat Rev Cancer,2006;6(4):259—69

[7] Ueda T,Volinia S,Okumura H,et al.Relation between microRNAexpression and progression and prognosis of gastric cancer:a microR-NA expression analysis.Lancet oncol,2010;11:136—46

[8] Petrocca F,Visone R,Onelli M R,et al.E2F1-regulated microR-NAs impair TGFbeta-dependent cell-cycle arrest and apopto-sis ingastric cancer.Cancer Cell,2008;13:272—286

[9] Kim do N,Chae H S,Oh S T,et al.Expression of viral microRNAs in Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma.J Virol,2007;81:1033—1036

[10] Volinia S,Calin G A,Liu C G,et al.A microRNA expression signa-ture of human solid tumors defines cancer gene targets.Proc NatlAcad Sci US A,2006;103:2257—2261

[11] Tie J,Pan Y,Zhao L,et al.Mir-218 inhibits invasion and metastasis of gastric cancer by targeting the bobo1 receptor.Plos Genetic,2010;6(3):1—11