细菌鉴定

细菌鉴定（精选十篇）

细菌鉴定 篇1

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物

庆大霉素、链霉素、林可霉素、头孢氨苄、菌必治等。

1.1.2 试验器材

生物显微镜、托盘天平、锥形瓶、电炉、载玻片、盖玻片、恒温培养箱、超净工作台、立式圆形压力蒸汽灭菌器、冰箱、接种环、酒精灯等。

1.1.3 试剂

乳糖、磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂、胆盐、超纯水、中性红、结晶紫、95%乙醇、硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡磷胨水、拘橼酸盐、尿素、半固体琼脂、葡萄糖产气、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖等。

1.1.4 试验动物

试验犬均来自云南农业大学动物科学技术学院动物医院 (西站) 及康大妈流浪动物收容所。首先进行犬健康状况状况调查, 调查内容包括品种、年龄、性别、体重、临床症状, 引起犬腹泻的原因。根据犬的临床症状:出现呕吐, 慢性肠卡他, 厌食, 稀便, 血便, 渐进性消瘦, 营养不良, 精神不振, 体温升高, 脱水等有典型腹泻症状, 经诊断后排除病毒性腹泻及寄生虫腹泻可能的犬。

1.2 试验方法

1.2.1 粪样的采集

在动物医院里, 由于不可能随时都能采到新鲜粪便样品, 所以采用棉棒采集每只试验犬直肠深部少量粪便直接涂片观察, 并编号记录被检犬的年龄、营养状况、品种、性别等, 并保存待检。本次试验粪样采集时间为0d:2010年4月20日, 采到3个样品分别编号1、2、3。1d:2010年4月21日采到4个样品分别编号4、5、6、7。2d:2010年4月22日采到3个样品, 分别编号8、9、10。本次采样的犬品种不一, 有北京犬、雪橇犬、金毛、博美等。年龄从1月龄至8岁之间。各个体的粪样分别取2份。

1.2.2 培养基制备

麦康凯琼脂培养基制备, 麦康凯培养基用于肠道致病菌的选择性分离培养。配方如下蛋白胨20.0g, 乳糖10.0g, 胆盐5.0g, 氯化钠5.0g, 中性红0.03g, 琼脂14.0g, pH值7.1±0.2, 加热溶解于1000ml蒸馏水中, 121℃高压灭菌15min备用。本次试验使用的是由上海市医学化验所试剂厂生产的麦康凯琼脂培养基, 取样品52g加入1000ml蒸馏水中混合放置10min微火煮沸使之完全溶解, 115℃高压灭菌15min备用。鉴定原理为蛋白胨提供碳氮源、维生素和生长因子;牛胆盐可抑制革兰氏阳性菌的生长;氯化钠维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;乳糖为可发酵的糖类;中性红是pH指示剂, 细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈。

1.2.3 粪样检测

每一个样品分别取少量的粪样经无菌纯水稀释后涂于载玻片上等干后用革兰氏染色法[5]染色之后进行镜检。

1.2.4 接种培养

将样品在超净工作台上分别接种到麦康凯琼脂培养基上, 并且标明接种的编号。接种时用采样的棉签轻轻涂抹于培养基的一头, 之后用接种环以“之”字型画开, 每涂过培养皿的一半时旋转90°, 接种环烧白灭菌后继续沿“之”字画开。接种完成后将培养皿放入37℃恒温培养箱培养24h。

1.2.5 生化鉴定

使用精氨酸、鼠李糖、乳糖、水杨素、甘露醇、蔗糖、七叶苷、半乳糖、果糖、山梨醇、葡萄糖、懒氨酸、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、卫矛醇、甲基红实验、V-P试验、吲哚等分别配制生化鉴定管[5]。将培养皿中的典型菌种在超净工作台上接种至鉴定管中, 24h后观察结果。

1.2.6 药敏试验

使用药敏纸片呋喃妥因、链霉素、头孢氨苄、环丙沙星、妥布霉素、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、四环素、氯霉素、菌必治做两组药敏实验。以上药敏纸片均产自杭州天和生物试剂有限公司, 执行标准:WS/T125-1999。

1.2.7 注意事项

在操作中严格按照无菌操作, 使用明火、电时注意自身安全。实时记录试验数据。严格按照操作规程操作, 注意保护设备安全完整。

2 试验结果

2.1 粪样检测结果

在每一个便样的镜检中视野内大量存在革兰氏阴性、中等大小、两端钝圆的短杆菌, 呈单个或多个散在排列。从形态和革兰氏特性上判断在视野中的细菌为大肠杆菌[6] (图1) 。

2.2 接种培养结果

所有麦康凯培养基中均有均匀红色, 边缘整齐, 中心突起, 中等大小, 表面光滑湿润的散在菌落长出。其中1号培养皿有菌落200个, 2号有菌落185个, 3号有菌落50个, 4号有菌落130个, 5号又菌落70个, 6号有菌落150个, 7号有菌落134个, 8号有菌落124个, 9号有菌落125个, 10号有菌落113个 (图2) 。

2.3 生化实验结果

见表1。

注:“+”产酸;“—”阴性;“○+”产酸产气。

2.4 药敏试验结果

见表2。

注:敏感度按《抗菌药物药敏试验判断标准》抑菌圈大于等于20mm为极敏, 大于等于15mm小于20mm为高敏, 大于等于10mm小于15mm为中敏, 小于10mm为耐药。

3 讨论

3.1 生化分析

生化试验结果与动物传染病书上大肠杆菌基本特性相符[8], 而且与王云峰等[9]、孙善发等[10]的试验结果相一致。该菌能够分解麦芽糖、果糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、乳糖、山梨酸, 产酸产气, 不能产生硫化氢。因此从生化结果来看此菌种为大肠杆菌。

3.2 药敏分析

从药敏试验的结果来看, 该菌对头孢类, 和喹诺酮类[12]抗生素高度敏感, 但是林可霉素、四环素、庆大霉素的治疗效果不佳。这与有关的报道相符[11]。药敏试验说明该菌种已经对常用的药物产生耐药性。当前在犬细菌性腹泻的治疗中常常出现乱用抗生素, 或者使用了合适的抗生素却达不到良好治疗效果的现象。

3.3 犬病治疗中的误区

误区一:一泻就用止泻药。过早的服用止泻药, 或者是止泻药服用不当, 反而会延误病情, 甚至可以导致严重的并发症。误区二:先镇痛缓解腹泻, 感染性腹泻时可能会出现腹痛的现象, 一些犬主则习惯给犬服用654-2、颠茄片等止痛剂, 而且不按犬的的月龄, 随意使用。这种做法非常不安全, 因为止痛后, 不让肠蠕动, 会导致肠道蠕动功能瘫痪, 肠音消失或减弱, 容易引起肠黏膜脱落, 便血。误区三:一泻就吃消炎药, 许多人一看到犬腹泻, 就使用复方新诺明或诺氟沙星等抗生素。其实这种做法是不合适的。因腹泻有感染性和非感染性两类, 非感染性腹泻可由饮食不当、食物过敏、生活地域的改变、气候突变等原因引起, 此类腹泻使用抗生素治疗是无效的, 而应当服用一些助消化药或采用饮食疗法等。即便是感染性腹泻, 在选用抗生素时, 最好先做大便细菌培养, 明确致病菌种类, 再选用对细菌最敏感的抗生素进行治疗。切不可滥用抗生素。误区四:泻止就停药, 有的人腹泻常依症状服药, 即腹泻重时多服药, 腹泻轻时少服药, 稍有好转就停药。这样做很容易造成治疗不彻底而使腹泻复发, 或转为慢性腹泻, 给治疗带来很多困难[7]。正确的使用抗生素后, 就不能随便停用, 否则就容易使细菌产生耐药性。

3.4 试验犬与健康犬肠道菌比较

通过对引起犬细菌性腹泻的细菌进行分离鉴定得出的结果与健康犬的常规肠道菌进行对比发现。在正常的犬肠道内存在着许多种类的细菌其中包括需氧、兼性厌氧、厌氧细菌、真菌在内的45个菌属的约164种菌。涉及菌种包括链球菌、葡萄球菌、棒状杆菌、埃希菌、双歧杆菌、拟杆菌、乳杆菌、梭菌、念珠菌、青霉菌、地霉菌、毛霉菌与链格孢霉等[13], 通过对正常犬只的大便进行培养也证明了这点。而引起这次细菌性腹泻的细菌培养后主要得到的是大肠杆菌, 说明了这些犬的细菌性腹泻主要是由致病性大肠杆菌引起的。

4 结论

细菌分离鉴定 篇2

熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法，细菌分离鉴定。

实验内容：

一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定

(一)标本采集

1.脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。

2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。

3.咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。

4.血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。

5.脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。

6.尿道、阴-道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右;女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。

(二)分离鉴定程序

待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。常见的致病性球菌检查程序如下。

直接涂片、革兰染色、镜检(形态、排列、染色性)

脓、痰、咽拭子

分泌物、脑脊液 观察菌落性状、溶血性、色素

血琼脂平板→ 涂片、染色、镜检

↑ 挑取可疑菌落 生化反应

血液、穿刺液 →肉汤培养基 纯分离 致病性测定

↓ 药敏试验

如培养液混浊时可涂片、染色、镜检

(三)常见临床标本的检查方法

1．脓拭子

在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。

材料

(1)标本：脓拭子

(2)培养基：血琼脂平板

(3)兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片

方法 脓汁 → 革兰染色 → 镜检

↓ ↑

血琼脂平板 →观察菌落形态及溶血情况

↓

致病力试验

(1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)，鉴定材料《细菌分离鉴定》。标本放置4℃冰箱保存，待报告发出后再丢弃。

(2)将脓汁涂布于血琼脂平板上，再以灭菌接种环作划线分离。置培养37℃培养18h～24h。

(3)经培养后据菌落特点及涂片检查结果进行初步识别，根据需要再作进一步鉴定。若菌落较大、溶血透明、产生金黄色色素、涂片为革兰阳性球菌并成堆排列时可能系葡萄球菌，应确定其为何种葡萄球菌;必要时再作血浆凝固酶试验及甘露醇发酵试验，确定其致病力。

2.咽拭子

咽喉中存在的细菌较多，可以有厌氧及需氧性链球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四联球菌、脑膜炎球菌、卡他球菌、喉杆菌、结核杆菌枯草杆菌、百日咳杆菌肺炎杆菌及绿脓杆菌等。此外也可有白色念珠菌奋森螺旋体等。本实验以咽拭子作为标本，重点检查病原性球菌。

材料

(1)标本:咽拭子。

(2)培养基:血琼脂平板。

方法

咽拭子

↓

血琼脂平板

↓

观察菌落形态及溶血性

↓

革兰染色，镜检

取标本涂布于血琼脂平板，再以灭菌接种环划线分离，置37℃培养18h～24h培养。标本放置4℃冰箱保存，待报告发出后再丢弃。

可根据下述特点进行鉴别：

(1)在菌落周围产生2mm～4mm宽、界线分明、完全透明的溶血环、涂片为革兰阳性球菌并呈链状排列，可能是乙型溶血性链球菌。

(2)菌落细孝半透明、有草绿色溶血环、涂片为革兰阳性球菌呈链状排列，可能为甲型溶血性链球菌。需要进一步与肺炎球菌区别时，可做胆汁溶菌试验及菊糖发酵反应。

菌落细小半透明、不溶血、涂片为革兰阳性链状排列的球菌时，为丙型链球菌。

(4)菌落扁平边缘隆起、中央稍凹、半透明、呈草绿色溶血、革兰染色为阳性双球菌、呈矛头状排列时为肺炎球菌，应以胆汁溶菌及菊糖发酵反应与甲型溶血性链球菌区分。

(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革兰染色为阴性双球菌，呈肾形排列时，可能为脑膜炎球菌，需要进一步作氧化酶试验及糖发酵试验(接种于含血清之葡、麦、蔗糖发酵管中)。

二、粪便标本中肠道杆菌的分离与鉴定

(一)标本收集

取患者的粪便或肛-门拭子。

(二)鉴定程序

肠道杆菌为一大群革兰阴性杆菌，从形态及染色性上无法鉴别为何种菌，只能依靠生化反应和血清学反应进行鉴定。

患者粪便(粘液、脓血)→肠道选择、鉴别培养基(如ss、中国蓝、伊红美兰)

↓

挑取可疑菌落(据大孝颜色、透明度而定)

↓

双糖铁及其他鉴别培养基

↓

据结果分析鉴定

↓

玻片凝集(做出特异性诊断)

葡萄糖乳糖动力H2S尿素

⊕⊕±--艾希菌属非致病菌

⊕+---克雷伯菌属

⊕±+++变形杆菌

⊕-++-乙型副伤寒致病菌

⊕-+±-甲型副伤寒

+-++-伤寒杆菌

一种草鱼细菌病病原的分离鉴定 篇3

关键词：铜绿假单胞菌；感染；草鱼；鉴定

中图分类号：S941 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.014

Identification and Isolation of Bacterial Pathogens from Bacterial Disease of Grass Carp

DENG Wei

（Tianjin Diseases Prevention and Control Center of Aquatic Animals， Tianjin 300221，China）

Abstract： An epizootic was discovered in grass carp （Ctenopharyngodonidellus） in earthen ponds in Ninghe. The diseased fish presented with hemorrhaging in the abdominal wall， ascites in the abdomen and pale liver. Strains named PA001 and PA002 were isolated from the moribund fish， and were identified as Pseudomonas aeruginosa according to biochemical tests. The pathogenicity of PA001 was confirmed by infectivity experiments. According to the result of antimicrobial susceptibility testing， florfenicol were used by oral administration， and the result showed that it was an effective measure to control the disease.

Key words： Pseudomonas aeruginosa； infection； grass carp； identification

假单胞菌是鱼类“赤皮病”的病原菌，该病对淡水养殖鱼类危害严重，常引起较大的经济损失[1]。在假单胞菌属之中，荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、绿针假单胞菌和变形假单胞菌都能导致鱼类的病害发生[2-5]。然而，有关铜绿假单胞菌能引发鱼类疾病的报道却很少见，尽管其常作为一种人类病原被报道。本研究报道了一例由铜绿假单胞菌引发的草鱼疾病。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分离

2013年5月8日，10尾患病草鱼从天津市宁河县某养殖场送至本实验室进行诊断。通过镜检草鱼的鳃和体表，未发现大量的寄生虫。在无菌操作下，从濒死草鱼的肾脏、肝脏和脾脏取样，在LB培养平板上分离病原菌，28 °C培养24 h 后，选取优势菌落进一步分离纯化，分离得到两株优势菌株PA001和PA002。

1.2 细菌的鉴定

菌株PA001和PA002的形态、生理生化特性按文献[6]的方法进行鉴定。同时利用法国梅里埃公司的半自动细菌鉴定仪对菌株进行鉴定。

1.3 人工感染试验

试验草鱼由天津市换新良种场提供，共60尾，体长（12±2.1） cm。草鱼饲养于50 L的圆形塑料桶中，充气，每天按体质量的2%投喂膨化饲料，上下午各投喂1次。暂养2周，确认无病后，开始试验。将PA001用LB培养基培养，5 000 g离心集菌，用PBS洗涤3次后，用麦氏比浊法将菌液浓度调整为1.0×107 CFU·mL-1，腹腔注射草鱼0.2 mL，对照组注射同样剂量的PBS，连续观察2周。

1.4 药敏试验

28 °C培养过夜的PA001用PBS调整浓度至1×108 CFU·mL-1，取100 μL涂布于Mueller-Hinton琼脂平板，然后将药敏纸片（购于杭州微生物公司）贴在平板上，28 °C培养24 h 后测定抑菌直径，按照产品说明书判断敏感度。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定

PA001和PA002呈现相同的生理生化特征，为革兰氏阴性杆菌，具有运动性，不产生孢子。在LB平板上28 °C培养48 h后，菌落成圆形，湿润，边缘整齐，不透明，淡黄色，菌落直径约为2～2.5 mm。同时，在血平板上，两株细菌都具有β溶血，其他生化反应与铜绿假单胞菌ATCC 27853株具有相同的结果（表1），因此，根据常规生理生化测试可初步判定为铜绿假单胞菌。

利用ATB鉴定系统对PA001和PA002进行鉴定，两株细菌显示完全相同的鉴定结果，都显示为铜绿假单胞菌（表2）。

2.2 人工感染试验

试验组草鱼在感染后第5天出现死亡，至14 d，累计死亡率为67%。人工感染后试验鱼表现为活动减弱，腹部充血，腹腔有积水，个别死亡鱼眼球突出。死鱼解剖检查，可见肝脏发白，同自然发病的症状基本相似，对照组不表现任何症状。从感染后的病鱼肝脏中再次分离细菌，用优势菌PA001-1再次感染草鱼，得到相同的结果。

2.3 药敏试验

根据菌株PA001对12种药物的药敏试验结果，该菌株对妥布霉素、四环素和氟苯尼考等3种抗生素敏感，对链霉素、氯霉素和庆大霉素等3种抗生素中度敏感，对诺氟沙星、氨苄青霉素、红霉素、罗红霉素、卡拉霉素和万古霉素等6种抗生素显示出耐药（表3）。

3 结论与讨论

草鱼是我国的四大家鱼之一，年产量达229.7万t[7]。然而，由于集约化程度和养殖密度的不断提高，草鱼病害也日渐增多。据报道，荧光假单胞菌[5]、柱状黄杆菌[8]、嗜水气单胞菌[9]、霍乱弧菌[6]和拟态弧菌[6]都曾引起草原细菌性病害的暴发。本试验中，铜绿假单胞菌从患病草鱼肝脏中被分离到，且通过攻毒试验证明其对草鱼的致病性，这说明铜绿假单胞菌是引起此次草鱼疾病的病原。然而，由于能对嗜水气单胞菌产生拮抗作用，为了控制嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症，铜绿假单胞被作为一种益生素用于鲮鱼的养殖。由于铜绿假单胞菌对草鱼的致病性，它作为益生素使用的安全性应给予高度的重视。

此次疾病流行了1个月，导致了超过30%的草鱼死亡，根据药物敏感性的试验结果，利用口服氟苯尼考（每尾鱼25 mg·kg-1·d-1）的方法对草鱼进行治疗，3 d后病害得到控制，1周后草鱼停止死亡，这表明药物敏感性试验在治疗药物筛选过程中具有很强的实际意义。所以，在今后的生产实践中，应根据药物敏感性试验结果，做到科学合理地选择和使用药物。

参考文献：

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[2] Altinok I， Balta F， Capkin E， et al. Disease of rainbow trout causedby Pseudomonas luteola[J]. Aquaculture， 2007， 273： 393-397.

[3] Altinok I， Kayis S， Capkin E. Pseudomonas putida infection in rainbow trout[J]. Aquaculture， 2006， 261： 850-855.

[4] Aly S M， Abdel-Galil Ahmed Y， Abdel-Aziz Ghareeb A， et al. Studies on Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus， as potential probiotics， on the immune response and resistance of Tilapia nilotica （Oreochromis niloticus） to challenge infections[J]. Fish and Shellfish Immunology， 2008， 25：128-136.

[5] 耿晓修，丁诗华，孙翰昌，等.荧光假单胞菌灭活疫苗对草鱼的免疫保护效应[J]. 西南农业大学学报：自然科学版，2006，28：120-123.

[6] 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[7] 农业部渔业局.中国渔业年鉴[M]. 北京：中国农业出版社，2012.

[8] 王良发，谢海侠，张金，等. 我国淡水鱼类柱形病病原菌柱状黄杆菌的遗传多样性[J]. 水生生物学报，2010，34（2）：367-377.

[9] Song X H， Zhao J， Bo Y X， et al. Aeromonas hydrophila induces intestinal inflammation in grass carp （Ctenopharyngodon idella）： An experimental model[J]. Aquaculture， 2014， 434： 171-178.

[10] 李楠，郭慧芝，焦冉，等. 草鱼的一种急性细菌性传染病病原的分离鉴定及致病性研究[J]. 水生生物学报，2011，35（6）：980-987

腹泻猫肠道细菌的分离鉴定 篇4

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物

呋喃妥因、头孢氨苄、环丙沙星、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、氯霉素、菌必治等药敏纸片。

1.1.2 试验器材

培养基、恒温培养箱、超净工作台、接种环、酒精灯等。

1.1.3 试验试剂

糖类、磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂、胆盐、超纯水、中性红、结晶紫、蛋白胨、伊红-Y、美蓝、硫化氢、苯丙氨酸、枸橼酸盐、尿素、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、木胶糖等。

1.2 试验方法

1.2.1 粪便采集

挑选腹泻猫, 排除病毒性、寄生虫性和其他条件性腹泻, 确诊为细菌性腹泻后, 用无菌棉签采集患病猫的新鲜粪便10份;再采集10只临床健康的猫作对照。

1.2.2 细菌培养

将采集的20份样品在超净工作台上分别接种到普通培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基上, 并且标明接种的编号。接种完后将培养皿放入37℃恒温培养箱培养18~24h, 观察3种培养基上菌落的形态结构和颜色特点。根据菌落形态及颜色进行分离培养。

1.2.3 生化鉴定

使用精氨酸、鼠李糖、乳糖、水杨素、甘露醇、蔗糖、七叶苷、半乳糖、果糖、山梨醇、葡萄糖、懒氨酸、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、卫矛醇、甲基红实验、V-P试验、吲哚等分别配制生化鉴定管[4]。将培养皿中纯化的典型菌种在超净工作台上接种至生化鉴定管中, 24h后观察结果[5]。

1.2.4 药敏试验

将纯化所得的细菌接种于普通培养基上, 干燥后贴上药敏试剂片, 37℃恒温培养18~24h观察结果, 用游标卡尺测量抑菌圈直径。

2 试验结果与分析

2.1 接种培养结果

接种病猫粪便的麦康凯培养基中均有均匀红色, 边缘整齐, 中心突起, 中等大小, 表面光滑湿润的散在菌落长出, 疑似大肠杆菌。

2.2 生化试验结果

注:“+”产酸;“-”阴性;“○+”产酸产气。

由表1可知:这些细菌均能够分解麦芽糖、果糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、乳糖、山梨酸, 产酸产气, 不能产生硫化氢, 因此判断为大肠杆菌。

2.3 药敏试验结果

(mm)

由表2可知:分离的大肠杆菌对头孢类、喹诺酮类抗生素高度敏感, 对林可霉素、四环素、庆大霉素不敏感。

3 讨论

生化试验结果与参考资料大肠杆菌特性相符[6], 确定引起猫腹泻的细菌是大肠杆菌, 而且与王云峰等[7]、孙善发等[8]的试验结果相一致。从药敏试验的结果看, 细菌对头孢类、喹诺酮类[9]抗生素高度敏感, 对林可霉素、四环素、庆大霉素不敏感, 与有关的报道相符[10]。说明大肠杆菌已对一些常用的药物产生耐药性。通过对引起猫细菌性腹泻的细菌与健康猫的常规肠道菌进行对比发现, 正常猫肠道内存在着许多细菌, 涉及菌种包括链球菌、葡萄球菌、棒状杆菌、埃希菌、双歧杆菌、拟杆菌、乳杆菌、梭菌、念珠菌、青霉菌、地霉菌、毛霉菌与链格孢霉等。而引起这次细菌性腹泻的细菌培养后主要得到的是大肠杆菌, 说明了这些猫的细菌性腹泻主要是由致病性大肠杆菌引起的。

4 结论

通过对10只确诊患细菌性腹泻猫的粪样进行分离及生化得出引起猫腹泻的致病菌主要是大肠杆菌。药敏试验结果表明, 这类大肠杆菌除对头孢类、奎诺酮类的抗生素较敏感外, 对其他抗菌药物如氨苄青霉素、红霉素、链霉素等具有不同程度的抗药性。

摘要：试验将采集的新鲜粪样接种到培养基上培养观察菌落形态结构、颜色特点。然后挑取培养基上的菌落进行革兰氏染色、镜检, 在生物显微镜视野内找到大量散在两端钝圆的短杆菌, 初步确定致病细菌为短棒革兰氏阴性菌。之后用麦康凯培养纯化, 用纯化得到的菌落进行生化鉴定, 确定致病菌为大肠杆菌。药敏试验结果表明, 头孢曲松对其抑制作用最强, 其次是恩诺沙星。

关键词：猫细菌性腹泻,分离鉴定,药敏试验

参考文献

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[2]喻华英, 贾桂珍, 邹开胜.犊牛腹泻病中大肠杆菌病的分离及鉴定[D].塔里木大学动物科学院, 2006, 6 (2) :67-68.

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[4]陈天寿主编.微生物培养基的制备与应用[M].北京:中国农业出版社, 352-353.

[5]陆承平主编.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社, 2007.100-108.

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[7]陈溥言主编.兽医传染病学[M].北京:中国农业出版社:2006.112.

[8]林德贵.犬肠道抗菌药物相关性菌群失调的微生物学与组织病理学研究[D].华中农业大学兽医外科学, 2008.

[9]郭海勇, 许磊, 吴静等.小鼠胚胎肠道细菌的分离与初步鉴定[D].长春:吉林农业大学动物科学技术学院, 2008.

常见细菌鉴定 篇5

平装: 331页

正文语种: 简体中文

开本: 16

ISBN: 9787117119610

条形码: 9787117119610

尺寸: 25.6 x 18.6 x 1.6 cm

重量: 540 g

百分网内容简介

《临床常见细菌、真菌鉴定手册》着重对院内感染的常见细菌、真菌及其耐药性检测和研究进行了细致阐述，常见细菌鉴定。细菌耐药也是当前临床面临的重大难题之一，抗生素滥用是造成耐药性不断增长的主要原因。微生物是进化史上最成功的例子，存在几十亿年了，新兴的微生态学理论认为，人类和微生物之间是适应而不是对抗。院内感染菌株绝大部分是条件致病菌，当机体免疫力低下、抗生素使用不合理破坏了正常菌群，导致微生态失衡情况下，引起感染的发生、发展。我从事微生态研究多年，深刻认识到只有从生态平衡角度，将传统的单纯“杀菌”理论转变为“杀菌”加“促菌”理论，保护人体的正常菌群，维护人体微生态平衡，提高机体免疫能力，才是控制感染的根本办法。

百分网目录

上篇 临床细菌学

第一章 需氧及兼性厌氧，革兰染色阴性杆菌、球杆菌、球菌及弯曲菌和螺旋菌

第一节 心杆菌属

第二节 放线杆菌属、艾肯菌属、金氏杆菌属和色杆菌属

第三节 弗朗西丝菌属

第四节 布鲁菌属

第五节 军团菌属

第六节 假单胞菌属

第七节 伯克霍尔德菌属、窄食单胞菌属、丛毛菌属和食酸菌属

第八节 不动杆菌属

第九节 莫拉菌属

第十节 金黄杆菌属和威克斯菌属

第十一节 奈瑟菌属

第十二节 鲍特菌属

第十三节 产碱杆菌属、无色杆菌属、苍白杆菌属和根瘤菌属

第十四节 弧菌属

第十五节 气单胞菌属

第十六节 肠杆菌科

第十七节 巴斯德菌属

第十八节 弯曲杆菌属和弓形菌属

第十九节 螺杆菌属

第二十节 巴尔通体属

第二十一节钩端螺旋体属

第二十二节疏螺旋体属

第二十三节密螺旋体属

第二章 需氧革兰染色阳性球菌及杆菌

第一节 葡萄球菌属

第二节 链球菌属

第三节 肠球菌属

第四节 气球菌属及其相关菌属

第五节 李斯特菌属和丹毒丝菌属

第六节 棒状杆菌属及相关菌属

第七节 芽胞杆菌属和其他需氧芽胞杆菌

第八节 分枝杆菌属

第九节 奴卡菌属、红球菌属

第三章 专性厌氧菌

第一节 消化球菌属、消化链球菌属、嗜胨菌属、微金菌属和厌氧球菌属

第二节 韦荣菌属、氨基酸球菌属和巨形菌属

第三节 丙酸杆菌属、放线菌属、双歧杆菌属、真杆菌属、乳杆菌属、蛛网菌属、放线棒杆菌属和动弯杆菌属

第四节 拟杆菌属、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、梭杆菌属、二氧化碳嗜纤维菌

属及其他革兰阴性无芽胞厌氧杆菌属

第五节 梭状芽胞杆菌属

第四章 支原体属、脲原体属、衣原体属、立克次体属和东方体属

第一节 支原体属和脲原体属

第二节 衣原体属

第三节 立克次体属和东方体属

第五章 埃立克体属、无形体属和相关细胞内寄生体属

第一节 埃立克体属与无形体属

第二节 考克斯体属

第三节 养障体属

下篇 临床深部真菌

第六章 酵母菌及酵母样真菌

第一节 念珠菌属

第二节 隐球菌属

第三节 毛孢子菌属

第四节 地丝菌属

第五节 芽生裂殖菌属

第六节 其他酵母及酵母样真菌

第七章 双相性真菌

第一节 球孢子菌属

第二节 芽生菌属

第三节 组织胞浆菌属

第四节 孢子丝菌属

第八章 丝状真菌

第一节 曲霉菌属

第二节 青霉菌属

第三节 毛霉菌属、根霉菌属

人参锈腐病拮抗细菌的筛选与鉴定 篇6

关键词：人参锈腐病；拮抗细菌；筛选；鉴定

中图分类号： S435.675 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.16.019

人参锈腐病作为对人参的主要病害之一，感染后参根出现不同程度的红褐色腐烂斑[1]。长期以来人们一直依靠化学农药对人参土传病害进行防治，但并没从根本上解决问题，利用有益微生物来对其进行防治，是具有无毒、无污害的一条有效途径[2]。本研究从靖宇县、长白山两地土壤中分离细菌，并对其中抗人参锈腐病的菌株进行筛选与鉴定，期望得到具有商业价值的拮抗菌株。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和培养基

人参锈腐病、镰刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻纹枯、玉米纹枯。供试培养基为NA，PDA和BY培养基。

1.2人参土壤拮抗细菌的分离

取自靖宇县和长白山土壤共85份。取各土样5克，分别加入装有50毫升无菌水的三角瓶中，摇床振荡30分钟，然后进行梯度稀释。吸取稀释液 100μL，放入事先准备好的NA 平板上均匀涂布，每个处理3次重复。稀释度以每平板菌落数100～150为宜，于28℃下培养24小时。调取不同类型的菌落于 NA 平板上纯化3次后 ，4 ℃ 保存于NA斜面上备用。

1.3 菌株及发酵液的拮抗活性测定

以人参锈腐病为指示菌进行拮抗活性测定。将病原菌放置PDA中央，将细菌划线到四周，观察有无抑菌圈出现，筛选优良拮抗菌株。

将上述具有拮抗性的菌株转接至新鲜的斜面培养基上，28 ℃ 条件下培养1天后，接种至装液50毫升的250毫升三角瓶内，在28℃、转速为200转/分钟的旋转式摇床上振荡培养48小时，得发酵液。

发酵液经离心后与菌体分离，分别用乙酸乙酯和甲醇进行抽提，旋转蒸发仪浓缩，将浓缩液加入到滤纸片中，进行对峙培养，观察有无抑菌效果。

1.4 拮抗细菌的抑菌谱测定

对抑菌圈明显、拮抗效果好的菌株进行抑菌谱测定，供试病原菌包括镰刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻纹枯、玉米纹枯。方法同本文“1.3”。

1.5 16S rDNA基因序列测定

细菌总DNA提取用CTAB NaCl。PCR扩增采用通用引物27F，1492R。

PCR反应体系（20μL）扩增体系：10×扩增缓冲液（不含MgCl2）2.0μ L，MgCl21.0μL，dNTP （ 10 mmol/ L ） 1 μL，P1、P2（10μmol/ L）各1.0μ L，Taq 酶（215 U/μL） 0.5μL，DNA 1.0μL ，补加超纯水至20μL。PCR程序：95 ℃预变性5分钟 ；94 ℃变性60秒，56 ℃退火30秒，72 ℃延伸1.5分钟，循环33 次，72 ℃最终延伸10分钟。代表菌株的PCR产物测序由上海生工公司完成。测序结果用NCBI数据库中的BLAST进行相似性分析，找到与其同源性较高的菌株。

2 结果与分析

2.1土壤拮抗细菌的分离

从两地共分离出500株细菌，其中350株来源于长白山，150株来源于靖宇县。

2.2土壤细菌拮抗活性的测定结果

对采自不同地区、不同地块的85份土样中分离得到的 500 株细菌进行室内抗菌活性测定。经过初筛、复筛，发现有10株菌株对人参锈腐病有明显拮抗作用。其中菌株CB206 对人参锈腐病菌的抑菌效果最好。

2.3拮抗菌株CB206的抑菌谱测定

将菌株CB206与镰刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻纹枯、玉米纹枯进行抑菌圈对峙培养试验。CB206对几种病原菌都要较好的拮抗效果，说明其有很好的光谱抗菌性，有较好的研究开发价值。

2.4拮抗细菌BS015的16S rDNA序列测定

以细菌的基因组DNA为模板，经过PCR扩增后，得到1条约1500 bp 的DNA 片段。将其测序，经过在NCBI数据库中进行Blast相似性分析得其属于沙雷菌属。

3 结论与讨论

本实验从不同地区共筛选到20株有拮抗作用的细菌。对拮抗效果最好的菌株CB206进行16SrDNA基因序列和生理生化试验，结果表明该菌株属于沙雷菌属。

本实验筛选出的菌株CB206对人参锈腐病菌具有明显的抑制作用，在抑菌谱试验中发现CB206具有光谱抗菌性，可能是多种生防机制共同作用，例如产生抗生素、竞争、溶菌以及促生和诱导抗性等协同作用的结果。对于活性物质的筛选，盆栽试验，安全性等问题，有待于进一步的研究。

参考文献

[1] 赫荣琳，李玉，等.人参锈腐病接抗菌的筛选及鉴定[D].吉林农业大学，2006.

[2] 吴连举，杨依军，武侠，等.利用土壤拮抗微生物防治人参锈腐病[J].中国生物防治，1999，15（04）：166-168.

大豆细菌斑点病抗性鉴定的研究概况 篇7

1 大豆细菌性斑点病研究进展

1.1 症状与危害

不同大豆品种对大豆细菌性斑点病的抗病性表现差异较大,抗感反应明显。抗性好的品种主要表现为过敏性坏死反应(HR)[3]、抑制病原细菌在大豆体内或体表增殖[4];抗性差的品种则表现出症状显症明显,叶部发病较重,在发病初期产生半圆,有时是近圆形水浸状较小斑点,发病后期形成多角型黑褐色病斑,病斑直径3～4 mm,中心干枯变脆,产生水浸状晕圈,有时产生褪绿色晕圈,叶部发病重时病斑可连接成片[2]。易感品种可减产5%～10%,严重发生年则可达到30%～40%;可使籽粒变色,大幅度降低大豆商品价值[5]。

1.2 病原菌生理分化

大豆细菌性斑点病菌存有明显的生理小种分化现象。不同地区的大豆细菌性斑点病菌的生理小种差异较大[6]。不同育种单位育成的大豆品种是否抗病,能抗哪一个生理小种,对于利用和创新抗病品种有重要意义。但是抗大豆细菌性斑点病抗病育种研究进展缓慢,究其原因是多方面的,最主要是抗源较缺乏、抗性遗传规律尚不清晰,而大豆细菌性斑点病抗性鉴定是其它工作的基础,如病源菌致病性分化、抗病品种选育、宿主抗性遗传和抗病种质筛选等。因此科学、精准地鉴定抗大豆细菌性斑点病种质资源,对于开展大豆抗病育种工作和提高病害综合防控成效具有重要的理论价值和实践意义。

1.3 种质材料抗性鉴定

国外植病学者Debabrata等对大豆细菌性斑点病的品种抗性鉴定进行了卓有成效的研究。认为P.I.68708,Flambeau,P.I.189968和Norchief是高抗的大豆种质,Harosoy,Acme和P.I.132207是高感的大豆种质[7]。Wrather J A等研究表明Pershing是感病的大豆品种,Avery是抗病的大豆品种[8]。Park等发现Williams79虽然在田间发病严重,但秋天测产时,产量不会明显降低。因此Park认为Williams79是一个较为耐大豆细菌性斑点病的品种[9],生产中可以在病区大面积推广应用。在水平抗性育种中也可以采用Williams79作为抗病亲本,通过不断连续回交的方式,改造目前生产中感病的主栽大豆品种。

中国研究人员在大豆细菌性斑点病研究方面也进行初步探索,为了初步弄清中国南北方大豆品种对大豆细菌性斑点病的抗感反应情况。近几年来,孙永吉等对收集到的1 253份大豆品种进行抗性鉴定,鉴定结果表明合丰15、黑农9号、合丰18和黑农25等32份大豆种质资源对大豆细菌性斑点病表现高抗,吉林省农业科学院育成的吉林9号大豆品种和黑龙江省农业科学院育成的黑农16大豆品种表现感病[10]。张佳环等通过生产田实际发病调查与室内人工接种鉴定相结合的研究方法,将1 762份大豆种质资源进行了抗性鉴定,其中丹豆4号、绥农8号、合丰31、绥农7号、吉农1号和黑农31这6份大豆品种为高抗;长农4号、黑农28、吉林20和吉林13这4份大豆品种为高感[5]。东北农业大学大豆研究所张淑珍于2005年通过在实验室盆栽方法,对收集到的108份大豆种质进行针刺法人工接种鉴定,其中鉴定出垂直抗性较好的大豆种质有九丰5号、黑农25、吉林2号、农大9799、铁丰18、九丰4号、东农42、黑河9号和合丰15等15份材料,抗病材料占供试材料的13.89%,24个大豆种质表现为中间类型,占供试材料的22.2%[11]。周博如通过研究认为东农42和绥农8号2个大豆品种是感病的,黑农38和黑农37则是抗病的大豆品种[12]。这与张淑珍研究结果不同,张淑珍认为东农42是抗病品种。近年来据不完全统计,我国的品种资源圃中大多数的大豆品种对大豆细菌性斑点病都表现为高抗,其中黑龙江省抗病大豆品种比例为98.1%、辽宁省高抗大豆品种比例为97.6%、吉林省抗病大豆品种比例35.5%。仅有极少部分大豆品种对细菌性斑点病表现为高感,其中黑龙江省为0.4%、辽宁省为0.1%、吉林省为9.8%[5]。这说明我国存在着大量的大豆细菌性斑点病的抗源,所鉴定的抗源材料可以直接用于生产,同时可直接用于抗病育种的亲本材料,为进一步研究大豆细菌性斑点病的抗性遗传规律、拓宽抗病基因资源、培育水平抗性好的品种等工作打下基础。

2 存在问题及对策

2.1 抗性鉴定不统一,应制定统一规范鉴定方法

目前大豆细菌性斑点病的鉴定多采用针刺法[11]和盆栽人工喷雾接种鉴定法[10],进行室内人工接种鉴定其病抗性。针刺法是准确、快速、技术容易掌握的室内幼苗期鉴定方法,其鉴定结果与病圃田间发病结果对比,二者之间病情指数均呈极显著相关;在病害严重发生年份,田间人工喷雾法鉴定效果较好,该方法适于田间大量种质材料的初选,缺点是容易受年度间环境条件变化的影响。在不同生态地区、不同气象年份间存在差异,从而导致同一大豆品种在不同地区间、不同年份间抗性差异较大。为了校正鉴定结果的差异,应制定统一规范的病害鉴定方法。

2.2 鉴定方法不全面,应采取多种措施筛选和创造抗源

对较好的材料只停留在初步鉴定上,缺乏反复验证性鉴定,更缺乏在分子生物学方面抗性遗传规律的研究。可采取远缘杂交、生物技术等方法筛选和创新抗源,通过复式杂交、修饰回交、混交混选等大豆育种方法与体系,实现农艺性状与抗病性同步提高。为抗大豆细菌性斑点病育种工作提供丰富的资源材料。

2.3 鉴定不准确,应充分应用分子生物学的方法

传统的病圃鉴定方法,不仅需要大量的设施、人力,而且鉴定结果不稳定,易受环境条件的干扰。在发病重的病圃或发病重的年份,容易将抗大豆细菌性斑点病的材料淘汰,造成不必要的损失,而且在发病轻的病圃或发病轻的年份耐病,一些中抗或感病的材料容易作为抗病类型出现。利用SSR和QTL等分子标记技术,找到与大豆抗病基因紧密连锁的分子标记,应用这些与抗病基因紧密连锁的分子标记在育种实践中进行抗病性选择,可增加鉴定的准确性,是一项有效的、快速的育种技术。

参考文献

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[10]孙永吉,刘宗麟,刘玉芝,等.大豆品种资源抗细菌斑点病鉴定与评价[J].大豆科学,1989,8(2):185-189.

[11]周博如,李永镐,刘太国,等.不同抗性的大豆品种接种大豆细菌性疫病菌后可溶性蛋白、总糖含量变化的研究[J].大豆科学,2000,20(2):111-114.

蓝莓贮藏期病原细菌的分离与鉴定 篇8

云南省玉溪市蓝莓一般成熟于6~8月, 属于高温多雨季节, 且蓝莓是呼吸跃变型浆果, 果实糖分含量较高, 采后呼吸作用旺盛, 各种生理代谢加快, 又因含水量较高, 因此采后贮藏过程中果实易发生变质、腐烂等贮藏病害, 造成大量损失, 严重影响其商品性和经济价值。蓝莓耐藏性特别低, 常温下 (18~22℃) 放置5~l5d, 果实易腐烂。Connor等研究表明, 蓝莓果实在22℃温度下, 2~4日开始出现失水萎蔫、软化、褐变、腐烂等症状[4]。目前, 国外关于蓝莓贮藏病害的研究报道, 主要集中在采后病害防治, 而在国内, 蓝莓贮藏病害致病病原菌已经分离鉴定出几种常见的真菌, 包括灰葡萄孢、草酸青霉、褐孢霉、链格孢和枝顶孢[5], 关于蓝莓贮藏期腐败细菌分离鉴定鲜有报道。本试验采用分子、形态鉴定方法, 对蓝莓果实贮藏病害中几种常见腐败细菌进行分离鉴定, 判断其所属种类。本实验结果对蓝莓腐败细菌予以初步识别, 为防治蓝莓果实贮藏病害、延长蓝莓贮藏保鲜期提供了理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

蓝莓果实采摘于云南省玉溪市澄江地区蓝莓基地, 蓝莓采后立即运回西南林业大学微生物实验室。选择大小一致、无病虫、无损伤的健康果实作为试验材料, 用蒸馏水清洗后置于室温条件 (温度18~22℃, 相对湿度90%~95%) 贮藏3~7d, 从自然发病果实的新发病害部位获得分离材料。

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基 (NA培养基) :蛋白胨10g, 牛肉膏5g, 琼脂粉16g, 氯化钠5g, p H值7.4~7.6, 加水补足1 L, 121℃高压灭菌20min。NA液体培养基配方同固体培养基但不加琼脂粉。

1.3 试验仪器

PCR仪, 美国Bio-RAD公司;电子恒温不锈钢水浴锅, 萧山永发电器有限公司沪南实验仪器厂;电泳仪和电泳槽, 北京六一仪器厂;制冰机, 美国Grant雪花制冰机公司;离心机和微量移液器, 德国eppendorf公司;高速冷冻离心机, 德国SORVALL公司;超净工作台, Thermo公司;光照培养箱SPX-300B-G型, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;凝胶成像仪G:BOX, 英国Syngene公司;奥林巴斯光学显微镜。

2 试验方法

2.1 病原细菌的分离与鉴定

从蓝莓新发病害交接处取果皮组织, 用无菌水冲洗3次后, 于NA平板上采用平板划线法分离, 后于恒温培养箱30℃倒置培养2d;将获得的菌落纯化3次以上直至获得单一菌落后, 镜检, 转接到NA斜面, 待菌苔长出后于4℃临时保存。

2.2 病原细菌的显微观察

挑取少量处于对数期的病原细菌菌体制作涂片, 采用革兰氏染色法染色后[6]后在显微镜下观察照相。

2.3 病原菌细菌的分子鉴定

2.3.1 病原菌细菌DNA的提取。

将纯化后菌株接种于NA液体培养基, 30℃振荡培养24h, 13000r/min, 离心1min, 收集菌体。收集的菌体用生理盐水离心洗涤3次, 后用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取试剂盒提取细菌基因组DNA。提取的DNA在含有荧光染色剂的0.8%琼脂糖凝胶上水平电泳检测, 并用凝胶成像系统观察照相。

2.3.2 16s r DNA的扩增。

16s r DNA的PCR扩增采用细菌通用引物27F和1492R, 引物由硕阳生物技术有限公司合成。正向引物27F:5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’;反向引物1492R:5’TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3’。反应采用25μL细菌PCR反应体系, 反应体系见表1。

按上述组分配制好反应液, 混匀后进行PCR扩增, 反应程序:94℃起始变性5min;94℃45S, 56℃45S, 72℃1min30S, 35个循环;72℃延伸5min。

PCR产物在含有染色剂的0.8%琼脂糖凝胶上水平电泳检测, 并用凝胶成像系统观察照相。

2.3.3 16s r DNA的测序及序列分析。

将上述16s r DNA的PCR产物送到北京诺赛基因组研究中心有限公司测序, 测序引物同扩增引物。测序结果利用DNAMAN软件拼接, 拼接好的序列在Eztaxon Server 2.1进行序列比对, 并在Gene Bank的数据库 (http://ww.ncbi.nlm.nih.gov) , 下载相近的参比16s r DNA序列, 用MEGA 6软件构建系统发育树, 并进行序列相似性分析。

3 结果与分析

3.1 病害发生症状

蓝莓果实腐烂初期表面呈浅褐色水渍状病斑, 继而变褐软腐, 3~7d后扩展全果, 使果肉变褐软腐, 表面密生灰白色软毛, 发病部位没有一定的规律, 腐烂部分可深入到果心。

3.2 病原细菌传统形态学鉴定结果及革兰氏染色结果

病原细菌培养后的菌落形态如图1, 菌落形态观察结果:L-5菌落平坦, 不透明, 不光滑, 有粉红色分泌物;L-6菌落平坦, 不透明, 菌落表面有浅桔黄色分泌物;L-7菌落平坦, 不透明。菌落表面有桔黄色分泌物。

细菌采用革兰氏染色显微图像如图2, 菌株L5、L6和L7菌均为短杆状, 革兰氏染色程阳性, 且都具荚膜。

3.3 病原细菌分子鉴定结果

3.3.1 16s r DNA的PCR扩增结果。

以细菌通用引物27F和492R作为引物, 对蓝莓贮藏期分离出的3株病原细菌进行16s r DNA扩增, 扩增的电泳检测结果如图3, 均能得到清晰稳定的条带, 片段约为1500bp。

3.3.2 16S r DNA全序列测定和同源性分析。

将上述所得供试菌株的PCR产物测序, 测序结果用DNA-MAN软件拼接, 拼接结果于Eztaxon Server 2.1进行序列比对, 比对结果如表3, 由表2可知:菌株L-5与Serratia nematodiphila DZ0503SBS1相似性为98.48%;菌株L-6与Microbacterium arborescens DSM 20754相似性为99.09%, 菌株L-7与Curtobacterium albidum DSM 20512相似性为98.93%。根据16S r RNA序列相似性达到97%以上则认为是同一个属[7], 若序列相似性小于96%~97%的可以认为不是同一个种, 小于93%~95%的可以认为不是同一个属[8]的划分原则, 确定分离得到的3株病原细菌L5、L6和L7分别属于沙雷氏菌属 (Serratia) 、微杆菌属 (Microbacterium) 和短小杆菌属 (Curtobacterium) 。在Gen Bank上下载与分离得到的3株病原菌序列相近的菌株序列, 利用MEGA 6软件建立系统发育树, 进行系统发育学分析如图4, 由图4可见L5、L6和L7分别隶属于3个系统发育分支, 分别为沙雷氏菌属、微杆菌属和短小杆菌属分支, 这与序列比对分析结果一致。

综上所述, 通过平板划线培养分离得到引起蓝莓贮藏期腐烂的3株优势细菌, 经形态学观察结合16S r DNA序列分析, 分别属于沙雷氏菌属、微杆菌属和短小杆菌属。

4 讨论与展望

引起果品腐败的微生物通常包括细菌、霉菌和酵母, 以细菌和霉菌引起的果品腐败最为常见, 其中:细菌中的非芽孢杆菌由于不产生芽孢且热抵抗力较弱, 是新鲜果品中的常见腐败菌。在自然界存在的细菌中, 非芽孢细菌的种类比有芽孢细菌多, 因此污染果品的机会较多。本实验中分离鉴定出引起蓝莓腐烂的3种杆菌分别属于沙雷氏菌属、微杆菌属和短小杆菌属, 实验表明, 非芽孢杆菌的腐败细菌可以导致贮藏期蓝莓腐烂。据报道, 在冬季贮存甜瓜腐烂组织也分离出沙雷氏菌属的菌株。分离的细菌类群中沙雷氏菌属是在自然界中作为人类的条件致病菌, 该属有的种可能与人类菌血症有关[9]。崔慧玲等在鲜切生菜贮藏过程中分离鉴定出腐败细菌微杆菌属的某一种[10], 本实验也从贮藏蓝莓果实腐烂发病部位分离鉴定出1株微杆菌属中的腐败细菌。此外, 本次实验首次从蓝莓果实中分离得到1株短小杆菌属细菌。

上述结果表明, 腐烂蓝莓组织中存在有害细菌类群, 针对此情况, 可以采用低温控制结合化学灭菌的方法进行蓝莓采后贮藏, 具体操作工艺流程有待后续进一步深入研究。

摘要：为明确云南省玉溪市蓝莓果实腐烂的病原细菌种类, 对玉溪市澄江地区蓝莓果实进行致病细菌分离, 对分离的病原细菌进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。实验结果表明, 从发病腐烂的蓝莓果实上分离出3株病原细菌, 初步确定属于沙雷氏菌属 (Serratia) 微杆菌属 (Microbacterium) 和短小杆菌属 (Curtobacterium) 。研究结果对玉溪澄江地区蓝莓贮藏期腐烂病害的防治和进一步深入研究将提供一定的参考理论依据。

关键词：蓝莓,细菌,分离鉴定

参考文献

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[9]东秀珠, 蔡英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社, 2001:252.

一株产纤维素酶细菌的筛选鉴定 篇9

关键词：产纤维素酶细菌,筛选,鉴定

纤维素是自然界中所有植物的主要组分,由于其存在很多的高能氢键难以水解,因此很难被人类或动物直接利用[1]。纤维素酶是能够降解纤维素生成葡萄糖的一类酶的总称,是一个由多种水解酶组成的复杂酶系[2]。

纤维素酶已被应用到饲料加工业中,用于纤维素物质的预处理,如谷物的去壳,青贮饲料的处理等,从而提高动物的消化能力[1]。但由于其加工、纯化工序繁杂,成本较高,因而影响了它在饲料工业中的广泛应用。

目前对产纤维素酶菌株筛选方面的研究较多,但多为霉菌,由于霉菌为好氧型微生物,而饲料发酵大部分是在厌氧环境中进行的,不利于霉菌的应用[3]。因此对兼性厌氧型产纤维素酶的细菌进行研究是很重要的[4]。本文旨在报道一株产纤维素酶细菌的筛选、鉴定,以期能应用到青贮饲料的制作中。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

新疆乌苏窖藏两年以上且未加任何添加剂的青贮饲料,材料柔软、松散、较完整,未发现有霉变,呈淡黄色,pH 3.8左右。

1.1.2 试剂

DNA Marker、CTAB购自大连宝生物工程有限公司,琼脂糖(Biowest Agarose)购自上海生物技术有限公司;SDS、EB购自Sigma公司;溶菌酶(Lysozyme)购自上海生物工程有限公司;琼脂糖(Biowest Agarose)购自北京三博生物工程有限公司;其它化学试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器

SPX-250型生化培养箱(上海跃进医疗器械厂);SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化),MLS-3020高压蒸汽灭菌锅(新德医疗器械有限公司);DK-8D电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司);pHS-3C酸度计(上海雷磁仪器厂); TV lens C-0.45X显微成像仪(日本Nikon);E360K离心机(德国eppendorf);,AEL-160岛津电子天平(日本岛津自动化设备有限公司);Mastercycler ep PCR仪(德国Eppendorf)。

1.1.4 培养基

(1)筛选培养基

蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母粉5g,羧甲基纤维素钠10g,琼脂15g,水1 000ml,调pH至6.0,121℃高温灭菌25min。

(2)摇瓶产酶培养基

蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母粉5g,羧甲基纤维素钠10g,水1 000ml,调pH至6.0,121℃高温灭菌25min。

(3)斜面保藏培养基(LB琼脂培养基)

蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母粉5g,琼脂15g,水1 000ml,调pH至6.0,121℃高温灭菌25min。

1.2 方法

1.2.1 初筛

称样品1g,加入到一个盛有99mL无菌水带有玻璃珠的三角瓶中,将样品充分打散、混匀,即成10-2稀释液,然后再按10倍稀释法依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0.1mL涂筛选平板(各2个重复),37℃培养箱倒置培养24h,长出的菌落反复转接几次筛选平板后,挑取长势优良的单菌落接入斜面保藏培养基备用。

1.2.2 刚果红染色鉴定法[5]

将分离到的菌株活化后点种于筛选培养基平板上并编号,37℃恒温倒置培养2d,用1mg/mL的刚果红溶液浸染1h,再用1mol/L的NaCl溶液脱色1h,倒入1mol/L的盐酸使背景呈蓝色而使透明圈更加明显(各2个重复)。依据菌落直径与透明圈直径的比值大小筛选产酶菌株。

1.2.3 摇瓶复筛

将不同直径的水解CMC-Na透明圈菌株分别接人50mL(250mL三角瓶)摇瓶产酶培养基内(各2个重复),在37℃、200r/min连续发酵培养,测定其CMC酶活力[6,7]。

1.2.4 羧甲基纤维素酶(CMC酶)活力测定

参照NY/T 912-2004 测定饲料添加剂纤维素酶活力[8]。

酶活定义:在温度50℃、pH 6.0条件下,每分钟由底物降解释放1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。

1.2.5 菌种鉴定方法

根据形态观察和生理生化检测进行初步鉴定[9]。

用16S rDNA序列比较法进行分子鉴定[10]。具体方法是先用摇瓶产酶培养基培养待鉴定菌株2d,离心收集菌体,抽提菌株的总DNA,用16S rDNA通用引物进行PCR扩增,产物回收纯化后,进行DNA序列测定,将所测得的序列与Genebank中的16S rDNA序列进行Blast分析比较。

引物序列为:XJ1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

XJ2:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'

PCR反应程序设计为:95℃、4min,94℃、1min,56℃、1min,72℃、1.5min,30个循环后,72℃延伸8min,4℃保存。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

菌株经筛选平板反复转接几代仍能正常生长,则说明其可以利用CMC-Na为惟一碳源,具有一定的降解纤维素能力。挑出生长良好的单菌落点种筛选平板,根据刚果红染色后形成的水解圈直径和菌落直径的比值,获得具有产纤维素酶能力的菌株6个(表1)。其中ws-6菌株产生的透明圈大而清晰,直径比达24∶5(图1),将此菌株初步确定为高产纤维素酶菌株。

2.2 ws-6菌株产纤维素酶能力的验证

将筛选得到的菌株制备摇瓶液体种子,然后接入到液体产酶培养基中,37℃、200r/min发酵培养2～3d后测定CMC酶活力,结果表明ws-6菌株纤维素酶活明显高于其他菌株,达2.55U/mL,该结果验证了ws-6菌株分泌CMC酶能力较强,具有进一步研究开发价值。

2.3 菌株的鉴定

2.3.1 菌株的形态观察

经观察ws-6菌株的菌落呈淡黄色、不透明,表面干燥、不光滑,中间呈褶皱、隆起,边缘不整齐,老化后菌落表面成淡红色(图2)。

菌体呈长杆状,具圆端,成对排列,运动,周生鞭毛,中生芽孢,但芽孢形成率较低,且芽孢椭圆形,孢囊不膨大,繁殖方式为二等分裂(图3)。格兰氏染色呈阳性。根据伯杰氏手册初步鉴定该菌为芽孢杆菌。

2.3.2 菌株的生理生化鉴定

芽孢杆菌的个体微小,形态特征简单,单凭形态特征不能达到鉴定目的,必须借助生理生化特征进一步鉴别,由于芽孢杆菌对各种生理生化实验的反应不同,显示出各类酶系不同,因此,结果也比较稳定,可作为鉴定的重要依据。ws-6菌株的生理生化特征见表2。

注:表中“+”表示鉴定反应呈阳性,“-”表示鉴定反应呈阴性。

2.3.2.1 最适生长pH值的确定

将ws-6菌株点种到pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的LB琼脂培养基上,37℃恒温培养2d,观察菌株的生长情况并测量各平板上菌落的直径(表3)。观察结果该菌在pH 4.0的平板上生长缓慢,有明显的迟滞期,而在pH 5.0～8.0的平板上生长良好,表明ws-6菌株在pH 5.0～8.0的条件下生长,其最适生长pH值为5.0～7.0,是一种嗜酸菌。

2.3.2.2 最适生长温度的确定

将ws-6菌株转移到pH 6.0的LB琼脂培养基上,分别于30、35、40、45、50、55、60℃条件下恒温培养2d。观察到该菌能在30～55℃ 的环境下生长,其最适生长温度为35℃左右。

2.3.2.3 对氧气的需求

通过LB琼脂培养基穿刺培养观察,ws-6菌株在穿刺管中各处均有生长,说明该菌株属兼性厌氧菌。

2.2.7 分子鉴定

ws-6菌株的16S rDNA 的PCR结果见图3,由第二泳道为PCR扩增产物,PCR扩增所产生的DNA片段为单一的谱带,片段大小约为1.5kb,表明扩增产物无明显非特异性扩增现象。

ws-6菌株的16S rDNA测序结果如下:

CAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGG

GCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATTATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGT

TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG

GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTT

GTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG

通过在Genebank上进行BLAST比对分析,该序列与Bacillus licheniformis ATCC14580的同源性最高,为99%,进一步鉴定该菌为地衣芽孢杆菌。

3 讨论

本研究从新疆乌苏窖藏饲料中筛选到一株产纤维素酶能力较强的菌株,编号为ws-6,经过鉴定证实该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。目前的研究以地衣芽孢杆菌生产蛋白酶、淀粉酶的居多[11,12,13],产纤维素酶的研究较少,而本研究在菌株的筛选过程中发现该菌株对纤维素有较强的降解作用,在较低的pH值条件下生长良好,且兼性厌氧,有望将其应用到青贮饲料的制作过程中,提高青贮饲料的营养价值。

细菌鉴定 篇10

1 材料与方法

1.1 菌株的分离

土壤样品采自南极乔治王岛,用无菌塑料袋储藏于-20℃冰箱备用。采用梯度稀释法将样品稀释后涂布于分离平板上(TSA、LBA、NA),1g样品稀释于10 mL无菌水中,梯度稀释到10-3倍并涂布于分离平板上。平板于20℃培养3～5 d,挑选出单菌落保存备用。

1.2 南极K25菌株的鉴定

K25菌株基因组的提取采用Dneasy试剂盒,按照说明书操作。PCR扩增16S rDNA采用通用引物BSF8 5'-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3'和BSR1541 5'-aag gag gtg atc cag ccg ca-3',PCR条件如下:

A.PCR扩增体系(50μL)

B.PCR扩增条件

95℃预变性3 min;95℃变性1min,57℃复性30 s,72℃延伸60 s,30个循环;最后72℃延伸3 min。

1.3 抑菌试验

采用对峙培养试验检测K25的抑菌活性,将K25菌种接种于营养琼脂中央,待菌落形成以后,将混有指示菌的营养琼脂倒于上面(1.3%的营养肉汤和0.7%的琼脂)。20℃培养2d,若菌落周围出现透明圈,说明K25能抑制指示菌的生长[10]。指示菌由马来西亚沙巴大学生物技术研究中心(IPB)提供,均为分离自食物的病原菌:大肠杆菌属V517,大肠杆菌属0125,沙门氏菌属S.Bi8,沙门氏菌属S.Tm13,克雷伯氏杆菌属14x,芽孢杆菌属K3。

1.4 抗生素耐受性

南极菌株K25对抗生素的耐受性采用滤纸片扩散发检测。供检测用的12种抗生素及测定浓度如下:氨苄青霉素(10μg)、头孢他啶(30μg)、亚胺培南(10μg)、环丙沙星(5μg)、氯霉素(30μg)、庆大霉素(10μg)、卡纳微素(30μg)、链霉素(10μg)、四环素(30μg)、硫酸多粘菌素B(300单位)、红霉素(15μg)、氯林可霉素(2μg)、林肯霉素(10μg)、新生霉素(5μg)和万古霉素(30μg)。

2 结果

2.1 鉴定

以南极菌株K25基因组为模版,利用通用引物BSF85‘-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3’和BSR1541 5‘-aag gag gtg atc cag ccg ca-3’对其16S rDNA片段进行扩增,结果如图1。由图可以看出,PCR扩增所得产物的分子量在1.5 kb左右,符合16S rDNA片段大小。

将PCR产物纯化,送往生物科技公司进行测序,得到南极菌株K25的16S rDNA序列。登录NCBI网站,将其序列输入进行比对(BLAST),可得比对结果。表1为比对结果的前三个相似菌株,南极菌株K25与第一个土壤杆菌高度相似(96%),可以确定南极菌株K25为土壤杆菌。M:M arker,CK:对照,16S:16S rDNA

2.2 抑菌试验

结果如表2,南极细菌K25对沙门氏菌属S.Bi8、克雷伯氏杆菌属14x及芽孢杆菌属K3有抑制作用,尤其对后者作用最强,而对其余的三种病原菌没有抑制作用。

2.3 抗生素耐受性

南极菌株K25对抗生素的耐受性检测结果如表3,图2。结果显示该菌株对氨苄青霉素等9种抗生素都有耐受性,而对另外的6种抗生素没有抗性。

3 分析与讨论

根据NCBI网站16S rDNA序列比对结果(表2),南极细菌K25与一株土壤杆菌相似度最高,为96%。K25菌株能抑制沙门氏菌属S.Bi8、克雷伯氏杆菌属14x和芽孢杆菌属K3,其中对芽孢杆菌属K3的抑制作用最强,而对另外的三株供试菌株无抑制作用。这种抑制作用可能是由于菌株所产生的抗菌物质导致的。此外,K25菌株对供试的9种抗生素有抗性:氨苄青霉素(10μg)、头孢他啶(30μg)、氯霉素(30μg)、庆大霉素(10μg)、卡纳微素(30μg)、链霉素(10μg)、硫酸多粘菌素B(300单位)、新生霉素(5μg)及万古霉素(30μg),而对另外的5种抗生素没有抗性。

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