HPLC测定骨伤黄药散中姜黄素含量

骨伤黄药散由姜黄, 红花等五味中药组成, 具有活血化淤, 消肿止痛作用, 用于治疗跌打损伤, 骨折脱位的早期局部红肿青紫痛疼。属多年使用的医院制剂, 疗效显著, 广受患者欢迎。姜黄, 为方中君药, 姜黄素为姜黄主要有效成分, 具有抗感染、抗炎、抗凝等作用, 与本品功能主治一致;姜黄素的含量测定方法[1~5]有薄层扫描法、分光光度法、硼显色分光光度法, 荧光分光光度法, 高效液相色谱法。前4种方法采用在420nm波长测定黄色素的方法, 测定结果不稳定, 且受其他黄色素干扰, 与其相比HPLC测定方法简单、灵敏、重现性好。故本研究建立以PR-HPLC法测定姜黄素含量来控制该制剂质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-2010A型高效液相色谱仪, UV-VIS紫外检测器, CLASS-VP色谱工作站;超声波清洗器 (型号:KQ-100型昆山市超声波仪器有限公司) 。

1.2 试药

姜黄素对照品 (供含量测定用, 批号110823-200603) , 购自中国药品生物制品检定所;样品由本研究所制备 (批号090502, 090504090506) ;乙腈为色谱纯, 水为纯净水, 其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Akasil-C18 (250mm×4.6mm, 5μm) ;流动相:乙腈-4%冰醋酸溶液 (48:52) 为流动相;流速:1.0mL.min-1;柱温:30℃;检测波长为430nm。

2.2 实验溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备

A-对照品溶液;B-供试品溶液;C阴性对照溶液;1-姜黄素

取本品细粉约0.3g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇25m L, 称定重量, 超声提取30min, 放冷, 再称定重量, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 静置, 微孔滤膜 (0.4 5μm) 滤过, 作为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取已干燥至恒重的姜黄素对照品4.55mg置10mL量瓶中, 加甲醇溶解, 并稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品储备溶液 (0.455mg.mL-1) 。精密量取该储备液0.7mL, 置10mL的量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 配制成每1mL含0.0318mg的溶液, 作为对照品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除姜黄外的其它药材, 按制备工艺制成缺姜黄阴性样品, 并按2.2.1项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适应性实验

分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各5μL, 按2.1项下色谱条件进样, 记录色谱图。可见供试品溶液在与对照品溶液相应位置有吸收峰, 阴性对照溶液在姜黄素出峰位置无干扰, 见图1。

2.4 线性关系考察

取本品储备液 (0.455mg.mL-1) 1mL置10mL的量瓶中加甲醇稀释至刻度 (0.0455mg.m L-1) , 分别精密吸取该对照品1、2、3、4、5、6μL注入高效液色谱仪中, 依法测定, 以姜黄素对照品进样量X (μg) 为横坐标, 峰面积Y为纵坐标, 计算回归方程为:Y=7.7 8 6 9×1 0 6 X+2.4 7 4 7×1 0 4, R=0.9999, 说明在0.0455~0.273μg范围内, 线性关系良好。

2.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液 (0.03185mg.mL-1) 和供试品溶液各5μL, 注入HPLC仪中, 依法测定, 重复进样6次, 测定姜黄素峰面积, 结果对照品RSD=0.80% (n=6) , 供试品的RSD=0.76% (n=6) 。

2.6 稳定性实验

供试品溶液在配置后, 分别于0、2、4、8、1 6, 2 4 h进行测定。观察峰面积的变化, 结果表明峰面积在24h之内稳定, RSD=0.61%。

2.7 重现性实验

取同一批号5份, 精密称定, 按供试品溶液的制备方法操作, 精密吸取各供试品溶液5μL, 依法测定, 结果, 样品的RSD=1.73%。

2.8 回收率实验

采用加样回收试验, 取已知含量的样品6份, 精密称定, 每2份为1组, 每组分别加入姜黄素对照品溶液一定量。按供试品溶液的制备方法操作, 并依法测定姜黄素的含量, 结果见表1。

2.9 样品含量测定

取3批样品 (090502, 090504, 090506) , 分别按2.2.1项下处理, 吸取样品溶液和对照品溶液各5μL, 注入液相色谱仪, 测定, 结果3批样品中姜黄素含量分别为2.72mg.g-1, 2.62mg.g-1和2.60mg.g-1平均含量2.65mg.g-1。

3 讨论

(1) 提取方法选择参照相关文献[4~6]被测成分姜黄素的理化性质, 拟以甲醇为溶剂提取, 对提取方法 (回流法, 超声法) 、提取时间 (20、30、40min) 进行了比较。结果样品以甲醇为溶剂, 超声提取30min基本提取完全, 并简单易行; (2) 测定波长选择姜黄素对照品溶液用可见紫外分光光度计全波长扫描, 结果姜黄素最大吸收波长430nm, 故采用430nm作为HPLC检测波长。在该波长处测定不但灵密度高, 且避免了杂质的干扰。 (3) 药典[1]中姜黄素测定采用C8柱, 而一般实验室常备C18柱, 经比较2者测定结果差异性不大, 可互用。

摘要：目的 建立骨伤黄药散中姜黄素的含量测定方法。方法 HPLC法, AKasilC18柱 (4.6mm×250mm, 5μm) , 流动相:乙腈-4%冰醋酸水溶液 (48:52) , 检测波长430nm。结果 姜黄素线性范围为0.0455～0.273μg, 平均回收率为100.57%, RSD=1.99%。结论 方法简便、准确、专属性强, 为骨伤黄药散的质量控制提供了有效的方法。

关键词：骨伤黄药散,姜黄素,高效液相色谱法

参考文献

[1] 中国药典2005版[S].2005:186～456.

[2] 王青虎, 白玉霞.薄层比色法测定沙日嘎-4汤中姜黄素的含量[J].中国实验方剂学杂志, 1998, 4 (5) :12～13.

[3] 吴桂碧.薄层扫描法测定姜黄中姜黄素的含量[J].华西药学杂志, 1995, 10 (3) :172～174.

[4] 赵晓霞, 田丰, 胥云.RP-HPLC测定姜黄中姜黄素的含量[J].中国中药杂志, 2003, 28 (8) :782.

[5] 韩刚, 张义春, 刘士勇.姜黄中黄素素含量测定方法比较[J].西北药学杂志, 2005, 20 (1) :15.

[6] 陈晋红, 李为荣, 刘大为, 等.姜黄药材中有效成分含量测定[J].中药新药与临床药理, 2009, 20 (3) :253.