HPLC法测定凹叶景天中槲皮素和异鼠李素含量

HPLC法测定凹叶景天中槲皮素和异鼠李素含量（通用3篇）

篇1：HPLC法测定凹叶景天中槲皮素和异鼠李素含量

HPLC法测定凹叶景天中槲皮素和异鼠李素含量

采用高效液相色谱(HPLC)法测定了凹叶景天中槲皮素和异鼠李素含量.采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,以乙腈-水-磷酸(43:57:1)为流动相,流速为1.0 mL・min-1,检测波长为360 nm.得到槲皮素回归方程为y=74197x+40608, R2=0.9998,槲皮素在3.6～18.0 μg・mL-1范围内线性关系良好,平均加样回收率为100.65%,RSD=2.02%;异鼠李素回归方程为y=285344x+5535.1,R2=0.9998,异鼠李素在1.06～5.30 μg・mL-1范围内线性关系良好,平均加样回收率为101.99%, RSD=4.95%.该方法简便、高效、准确度较高,结果令人满意,为制定凹叶景天的质量标准及指纹图谱的研究提供了依据.

作 者：吕飞 翁德会 吴士筠 干信 LU Fei WENG De-hui WU Shi-jun GAN Xin 作者单位：中南民族大学工商学院环境与生命科学系,湖北,武汉,430065刊 名：化学与生物工程 ISTIC英文刊名：CHEMISTRY & BIOENGINEERING年，卷(期)：26(8)分类号：O657.72关键词：凹叶景天 高效液相色谱 槲皮素 异鼠李素

篇2：HPLC法测定凹叶景天中槲皮素和异鼠李素含量

沙棘黄酮是从沙棘果实或干燥的沙棘果皮渣、叶中提取的有效成份, 对心脑血管系统、免疫系统、呼吸系统疾病都具有良好的治疗效果[2]。沙棘黄酮中含量较高的黄酮苷元有槲皮素、山柰素和异鼠李素, 本实验拟采用HPLC法对收集到的国内4个厂家生产的7个批次的沙棘黄酮粉中这三种成分的含量进行测定, 以便对当前市场上沙棘黄酮制品原料的品质状况有个初步的了解。

1 仪器与试药

岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪, 超声波清洗器 (昆山) , 290SCS电子天平 (瑞士PRECI-SA) , HH-4恒温水浴锅 (常州国华) , SHB-Ⅲ循环水式真空泵 (郑州长城) , 优普超纯水机 (成都超纯科技) 。

槲皮素对照品 (批号:10081-200406, 含量测定用, 97.30%) 、山柰素对照品 (批号:110861-200808, 含量测定用, 95.90%) 、异鼠李素对照品 (批号:110860-200608, 含量测定用, 100%) 均由中国药品生物制品检定所提供;甲醇 (分析纯、色谱纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司) 、盐酸 (分析纯, 天津市大茂化学试剂厂) , 水为去离子水。

沙棘黄酮粉样品由山西、内蒙古等地的4家公司提供, 一共7个批次, 依次编号为1~7号。

2 色谱条件

色谱柱为Kromasil C18 (4.6mm×250mm, 5μm) , 以甲醇为流动相A, 以0.4%磷酸水溶液为流动相B, 按表1中的规定进行梯度洗脱, 流速:1.0m L/min, 检测波长为370nm, 柱温25℃。对照品及样品HPLC图谱见图1。

3 对照品溶液的配制及线性关系考察

3.1 对照品溶液配制

称取槲皮素对照品约3mg, 精密称定, 为3.03mg, 置25m L量瓶中, 加入甲醇至刻度, 摇匀, 精密量取2.00m L置10m L量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 即得。

称取山柰素对照品约25mg, 精密称定, 为24.42mg, 置50m L量瓶中, 加入甲醇至刻度, 摇匀, 精密量取1.00m L置100m L量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 即得。

称取异鼠李素对照品约2mg, 精密称定, 为1.99mg, 置25m L量瓶中, 加入甲醇至刻度, 摇匀, 即得。

3.2线性关系考察

分别精密吸取槲皮素对照品、山柰素对照品和异鼠李素对照品适量, 按照上述色谱条件进样测定, 以峰面积为纵坐标, 以进样量为横坐标, 进行线性回归, 得回归方程如下,

槲皮素:Y=5015589.72X-15463.13, r=1,

线性范围0~0.4718μg;

山柰素:Y=3907962.95X-3238.16, r=1,

线性范围0~0.1124μg;

异鼠李素:Y=4543524.58X-25446.38, r=1,

线性范围0~1.5920μg。

4 供试品溶液制备

分别称取各批次沙棘黄酮粉约0.2g, 精密称定, 加入甲醇60m L, 超声提取1h, 滤过, 滤液转移至100m L量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 精密量取25.00m L置烧瓶中, 加入3.5m L稀盐酸, 75℃水解1h, 放冷, 转移至50m L量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 作为供试品溶液[3]。

5 方法学研究

5.1 精密度

取异鼠李素对照品溶液按上述色谱条件连续进样6次, 进样量5μl, 记录峰面积, 计算峰面积RSD为0.15%, 表明仪器精密度良好。

5.2 稳定性

称取1号沙棘黄酮粉约0.2g, 按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液, 分别在0h、3h、6h、12h、18h进样, 考察供试品溶液的稳定性。结果显示供试品溶液在18h内基本稳定。

5.3 重复性

称取1号沙棘黄酮粉5份, 按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液, 进样测定, 记录峰面积, 计算三种指标成分的保留率, 考察供试品溶液制备方法的重现性。结果显示, 指标成分的保留率数据RSD均低于1.5%, 表明该方法重现性良好。

5.4 加样回收率

称取2号沙棘黄酮粉6份, 每份约0.1g, 置锥形瓶中, 精密称定, 分别加入前期配制的槲皮素对照品溶液 (3.03mg→25m L) 1m L、山柰素对照品溶液 (24.42mg→50m L) 2m L、异鼠李素对照品溶液 (1.99mg→25m L) 3m L, 加入甲醇60m L, 按上述供试品溶液制备方法制备供试品, 进样测定, 三种成分的平均回收率分别为101.39%、101.11%、103.66%, RSD分别为2.49%、2.93%、1.72%, 均低于3%, 表明本实验方法稳定可行。

6 含量测定

按照上述实验方法, 对收集到的4家公司生产的7份沙棘黄酮粉样品进行测定, 数据结果见表2。

由表2中的数据可以看出, 槲皮素含量最低的是6号样品, 山柰素含量最低的是4号样品, 异鼠李素含量最低的是6号样品。2号、3号样品为同一家公司产品, 4~6号为同一家公司产品。可以看出, 4家公司的样品中三种指标成分的含量差别很大, 即便是同一家公司不同批次的产品, 含量差别也很大。

7 讨论

上述各厂家生产的沙棘黄酮粉中槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量差异较大, 原因可能是多方面的。目前, 国内厂家基本上都是以紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量来进行规格标示的, 本实验测定的这三种成分的含量并不能代表总黄酮的含量, 因此在含量数据上与厂家标示不符是正常的。收集样品涉及到的4个厂家, 其主营方向不同, 提取制备沙棘黄酮原料的生产工艺可能存在差异, 加上沙棘原料本身也存在地域性差异, 多种因素叠加, 可能就出现了总黄酮含量较高, 而异鼠李素、槲皮素等成分含量偏低的情况。而同一厂家生产的沙棘黄酮含量差异较大, 则说明国内相关厂家在原料、工艺等方面距规范化、标准化生产还有很大的差距, 以此中间体作为原料生产的保健食品质量稳定性难以得到保证。

摘要：建立同时测定沙棘黄酮粉中槲皮素、山柰素和异鼠李素三种成分含量的HPLC方法, 对收集到的7个批次沙棘黄酮粉样品进行质量分析。采用Kromasil C18 (4.6mm×250mm, 5μm) 色谱柱为固定相, 甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相, 进行梯度洗脱, 流速1.0mL/min, 检测波长为370nm, 柱温25℃。结果显示:该方法稳定可靠, 重复性强。收集到的7个批次的沙棘黄酮粉样品中三种成分的含量差异较大, 即便是同一厂家不同批次的产品差异也较大。

关键词：沙棘黄酮粉,含量测定,HPLC

参考文献

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篇3：HPLC法测定凹叶景天中槲皮素和异鼠李素含量

关键词：沙棘果肉黄酮,沙棘籽黄酮,槲皮素,山奈酚,异鼠李素

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)属胡颓子科沙棘属植物,又名醋柳,是我国蒙医、藏医传统习用药材,蒙药名为“其察日嘎纳”,藏药名为“达普”。1977年首次被卫生部收载于《中华人民共和国药典》,之后又被颁布为药食两用品种,具有健脾消食、止咳祛痰、活血散淤的功效[1]。沙棘黄酮是从沙棘的果实或叶中提取的总黄酮,其主要成分是异鼠李素、槲皮素和山奈酚及三者的苷类。黄酮是沙棘重要的活性成分之一,在沙棘的药用开发中占有重要地位。近年来的相关药理研究证实,沙棘黄酮具有抗心肌缺血、抗心律失常、提高耐缺氧能力、抑制血小板聚集、抗溃疡、抗炎、抗氧化、抗辐射和增强免疫力等功效[2,3]。随着沙棘产业化开发的不断深入,沙棘各部位的应用研究亦不断深化。沙棘种子提取出油脂后,从籽渣提取的黄酮类化合物即为沙棘籽黄酮,而从沙棘果肉(不含果皮)提取的黄酮本文称之为沙棘果肉黄酮。目前制药行业应用的沙棘黄酮多为果肉黄酮,而对籽黄酮的研究和应用尚较少。本文比较了沙棘果肉黄酮和沙棘籽黄酮中异鼠李素、槲皮素和山奈酚3种黄酮苷元的含量分布特点,以期为科学合理利用沙棘资源提供基础研究数据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪:日本岛津公司;TU-1901型双光束紫外可见光分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;METTLER AB153-S电子天平:瑞士METTLER公司;KH-250DB型数控超声波清洗器:昆山禾创超声仪器有限公司;ALH-6000-U艾科浦超纯水机:重庆颐洋企业发展有限公司。

1.2 药物与试剂

沙棘果肉黄酮(批号:201-140917)、沙棘籽黄酮(批号:202-140503):均由内蒙古宇航人药业公司提供;槲皮素对照品(批号:100081-201408)、异鼠李素对照品(批号:110860-201410):均购自中国食品药品检定研究院;山奈酚对照品(批号:0796-140428):购自北京中科仪友化工技术研究院;甲醇、磷酸为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取异鼠李素对照品适量,用甲醇超声溶解,转移至100 m L容量瓶中,用甲醇定容,摇匀,制得质量浓度为24.2 mg/L的异鼠李素对照品溶液。精密称取山奈酚对照品适量,用乙醇超声溶解,同法操作制得质量浓度为23.4 mg/L的山奈酚对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

取沙棘果肉黄酮约0.01 g,精密称定,加入甲醇60 m L,超声提取1 h,滤过,滤液转移至100 m L容量瓶中,甲醇定容,摇匀,作为沙棘果肉黄酮供试品溶液。取沙棘籽黄酮约0.05 g,精密称定,加入70%乙醇60 m L,超声提取1 h,滤过,滤液转移至100 m L容量瓶中,70%乙醇定容,摇匀,精密吸取25 m L置50 m L圆底烧瓶中,加入5 mol/L的盐酸溶液5 m L,80℃回流水解1 h[3],冷却,70%乙醇稀释至50 m L,作为沙棘籽黄酮供试品溶液。

2.1.3 检测波长的测定

取异鼠李素和山奈酚对照品溶液2.0 m L,各置于10 m L容量瓶中,分别用甲醇和乙醇定容,摇匀,以相应溶剂为空白对照,在200~500 nm波长范围内进行波谱扫描。另取沙棘果肉黄酮与沙棘籽黄酮供试品溶液1.0 m L,各置于10 m L容量瓶中,分别用甲醇和乙醇稀释至刻度,摇匀,同法进行波谱扫描。结果异鼠李素和山奈酚对照品分别在371 nm和367 nm处有最大吸收,沙棘果肉黄酮与沙棘籽黄酮分别在371 nm和366 nm处出现最大吸收。根据扫描结果,分别选择371 nm和367 nm作为沙棘果肉黄酮和沙棘籽黄酮中总黄酮含量测定的检测波长。

2.1.4 标准曲线的制备

取“2.1.1”项下异鼠李素对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 m L分别置于10 m L容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,以甲醇为空白对照,于371 nm波长处测定吸光度。同法操作,用乙醇作为稀释溶剂配制系列浓度山奈酚对照品溶液,以乙醇为空白对照,于367 nm波长处测定的吸光度。各自以异鼠李素和山奈酚质量浓度C(mg/L)为横坐标,相应吸光度A为纵坐标,进行线性回归,得如下回归方程:异鼠李素A=0.07094 C-0.0018,r=0.9997,线性范围2.42~12.10 mg/L;山奈酚A=0.06714C+0.0014,r=0.9998,线性范围2.34~11.70 mg/L。

2.1.5 精密度试验

取同一浓度的异鼠李素对照品溶液,以甲醇为空白对照,于371 nm波长处测定吸光度,重复测定6次;同法用山奈酚对照品溶液进行精密度试验,计算得异鼠李素和山奈酚的RSD分别为0.22%和0.35%,表明精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

按“2.1.2”项下方法制备沙棘果肉黄酮与沙棘籽黄酮供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h按“2.1.3”项下方法操作,于最大吸收波长处测定吸光度,计算得沙棘果肉黄酮和沙棘籽黄酮的RSD分别为1.35%和1.62%,表明2种供试品溶液在24 h内均稳定。

2.1.7 重复性试验

按“2.1.2”项下方法平行制备5份沙棘果肉黄酮与沙棘籽黄酮供试品溶液,按“2.1.3”项下方法操作,于最大吸收波长处测定吸光度,根据回归方程和稀释倍数计算样品中的总黄酮含量,结果沙棘果肉黄酮和沙棘籽黄酮的RSD分别为1.85%和2.09%,表明本方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验

取已知总黄酮含量的沙棘果肉黄酮样品3份,每份约0.005 g,精密称定,分别加入约等于样品中总黄酮含量的异鼠李素对照品,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.3”项下方法操作,在最大吸收波长处测定吸光度,计算加样回收率;同法操作,加入山奈酚对照品测定沙棘籽黄酮的加样回收率,结果见表1。

2.1.9 样品总黄酮含量测定

取沙棘果肉黄酮样品3份,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.3”项下方法操作,于371 nm波长处测定吸光度,计算得沙棘果肉黄酮样品中总黄酮平均含量为42.02%,RSD为1.35%(n=3)。取沙棘籽黄酮样品3份,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.3”项下方法操作,于367 nm波长处测定吸光度,计算得沙棘籽黄酮样品中总黄酮平均含量为15.84%,RSD为1.78%(n=3)。

2.2 槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250mm,5μm),流动相为甲醇-0.2%磷酸(50:50),流速1.0m L·min-1,检测波长370 nm,柱温为室温,进样量20μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取槲皮素对照品适量,用甲醇超声溶解,制成质量浓度为152.0 mg/L的槲皮素对照品溶液;同法制得质量浓度分别为192.5 mg/L和186.5mg/L的山奈酚和异鼠李素对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取沙棘果肉黄酮约0.05 g,精密称定,加入甲醇60 m L,超声提取1 h,滤过,滤液转移至100 m L容量瓶中,甲醇定容,摇匀,精密吸取25 m L置50 m L圆底烧瓶中,加入5 mol/L的盐酸溶液5 m L,80℃回流水解1 h,冷却,甲醇稀释至50 m L,作为沙棘果肉黄酮供试品溶液。取沙棘籽黄酮约0.2 g,精密称定,按“2.1.2”项下方法操作,得沙棘籽黄酮供试品溶液。

2.2.4 系统适用性试验

取“2.2.2”项下3种对照品溶液以一定体积比混合后用适量甲醇稀释,在“2.2.1”项色谱条件下进样,记录色谱图;另取适量“2.2.3”项下沙棘果肉黄酮和沙棘籽黄酮供试品溶液,在“2.2.1”项色谱条件下进样,记录色谱图,见图1。在本实验条件下,与各对照品对应的供试品溶液色谱峰的理论塔板数均不低于6 000,色谱峰的分离度均大于2.0。

图1 HPLC色谱图(1.槲皮素;2.山奈酚;3.异鼠李素)

2.2.5 标准曲线的制备

精密吸取“2.2.2”项下槲皮素对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 m L分别置于10 m L容量瓶中,甲醇定容,按“2.2.1”项下色谱条件进样,以质量浓度X(mg/L)为横坐标,以峰面积Y为纵坐标,进行线性回归;分别对“2.2.2”项下的山奈酚和异鼠李素对照品溶液同法操作进行测定,可得如下回归方程:槲皮素Y=88841X-28334,r=0.9998,线性范围3.04~48.64 mg/L;山奈酚Y=89058X-44068,r=0.9999,线性范围3.85~61.60 mg/L;异鼠李素Y=89491X-179218,r=0.9997,线性范围3.73~59.68 mg/L。

2.2.6 精密度试验

取“2.2.2”项下3种对照品溶液以一定体积比混合后用适量甲醇稀释,在“2.2.1”项色谱条件下重复进样6次,测得槲皮素、山奈酚、异鼠李素峰面积的RSD分别为1.20%、1.16%和1.24%,表明精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

取沙棘果肉黄酮的同一供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h按“2.2.1”项色谱条件进样测定3种黄酮苷元的峰面积,计算得槲皮素、山奈酚、异鼠李素的RSD分别为0.70%、1.58%和1.98%。同法测定沙棘籽黄酮供试品溶液的稳定性,计算得上述3种黄酮苷元的RSD分别为1.12%、0.55%和2.29%,表明2种供试品溶液在24 h内均稳定。

2.2.8 重复性试验

按“2.2.3”项下方法平行制备6份沙棘果肉黄酮供试品溶液,在“2.2.1”项色谱条件下进样测定3种黄酮苷元的峰面积,计算槲皮素、山奈酚、异鼠李素的RSD分别为2.04%、1.76%和1.69%。同法操作测定沙棘籽黄酮,计算上述3种黄酮苷元的RSD分别为2.22%、2.12%和1.83%,表明方法的重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验

取已知槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量的沙棘果肉黄酮样品3份,每份约0.02 g,精密称定,加入适量异鼠李素对照品和一定体积的“2.2.2”项下槲皮素和山奈酚对照品溶液,再按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,在“2.2.1”项色谱条件下进样测定,计算沙棘果肉黄酮中3种黄酮苷元的加样回收率;同法操作,测定沙棘籽黄酮的加样回收率,结果见表1。

2.2.10 样品中3种黄酮苷元含量的测定

取3份沙棘果肉黄酮样品,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定峰面积,计算槲皮素、山奈酚和异鼠李素的平均含量分别为9.03%、2.12%和22.74%,其RSD分别为1.78%、2.06%和1.86%。同法测定沙棘籽黄酮样品,计算上述3种黄酮苷元的平均含量分别为0.66%、4.99%和1.03%,其RSD分别为1.88%、1.56%和1.92%,结果见表2。

3 讨论

3.1沙棘中富含的异鼠李素和山奈酚并不与Na NO2-Al(NO3)3-Na OH试剂发生显色反应,在500 nm左右几乎无吸收,故不适合用比色法来测定[5]。沙棘果肉黄酮以异鼠李素为主,而沙棘籽黄酮则以山奈酚为主,故本实验分别以异鼠李素和山奈酚作为对照品采用紫外分光光度法测定了总黄酮含量[6,7]。本实验在总黄酮含量测定过程中,首先通过溶剂筛选实验确定,甲醇对沙棘果肉黄酮中的黄酮成分提取效果较好,而沙棘籽黄酮则以70%乙醇作为溶剂时的效果较好;其次通过水解前后效果对比试验得出,水解步骤对沙棘果肉黄酮的总黄酮含量测定值影响并不大,故供试品溶液未经水解直接进行测定,形成上述现象的原因可能是沙棘果肉黄酮中的黄酮类成分大多以苷元形式存在,故水解步骤对总黄酮含量的测定值并无显著影响。

3.2本研究对甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.4%磷酸、甲醇-0.2%醋酸等不同流动相进行了比较实验,结果表明,甲醇-0.2%磷酸作为流动相时,各成分分离度和峰形均较好。再通过流动相比例试验得出,当甲醇和0.2%磷酸的比例为50:50时,各峰分离度均大于2.0,理论塔板数按异鼠李素计算大于6 000,保留时间小于40 min。

3.3本实验结果表明,沙棘果肉黄酮以异鼠李素的含量最高,约占总黄酮的一半,3种黄酮苷元中以山奈酚的含量最少,仅占总黄酮的2.12%;而沙棘籽黄酮正相反,3种黄酮苷元中以山奈酚的含量最高,约占到总黄酮的三分之一。异鼠李素具有抗心肌缺氧、缺血,抗心律失常,抗氧化,降低血清胆固醇,抗肿瘤等药理作用[8],目前主要用于心脑血管疾病的治疗,而山奈酚具有防癌、抗癌、抗炎、防治糖尿病及免疫抑制等药理作用[9]。根据不同部位提取的沙棘黄酮组成的不同,具有针对性地进行产品开发将更有利于沙棘资源的合理利用。另外,沙棘果肉黄酮中槲皮素、山奈酚和异鼠李素3种黄酮苷元占总黄酮的80.66%,而在沙棘籽黄酮中仅占42.17%,说明除上述3种黄酮苷元外沙棘籽黄酮还具有较高含量的其他黄酮苷元,对此还应进行进一步研究。

参考文献

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