伯杰鉴定细菌手册

伯杰鉴定细菌手册（通用4篇）

篇1：伯杰鉴定细菌手册

鉴定细菌学 - 拼音

伯杰氏鉴定细菌学手册》(第8版)将本科分为5个属，其主要鉴别特征见表[芽孢杆菌 ...

jiàn dìn xì jūn xué

鉴定细菌学 - 英文

Identification of Bacteriology

篇2：伯杰鉴定细菌手册

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编者评论 -

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篇3：伯杰鉴定细菌手册

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物

庆大霉素、链霉素、林可霉素、头孢氨苄、菌必治等。

1.1.2 试验器材

生物显微镜、托盘天平、锥形瓶、电炉、载玻片、盖玻片、恒温培养箱、超净工作台、立式圆形压力蒸汽灭菌器、冰箱、接种环、酒精灯等。

1.1.3 试剂

乳糖、磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂、胆盐、超纯水、中性红、结晶紫、95%乙醇、硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡磷胨水、拘橼酸盐、尿素、半固体琼脂、葡萄糖产气、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖等。

1.1.4 试验动物

试验犬均来自云南农业大学动物科学技术学院动物医院 (西站) 及康大妈流浪动物收容所。首先进行犬健康状况状况调查, 调查内容包括品种、年龄、性别、体重、临床症状, 引起犬腹泻的原因。根据犬的临床症状:出现呕吐, 慢性肠卡他, 厌食, 稀便, 血便, 渐进性消瘦, 营养不良, 精神不振, 体温升高, 脱水等有典型腹泻症状, 经诊断后排除病毒性腹泻及寄生虫腹泻可能的犬。

1.2 试验方法

1.2.1 粪样的采集

在动物医院里, 由于不可能随时都能采到新鲜粪便样品, 所以采用棉棒采集每只试验犬直肠深部少量粪便直接涂片观察, 并编号记录被检犬的年龄、营养状况、品种、性别等, 并保存待检。本次试验粪样采集时间为0d:2010年4月20日, 采到3个样品分别编号1、2、3。1d:2010年4月21日采到4个样品分别编号4、5、6、7。2d:2010年4月22日采到3个样品, 分别编号8、9、10。本次采样的犬品种不一, 有北京犬、雪橇犬、金毛、博美等。年龄从1月龄至8岁之间。各个体的粪样分别取2份。

1.2.2 培养基制备

麦康凯琼脂培养基制备, 麦康凯培养基用于肠道致病菌的选择性分离培养。配方如下蛋白胨20.0g, 乳糖10.0g, 胆盐5.0g, 氯化钠5.0g, 中性红0.03g, 琼脂14.0g, pH值7.1±0.2, 加热溶解于1000ml蒸馏水中, 121℃高压灭菌15min备用。本次试验使用的是由上海市医学化验所试剂厂生产的麦康凯琼脂培养基, 取样品52g加入1000ml蒸馏水中混合放置10min微火煮沸使之完全溶解, 115℃高压灭菌15min备用。鉴定原理为蛋白胨提供碳氮源、维生素和生长因子;牛胆盐可抑制革兰氏阳性菌的生长;氯化钠维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;乳糖为可发酵的糖类;中性红是pH指示剂, 细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈。

1.2.3 粪样检测

每一个样品分别取少量的粪样经无菌纯水稀释后涂于载玻片上等干后用革兰氏染色法[5]染色之后进行镜检。

1.2.4 接种培养

将样品在超净工作台上分别接种到麦康凯琼脂培养基上, 并且标明接种的编号。接种时用采样的棉签轻轻涂抹于培养基的一头, 之后用接种环以“之”字型画开, 每涂过培养皿的一半时旋转90°, 接种环烧白灭菌后继续沿“之”字画开。接种完成后将培养皿放入37℃恒温培养箱培养24h。

1.2.5 生化鉴定

使用精氨酸、鼠李糖、乳糖、水杨素、甘露醇、蔗糖、七叶苷、半乳糖、果糖、山梨醇、葡萄糖、懒氨酸、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、卫矛醇、甲基红实验、V-P试验、吲哚等分别配制生化鉴定管[5]。将培养皿中的典型菌种在超净工作台上接种至鉴定管中, 24h后观察结果。

1.2.6 药敏试验

使用药敏纸片呋喃妥因、链霉素、头孢氨苄、环丙沙星、妥布霉素、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、四环素、氯霉素、菌必治做两组药敏实验。以上药敏纸片均产自杭州天和生物试剂有限公司, 执行标准:WS/T125-1999。

1.2.7 注意事项

在操作中严格按照无菌操作, 使用明火、电时注意自身安全。实时记录试验数据。严格按照操作规程操作, 注意保护设备安全完整。

2 试验结果

2.1 粪样检测结果

在每一个便样的镜检中视野内大量存在革兰氏阴性、中等大小、两端钝圆的短杆菌, 呈单个或多个散在排列。从形态和革兰氏特性上判断在视野中的细菌为大肠杆菌[6] (图1) 。

2.2 接种培养结果

所有麦康凯培养基中均有均匀红色, 边缘整齐, 中心突起, 中等大小, 表面光滑湿润的散在菌落长出。其中1号培养皿有菌落200个, 2号有菌落185个, 3号有菌落50个, 4号有菌落130个, 5号又菌落70个, 6号有菌落150个, 7号有菌落134个, 8号有菌落124个, 9号有菌落125个, 10号有菌落113个 (图2) 。

2.3 生化实验结果

见表1。

注:“+”产酸;“—”阴性;“○+”产酸产气。

2.4 药敏试验结果

见表2。

注:敏感度按《抗菌药物药敏试验判断标准》抑菌圈大于等于20mm为极敏, 大于等于15mm小于20mm为高敏, 大于等于10mm小于15mm为中敏, 小于10mm为耐药。

3 讨论

3.1 生化分析

生化试验结果与动物传染病书上大肠杆菌基本特性相符[8], 而且与王云峰等[9]、孙善发等[10]的试验结果相一致。该菌能够分解麦芽糖、果糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、乳糖、山梨酸, 产酸产气, 不能产生硫化氢。因此从生化结果来看此菌种为大肠杆菌。

3.2 药敏分析

从药敏试验的结果来看, 该菌对头孢类, 和喹诺酮类[12]抗生素高度敏感, 但是林可霉素、四环素、庆大霉素的治疗效果不佳。这与有关的报道相符[11]。药敏试验说明该菌种已经对常用的药物产生耐药性。当前在犬细菌性腹泻的治疗中常常出现乱用抗生素, 或者使用了合适的抗生素却达不到良好治疗效果的现象。

3.3 犬病治疗中的误区

误区一:一泻就用止泻药。过早的服用止泻药, 或者是止泻药服用不当, 反而会延误病情, 甚至可以导致严重的并发症。误区二:先镇痛缓解腹泻, 感染性腹泻时可能会出现腹痛的现象, 一些犬主则习惯给犬服用654-2、颠茄片等止痛剂, 而且不按犬的的月龄, 随意使用。这种做法非常不安全, 因为止痛后, 不让肠蠕动, 会导致肠道蠕动功能瘫痪, 肠音消失或减弱, 容易引起肠黏膜脱落, 便血。误区三:一泻就吃消炎药, 许多人一看到犬腹泻, 就使用复方新诺明或诺氟沙星等抗生素。其实这种做法是不合适的。因腹泻有感染性和非感染性两类, 非感染性腹泻可由饮食不当、食物过敏、生活地域的改变、气候突变等原因引起, 此类腹泻使用抗生素治疗是无效的, 而应当服用一些助消化药或采用饮食疗法等。即便是感染性腹泻, 在选用抗生素时, 最好先做大便细菌培养, 明确致病菌种类, 再选用对细菌最敏感的抗生素进行治疗。切不可滥用抗生素。误区四:泻止就停药, 有的人腹泻常依症状服药, 即腹泻重时多服药, 腹泻轻时少服药, 稍有好转就停药。这样做很容易造成治疗不彻底而使腹泻复发, 或转为慢性腹泻, 给治疗带来很多困难[7]。正确的使用抗生素后, 就不能随便停用, 否则就容易使细菌产生耐药性。

3.4 试验犬与健康犬肠道菌比较

通过对引起犬细菌性腹泻的细菌进行分离鉴定得出的结果与健康犬的常规肠道菌进行对比发现。在正常的犬肠道内存在着许多种类的细菌其中包括需氧、兼性厌氧、厌氧细菌、真菌在内的45个菌属的约164种菌。涉及菌种包括链球菌、葡萄球菌、棒状杆菌、埃希菌、双歧杆菌、拟杆菌、乳杆菌、梭菌、念珠菌、青霉菌、地霉菌、毛霉菌与链格孢霉等[13], 通过对正常犬只的大便进行培养也证明了这点。而引起这次细菌性腹泻的细菌培养后主要得到的是大肠杆菌, 说明了这些犬的细菌性腹泻主要是由致病性大肠杆菌引起的。

4 结论

篇4：不同来源石油降解细菌的筛选鉴定

【摘 要】从江苏油田的原油和四种不同来源的土壤中，用三种不同的培养液筛选得到41株细菌。对具有较强降解能力细菌的其中8株菌进行测序鉴定，初步确定属于芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、食碱杆菌属及无色杆菌属。

【关键词】石油；降解；细菌

石油及其加工品进入土壤，造成土壤的石油污染。微生物修复具有处理效果好，污染物残留量低，不产生二次污染，对环境影响很小，能够保持或改善植物生长的土壤环境等优点[1]。向污染土壤中投加环境适应性强、降解效能高的菌种或菌群是提高石油类污染物降解效率的重要手段[2]。

1.材料与方法

1.1菌种来源

（1）土样：江苏真武石油基地。①132#磕头机（久置未用）旁表层土；②185#磕头机（长期使用）旁表层土；③磕头机附近草地草根土；④计量站旁表层油污土。

（2）原油：江苏真武石油基地。

1.2富集培养基

（1）无机盐培养液（g/L）：NaNO32，K2HPO41，K2HPO4·3H2O0.5，NaCl0.5，MgSO4·7H2O0.1，CaCl20.01，FeSO4·7H2O0.01PH=7，石油烃（原油：柴油体积比1：4）1%

（2）牛肉膏蛋白胨培养液（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，PH=7，石油烃0.5%

（3）牛肉膏蛋白胨培养液，石油烃0.5%，表面活性剂50mg/L

1.3石油中细菌的培养分离

牛肉膏蛋白胨培养基冷却后，加入1%的原油混匀，倒平板。恒温培养箱中30℃静置培养。待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，划线纯化，将纯化菌株于试管斜面培养后于冰箱4℃保存。三个重复。

1.4土壤中石油烃降解菌的筛选

称取10g土样加入到装有100mL富集培养液的三角瓶中。30℃振荡培养7天。静置30min，取10mL上清夜转接入新鲜培养液中。重复上述步骤连续富集培养5次。

富集培养后，取菌液1mL梯度稀释成10-6、10-7、10-8，取三种不同稀释度菌液0.1mL涂布于分离培养基平板上，28℃恒温培养；待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，划线纯化，将纯化菌株于试管斜面培养后于冰箱4℃保存。三个重复。

1.5分离菌株的石油烃降解率测定

将所得菌株制成菌悬液（1.1～1.4×108个/ml），取1ml转接入10ml加了1%石油烃的无机盐培养液中，28℃摇床培养7d后，用重量法[3，4]测定降解率。以不接菌的培养基作对照。

1.6高效石油降解菌鉴定

1.6.1菌株DNA提取

选取降解率较高（大于40%）的纯菌株，30℃振荡培养过夜。取1ml培养液到Eppendorf管中，离心，8000r/min，5min，弃去上清液，倒扣Eppendorf管在干滤纸上，空干溶液。将菌体重新悬浮于50μL 超纯水，置旋涡混合器上旋转混匀3s。将Eppendorf管放在沸水浴中煮10min。取出Eppendorf管冰浴10min。如此反复冻融三次，冷却后迅速离心，12000r/min 8min。取上清液，-20℃保存备用 。

1.6.2菌株16SrDNA的PCR扩增

以DNA为模板，引物27F：5`-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3`和1492R：5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`；TACGACTT-3；总反应体系为50μL，10×Buffer 5μL，25mmol/L MgCl24μL，2.5mmol/LdNTP 4μL，反向引物与正向引物各1μL，Taq酶0.25μL （5U/μL），模板DNA 2.5μL，ddH2O补足至50μL；PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃继续延伸10min，4℃保存。

1.6.3菌株测序

扩增成功后，产物送上海生物工程有限公司进行测序。测序后，用Sequence Scanner v1.0软件进行序列分析，将有效序列到NCBI用Blast进行对比。

2.结果与分析

2.1细菌分离结果

从原油和不同培养时间土壤样品中总筛选到41株细菌，其中石油中筛选出2株，土壤中39株。

2.2降解率测定结果

对筛选得到的41株细菌，测定其对石油烃的降解率，降解率最低1%，降解率高于40%的有12株，菌株编号为5、10、13、14、17、21、23、28、47、48、49、51，降解率分别为54.4%、61.8%、63.2%、69.5%、57.4%、47.9%、44.1%、45.6%、77.9%、63.2%、76.5%，其中5#菌来源于原油。

2.3石油降解菌株的鉴定

将降解率大于40%的12株细菌送上海生物工程公司测序，其中21、47、48、49这4株菌扩增失败未测序。其余8株16SrDNA序列测定结果用SequenceScannerv1.0软件进行序列分析与GenBank中已发表的16SrDNA序列进行同源性比较，初步鉴定5#属于芽孢杆菌属（Lysinibacillussp.），10#属于短波单胞菌属（Brevundimonassp.），13#、17#、23#、28#属于假单胞菌属（Pseudomonassp.），14#属于食碱杆菌属（Alcanivoraxsp.），51#属于无色杆菌属（Achromobactersp.）。

3.结论

目前研究报道，能以烃类为唯一碳源和能源生长的微生物在自然界分布广泛，约有70个属（其中细菌28个属，真菌30个属），200多个种[5]。本研究从江苏扬州真武石油污染土壤中分离得到41株能利用石油的细菌，为石油污染土壤的微生物修复提供了新菌种资源；同时对其中降解率较高菌株进行了初步鉴定，确定菌属。

【参考文献】

[1]Aatry AR，Euis GM.Bioremediation：An effective remedied alternative for petroleum hydrocarbon contaminated soil[J].Environ.Prog，1992，11：312-318.

[2]袁红莉，杨金水，王占生.降解石油微生物菌种的筛选及降解特性[J].中国环境科学，2003，23（2）：157-161.

[3]谢丹平，尹华，彭辉，等.混合菌对石油的降解[J].应用与环境生物学报，2004，10（2）：210-214.

[4]污染源统一检测分析方法编写组.污染源统一检测分析方法（废水部分）[M].技术标准出版社，1983，135-136.