食管癌细胞（精选八篇）
食管癌细胞 篇1
本研究在体外实验中观察钒化钠对食管癌细胞系EC109的作用,研究钒化钠是否对食管癌细胞系EC109具有增殖抑制作用,并进一步揭示钒化钠抗肿瘤作用的分子机制,扩大其抗肿瘤谱,为钒化钠进一步发展成一种新型的抗肿瘤药物提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 药品 钒化钠购买于北京化学试剂公司,纯度为分析纯。MTT和RPMI1640培养基购自Gibco公司,胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司,二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠、丙烯酰胺等化学试剂购自Sigma公司,BCA蛋白分析试剂盒购自PIERCE公司。
1.2 细胞株 人食管癌细胞系EC109购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。食管癌细胞系EC109在37 ℃、饱和湿度及5 % CO2条件下,用培养瓶在含10 %胎牛血清、1×105 U/L青链霉素的RPMI1640培养液中传代培养。
1.3 生长抑制实验(MTT法) 常规培养人食管癌细胞系EC109细胞,将对数生长期的细胞调整细胞浓度为5×107/L,待培养24 h细胞贴壁生长后分为对照组和实验组,对照组加入RPMI-1640培养液,实验组加入用无血清培养基配制的终浓度分别为0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、50.0 μmol/L、100.0 μmol/L和200.0 μmol/L钒化钠试剂,每一浓度设6个复孔,分别于加药后培养4 h、12 h、24 h、48 h检测各组细胞增殖抑制的差异。
1.4 统计学处理 采用SPSS 11.0软件包对数据进行单因素方差分析,统计数据以均数±标准差(
2 结果
钒化钠对食管癌细胞株EC109的增殖抑制作用,MTT法检测钒化钠在0.1~200.0 μmol/L浓度范围内对EC109细胞增殖的影响。结果显示,用钒化钠处理EC109细胞4 h,各个药物作用组对细胞无抑制作用(P>0.05);用钒化钠处理EC109细胞12~48 h,在0.1~10.0 μmol/L浓度范围内对EC109细胞无抑制作用,药物作用组与对照组之间的OD值差异无统计学意义(P>0.05);但在50.0~200.0 μmol/L浓度范围内对EC109细胞的抑制作用呈剂量依赖效应关系和时间依赖效应关系,药物作用组与对照组之间的OD值相比差异有统计学意义(P<0.05);随药物作用时间的延长,药物浓度越高,其抑制作用越强。见表1。
*与对照组比较P<0.05,**与对照组比较P<0.01
3 讨论
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,寻找有效的化疗药物成为食管癌治疗领域研究的热点。钒化钠以其无致命不良反应而用于糖尿病病人的干预治疗[5],表明钒化钠作为临床治疗药物的潜在可能性。Bishayee等[6]报道了一系列钒制剂对动物模型系统的抗肿瘤活性。生长细胞对钒化钠的毒性作用更敏感,通过皮下注射,钒化钠很有效地抑制了小鼠肿瘤生长,抑制癌细胞生长增殖[7]。本研究利用MTT法,分析钒化钠对肿瘤细胞生长的抑制作用及其分子机制。为进一步将钒化钠研发成一种新的化疗药物提供理论基础。
MTT比色法是反映细胞增殖常用的方法。MTT能被活细胞线粒体中的琥珀酸还原酶还原为蓝紫色结晶,其490 nm的A值(MTT测定值)与活细胞的数目成正比。MTT法的测定结果表明高实验浓度(≥50 μmol/L)钒化钠对食管癌细胞株EC109细胞有明确的生长抑制作用,随药物作用时间的延长,药物浓度越高,其抑制作用越强。这一结果为钒化钠防治食管癌的临床应用奠定理论基础。由于细胞生长抑制是一个极其复杂、涉及多步骤、多因子参与的过程,故钒化钠抑制肿瘤细胞生长的详细机制仍需进一步研究。
参考文献
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食管癌细胞 篇2
关键词 原发性食管小细胞癌 根治切除
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.09.193
原发性食管小细胞癌(PESC)是食管癌中恶性程度最高的肿瘤，生长快、转移早，对化疗及放疗效果不佳，目前仍然没有统一的治疗标准。2001年7月～2011年10月通过手术方式治疗78例经胃镜诊断为食管小细胞癌的病例。现总结报告如下。
资料与方法
一般资料：78例经胃镜诊断为食管小细胞癌患者，男47例，女31例；年龄42～73岁，平均53.5岁；临床表现为进食哽咽感、胸骨后疼痛，1例为胃部不适。出现症状到初诊时间为1周～3个月。術前胃镜病理检查报告为食管小细胞癌，术前检查未见远处转移、无手术禁忌，有手术根治可能。
治疗方法：对于上述病例均行手术治疗。对于胸中上段食管癌行颈、右胸和腹正中三切口食管癌根治食管胃左颈部吻合术，对于胸下段食管癌行左开胸食管癌根治食管胃左颈部吻合术，术中均予以局部淋巴结清扫。
结果
78例患者术后有19例确诊为小细胞食管癌,余为鳞癌或腺癌。19例小细胞食管癌中3例合并鳞癌，合并腺癌2例，11例术后证实有局部淋巴结转移，全组无围术期死亡者。术后病理分期：Ⅰ期1例，ⅡA期7例，ⅡB期3例，Ⅲ期8例，Ⅳ期1例。对19例小细胞食管癌予以随访，其中术后6～15个月发生肝、肺转移3例；术后3～36个月发生颈部、纵隔和吻合口、残胃、局部复发11例。余5例3年内无复发或转移，未再随访。全组中位生存时间为14个月，有淋巴结转移者的中位生存时间为10个月，低于无淋巴结转移者。
讨论
原发食管小细胞癌恶性程度高，出现淋巴道、血道转移较早，而患者临床表现及影像学检查与一般食管鳞癌及腺癌患者并无区别，且小细胞癌分化程度较低、倍增较快。PESC治疗失败的主要原因为远处转移。本研究中78例术前通过胃镜活检诊断为小细胞食管癌的病例术后仅有19例术后证实为小细胞食管癌、余为鳞癌和腺癌，说明胃镜活检为小细胞食管癌的患者会有相当一部分假阳性。这与王卫杰［1］与王国范等［2］报告假阳性率相仿。考虑可能为在取材过程中细胞受到压榨或揉搓，使病理科不能很好地区分细胞形态、加上所取组织较少不能进行免疫组化检查而造成对小细胞食管癌的误诊。有部分胃镜活检诊断为小细胞食管癌的病例，术后证实为小细胞与鳞癌及小细胞与腺癌的混合型。
Brega-Massone等［3］对分别为Ⅰ期和Ⅱ期和Ⅲ期的3例原发性小细胞食管癌患者进行了食管癌根治颈部吻合术，术后Ⅰ期Ⅱ期患者生存时间均超过了10年，对Ⅲ期患者术后综合了化疗治疗存活时间亦超过了2年。Nagahama等［4］对1例原发食管小细胞癌肝转移患者进行了手术治疗和术后顺铂联合5-Fu的灌注化疗后，其生存时间亦超过了4年。国内李澄涛等［5］报告对25例食管小细胞癌行手术治疗认为，根治性切除是治疗小细胞食管癌的主要方法。梁军等［6］对75例食管小细胞癌进行了回顾行分析，发现原发小细胞食管癌单纯手术治疗组生存时间长于单纯化疗及单纯放疗组。结合本组78例治疗效果，笔者认为手术可以切治误诊为小细胞食管癌的鳞癌和腺癌；手术可以减少PESC肿瘤细胞的负荷；手术可切除PESC和鳞癌及腺癌混合肿瘤中对放化疗均不甚敏感的腺癌及鳞癌成分，提升PESC混合肿瘤的治疗效果；手术可切除对化疗药物不敏感的PESC的肿瘤细胞，提高其化疗敏感度。故对胃镜诊断PESC的患者，只要行术前检查有手术指征的，均应优先考虑根治手术以提高患者远期生存。
参考文献
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中国高血压联盟2012工作发布会在京召开
我国成功申办高血压领域“奥林匹克大会”
本刊讯（记者 胡睿） 2月21日，中国高血压联盟2012年工作会议在京召开，会上通报了2018年中国成功申办“国际高血压学会科学年会（ISH）”的喜讯。据世界高血压联盟主席刘力生介绍，ISH是世界高血压领域的“奥林匹克大会”，经过近8年的努力我国才获得申办资格，从今年起联盟将认真做好ISH的宣传和准备工作。
同时，中国高血压联盟主席吴兆苏教授也介绍了2012年社区防治工作重点。联盟将继续开展基层医务人员的培训工作，推广《中国高血压防治指南》和《中国血压测量指南》，并开展《中国高血压患者教育指南》的制定工作。
食管癌细胞 篇3
近年来,随着肿瘤免疫学的研究进展,人们对肿瘤患者T淋巴细胞rDNA转录活性的研究重点从外周血T淋巴细胞染色体核仁形成区嗜银蛋白(AgNORs)的变化转到了间期核Ag NORs的表达上。众多学者的研究表明,肿瘤患者T淋巴细胞Ag NORs含量低于正常人[1,2]。然而,T淋巴细胞分裂期染色体Ag NORs与间期核的Ag NORs有无相关性,尚未见报道。为了深入研究肿瘤患者T淋巴细胞Ag NORs变化规律、与细胞周期的关系及临床意义,本研究特对同一受检者同时进行T淋巴细胞间期核Ag NORs和分裂期染色体Ag NORs同时检测。现报道如下:
1 资料和方法
1.1 研究对象
食管癌患者74例。其中男性45例,女性29例;年龄36～64岁。所有病例均为本院门诊或住院初治患者,经影像学或Ag NORs检测后手术证实;患者无免疫系统疾病,采血前未用影响机体免疫功能的药物。对照组50例,为同期体检的本院健康职工,性别、年龄与肿瘤患者相匹配。
1.2 主要仪器及试剂
KL型图像分析仪,RPMI1640培养液,银染液、固定液及其他配套试剂。
1.3 检测方法
1.3.1 细胞培养、制片和银染色
将所有受检对象的细胞培养液分为两组,即染色体Ag NORs组和间期核Ag NORs组。无菌条件下抽取0.5 m L血,加入到含PHA的RPMI1640培养液中,37℃培养。染色体Ag NORs组,在培养至70 h时,加终浓度为0.05μg/m L秋水仙素,继续培养至72 h;间期核AgNORs组,在培养至72 h时,每瓶(5 m L)培养液中加2滴终止培养液继续培养至74 h。两组细胞培养物经离心、低渗、固定等处理过程,最后获得的细胞悬液滴于冷却的载玻片上,制成标本片。标本片在90℃水浴箱的铝板上用Ag NO3染色,待标本片呈深黄色取下,蒸馏水冲净、晾干,待检。细胞培养、制片及银染色具体过程见文献[3]。
1.3.2 镜检及图像分析
染色体Ag NORs组:每例在油镜下观察染色清晰、分散良好的中期分裂相30个,其中单侧或双侧有银染点的近端着丝粒染色体计为1个Ag NORs。按单盲法计数Ag NORs数,统计每例D组、G组及“D+G”组的Ag NORs数/细胞。间期核Ag NORs组:显微镜下观察银染标本片,可见已转化的T淋巴细胞胞质大多消失,细胞核的核仁及核质中均见黑色银染颗粒,前者为主核仁中的单个银染颗粒,后者为核质中的卫星颗粒。二者的面积之和称为银染核仁面积。调好图像,启动图像分析程序,每例计数30个T淋巴细胞银染核仁面积与细胞核面积的百分比值(I.S%)。
1.4 统计学分析
食管癌组和对照组比较采用t检验,染色体Ag NORs与间期核Ag NORs比较采用直线相关和回归相关分析法数据以均数±标准差(x±s)表示,P<0.01为差异有显著性。
2 结果
2.1 T淋巴细胞间期核AgNORs
食管癌组和对照组T淋巴细胞间期核Ag NORs含量的比较,见表1。以I.S%=6为临界值,85%(63/74)的食管癌患者I.S%低于临界值,而对照组仅4%(2/50)的个体I.S%低于临界值。
2.2 T淋巴细胞染色体AgNORs
食管癌组和对照组T淋巴细胞染色体Ag NORs的比较,见表2。
2.3 T淋巴细胞染色体和间期核的AgNORs相关性分析
以代表T淋巴细胞染色体Ag NORs数/细胞,以X代表T淋巴细胞间期核的I.S%,食管癌组的直线回归方程为Y=1.43+0.67X,相差系数r=0.82(P<0.001);对照组Y=-136+1.21X,r=0.87(P<0.001),见附图。
3 讨论
外周血中有核细胞主要是粒细胞与淋巴细胞,血细胞培养过程中,PHA刺激可使淋巴细胞转化生长而粒细胞不转化;流式细胞仪分析显示,外周血培养后,CD20阳性的B淋巴细胞所占比例很少,而T淋巴细胞占绝大部分。因此,外周血培养后进行Ag NORs检测,反映的是T淋巴细胞的rDNA转录活性。
人类的核仁形成区(NORs)是指5对近端着丝粒染色体短臂次缢痕处的rRNA基因,也称为rD-NA。从rDNA转录的rRNA是核糖体的主要成分,核糖体是蛋白质合成场所,而蛋白质是一切细胞功能活动的物质基础。rDNA的转录活性可通过银染色技术显示,双向凝胶电泳实验分析表明,细胞核中被银染色的物质是位于rDNA周围、具有助转录活性的酸性非组蛋白[4],称其为核仁形成区嗜银蛋白(Argyrophilic nuclear organizer region proteins,AgNORs)。因此,Ag NORs的含量反映了rDNA的转录活性,是其转录活性的标志,Ag NORs的检测也称为rDNA转录活性分析。
间期核中Ag NORs的含量用银染核仁面积与细胞核面积的百分比值(I.S%)表示,其比值低,表明Ag NORs含量少,rDNA转录活性低,蛋白质合成减少,细胞增殖活性低;在细胞周期的分裂期,T淋巴细胞核中的Ag NORs表现为近端着丝粒染色体短臂次缢痕区的银染小体,其数目的多少同样反映rD-NA转录活性的高低。
本研究结果显示:食管癌组T淋巴细胞间期核I.S%显著低于对照组(P<0.001),与王军业[5]等的研究结果相一致;分裂期T淋巴细胞染色体Ag NORs数/细胞,不管是D组、G组,还是“D+G”组,也都显著低于对照组(P<0.01)。这表明食管癌患者T淋巴细胞rDNA转录活性显著下降。
T淋巴细胞是参与细胞免疫的主要效应细胞,在机体的抗肿瘤免疫中发挥重要作用,其免疫活性直接反映机体的抗肿瘤能力。肿瘤的发生和发展与机体的免疫监视和免疫清除功能密切相关,T淋巴细胞rDNA转录活性下降导致其增殖功能降低、免疫活性下降,机体的免疫监视和清除作用下降,体内由于基因突变产生的少数恶性细胞得以逃脱免疫监视和清除作用,并发展为肿瘤。肿瘤形成后,癌细胞可释放免疫抑制因子,抑制T淋巴细胞酸性非组蛋白的合成,使其rDNA转录活性、增殖活性及免疫监视功能进一步下降,以致免疫损伤不断积累,肿瘤得以发展。
上世纪八、九十年代,不少学者研究了肿瘤患者T淋巴细胞染色体Ag NORs的变化,但不同作者的研究结果不同,有的认为肿瘤患者T淋巴细胞染色体Ag NORs含量增多,有的则认为含量减少。如CHENG等对女性腺癌的研究、KIVI等对卵巢癌和乳腺癌的研究均表明患者组T淋巴细胞染色体AgNORs比对照组增多,而MURTY等对宫颈癌的研究、吕宝忠等对肝癌的研究则表明患者组T淋巴细胞染色体Ag NORs比对照组明显减少[6]。
笔者认为,不同类型的肿瘤及肿瘤发展的不同阶段,T淋巴细胞的rDNA转录活性受损不同。某些类型肿瘤的早期,癌细胞仍受机体免疫系统的抑制,癌细胞分泌的代谢物可使巨噬细胞致敏,并将信息传递给T淋巴细胞,从而产生免疫监视作用。此时,T淋巴细胞可具有较高的rDNA转录活性,这可能是某些作者报道的肿瘤患者T淋巴细胞染色体AgNORs含量增多的原因。随着促癌因素的增强,肿瘤生长的加快,不管何种肿瘤,癌细胞产生的某些特异的免疫抑制物将使机体逐渐陷入免疫缺陷状态,T淋巴细胞rDNA转录活性下降,间期核和染色体的Ag NORs都将低于正常人[7]。因此,体现T淋巴细胞rDNA转录活性的Ag NORs含量,既是机体免疫功能的主要指标,也是评价肿瘤患者免疫功能的重要指标。
肿瘤患者T淋巴细胞rDNA转录活性下降的原因,有作者[8]认为还与rDNA的寿命缩短有关,这种观点认为,基因由三维子和时间子复合而成。三维子决定转录和编码产物的三维特异性,时间子代表基因转录的寿命。癌变时,肿瘤细胞中某些蛋白的大量产生(如肝癌时产生的甲胎蛋白),必然需要更多的核糖体,相应地,rDNA必须更多更快地转录;rDNA的超量转录致使时间子消耗,表现为Ag NORs含量下降。
作为细胞水平的一种检测方法,Ag NORs检测能从基因水平定量分析受检者T淋巴细胞的免疫活性,较灵敏地反映机体的免疫功能状态。免疫功能失调将导致感染、恶性肿瘤等的发生,如果将T淋巴细胞Ag NORs含量检测作为一种体检项目,则有助于了解受检者的免疫状况,从而早期发现疾病。肿瘤患者通常处于免疫功能低下状态,在肿瘤高危人群中进行T淋巴细胞Ag NORs检测,对恶性肿瘤的筛查有积极意义[9,10],如本研究中,以I.S%=6为临界值,食管癌的诊断符合率达到85%;针对肿瘤患者普遍存在的免疫低下状态,合理使用免疫调节剂应成为肿瘤治疗的重要措施。
T淋巴细胞间期核Ag NORs含量的I.S%与分裂期染色体Ag NORs数/细胞的相关性分析表明,这两种指标在食管癌组(r=0.82,)和对照组(r=0.85)均呈正相关,说明这两种指标均能代表rDNA的转录活性。与分裂期染色体Ag NORs检测相比,间期核Ag NORs检测的细胞培养、制片过程较简单,并且能应用KL图像分析系统自动计数,比光学显微镜人工观察染色体更具直观性,减少了人为因素的干扰,使结果更稳定、准确、可靠;另外,KL图像分析系统还可储存大量相关信息,便于对患者进行动态观察。因此,T淋巴细胞间期核Ag NORs含量检测更适合在临床推广应用。
参考文献
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食管癌细胞 篇4
1 资料和方法
1. 1 一般资料
选择本院2008 年11 月至2010 年1 月92 例段食管癌的手术切除标本,其中男59 例,女33 例,年龄43 ~ 79 岁,平均( 57. 4 ± 2. 3 ) 岁。所有患者既往均未接受过化疗,且均为首次接受手术治疗及术后病理检查。将入选病例分为轻度浸润组( NK细胞≤50 个)30 例,中度浸润组( 50 个< NK细胞< 150 个) 35 例,高度浸润组( NK细胞≥150 个) 27 例。
1. 2 检查方法
1.2.1主要试剂鼠抗人CD57单克隆抗体购自北京中山生物技术公司;免疫组化SP试剂盒和DAB显色试剂盒均购自厦门鹭隆分子生物技术有限公司。
1.2.2免疫组化枸橼酸修复液高温修复,滴加3%H2O2,室温静置10 min。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(sreptavidin peroxidase,SP)检测斑块内CD57的表达。标本用10%的多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,每个蜡块切5μm厚切片,石蜡切片脱蜡至水化,3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min,微波修复抗原10 min,正常羊血清37℃封闭20 min,弃去封闭液,滴加稀释的兔抗大鼠CD57一抗(1∶250),37℃孵育1 h,加入稀释的山羊抗兔Ig G二抗(1∶10 000)37℃孵育30 min,滴加辣根过氧化物酶标记的链亲和素37℃孵育40 min,各步骤之间均以PBS冲洗3次,DAB显色5~10 min,显微镜下观察至出现阳性着色,以蒸馏水冲洗终止反应,苏木精复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察结果。每张切片于高倍镜下随机取5个不同视野,计算CD57的阳性染色点(棕黄色或棕褐色)的数量。
1. 2. 3 结果判断肿瘤细胞的胞浆或胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞,按阳性细胞数和染色强度计分,分值为0 ~ 3 分。不显色或细胞数小于5% 为阴性( - ) ,轻度显色或细胞数5% ~ 25% 为弱阳性( + ) ,中度显色或细胞数为26% ~ 50% 为中度阳性( + + ) ,重度显色或细胞数≥50% 为强阳性。
1. 3 统计学处理
采用SPSS 16. 0 软件进行数据分析,计量资料采用均数 ± 标准差表示。先使用Shapiro-Wilk test对数据正态性进行检测,并用Levene test分析方差齐性。组间差异采用 χ2检验或方差分析或Kruskal-Wallis秩和检验,生存分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用log-rank检验,将P < 0. 05 的因素加入Cox比例风险回归模型,P < 0. 05 认为差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 不同NK细胞浸润程度与生存率的关系
高度浸润组、中度浸润组及轻度浸润组5 年生存率依次为70. 4% 、48. 6% 及36. 7% ,3 组比较差异有统计学意义( P < 0. 05) ,2 年生存率依次为74. 1% 、65. 7% 及60. 0% ,3 组比较差异有统计学意义( P <0. 05) ,1 年生存率依次为81. 4% 、77. 1% 及76. 6% ,3 组比较差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见图1、表1。
2. 2 不同临床因素患者生存率
根据Kaplan-Meier法计算后发现随着TNM及Grade分级的进展,食管癌患者5 年生存率逐渐降低( P < 0. 05) 。无淋巴结转移的患者5 年生存率高于术前有淋巴结转移的患者( P < 0. 05) 。见表2。
2. 3 不同TNM分期不同NK细胞浸润程度患者的5年生存率比较
TNM分期中Ⅰ期和Ⅱ期患者不同NK细胞浸润程度患者5 年生存率差异无统计学意义( P > 0. 05) ,但在Ⅲ-Ⅳ期食管癌患者中高度浸润组患者的5 年生存率高于轻度浸润组( P < 0. 05) ,见表3。
2. 4 影响5 年生存率的因素分析
利用Cox回归模型分析后得出,TNM分期、肿瘤直径、NK细胞浸润程度以及肿瘤分化程度是影响食管癌预后的独立危险因子( P < 0. 05) ,见表4。
3 讨论
对于临床工作者而言正确判断癌症术后患者的预后情况十分重要,目前需要更多的指标研究分析食管癌术后预后。国际抗癌联盟于1997 年提出的TNM分期虽然可以在一定程度上判断患者预后,该指标与肿瘤浸润程度、有无远处脏器转移等特征有一定关系,但是较为粗略,因此探寻一种可精确判断癌症术后患者预后的指标显得尤为急迫。随着免疫学在肿瘤领域应用的逐渐深入,越来越多的文献资料［3-7］显示肿瘤的预后与肿瘤局部免疫细胞的浸润程度具有一定关系,同时证实了淋巴细胞的高水平浸润可改善肿瘤患者的预后。
NK细胞是直接从骨髓中衍生而来的重要免疫细胞,属于重要的淋巴细胞种类之一,占淋巴细胞总数的15% 左右,具有识别靶细胞、杀伤介质等作用［8-9］。NK细胞不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关,还在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。动物模型实验［6-7］显示肿瘤的复发和转移较易发生于NK细胞数量低的动物身上,而NK细胞数量多的动物则表现出较强的抗肿瘤复发能力,NK细胞数量低的动物注射脾细胞后可促进NK细胞的活性,从而降低了肿瘤复发率［10］。尽管NK细胞在动物模型实验中不断带给我们惊喜,但是NK细胞在人类免疫系统监视环节所发挥的作用尚未明了。有研究［11］表明,人类头面部的癌症复发及转移与NK细胞的活性有关,干预手段介入前患者的NK细胞活性越低,其远处转移的时间越短; 但是又有学者发现黑色素瘤的发生发展与NK细胞的数量及活性不存在相关关系。本研究通过免疫组化手段将92 例标本分为轻度浸润组、中度浸润组以及高度浸润组,发现高度浸润组患者的5 年生存率明显高于其余两组,提示NK细胞可促进宿主加强抗肿瘤反应,改善患者预后。为了进一步探析NK细胞浸润程度与肿瘤分期之间的关系,我们对不同TNM分期不同NK细胞浸润程度患者的5 年生存率进行统计分析,发现Ⅲ-Ⅳ期食管癌患者中高度浸润组患者的5 年生存率高于NK细胞低表达组,但Ⅰ期和Ⅱ期不同NK细胞浸润程度患者5 年生存率差异无统计学意义,这一结果与其他报道［12-13］不相同,我们认为造成这一差异的原因可能与样本量不够大或者随访时间不够长有关,下阶段将扩大样本、延长随访时间以深入研究。
食管癌细胞 篇5
关键词：食管肿瘤,Snail基因,RNA干扰,侵袭转移
肿瘤的侵袭与转移是恶性肿瘤发生、发展的重要阶段,有证据表明90%以上的恶性肿瘤最终都是因肿瘤的侵袭转移或复发而导致死亡。近年来研究发现许多基因异常表达与肿瘤的发生、发展有关,Snail基因就是其中之一。Snail是Snail家族的第一个成员,近年来大量的研究表明,Snail在食管癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤中高表达[1,2,3,4,5],并且在上皮-间质转型(EMT)并促进侵袭转移中发挥着重要的作用[6],但是目前国内外极少有关Snail在人类食管癌方面的研究。
本研究通过siRNA干扰的方法抑制人食管癌细胞EC9706的Snail基因的表达,进一步观察Snail基因对人食管癌细胞侵袭能力的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
食管癌细胞EC9706(由中国医学科学院国家分子肿瘤实验室提供)用含有10%新生牛血清的DMEM高糖培养基(购自GIBCO公司)在37℃的培养箱中培养,细胞贴壁生长,隔夜换液,2～3 d传代1次,取对数生长期细胞进行实验。LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司,Snail-siRNA购自广州锐博生物公司,Trizol试剂购自Invitrogen公司,RT-PCR试剂盒购自Promega公司,内参照GAPDH引物及Snai引物由广州锐博生物公司合成,Transwell孔板购自美国Corning公司。
1.2 细胞转染
由广州锐博生物公司合成3条针对Snail的siRNA序列,筛选出其中1条有效的siRNA序列,参照说明书进行Snail-siRNA转染。Snail-siRNA序列正义链:5’-GCUGCAGGACU-CUAAUCCAdTdT-3’;反义链:5’-UGGAUUAGAGUCCUGCA GCdTdT-3’。将细胞分为三组,实验组:转染时加入Snail特异性siRNA;空白对照组:转染时加入无血清1640培养液500μl;阴性对照组:转染时加入非特异性siRNA。
1.3 RT-PCR法检测Snail mRNA的表达
应用RNA提取试剂盒提取总RNA,Snail引物设计参考文献并经过GeneBank验证。Snail引物序列上游:5’-TTC TTCGCTACTGCTGCG-3’;下游:5’-GGGCAGGTATGGAGA GGAAGA-3’,预扩增片段883 bp。内参照GAPDH引物序列上游:5’-TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3’;下游:5’-AT-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3’,预扩增片段190 bp。循环条件:94℃变性1 min,56℃退火40 s,72℃延伸30 s,40个循环后,72℃延伸10 min。产物行琼脂糖凝胶电泳,照像并扫描分析。
1.4 Western blotting法检测Snail蛋白的表达
取蛋白质样品上样,用12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离样品,转膜,封闭液于室温封闭后加入一抗(1∶1 000)(羊抗人Snail),4℃孵育过夜,碱性磷酸酶标记二抗IgG(1∶1 000),37℃孵育1 h,加入化学发光液,暗室曝光,显影,定影。
1.5 细胞划痕实验
将生长状态良好的细胞接种于6孔板中,待长到完全融合时,用200μl枪头在6孔板的底面上沿直线轻轻进行划痕,划痕后PBS冲洗2次,继续培养,12 h后在倒置显微镜下观察细胞划痕愈合情况并照相,以细胞划痕愈合百分比表示细胞的运动能力(0 h的细胞划痕愈合为0%)。
1.6 Transwell小室体外侵袭实验
将Transwell小室置于24孔板内,每个孔下室内加入含10%小牛血清的DMEM培养液500μl,上室加入200μl细胞悬液,每组设5个复孔,常规培养12 h,取出Transwell小室,95%乙醇固定,用棉拭子将小室内面的基质胶擦去,4%的多聚甲醛固定,HE染色,显微镜下观察照相。
1.7 统计学方法
采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示,三组间比较采用方差分析,组间两两比较采用SNK法,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组细胞Snail mRNA表达情况比较
实验组细胞Snail mRNA表述条带明显暗于阴性对照组及空白对照组(图1)。Snail mRNA的相对表达量=Snail mRNA表达量/GAPDH表达量,Snail mRNA在实验组的相对表达量为(0.11±0.09),显著低于空白对照组的(0.61±0.20)及阴性对照组的(0.68±0.24),差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 三组细胞Snail蛋白表达情况比较
实验组细胞Snail的蛋白表达条带明显暗于阴性对照组及空白对照组(图2)。Snail蛋白的相对表达量=Snail蛋白表达量/β-actin蛋白表达量,Snail蛋白在实验组的相对表达量为(0.09±0.04),显著低于空白对照组的(0.61±0.22)及阴性对照组的(0.72±0.16),差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 三组细胞的迁移能力比较
单层细胞划痕实验12 h后,实验组细胞的划痕愈合速度明显慢于阴性对照组及空白对照组(图3)。三组细胞划痕愈合百分比分别为:实验组为(32.7±4.5)%;空白对照组为(87.6±4.9)%;阴性对照组为(92.6±2.1)%,实验组细胞的迁移能力明显低于空白对照组和阴性对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01),空白对照组和阴性对照组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
2.4 三组细胞侵袭能力的比较
Matrigel胶能在聚碳酸酯微孔滤膜上形成类似哺乳动物基底膜样结构,因此,EC9706细胞穿过Matrigel胶的情况可以反映出EC9706细胞的侵袭能力。Transwell侵袭小室实验结果显示,实验组穿膜细胞数为(34.0±2.4)个/HP,明显低于阴性对照组[(72.0±4.7)个/HP]与空白对照组[(75±5.3)个HP],差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组与空白对照组穿膜细胞数比较,差异无统计学意义(P>0.05),说明实验组细胞的侵袭能力明显低于空白对照组及阴性对照组(图4)。
3 讨论
食管癌是目前常见的消化道恶性肿瘤之一,我国是世界上食管癌的高发地区。近年来随着外科技术及新辅助治疗的飞速发展,使部分食管癌患者得到了一定治疗,但是由于食管癌高侵袭性的生物学特点,总体来说食管癌仍是一种预后较差的恶性肿瘤,因此探索控制食管癌细胞侵袭的相关机制成为进一步提高食管癌疗效的关键。目前研究发现Snail基因与肿瘤的侵袭转移密切相关。
Snail是近年来发现的锌指转录因子,其属于转录抑制子中的Snail超家族,首先在果蝇中发现,具有促进细胞迁移的作用,在上皮-间质转型(EMT)并促进侵袭转移中发挥着重要的作用。EMT是指上皮细胞在特定生理病理状态下向间充质细胞转化的现象,发生于多种病理、生理过程中,例如伤口愈合、胚胎发育等,近年来大量的研究表明肿瘤的侵袭转移与EMT密切相关[7]。肿瘤在侵袭转移的过程中上皮性肿瘤细胞失去极性,转化成为有能力的间质细胞,从而穿透基底膜进入到循环系统而播散转移。研究证实,Snail参与了某些恶性肿瘤的细胞EMT并且促进了其侵袭转移[8]。体外实验已经证实抑制Snail基因的表达可以显著降低肿瘤细胞的侵袭能力。将反义Snail转染入鼻咽癌5-8F细胞、肝癌HepG2细胞及卵巢癌HO9810细胞后,肿瘤细胞的运动能力显著降低,并且侵袭细胞外基质的能力也显著降低,从而限制了肿瘤细胞的侵袭与转移[9,10,11],但是目前国内外有关抑制食管癌细胞Snail基因的研究甚少。
食管癌细胞 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2012年1月-2014年1月在本院接受治疗的食管癌患者70例, 收集其临床资料、癌组织及癌周围正常组织的标本等资料。所有患者均符合食管癌的临床诊断标准, 所有患者均初发, 手术前未接受化疗及放疗。其中男41例, 女29例, 年龄44~81岁, 平均 (62.65±5.24) 岁。按照WHO组织学分型分级标准, 将其分为19例高分化, 26例中分化, 25例低分化;39例有淋巴结转移, 31例无淋巴结转移;TNM分期:Ⅰ期10例, Ⅱ期18例, Ⅲ期42例。
1.2 方法
1.2.1 采集标本
选择70例食管癌患者癌细胞组织标本、与癌组织边缘距离大于5 cm的癌周围组织标本。将两组标本用4%多聚甲醛固定, 进行常规石蜡包埋。食管癌细胞系Eca-109及TE-1均采自细胞库。
1.2.2 食管癌组织Nanog蛋白检测
采用免疫组化PV二步法, 用Nanog阳性蛋白染色精原细胞瘤进行阳性对照, 使用PBS进行阴性对照[4]。具体操作方法如下:先进行常规脱蜡至水, 使柠檬酸抗原微波修复之后, 逐渐冷却;再分别滴加一抗和二抗孵育。其中一抗要用1:400稀释, 二抗要用1:100稀释。待DAB显色之后, 依次进行脱水、透明及封片。之后在高倍镜辅助下, 选择不同视野, 分别计数癌细胞200个, 根据阳性细胞所占数量计算百分比:强阳性, 即阳性细胞大于50%, 为棕褐色;中度阳性, 即阳性细胞在30~50%之间, 为棕黄色;弱阳性, 即阳性细胞低于30%, 为浅黄色;阴性, 即没有阳性细胞。
1.2.3 食管癌细胞系Eca-109及TE-1检测
应用免疫荧光技术[5]。具体措施为:将食道癌细胞置于培养基中进行培养, 培养基含有10%胎牛血清, 细胞在5%CO2、37℃的细胞培养液中进行培养, 生长至80%融合时再传代。胰酶消化完毕后要摇均匀, 接种后用5%CO2孵箱培养过夜, 并用4%多聚甲醛固定牢固, 其中一抗孵育过夜, 二抗避光孵育2 h, 再避光复染15 min。用PBS清洗后, 进行荧光照相, 利用高倍镜观察, 随机选择12~18个视野, 计数500个细胞中核表达阳性染色的细胞数量, 从而准确计算核表达的阳性细胞率。
1.3 统计学处理
采用SPSS 18.0统计学软件对所得数据进行分析, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料采用χ2检验, 以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 食管癌组织Nanog蛋白表达
癌周围正常组织Nanog蛋白主要呈现低水平表达, 阳性反应主要存在细胞质内部;食管癌组织中的Nanog蛋白表达主要在细胞质内部, 颜色为棕黄色, 呈颗粒状, 阳性率与组织恶性程度呈正比, 即组织恶性程度越高, 阳性率越高, Nanog蛋白在细胞核中的表达逐渐增多, 尤其是在低分化细胞核中, 其Nanog蛋白阳性率高达45.7% (32/70) , 癌周围正常组织仅为12.86% (9/70) 。两者比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。
2.2 食管癌组织Nanog蛋白表达和临床病理的关系
食管癌组织中的Nanog蛋白表达水平和食管癌病理分期、分化程度及淋巴结转移有明显关系 (P<0.05) , 见表1。
2.3 食管癌细胞系Nanog蛋白表达
食管癌细胞系Eca-109及TE-1的Nanog阳性蛋白表达水平较高, 存在异质性, 多数细胞以细胞质表达为主, 少数则以细胞核表达为主, 且细胞核表达阳性率为10%。
3 讨论
Nanog是胚胎干细胞中参与干细胞分化的转录因子, 它作为维持干细胞增殖的关键基因、干细胞生物学标志, 引起医学专家的很大重视[5,6,7]。有研究结果认为, Nanog蛋白在体细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤中, 均有表达, 且对肿瘤的治疗、转移、复发及预后等产生重要影响[8]。经分析, Nanog蛋白过表达或许是时肿瘤组织产生耐药性的重要原因[9]。本次研究, 通过检测Nanog蛋白在食管癌组织及癌周组织中的表达水平, 结果表明Nanog蛋白在正常组织中的少量表达主要集中在食管黏膜基底层细胞中的细胞质表达, 原因可能是基底层细胞具备干细胞的特点, 属于增生层, 而Nanog蛋白能够控制细胞增殖活动。食管癌组织Nanog蛋白呈高水平表达, 其阳性率与组织恶性程度呈正比, 病理分期和淋巴结转移增加、肿瘤分化程度降低, Nanog蛋白表达便会升高[10]。
大部分细胞Nanog蛋白表达主要集中在细胞质, 少许在细胞核表达[11,12,13]。本研究检测结果显示, 食管癌细胞系Eca-109及TE-1的Nanog阳性蛋白表达水平较高, 以细胞质为主, 含少量细胞核, 说明肿瘤干细胞含有少量以核表达为主的细胞。
综上所述, 干细胞Nanog蛋白在食管癌组织中的表达水平, 和食管癌病变的发生、发展及转移情况有密切关系。
摘要：目的:通过分析干细胞Nanog蛋白在食管癌组织中的表达, 进一步探讨其和食管癌病理特征存在的关系。方法:回顾性分析2012年1月-2014年1月在本院接受治疗的70例食管癌患者, 收集其临床资料、癌组织及癌周围正常组织的标本等资料, 采用免疫组化法检测其癌组织和癌组织周围正常细胞的干细胞Nanog蛋白, 并用免疫荧光技术检测食管癌细胞系Eca-109及TE-1的Nanog蛋白表达。结果:经检测, 食管癌组织中的Nanog蛋白表达水平显著高于癌周围正常组织, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 且食管癌组织中的Nanog蛋白表达水平和食管癌病理分期、分化程度及淋巴结转移有明显关系 (P<0.05) 。结论:干细胞Nanog蛋白在食管癌组织中的表达水平, 和食管癌病变的发生、发展及转移情况有密切关系。
食管癌细胞 篇7
1资料与方法
1.1一般资料选择2010年12月-2015年6月在我院胸外科行食管癌手术, 术后早期接受输血治疗的老年食管癌患者140例, 肿瘤均经病理及影像学诊断及临床手术确诊, 按具体病情分为去白组76例和悬红组64例, 去白组:男47例, 女29例, 年龄60~72岁;悬红组:男38例, 女26例, 年龄61~73岁;并选取同期30例未输血老年肿瘤患者为对照组, 男17例, 女13例, 年龄60~69岁。3组在平均年龄及性别构成上比较差异无统计学意义 (P>0.05) 具有可比性。
1.2治疗方法研究对象所需的血液制品均由本地区中心血站提供。输血前分别行交叉配血, 配型成功, 输注去白细胞悬浮红细胞及悬浮红细胞, 对照组采用营养疗法。3组术术后均使用抗生素预防感染治疗, 观察各组研究对象非溶血性输血发热反应发生率、过敏发生率, 术后感染情况 (包括肺部感染、手术切口感染等) 及手术伤口愈合情况等。
1.3统计学方法应用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。计量资料±s表示, 组间比较应用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 组间比较应用x2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1输血量及输血反应发生率去白组术后输血量与悬红组输血量比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。输血反应发生率去白为3.95%低于悬红组的7.81%, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
注:与悬红组比较, *P<0.05
2.2术后感染率及切口愈合情况术后感染率去白组与悬红组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;去白组与对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05) ;3组术后切口平均愈合时间的比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。
注:与悬红组比较, *P<0.05
3讨论
食管癌患者由于术前进食受到影响, 肿瘤消耗及术中手术创伤及术后创面渗血多等特点, 老年肿瘤食管癌患者术后早期合并贫血并不罕见, 输血治疗为临床重要的治疗手段之一。老年食管癌患者术后早期输血有其自身的特殊性, 一方面改善患者术后一般状况, 纠正贫血改善心肺功能, 促进术后伤口及吻合口愈合恢复, 提高术后耐受能力的有显著作用。同时研究发现[1], 肿瘤患者普遍存在免疫功能低下, 输注同种异型血细胞所引起的免疫抑制也是临床医务工作者不容忽视的重要问题。有研究表明[2], 肿瘤患者围手术期输血诱发的免疫抑制与术后感染关系密切;亦有研究表明[3], 免疫抑制对肿瘤生长、转移及复发有促进作用。
成分输血是临床输血治疗的新发展方向, 也是地方输血发展程度进步的衡量标志, 发达国家成分输血较为普及, 尤其在欧美血液成分输注以红细胞及血小板为主, 在我国以红细胞及血浆为主, 血液中白细胞在4℃环境寿命仅为4h, 故一般血液制品中白细胞基本丧失生理功能, 对机体的来说无明显良性作用, 其人类白细胞抗原 (HLA) 却可以诱发受血者产生HLA抗体的主要抗原物质。有研究表明[4], 异型白细胞经单核巨噬系统破坏释放的内源性致热源为导致受血者发生非溶血性发热的主要原因。白细胞所含的组胺、白三烯及嗜酸性趋化因子等内源性致热源作用于受血者体温调节中枢可引起发热、同时也是引起受血者过敏反应的重要物质[5]。去白细胞悬浮红细胞为通过离心、过滤、沉降等方法去除血液中99.0%白细胞和94.6%的血小板等而成的血制品。有研究表明[6], 去白细胞成分老年肿瘤患者中的临床应用与悬浮红细胞的输注进行研究对比, 在相近输血量的情况下, 去白组非溶血性发热反应及过敏反应发生率远低于悬红组。本研究中发现, 去白组非溶血性发热反应及过敏反应发生率为3.95%, 悬红组为7.81%, 2组差异有统计学意义 (P<0.05) 。因此有理由认为, 输注去白细胞红细胞悬液对减少肿瘤患者输血反应有重要的临床应用价值。输血诱发的受血者机体免疫功能紊乱, 在老年肿瘤患者中免疫抑制作用尤为明显, 临床表现为术后感染率的上升及手术伤口预后时间的延长等, 廖韧等[7]研究发现:同种异体输血可引起CD4/CD8比值降低, NK细胞功能下降, 非特异性及特异性免疫抑制增强, 受血者免疫功能低下, 输血患者IL-2生成减少, 前列腺素PEG2生成增加, 然而前列腺素PEG2对机体免疫起抑制作用, 可降低CD4淋巴细胞的表达及引起单核巨噬细胞功能的降低。本研究数据显示:去白组术后感染发生率为7.89%, 悬红组为10.93%, 去白组术后感染发生率低于悬红组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。由此可见, 去白细胞红细胞悬液输注对于减少术后感染, 增强患者体质耐受等方面由于悬浮红细胞输注。
摘要：目的 观察去白细胞成分输血在老年食管癌患者术后早期应用的治疗效果。方法 收集需输血治疗老年食管癌患者140例, 按具体病情分为去白组76例和悬红组64例, 输注去白细胞悬浮红细胞为去白组, 输注悬浮红细胞为悬红组, 并以同期30例未输血老年食管癌患者为对照组, 观察治疗效果。结果 输血反应发生率去白组为3.95%低于悬红组的7.81%, 差异均有统计学意义 (P<0.05) ;术后感染发生率去白组为7.89%明显低于悬红组的10.93%, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;术后切口平均愈合时间3组比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论 老年食管癌术后早期去白细胞成分输血可减少输血反应, 减少术后感染率, 改善老年患者体质, 提高输血疗效, 值得临床选择使用。
关键词：食管癌,老年,输血,去白细胞悬浮红细胞,悬浮红细胞
参考文献
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[3]Melis M, Mcloughlin J M, Dean E M, et al.Correlattions between neoadjuvant treatment, anemia, and perioperative complications in patients undergoing esphagectomy for cancer[J].Surg Res, 2009, 153 (1) :114-120.
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[6]唐海平, 谭建国.去白细胞成分输血在老年肿瘤患者中临床应用研究[J].河北医学, 2015, 21 (2) :317-320.
食管癌细胞 篇8
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株
食管癌细胞系EC109购自上海细胞生物研究所。
1.1.2 试剂
RPMI1640培养基(Gibico公司),胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司),胰蛋白酶(上海华美生物工程公司),台盼兰(上海华美生物工程公司),二甲基亚砜(Amersco),聚丙烯酰胺凝胶、Caspase-3抗体、辣根酶标记山羊抗兔Ig抗体、ECL试剂盒购于北京中山公司,其他试剂均为分析纯。
1.1.3 仪器
二氧化碳培养箱(Thermoforma of THE U.S.A),倒置相差显微镜(XDB-1B,国产),超净工作台(SW-CJ-2F,上海博迅),自动双重纯水蒸馏器(SZ-98,上海本波仪器有限公司),手提式压力蒸汽消毒器(YXQ02型,山东),电热恒温鼓风干燥箱(Gzx-dh.500-bs,上海),电子天平(FA1004,上海恒平科学仪器公司),电泳仪(DF-D,北京),电转膜仪,紫外透视成像系统(KH-UVIII,上海康禾)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 食管癌细胞系EC109在37℃、饱和湿度及5%CO2条件下,用培养瓶在含10%胎牛血清、100U/mL青链霉素的RPMI1640培养液中传代培养。
1.2.2 Western blot技术 将食管癌细胞系EC109悬液接种于6孔培养皿中,培养至贴壁面积达80%~90%时弃去培养液,换上无血清培养基培养12 小时, 按实验分组分别加入不同浓度的钒化钠,分别为0.1、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0μmol/L,对照组不加药物。作用1小时后,用RIPA+PMSF细胞裂解液在冰上裂解细胞,低温离心15分钟提取蛋白,BCA法蛋白定量。加上样缓冲液,100℃变性5分钟。每孔50μg蛋白上样,10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白电转到硝酸纤维膜上,用5%脱脂奶粉封闭1小时,加一抗稀释液(1∶1 000稀释)4℃过夜,TTBS洗膜,结合辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000稀释),TTBS洗膜,用ECL化学发光试剂在X光胶片上曝光、显影、定影。以β-actin为内参照,应用凝胶成像分析系统进行条带扫描分析结果,结果以蛋白条带的面积积分值与β-actin的面积积分值比值表示。实验重复3次。
1.2.3 统计学处理 采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析,统计数据以均数±标准差(
2 结果
随钒化钠浓度的增加,食管癌细胞系EC109 Caspase-3蛋白表达也增高,见图1。Western blot技术检测结果显示,低浓度(0.1~10.0μmol/L)钒化钠组Caspase-3蛋白表达与对照组比较均无统计学意义(P>0.05);50.0、100.0、200.0μmol/L钒化钠组培养1小时后,各组Caspase-3蛋白表达均高于对照组(P<0.05),见表1。
*与对照组比较P<0.05,**与对照组比较P<0.01
3 讨论
钒是化学元素周期表中VB族的过渡元素,广泛存在于自然界中,参与人体许多生理过程,如细胞的生长和分化、糖类及脂类的代谢等[2]。Bishayee等[3]报道了一系列钒制剂对动物模型系统的抗肿瘤活性。最新研究表明,一种钒配合物LMC(氧原子配位的四价金属钒配合物)通过抑制DNA拓扑异构酶发挥抗肿瘤作用,对多种肿瘤细胞株A549、Hela、BEL-7402具有明显抑制生长的作用,且可将细胞阻断在G2/M期,而对正常肝细胞生长无明显影响[4]。
肿瘤的发生、发展与凋亡有密切关系。肿瘤不仅有细胞增殖和分化的异常,亦有细胞凋亡的异常。Caspase是参与诱导细胞凋亡的重要因素,Caspase-3是哺乳类动物细胞凋亡的关键蛋白酶[5]。Caspase家族存在于哺乳动物细胞中,是与线虫细胞死亡蛋白CED-3相似的一类蛋白酶,迄今已发现16个成员[6],均以无活性的前体形式存在,一经激活,将产生Caspase级联反应,导致细胞凋亡。现今认为,Caspase的激活与细胞凋亡需经两条不同的途径:一条是通过与细胞表面的死亡受体结合,激活Caspase-8后,再活化下游的Caspase(主要为Caspase-3);另一条是各种毒性物质刺激线粒体释放的细胞色素C,激活Caspase-9后,再活化下游的Caspase(主要也是Caspase-3)[7,8]。可见这两条途径均需激活Caspase-3。近年来发现Caspase-3参与了肿瘤发生过程中细胞凋亡异常的病理过程[6],细胞凋亡的分子机制研究表明,凋亡是多基因参与的级联反应过程。其中Caspase-3是凋亡的执行器之一[9]。Caspase-3为凋亡的效应分子,是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶,被称为凋亡的“执行者”[10]。Caspase-3是多种凋亡途径共同作用的因子,其蛋白表达水平的高低决定着细胞凋亡程度[11]。
目前,以诱导凋亡为目标的肿瘤治疗战略主要是通过各种因子活化Caspase-3前体而实现的。本实验结果显示,不同浓度钒化钠作用食管癌细胞系EC109后1小时,低浓度钒化钠组对Caspase-3蛋白的表达无明显影响,高浓度组Caspase-3蛋白的活性增加。提示一定浓度的钒化钠可能通过激活Caspase-3而发挥其促进食管癌细胞系EC109细胞凋亡的作用。这一结果为钒化钠防治食管癌的临床应用奠定理论基础。由于细胞凋亡是一个极其复杂、涉及多步骤、多因子参与的过程,故钒化钠诱导肿瘤细胞凋亡的详细机制仍需进一步研究。
摘要：目的:研究钒化钠对食管癌细胞系EC109 Caspase-3激活的影响,探讨钒化钠影响食管癌细胞系EC109细胞生长的机制。方法:以体外培养食管癌细胞系EC109为研究对象,给予0、0.1、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0μmol/L钒化钠,培养1小时后,用Western blot技术检测食管癌细胞系EC109 Caspase-3激活情况。结果:0、0.1、1.0、5.0、10.0μmol/L钒化钠组培养1小时后,各组Caspase-3蛋白激活与对照组比较均无统计学意义;50.0、100.0、200.0μmol/L钒化钠组培养1小时后,各组Caspase-3蛋白表达均升高。结论:高浓度的钒化钠可能激活EC109细胞Caspase-3蛋白。