改良CTAB法

改良CTAB法（精选三篇）

改良CTAB法 篇1

1 材料和方法

1.1 试剂和药品

液氮;2×CTAB提取缓冲液(表1):5 mol/L Na Cl,0.5 mol/L EDTA(p H值8.0),1 mol/L Tris-HCl(p H值8.0),β-巯基乙醇;氯仿/异戊醇(体积比为24∶1);无水乙醇;70%乙醇;双蒸水(dd H2O)。药品均为分析纯。

注:2×CTAB提取缓站液用H2O定容,最终总体积为100 m L,最终各试剂在此缓冲液中的浓度如下:CTAB,2%;5 mol/L Na Cl,1.4 mol/L;0.5 mol/L EDTA,20 mmol/L;1 mol/L Tris-HCl,100 mmol/L;β-巯基乙醇,2%。

1.2 仪器设备

低温离心机、恒温水浴锅、研钵、微量加样器等。

1.3 材料来源

以鸢尾(Iris tectorum)为原材料,其采于西北大学校园。

1.4 操作步骤

1.4.1 准备工作。

具体如下:(1)将水浴锅温度升至65℃;(2)将CTAB提取缓冲液置于水浴锅中预热;(3)在-20℃冰箱中预冷无水乙醇;(4)在4℃冰箱中预冷70%乙醇。

1.4.2 操作要点。

具体如下:(1)称取0.2 g幼嫩叶片置于灭菌干燥钵中,加入约30 m L液氮,轻轻捣碎叶片。等液氮即将挥发完时,快速研磨至粉状(越细越好),把粉末转移至有标号的2 m L Eppendorf管中。(2)向管中加入800μL 65℃预热的CTAB提取液。(3)将Eppendorf管置于65℃水浴锅中,保温50 min,每隔5 min用手轻微颠倒混匀1次。(4)取出样品管待冷至室温后,加入700μL氯仿/异戊醇(24∶1),来回颠倒混匀10 min,动作应轻柔。11 000 r/min室温离心6 min分层。(5)用剪去端部约0.8 cm的1 m L吸头将上清液转移至另一2 m L Eppendorf管中,重复步骤(4)。(6)用剪去端部的1 m L吸头转移上清液500~600μL至一1.5 m L Eppendorf管中。(7)向管中加入2倍体积的预冷无水乙醇约1 000μL,轻轻上下摇动样品管,DNA将从溶液中析出。如样品中DNA含量较少,会观察到管中含有白色悬浮的DNA颗粒;如样品中DNA含量较高,则可观察到白色絮丝状的DNA悬浮于溶液中。(8)将样品管置于低温离心机中12 000 r/min离心10 min,倒上清液,用预冷的70%乙醇400μL清洗DNA沉淀,室温放置5 min。(9)倒上清液,再加70%乙醇400μL。静置5 min后,在室温下干燥。(10)干燥后加入100μL双蒸水或0.1×TE缓冲液,放在4℃冰箱中保存(-20℃长期保存)。

2 结果与分析

2.1 用紫外分光光度计检测DNA含量

分别采用李宇伟等[1]、杜欣[2]、笔者的CTAB法提取DNA,260/280 OD比值分别在3.34~4.71、2.58~3.92、2.15~2.38。260/230 OD比值分别为1.11~1.64、1.30~1.42、1.60~1.64。表明笔者的方法所提DNA中RNA、蛋白等杂质较少。一般来讲,RNA不影响DNA的特性分析,在提取获得的DNA样品管中加入2μL RNase,即可除去RNA。

2.2 用改进方法提取DNA的电泳图样

鸢尾DNA提取液电泳结果如图1所示,7~9在高分子量区的DNA电泳条带最清晰,最整齐均匀,质量较好。

注:M为分子量标准;1~3为李宇伟等[1]的CTAB法提取DNA;4~6为杜欣的CTAB法提取DNA;7~9为改进后的CTAB法提取DNA。

2.3 以改进方法提取的DNA为模板进行PCR扩增

由图2可以看出,该法获得的鸢尾DNA可以完全满足PCR扩增的要求。

3 讨论

鸢尾叶片含多酚、蛋白质、脂类、多糖和色素等不利于DNA提取的物质,利用常规CTAB法难以获得高质量的DNA。李宇伟等[1]的CTAB法在65℃水浴时间是30~60 min,杜欣的CTAB法水浴时间是30 min。但通过试验发现,水浴30 min并不能完全破碎细胞膜和释放DNA。适当延长水浴时间如增至50 min,可使细胞膜裂解较完全,从而释放出更多DNA。李宇伟等[1]采用酚、氯仿多次抽提来除去蛋白质、色素等杂质,但试验表明抽提2次即可,因为抽提次数的重复并不一定改善DNA的纯度,有时反而增加负面作用[5]。杜欣采用氯仿/异戊醇对样品抽提的时间为5 min,而试验发现适当延长氯仿/异戊醇和提取液的接触时间,可减少蛋白质等杂质的干扰,该结果也验证了肖婷婷等[3]的观点。肖婷婷等[3]用CTAB法提取鸢尾DNA时加入异丙醇后置-20℃过夜,李宇伟等[1]加入无水乙醇后在-20℃静置2 h,而试验表明这一步骤并不是必须的,通过上下摇动样品管,使DNA从溶液中析出,也可以达到相同的效果。该文论述的提取方法对前人的CTAB法进行了优化,具有简便、快速、经济、纯度高、蛋白质和色素污染少等优点,可用于RAPD、ISSR、SSR等以PCR扩增为基础的试验需要。

摘要：鸢尾属植物中酚类、多糖含量较高,DNA提取较为困难。在前人工作基础上,改进了提取植物DNA的CTAB方法,通过延长水浴时间、氯仿/异戊醇(24∶1)2次抽提、适当延长氯仿/异戊醇与提取液接触时间等一系列改进,简化了提取步骤,大大缩短了提取时间。所提取的DNA纯度高,可满足以PCR扩增为基础的试验需要。

关键词：鸢尾属,DNA提取,改良CTAB法,PCR

参考文献

[1]李宇伟,王文静,连瑞丽.RAPD法构建鸢尾种质资源的DNA指纹图谱[J].河南农业科学,2008(8):112-115.

[2]杜欣.利用ISSR和RAPD分子标记对新疆喜盐鸢尾居群遗传多样性的研究[D].乌鲁木齐:新疆农业大学,2008:12-13.

[3]肖婷婷,朱艳,叶波平,等.鸢尾属药用植物总DNA提取方法的比较研究[J].中国野生植物资源,2010,29(3):46-50.

[4]易庆平,罗正荣,张青林.植物总基因组DNA提取纯化方法综述[J].安徽农业科学,2007,35(25):7789-7791.

改良法矫正重度乳头内陷 篇2

乳头内陷是一种常见的乳房畸形，其内陷的程度因人而异，乳头内陷局部难以清洗，易存积污垢，继发感染，引起　炎症，妨碍哺乳，轻度的原发性乳头内陷可实行保守治疗。轻度的表现为：不同程度的乳头退缩，用手挤压可使乳头突出于乳晕表面，此种可用吸乳头负压吸引和手法牵引。重度的表现为乳头完全淹没于乳晕表面无法被挤出，常呈反向生长，且无明显的乳头颈部，影响美观。重度需要通过手术来矫正，乳头内陷可见于单侧或双侧，通常炎症表现为：局部疼痛，奇痒等症状，给患者的心里带来负担，严重影响工作和生活，患者要求矫正治疗［1］。我科自2004年至2011年共收治单侧或双侧重度乳头内陷患者37例，通过乳晕新月瓣+乳腺旋转瓣+荷包缝合矫正治疗［2］，取得了很好的效果。

1临床资料

本组37例，其乳头单侧或双侧，均为重度乳头内陷。年龄15-27岁。其中30例为已婚妇女，因母乳障碍来就诊，8例未婚，自觉乳头部不适前来就诊。10例为单侧，27例为双侧。

2手术方法

全部采用乳晕新月形瓣+乳腺旋转瓣+内荷包法矫正术治疗。患者仰卧位，常规消毒铺巾，用盐酸利多卡因5ml+布比卡因5ml及肾上腺素做局部侵润麻醉，（生理盐水5ml稀释），做一贯穿乳头的牵引线，将内陷的乳头牵出体表，根据乳头内陷程度及乳头大小，在乳晕的上，内下象限设计多个新月形乳晕皮瓣，在这个方位设计的切口可较少损伤乳头；切开乳头下边缘，分离及切断乳腺管间的纤维束，检验乳头内陷矫正情况，有无彻底切断粘连的纤维束，如不理想，可切断部分乳腺管及大部分乳腺管；再在乳头上、下方设计乳腺组织旋转瓣，以使乳头下方的空隙被充分填充。在乳头颈部做一荷包缝合，以固定旋转的乳腺组织瓣，最后将乳晕缝合于乳头上下缘的切口内。术后，乳头基部压紧包扎，以防乳头回缩。

3结果

经采用此术士矫正后，所偶病例乳腺矫正效果佳，乳头乳晕血运良好，感觉正常，外形满意，瘢痕不明显，经随访1-2年，除8例失去联系外，余29例均未复发。其中8例未婚者，5例均已结婚并哺乳。

4典型病例

患者，女27岁，已婚生育一女，双侧重度乳头内陷，乳头完全无法用手挤出乳晕表面，行此手术方法矫正后，乳头内陷得以完全矫正，随访2年，未见复发。见照片。

5讨论

乳头内陷的一般原因是皮肤，皮下组织下陷，乳头平滑肌发育不良，乳腺管缩短，乳头下纤维肌肉减少，组织空虚，部分组织纤维化挛缩，乳腺管短缩和组织纤维化挛缩是引起重度乳头内陷的主要原因［3］.在行乳头内陷矫正术时，不可避免的要对乳头进行牵拉，松解基部并在基部采取紧缩措施。如果松解过多，紧缩过度，易造成乳头缺血，故操作时松解及紧缩应适当，术后多注意观察乳头血运，以便及时处理。

乳头内陷手术矫正方法较多常见的有"四个矩形瓣法"，"荷包缝合法"，等。这些手术方法对于一般的轻度乳头内陷矫治效果好；而对于重度乳头内陷，术后易复发或术后有感觉障碍。手术采用乳晕新月形瓣+乳腺旋转瓣的方式，解决了短缩纤维牵拉及乳头下支撑组织少的问题，将原新月形切除的皮下组织部分纳入乳头颈部，填充了乳头下空隙，增加了支撑的组织量，重塑了新的乳头颈，使术后乳头形态更佳，并减少了复发［4］。

由于乳头内陷的患者，局部情况困难，来就诊时常有局部慢性炎症或乳头表面皮鼓糜烂，应及早积极治疗，待上述症状控制后再实行手术。

参考文献

［1］　乔先明，乳头内陷的治疗//乔先明，时尚美容整形术，北京：学苑出版社、2009：251-253、

［2］刘文阁、王积恩，乳头内陷矫正术//刘文阁、实用美容整形外科手术学、北京、学苑出版社、2004：550

［3］周虹，谭谦，吴杰等，乳晕双菱形真皮瓣交叉填支撑法矫正乳头内陷，中华医学美学美容杂志，2001年、17（4）：263-265.

改良CTAB法 篇3

1 材料与方法

1.1 实验用材

发根农杆菌R1000诱导的红豆杉毛状根。

1.2 试剂与仪器

CTAB、Tris、EDTA、NaCl、PVP、RNaseA、β-巯基乙醇、氯仿∶异戊醇 (24∶1) 、无水乙醇、琼脂糖等, 所用试剂均为分析纯。PCR引物由上海生工合成。9700基因扩增仪, 美国ABI;DU530紫外分光光度计, 美国Beckman;电泳仪, 北京六一;GDS-8000PC凝胶图像分析仪, 美国UVP。

1.3 方法

(1) 改良CTAB法提取红豆杉毛状根基因组DNA:取新鲜红豆杉毛状根0.1～0.2g, 液氮研成粉末, 移入600μL CTAB-free缓冲液的2mL离心管中, 振荡混合后置于冰上10min。4℃8 000rpm离心5min, 弃上清, 加入65℃预热的700μL CTAB提取缓冲液和100μL 20%PVP, 65℃水浴30min。加入300μL无水乙醇, 再加入700μL的氯仿∶异戊醇 (24∶1) , 12 000rpm 4℃离心10min。取上清重复一次。取上清, 加入1/10体积的2.5mol/L醋酸钠和2倍体积的-20℃无水乙醇, 沉淀20min。4℃12 000rpm离心10min, 弃上清;70%乙醇洗涤沉淀2次。加入CTAB提取缓冲液调至400μL, 65℃水浴10min, 冷却后再加入等体积的氯仿∶异戊醇 (24∶1) , 4℃12 000rpm离心10min。取上清, 加入1/10体积2.5mol/L醋酸钠和2倍体积的-20℃无水乙醇, 沉淀20min, 4℃12 000rpm离心10min, 弃上清。70%乙醇洗涤沉淀2次, 风干。加入100μL TE溶液和2μL RNase后于37℃恒温水浴槽中消化RNA 2h。溶于30μL ddH2O中置于-20℃备用。

(2) 总DNA质量检测:运用紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测。

(3) PCR反应:以总DNA为模板, 核基因组ITS通用引物ITS4、ITS5 (White, 1990) 为引物进行PCR:2μL 10X PCR buffer, 2μL dNTP, 上、下游引物各1μL, 1μL模板DNA, 0.1μL rTaq酶, 12.9μL ddH2O。程序:94℃预变性4min, 94℃变性1min, 50℃退火1.5min, 72℃延伸2min, 35个循环, 72℃延伸8min,

(4) 电泳:行1%琼脂糖凝胶电泳, EB避光染色30min, 凝胶成像分析仪分析。

2 结果

(1) DNA样品质量:紫外检测显示A260/A280为1.91。

(2) 琼脂糖凝胶电泳:改进CTAB法提取的DNA较完整, 见图1。

3 讨论

紫杉醇是从红豆杉树皮中分离的一种二萜类化合物, 通过促进微管蛋白的不可逆聚合并使其稳定化而阻断癌细胞的有丝分裂和防止诱导细胞凋亡, 紫杉醇具有天然的抗癌功效, 能有效治疗卵巢癌和乳腺癌, 对肺癌、大肠癌、恶性黑色素瘤也有一定作用。此外, 还可用于治疗风湿性关节炎, 在医疗器械上也有应用。

紫杉醇在红豆杉树皮中的含量极低, 造成了原料药供不应求的矛盾, 必须寻求多种途径获得紫杉醇。利用发根农杆菌诱导植物细胞产生毛状根技术是20世纪80年代发展起来的植物基因工程技术, 在植物代谢物生产上显示出了巨大的应用潜力[1]。之后技术不断得到改进和完善[2]。毛状根培养系统在生物量的增加、有效成分的积累以及生产稳定性方面, 显示出独特优越性。

通过发根农杆菌诱导的方法生成红豆杉毛状根, 从中提取紫杉醇是目前我实验室正在研究的获取紫杉醇的方法。获得高质量的毛状根DNA对后续研究非常重要。红豆杉富含蛋白、多糖、酚类化合物和多种次生代谢物, 传统提取植物DNA的方法, 如Zigenhagen法[3]、SDS法[4]和CTAB法[5]等, 提取效果不佳, 所得DNA多糖混杂严重且得率较低。采用改良CTAB法提取红豆杉毛状根DNA, CTAB可以与核酸形成复合物, 复合物在低盐溶液中因溶解度的降低而沉淀, 在高盐溶液中又可解离, 从而使DNA和多糖分开, 大大降低了多糖的污染。缓冲液中所含的β-巯基乙醇可有效地阻止酚类物质氧化、防止褐变。加入RNase孵育又很好地清除了RNA污染。因此, 经过改良CTAB法提取红豆杉毛状根DNA, 所得DNA质量较好, 纯度较高, 比较符合后续实验对DNA纯度要求较高的需要。

参考文献

[1]FU C X, ZHAO D X, XUE X F, et al.Transformation of Sau-ssurea involucrate by Agrobacter iumrhizogenes:Hairy rootinduction and syringin production[J].Process Biochem., 2005, 40:3789-3794.

[2]杨慧洁, 杨世海.发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究[J].生物技术通报, 2009 (1) :16-21.

[3]应站明, 李媛.改良Zigenhagen法提取南方红豆杉总DNA[J].萍乡高等专科学校学报, 2007, 3 (3) :64-67.

[4]MATASYOH LG, WACHIRA FN, KINYUA MG, et al.Leaf storage conditions and genomic DNA isolation efficiencyin ocimum gratissimum from Kenya[J].Afr J Biotechnol, 2008, 7 (5) :557-564.