细菌内毒素检查

细菌内毒素检查（精选九篇）

细菌内毒素检查 篇1

1 材料与方法

1.1 试验材料

南阳普康药业有限公司生产的注射用的Hydrochloric acid with colin, 批号为2009011621、2009011721、2009011821;中国药品生物制品鉴定所生产批号为150601～201069规格为120EU的细菌内毒素工作标准品 (CSE) ;鲎试剂1 (TAL1) 湛江博康海洋生物有限公司生产的批号为1004172, 标示灵敏度为0.25EU/mL, 规格0.5mL;鲎试剂2 (TAL2) 由湛江安度斯生物有限公司生产的规格一样批号为1005282;细菌内毒素检查用水由中国药品生物制品检定所提供的规格为10mL, 批号为W2010—1。

1.2 方法

1.2.1 供试品Bacterial endotoxin限值 (L) 的确定

本品在临床用药按照“1h内药量的输入不能>1.2g”计算, 根据公式L=K/M, 其中M为每kg重量每小时的最大剂量, 人均体质量按照60kg计算, 由此可以得出L=0.25EU/mg;鲎试剂灵敏度复核试验根据2010版《中国药典》 (二部) 附录XIE对本试验中所采用的两个不同厂家生产的鲎试剂进行标示灵敏度的复核;并计算供试品的有效浓度。

1.2.2 干扰试验预试验和试验

用BET用水溶解精密称量的供试品, 并进行倍比稀释, 制成7个浓度的系列溶液, 作为供试品的阴性对照, 同时制备含Bacteria endotoxin标准品溶液的阳性对照系列溶液, 用鲎试剂进行干扰预试验。按照检查的要求, 使用两个不同厂家的鲎试剂对浓度为12.5、6.25、3.125的供试品进行干扰试验。取BET用水和供试品稀释液把同一支细菌内毒素工作标准品制作成2.0、1.0、0.5、0.25λ的溶液, 每个浓度作4管, 用BET和供试品稀释液作阴性对照。

1.2.3 细菌内毒素的检查

根据2010版《中国药典》 (二部) 附录XIE, 参照干扰试验结果和拟定的内毒素限值, 对3个批号、浓度为0.5mg/mL的盐酸克林霉素进行检查。

2 结果

2.1 干扰试验结果

根据计算可以拟定内毒素的限值L=0.5EU/mg, 鲎试剂灵敏度在0.5～2.0λ, 符合规定, 供试品最大浓度=2mg/mL, 最小浓度=0.015mg/mL, 干扰预试验显示在盐酸克林霉素浓度≤6.0mg/mL时鲎试剂和细菌内毒素无干扰反应。干扰试验结果显示在2.0λ呈阳性, 0.25λ呈阴性, 对照组呈阴性, Hydrochloric acid with colin浓度≤6.0mg/mL时鲎试剂和细菌内毒素无干扰反应。结果见表1。

2.2 细菌内毒素检查结果

阴性对照管和供试品管结果都为阴性, 阳性对照管和供试品阳性对照管结果均呈阳性, 经过检查, 3个批号的供试品均符合规定, 结果见表2。

3 讨论

3.1 影响内毒素检查准确性的因素[6]

3.1.1 在检查操作中, 要严格的遵循无菌操作的规定, 防止微生物污染试剂。

实验室要保持洁净, 所用的器皿必须要洗涤干净, 避免外源性内毒素影响试验的结果。在试验中, 一定要严格的按照规定, 保持合适的p H值, 避免破坏微量的内毒素。

3.1.2 Bacterial endotoxin的迭加。

试验中使用的一些材料和细菌内毒素检查用水都可能会存在微量的内毒素, 一般都不会超过鲎试剂的灵敏度, 不能被检查出来, 但是, 它可以增加供试品中内毒素的含量, 让其刚好超过灵敏度限值之上, 引起阳性反应。在实际检查过程中“假阳性实验”是不能完全避免的, 但是可以采取一定的措施来防止其影响, 如采用比供试品内毒素限值更小的鲎试剂来检查或者其他材料等。

3.1.3 结果判定。

细菌内毒素检查必须保证阴性对照溶液均为阴性, 供试品阳性, 对照溶液和阳性对照溶液结果均为阳性, 试验才为有效。供试品溶液管均为阴性, 判供试品符合规定, 反之则判供试品不符合规定。若有一管为阴性, 另一管为阳性, 需进行复试。复试时供试品溶液需做4支平行管, 若均为阴性, 判供试品符合规定, 否则判供试品不符合规定。

3.2 是否能妥当的确定一个新品种的内毒素限值, 直接关系和决定了

药物本身所允许的内毒素含量标准质量的评价, 标准要求太高, 目前的技术水平没有达到要求, 生产出来的产品通不过检查, 就会导致资源的不必要浪费, 标准要求太低, 又不能保证药品的质量, 导致很多临床用药的安全问题, 危及到人身的安全[3]。试验结果表明注射用盐酸克林霉素采用细菌内毒素检查法代替Pyrogen test是有效且可行的, 供试品在稀释浓度≤6.0mg/mL, 灵敏度为0.25EU/mg时内毒素与鲎试剂无干扰反应, 可以进行内毒素检查, 是有效可行的控制办法。

参考文献

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[3]严晓明, 江兰英, 王莉蓓, 等.盐酸克林霉素氯化钠注射液中细菌内毒素定量检查 (动态浊度法) 方法的研究[J].中国药事, 2005, 19 (10) :610-612.

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[5]张义伟.细菌内毒素检查的几点体会[J].中国实用医药, 2010, 5 (3) :86-87.

[6]范能全, 彭兰.细菌内毒素的检查及干扰因素的排除[J].中国药师, 2007, 10 (9) :915-916.

[7]Li Zhang, Huiping Hu, Zhi Liao, et al.Hydrochloric acid leachingbehavior of different treated Panxi ilmenite concentrations[J].Hydrometallurgy, 2011, 107 (1/2) :40-47.

注射用鹿瓜多肽细菌内毒素检查方法 篇2

方法 对药厂生产的注射用盐酸格拉斯琼氯化钠采用试剂检查细菌内毒素。

结果 细菌内毒素检查的方法比鲎试剂动物检查的方法更安全、灵敏。

结论 用该方法使结果更安全、准确。

【关键词】 格拉斯琼氯化钠;细菌内毒素;动物实验

1 一般资料

注射用盐酸格拉司琼氯化钠， (新疆制药厂生产， 批号：06120621、06120631、06121641)， (热源检查均符合规定)， 规格：50ml/瓶 ：注射用盐酸格拉司琼(以 C18H24N4O计)3mg与氯化钠。

鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司， 批号： 06120521、06120621、06120631， 规格：0.1ml/支， 灵敏度：0.25EU/ml。

)细菌内毒素标准品：由中国药品生物制品检定所， 批号：-10， 效价：160EU/A， 细菌内毒素检查用水(BET水)：湛江博康海洋生物有限公司生产， 批号：0603182， 规格50ml/瓶。

2 方法与结果

2. 1 鲎试剂灵敏度复核， 按《中国药典》[1]2005年版细菌内毒素检查方法的要求：结果，鲎试剂的灵敏度复核规定均在(0.5～2.0)λ之间符合规定。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果。

由表 1 可见3批鲎试剂均在(0.5～2.0)λ之间， 由此鲎试剂灵敏度均符合规定， 可见于细菌内毒素检查， 标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

2. 2 供试品内毒素限值(L)的确定， 《中国药典》[1]2005版二部附录采用细菌内毒素检查方法， 根据公式 L=K/M 确定供试品的内毒素限值。

式中L为供试品的细菌内毒素的限值， 以EU/ml考虑到合并用药因素， 供试品细菌内毒素限值 L为0.25EU/ml。

2. 3 供试品最大有效稀释倍数的确定， 采用公式 MVD=CL/λ确定供试品最大不干扰浓度。

根据公式MVD=CL/λ， 选用市售鲎试剂灵敏度标示值为0.25 EU/ml。

来确定供试品注射用格拉斯琼氯化钠的最大不干扰浓度MVD=CL/λ=2 。

2. 4 干扰预试验， 细菌内毒素检查用水对供试品2倍的稀释， 取供试品(原液)及1：2稀释的供试品溶液， 将细菌内毒素工作标准品逐一稀释， 稀释的倍数是1倍、2倍、4倍、8倍、把结果设立阴性和阳性的对照， 并且做阴、阳性对照(各2管)， 表明原液对鲎试剂有干扰， 供试品稀释后对鲎试剂试验无任何干扰。

见表2。

2. 5 供试品干扰试验，用两个厂家的灵敏度为0.25EU/mg， 制成细菌内毒素标准品分别含内毒素(2.0、 1.0、 0.5、0.25)λ浓度的溶液。

分别平行做4管， 并且做细菌内毒素检查用水和供试品的溶液为(1：2)分别做2管比较， 并计算以样品稀释液配制的细菌内毒素溶液反应到终点浓度几何均值(Et)观察结果， 表明ES在(0.5～2.0)λ之间， Et在(0.5 s～2.0) Es之间， 表明该注射液的2倍稀释液对鲎试剂试验没有产生干扰作用。

供试品的细菌内毒素取三批注射用盐酸格拉斯琼依次加入细菌内毒素检查用水制成每1ml中含格拉斯琼30μg的溶液， 按《中国药典》2005年版检查法进检查， 每1ml中含内毒素的量应(﹥0.25EU)。

见表3。

表 3供试品干扰试验结果。

3 讨论

本文主要通过干扰试验预试验， 取3批注射用盐酸格拉斯琼氯化钠溶液2倍稀释液对细菌内毒素检查无干扰。

用细菌内毒素检查法代替热原检查法是合理的， 表明用细菌内毒素检查方法控制内毒素的方法是可行的。

参考文献

[1] 国家要点委员.中华人民共和国药典(二部).2005年版、北京：化学工业出版社， 2005.

注射用葛根素的细菌内毒素检查法可行性【3】

[摘要] 目的:对注射用葛根素进行凝胶法干扰试验,建立注射用葛根素的细菌内毒素检查试验方法。

方法:采用《中国药典》2005年版二部附录收载的细菌内毒素检查法。

结果:注射用葛根素稀释至浓度1.5 mg/ml时对细菌内毒素检查法无干扰作用。

结论:使用细菌内毒素检查法检查注射用葛根素中的细菌内毒素是可行的,可用细菌内毒素检查法代替家兔热原检查法。

[关键词] 注射用葛根素;细菌内毒素;凝胶法;干扰试验

葛根素是从豆科植物野葛干燥根中提取的单体,为异黄酮类化合物,临床及基础研究证明,该药具有扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收缩功能、促进血液循环等药理作用[1-2],临床上现已用于治疗心脑血管及外周血管疾病[3-4]。

该品种国家药品标准WS1-(X-388-1)-Z进行热原检查[5],未进行细菌内毒素检查。

为考察该品种是否可以用细菌内毒素检查法来代替热原检查法,本文参照《中国药典》2005年版二部附录收载的细菌内毒素检查法对注射用葛根素进行了细菌内毒素检查研究。

1 仪器与试药

注射用葛根素(批号:08020301,规格:0.2 g/瓶,华北制药集团制剂有限公司;批号:20061222,12131,规格:100 mg/瓶,北京赛生药业有限公司;批号:20060522,200711303,规格:50 mg/瓶,北京赛生药业有限公司;批号:07102801,规格:0.4 g/瓶,山东瑞阳制药有限公司;批号:07121101,规格:0.2 g/瓶,山东瑞阳制药有限公司;批号:07100401, 规格:0.1 g/瓶,山东瑞阳制药有限公司;批号:07091602,规格:50 mg/瓶,山东瑞阳制药有限公司);鲎试剂(批号:0807022,规格:0.1 ml/支,标示灵敏度:0.25 EU/ml,湛江安度斯生物有限公司;批号:080506, 081012,规格:0.1 ml/支,标示灵敏度:0.25 EU/ml,厦门市鲎试剂实验厂有限公司鲎试剂);细菌内毒素工作标准品(批号:150601-200860,规格:160 EU/支,中国药品生物制品检定所);细菌内毒素检查用水(批号:0801180,规格:50 ml/支,湛江安度斯生物有限公司);漩涡振荡器(IKA-MS-1);恒温水浴箱(德国Julabo 19A)。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂标示灵敏度的复核[6-7]

根据鲎试剂灵敏度的标示值,将细菌内毒素工作标准品用BET水溶解,在漩涡振荡器上混匀15 min,然后制成2.00λ、1.00λ、0.50λ和0.25λ 4个浓度的内毒素标准溶液,按《中国药典》2005年版二部附录的细菌内毒素检查法规定,对湛江安度斯生物有限公司和厦门市鲎试剂实验厂有限公司两个厂家的鲎试剂进行灵敏度的复核,鲎试剂灵敏度的测定值(λc)=lg-1(∑X/4),式中X为反应终点浓度的对数值(lg),结果见表1。

3批鲎试剂灵敏度分别为0.25 EU/ml、0.25 EU/ml和0.42 EU/ml,均在0.5 λ～2.0 λ范围之间,表明3批鲎试剂灵敏度均符合规定,可用于细菌内毒素检查。

表 1 鲎试剂灵敏度复核结果

Tab.1 The results of tachypleus amebocyte lysate sensitivity test

2.2 注射用葛根素的细菌内毒素限值(L)的确定[6-7]

按《中国药典》2005年版二部中细菌内毒素检查法的规定确定细菌内毒素限值。

根据公式L=K/M,式中L为供试品的细菌内毒素限值,K为按规定的给药途径,人用每公斤体重每小时最大可接受的.内毒素剂量,注射剂K=5 EU/(kg・h),M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,人均体重按60 kg计算,注射时间若不足1 h,按1 h计算。

从注射用葛根素的产品使用说明书可知本品的最大用药剂量为600 mg,人均体重以60 kg计,滴注时间按1 h计算, 则M=600 mg/60 kg・h=10 mg/(kg・h),L= K/M =[5 EU/(kg・h)]/[10 mg/(kg・h)]=0.5 EU/mg。

本品为心血管药、儿童老人用药,根据《注射剂安全性检查法应用指导原则(修订稿)》的要求安全系数定为3,本品内毒素最终确定限值为L=0.17 EU/mg。

2.3 注射用葛根素的干扰预试验稀释倍数的确定[8-9]

目前用于药品检验的市售鲎试剂灵敏度(λ)一般在0.50～0.03 EU/mg范围内,最小有效稀释浓度c=λ/L,L=0.17 EU/mg,故注射用葛根素进行细菌内毒素检测时,0.50～0.03 EU/mg的鲎试剂相对应的最小有效稀释浓度为3.00、1.50、0.75、0.38、0.18 mg/ml。

2.4 干扰预试验试验[8-9]

取3批注射用葛根素(批号:08020301,规格:0.2 g/瓶;批号:200711303,规格:50 mg/瓶;批号:07121101,规格:0.2 g/瓶)各1瓶,分别加BET水适量溶解,制成50 mg/ml的供试品原液,用BET水将供试品原液进行倍比稀释,制得3.00、1.50、0.75、0.38、0.18 mg/ml共5个浓度梯度的溶液,将此系列浓度溶液标记为供试品管(NPC系列),用上述稀释液作为溶剂,溶解并稀释细菌内毒素工作标准品,制得每个稀释度中细菌内毒素含量均为2 λ(0.5 EU/ml)的注射用葛根素溶液,标记此系列溶液为供试品阳性对照管(PPC系列)。

取灵敏度为0.25 EU/ml的湛江安度斯生物有限公司和厦门市鲎试剂实验厂有限公司两个不同厂家的鲎试剂进行试验,每一稀释度做2管,同时按常规分别设细菌内毒素阳性对照(PC)和检查用水阴性对照(NC)各2管,结果见表2。

表 2 注射用葛根素干扰预试验结果

Tab.2 The results of prerliminary interference test of

Puerarin for Injection

由表2结果可知,所用的3批注射用葛根素稀释到3.0 mg/ml浓度的溶液时,有2批样品对湛江安度斯生物有限公司的鲎试剂与细菌内毒素反应有干扰作用,稀释到1.5 mg/ml或以下浓度的溶液时,对两个厂家的鲎试剂与细菌内毒素反应无增强或抑制的干扰作用。

2.5 干扰试验[6-7]

用两个厂家的鲎试剂(灵敏度为0.25 EU/ml),按《中国药典》2005年版二部附录的细菌内毒素检查法进行试验,测定用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et)。

取3批注射用葛根素(批号:08020301,200711303,07121101)各1瓶,分别加BET水适量溶解,制成50 mg/ml的供试品原液,再用BET水稀释制成浓度为1.5 mg/ml的供试品稀释液,用BET水和供试品稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释成2.00 λ、1.00 λ、0.50 λ、0.25 λ浓度的BET水系列细菌内毒素溶液和供试品稀释液系列细菌内毒素溶液,每一稀释浓度重复4管,同时用上述供试品稀释液和BET水各做2管阴性对照管,按公式计算BET水和供试品稀释液反应终点浓度的几何平均值(Es和Et),Es=lg-1(∑Xs/4),Et=lg-1(∑Xt/4),结果见表3。

表 3 注射用葛根素的正式干扰试验结果

Tab.3 The results of interference test of Puerarin for Injection

由表3结果可知,2 λ管均为阳性,0.50 λ、0.25 λ管均为阴性,对于λ=0.25 EU/ml的2组鲎试剂的Es分别为0.25 EU/ml、0.35 EU/ml,Es均在0.5λ～2.0 λ范围内,3批注射用葛根素测得的Et均在0.5 λ～2.0 λ范围内,Et和Es的比值在0.5～2.0范围内,说明注射用葛根素在1.5 mg/ml或以下浓度的溶液对两个不同厂家的鲎试剂与内毒素的反应无增强或抑制的干扰作用,符合《中国药典》2005年版二部对细菌内毒素检查有效性的规定,因此可以确定注射用葛根素的最大无干扰浓度为1.5 mg/ml。

2.6 注射用葛根素的细菌内毒素检查

取9批注射用葛根素样品,分别根据“2.5”项下方法制成供试品稀释液,使用λ=0.25 EU/ml的两个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素检查,并用此稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释为2 λ的溶液,作为供试品的阳性对照,另外以细菌内毒素检查用水建立阳性对照和阴性对照。

按《中国药典》2005年版二部细菌内毒素检查法检查,结果见表4。

由表4结果可知,阴性对照管(NC)均为阴性,供试品阳性对照管(PPC)和阳性对照管(PC)均为阳性,实验有效;供试品管(NPC)均为阴性,表明样品中未检出细菌内毒素,9批注射用葛根素的细菌内毒素检查均符合规定。

3 结论

3.1 无干扰浓度确定

干扰试验目的是评价样品浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度及干扰性质,初步筛选出对细菌内毒素检查无干扰的样品浓度范围。

本品通过将注射用葛根素稀释至1.5 mg/ml或以下浓度,消除对鲎试剂凝集反应的干扰。

3.2 鲎试剂的影响

不同厂家的鲎试剂由于生产工艺、质量参数等方面有一定差异,其抗干扰能力存在差异。

因此,本实验采用2个不同厂家的鲎试剂对3个批号的样品进行实验。

从正式干扰试验结果可见,样品稀释至1.5 mg/ml浓度时,Es或Et均在0.5 λ～2.0 λ范围之内,可认为注射用葛根素在该浓度下不干扰细胞内毒素检查。

3.3 检查结果

用两个厂家鲎试剂与9批样品进行细菌内毒素检查,样品中细菌内毒素限量均在0.17 EU/mg限值以下。

因此,注射用葛根素采用限值0.17 EU/mg进行细菌内毒素检查法代替热原检查法是可行的。

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细菌内毒素检查 篇3

【关键词】乳糖酸阿奇霉素注射液；细菌内毒素检查；干扰试验

【中图分类号】R927 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0677-02

阿奇霉素是一种15元环大环内酯类抗生素。据体外试验结果显示，阿奇霉素对临床中的诸多致病菌具有较强的抗菌作用，而常见的致病菌主要有革兰阳性需痒菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌（A组β溶血性链球菌）、肺炎（链）球菌、（溶血性链球菌（草绿色链球菌）和其他链球菌、白喉（棒状）杆菌。而针对耐红霉素的革兰阳性细菌，包括粪链球菌（肠球菌）以及耐甲氧西林的多种葡萄球菌菌株呈现交叉耐药性。

一般而言，各种抗菌类药物在发挥抗菌、杀菌作用时，也是要根据病菌的活性来选择适宜的抗菌类药物，只有这样才能够保证杀菌的效果。乳糖酸阿奇霉素对格兰阴性菌的活性视菌株而定，并且在用药之前需要做敏感性测定。而其主要针对的适应症为敏感致病菌株所引起的感染，主要包括：一是由肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、卡他摩拉菌、肺炎支原体、金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌引起的需要首先采取静脉滴注治疗的社区获得性肺炎；二是由沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、人型支原体引起的需要首先采取静脉滴注治疗的盆腔炎。

一般来说，乳糖酸阿奇霉素注射液的物理形态为无色澄明液体。通常的用法用量为：在临床应用中，首先要将乳糖酸阿奇霉素注射液融入到250ml或500ml的0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液中。在乳糖酸阿奇霉素注射液融合的过程中，尽量保持阿奇霉素的浓度，将融合最终的阿奇霉素的浓度控制在1.0-2.0mg/ml之间，采取静脉滴注的方式将药物注射入患者的体内，通常滴注的时间为浓度为2.0mg/ml，滴注1小时，然后以此向下类推。一般在进行社区获得性肺炎治疗时，要注意成人的用量为每次0.5g，而每天使用1次，至少要连用两天的药，继之换用口服阿奇霉素口服制剂0.5g/天，治疗7～10天为一个疗程。转为口服治疗时间应由医生根据临床反应确定。而在进行盆腔炎治疗时，要注意成人的用量为每次0.5g，也是每天一次，在用药1到2天之后改用阿奇霉素口服制剂0.25g/日，以7天为一个疗程。转为口服治疗时间应由医生根据临床反应确定。若怀疑合并有厌氧菌感染，则应合用抗厌氧菌药物。

乳糖酸阿奇霉素原料标准收载于国家药品标准新药转正标准西药第四十五册，标准编号WS1-（X-356）-2003Z，为保证临床用药安全，标准中对乳糖酸阿奇霉素细菌内毒素进行控制，乳糖酸阿奇霉素注射液的标准为国家食品药品监督管理局标准（试行）YBH10722004，质量标准为热原检查，该法繁琐且实验条件要求较高。本文参照《中国药典》2010年版二部附录细菌内毒素检查法进行干扰试验研究，对乳糖酸阿奇霉素注射液的细菌内毒素检查方法进行了可行性研究。

1实验材料

1.1样品

乳糖酸阿奇霉素注射液（规格：5mL：0.25g，批号：083130702083130703083130704），石药集团欧意药业有限公司生产。

1.2仪器与试药

鲎试剂（TAL）：批号1305211，1309281，灵敏度0.25EU·mLˉ·，规格0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司产品。细菌内毒素检查用水（BET水）：批号1209230，规格5mL/支，湛江安度斯生物有限公司产品。

2方法与结果

2.1供试品细菌内毒素限值的确定

根据L=K/M，L为供试品细菌内毒素限值，K为人用每公斤每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5EU/（kg·h），M为人用每公斤体重每小时的最大剂量。乳糖酸阿奇霉素注射液临床每次最大用量0.5g，因此拟定本品内毒素限值为：每1mg乳糖酸阿奇霉素注射液中含内毒素的量应小于0.6EU。

2.2鲎试剂灵敏度的复核

按照《中国药典》2010年版二部附录细菌内毒素检查法的要求复核所用鲎试剂，结果均符合规定（见表1）。

2.3干扰预试验

将乳糖酸阿奇霉素注射液从原液起，加入BET水按照1∶1依次倍比稀释至0.36mg·mLˉ·，依法制成2λ的供试品内毒素溶液，将上述稀释溶液用湛江安度斯生物有限公司的鲎试剂（灵敏度为0.25EU·mLˉ·）依法进行干扰预试验。

2.4干扰试验

根据预试验结果，取不同浓度的乳糖酸阿奇霉素注射液将同一支标准品制成2λ，1λ，0.5λ和0.25λ的供试品内毒素溶液，分别取两个厂家的鲎试剂与上述内毒素溶液依法进行干扰试验

结果表明，选用两个厂家3批鲎试剂，对3批乳糖酸阿奇霉素注射液进行的干扰试验，高浓度时对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应有抑制作用，经稀释至6.25mg·mLˉ·时即可排除干扰作用，其Es及Et均在0.5λ～2λ之间。

2.5细菌内毒素检查

根据干扰试验结果和拟定的细菌内毒素限值0.6EU·mgˉ·，采用两个厂家鲎试剂，根据公式c=λ·L-1，将乳糖酸阿奇霉素注射液稀释至0.42mg·mLˉ·，对3批乳糖酸阿奇霉素注射液分别进行细菌内毒素检查，结果均符合规定，与家兔法（热原检查）一致（见表2）。

3、讨论与结论

3.1细菌内毒素检查法能够对供试品中的细菌内毒素是否达标进行有效的判断，从而保障药品的质量。而一般来说，内毒素是一种革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分一般为类脂A。这种毒素通常是在菌体死亡后才会崩解释放出来。对细菌内毒素的检查一般有两种方法：一种是凝胶法，另外一种是光度测定法。其中光度测定法还包括浊度法和显色基质法。在对供试品進行检测试验时，可采用上述的两种检测方法进行内毒素的检查。如果检测的结果出现争议，在没有特殊规定的要求下，可以在进行凝胶法检验，从而以凝胶法的结果为基准。

3.2细菌内毒素主要来源于热原，而热原本身就是一种内毒素。当热原进入到机体血液循环系统中时，就会引起发热等一系列的不良反应，因此，对注射剂中的热原或者是细菌内毒素进行检查是保证注射剂安全性的重要质量指标。一般来说，乳糖酸阿奇霉素注射液中也具有热原或者是细菌内毒素，如果在临床中大量的进行乳糖酸阿奇霉素注射液的注射，在没有对注射液中的内毒素进行检查时，很容易使得药液中的热原对人体产生危害，通常过量的热原会使得病人在半小时到一小时之间出现冷颤、高温、出汗、昏晕或者是呕吐等症状，热原所引发的高温，最高可使得人体的体温达到40℃，严重者甚至会出现休克的现象，因此，要注意对乳糖酸阿奇霉素注射液中存在的热原或者是内毒素进行检查，保障热原和内毒素符合用药标准，从而有效保障注射液的质量，进而保障病人的安全。

3.3试验使用两个不同厂家的鲎试剂，对3批样品分别进行了干扰试验。结果表明，高浓度乳糖酸阿奇霉素注射液对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应有干扰作用，在浓度稀释至6.25mg·mLˉ·时即可排除干扰作用。细菌内毒素检查法具有灵敏性好、操作简便、准确快速等优点，结果与家兔法（热原检查）一致，所以乳糖酸阿奇霉素注射液可直接用细菌内毒素检查法替代家兔法检查。

参考文献

[1]陈晓平.注射用乳糖酸阿奇霉素细菌内毒素检查[J].医药导报，2005，24（10）：946-947.

[2]国家药典委员会编.中国药典[S].2010年版.二部.2010，附录99-102.

细菌内毒素检查 篇4

关键词：注射用双嘧达莫,细菌内毒素,干扰实验

注射用双嘧达莫在临床上用于抑制血小板聚集,具有抗血栓形成的作用。由于《中国药典》2010年版、《美国药典》USP32-NF27 JP14版、《欧洲药典》7.0版、《英国药典》2010年版均未收载注射用双嘧达莫的质量标准,本文根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪE[1]中收载的检查方法及基本原理,对注射用双嘧达莫的细菌内毒素检查进行了研究,并建立了方法。现将结果报道如下:

1 仪器与试药

1.1 仪器

MS-1型旋涡振荡器(德国IKA);恒温水浴箱(德国Julabo 19A)。

1.2 试药

细菌内毒素检查用鲎试剂(购于广东湛江安度斯生物有限公司,灵敏度:0.125 EU/m L,规格:0.1 m L/支,批号:1011181),BET水(购于广东湛江安度斯生物有限公司,批号:1101040,规格:5.0 m L/支)。细菌内毒素检查用鲎试剂(购于广东湛江博康海洋生物有限公司,灵敏度:0.125 EU/m L,规格:0.1 m L/支,批号:1102130)。细菌内毒素标准品(购自中国药品生物制品检定所,批号:150601-201070、150601-201072,效价:140 EU/支、120 EU/支)。注射用双嘧达莫(多菲药业有限公司,批号:20100501、20100701、20100702)。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度(λ)的复核

上述两个批号鲎试剂经由细菌内毒素标准品(150601-201070)标定,结果均在0.5~2.0λb(标准灵敏度)之间,均符合《中国药典》2010年版的相关规定,并以λ作为该批鲎试剂的灵敏度。

2.2 注射用双嘧达莫细菌内毒素限值(L)的确定

根据注射用双嘧达莫的临床实际应用情况,本品成人临床1 d常用量为30 mg/60 kg,根据公式L=K/M(K为人用每千克体质量每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(kg·h)表示,注射剂K=5 EU/(kg·h);M为人用每千克体质量每小时的最大剂量,以m L/(kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示,人均体重按60 kg计算,注射时间按1 h计算。将本品细菌内毒素限值确定为L=5 EU/(kg·h)/30 mg/60 kg=10 EU/mg,结合安全系数为7考虑,计算出本品细菌内毒素限值为1.4 EU/mg。

2.3 最小有效稀释浓度(C)的确定

限值L为1.4 EU/mg时,根据公式C=λ/L,鲎试剂灵敏度为λ=0.125 EU/m L,计算出供试品溶液中双嘧达莫的最小有效稀释浓度为C=λ/L=0.089 mg/m L。

2.4 干扰预试验

选取灵敏度为0.125 EU/m L的鲎试剂,对批号为20100501的供试品进行稀释检验,稀释浓度分别为0.36、0.18、0.09、0.04、0.02 mg/m L,稀释过程具体为:取本品1瓶(5 mg)加BET水至2.0 m L(浓度为2.5 mg/m L),取稀释液0.6 m L加BET水至4.0 m L(浓度为0.36 mg/m L),取稀释液1.5 m L加BET水至3.0 m L(浓度为0.18 mg/m L),取稀释液1.0 m L加BET水至2.0 m L(浓度为0.09 mg/m L),取浓度为0.09 mg/m L的稀释液0.5 m L加BET水至1.0 m L(浓度为0.04 mg/m L),取浓度为0.09 mg/m L的稀释液0.25 m L加BET水至1.0 m L(浓度为0.02 mg/m L)。试验中另设两管阳性对照(PC)和两管阴性对照(NC),结果见表1。

由表1可见注射用双嘧达莫在浓度低于0.36 mg/m L时对鲎试剂检查无干扰作用。

2.5 干扰试验

取相同厂家三批注射用双嘧达莫,用BET水稀释,终浓度为0.09 mg/m L,分别用两个厂家灵敏度为0.125 EU/m L的鲎试剂进行干扰试验,结果见表2。

注:Es和Et分别表示2λ/检查用水溶液和2λ/供试品溶液的反应终浓度的几何平均值。

由表2可以看出,Es值均落在(0.5~2.0)λ之间,且相应的Et/Es比值均在0.5~2.0之间;这一结果说明注射用双嘧达莫在稀释至0.09 mg/m L浓度时对细菌内毒素检查无干扰作用,符合细菌内毒素检查有效性的要求。因此,可以确定注射用双嘧达莫的最大无干扰浓度为0.09 mg/m L。

2.6 样品检验

本品共3批,按《中国药典》2010年版二部附录ⅪE[1],分别进行细菌内毒素检查,结果见表3。

由表3可见NC均为阴性,PC和(样品+PC)均为阳性,表明实验有效。样品管均为阴性,表明3批样品中均未检出细菌内毒素,符合规定。

3 讨论

热原检查和细菌内毒素检查均为药品注射剂安全性检查项目,是否能采用细菌内毒素检查法检测热原质应视该注射剂对细菌内毒素实验是否存在干扰及这种干扰能否排除的情况而定[3]。由本文中结果可见,注射用双嘧达莫在浓度为0.36 mg/m L时对鲎试剂和细菌内毒素标准品之间的反应无干扰作用。文中通过干扰预实验及正式干扰实验证实了本研究中所用方法的可靠性与可行性。

《中国药典》2010年版、《美国药典》USP32-NF27 JP14版、《欧洲药典》7.0版、《英国药典》2010年版均未收载注射用双嘧达莫的质量标准,本研究根据注射用双嘧达莫最大临床日用量,确定其细菌内毒素限值为每1 mg双嘧达莫中含内毒素的量应小于1.4 EU,并对多菲药业有限公司生产的三批注射用双嘧达莫进行了细菌内毒素检查干扰试验。由于本次试验样品批次较少,建议进一步收集多厂家、多批次样品进行细菌内毒素方法学研究实验,如按上述实验进行,结果符合细菌内毒素检查方法的要求,可以拟定注射用双嘧达莫的细菌内毒素检查标准。

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录85.

[2]唐元泰.关于注射剂细菌内毒素检查限值的确定[J].中国药品标准,2003,4(4):5-6.

[3]黄清泉,夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志,1997,32(2):72-74.

[4]厉青,赵赤,苏静.奥硝唑注射液的细菌内毒素检查研究[J].西北药学杂志,2011,26(2):54-55.

[5]王莉,张红宇,刘勤,等.盐酸氨溴索注射液细菌内毒素检查法研究[J].中国药业,2011,20(5):31-32

[6]刘骅,武谷.复合维生素B注射液细菌内毒素检查法的研究[J].安徽医药,2011,15(2):247-249.

细菌内毒素检查 篇5

1 仪器与试剂

FZQ-2型漩涡混合器 (江苏太县医疗器械厂生产) ; DK-98-Ⅱ型热恒温水浴锅 (天津泰斯特仪器有限公司) ;0604-0113箱式电阻炉 (上海阳光实验仪器有限公司) ;BET-16M细菌内毒素测定仪 (天津大学生物精密仪器厂) ;细菌内毒素工作标准品 (效价 (150EU/ml) , 中国药品生物制品检定所生产, 批号:150601-200861) ;鲎试剂 (TAL) (灵敏度为0.03 EU/ml湛江博康海洋生物有限公司生产, 批号:0812062) ;细菌内毒素检查用水 (湛江博康海洋生物有限公司生产, 批号:081024) ;维生素C注射液 (石家庄以岭药业股份有限公司生产, 批号10060302-1、10060302-2、10060302-3) 。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的可靠性实验

配制细菌内毒素工作标准品溶液, 依据标准分别将其稀释成0.5、0.25、0.125、0.06 EU/ml的4个浓度的标准品溶液进行标准曲线的可靠性实验。阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间, 将全部的数据进行线性回归分析, 根据线性回归分析, 得出标准曲线方程lgT=2.98903+ (-0.42242lgC) 。标准曲线的相关系数r=0.9975>0.9800, 说明实验有效。结果见表1。

2.2 干扰实验

2.2.1 计算最大有效稀释倍数:

本品细菌内毒素限值L为0.020EU/mg, 限值L=100mg/ml×0.020 EU/mg=2.0EU/ml当λ=0.03EU/ml时, 供试品最大有效稀释倍数MVD=CL/λ=1.0ml/ml×2.0EU/ml/0.03EU/ml=66.7倍。

2.2.2 制备细菌内毒素工作标准品溶液:

同标准曲线的可靠性实验中标准品的稀释, 得到浓度为1.0、0.5与0.25EU/ml的系列溶液。

2.2.3 制备供试品阳性对照溶液:

用细菌内毒素检查用水稀释原液 (100mg/ml) , 得到2倍稀释液 (浓度50mg/ml) 、4倍稀释液 (浓度25mg/ml) 、8倍稀释液 (12.5mg/ml) , 16倍稀释液 (浓度6.25mg/ml) 、32倍稀释液 (浓度3.125mg/ml) 、64倍稀释液 (1.56mg/ml) , 取0.5EU/ml细菌内毒素工作标准品溶液0.5ml, 与等量的2、4、8、16、32、64倍稀释的供试品溶液混合制成含供试品的内毒素标准品溶液, 在旋涡混合器上混合30s。原液的阳性对照液参照标准品稀释方法。

2.2.4 准备鲎试剂:

(1) 细菌内毒素工作标准品系列:取鲎试剂6支, 分别加入0.6ml细菌内毒素检查用水复溶, 取2支内毒素平行管分别加入0.1ml BET水作为阴性对照, 再另取27支分别加入浓度为0.5、0.25与0.125EU/ml的内毒素标准品溶液0.1ml各3支, 然后将33支平行管分别加入0.1ml的鲎试剂, 用封口膜将瓶口封严, 将各管中溶液轻轻混匀, 放置于细菌内毒素检测仪中反应。 (2) 供试品系列:取鲎试剂21支, 加入0.6ml的细菌内毒素检查用水复溶, 其中2支平行管分别加入0.1ml的细菌内毒素检查用水, 作为阴性对照, 42支平行管分别加入各倍数稀释液0.1ml各2支, 作为供试品阴性对照。其余42支加入各稀释倍数供试品阳性对照液0.1ml各2只, 作为供试品阳性对照, 将105支平行管各加入0.1ml鲎试剂, 用封口膜将管口封严, 将各管中溶液轻轻混匀, 放置于细菌内毒素检测仪中反应。

2.2.5 结果观察:

通过细菌内毒素干扰实验检查, 使用灵敏度0.03EU/ml鲎试剂对供试品进行细菌内毒素检查, 样品在原液至64倍稀释时不存在干扰。见表2。

3 讨 论

通过上述试验, 维生素C注射液在细菌内毒素限值L<0.020EU/mg时, 用灵敏度0.03EU/ml鲎试剂, 供试品原液可进行细菌内毒素检查。利用定量测定法的优点在于能够正确显示样品中的真实含量, 且结果准确, 灵敏度高。使用定量仪器进行测试时还可观测到反应曲线, 因此动态浊度测量法值得广泛推广, 且3批维生素C注射液进行了兔法热原检查, 结果均符合规定。

摘要：目的 建立定量检测维生素C注射液细菌内毒素实验方法。方法 采用《中国药典》2005版 (二) 部附录检测细菌内毒素的动态浊度法。结果 维生素C注射液用细菌内毒素定量法检测无干扰因素影响, 内毒素回收率在50%200%范围内。结论 使用动态浊度法定量检测维生素C注射液的细菌内毒素是可行的。

关键词：维生素C注射液,细菌内毒素,动态浊度法,干扰实验

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部.中国药典[S].2005-07-01.

细菌内毒素检查 篇6

1 试验材料

鲎试剂[(TAL)批号:0607130,灵敏度:0.25 EU/ml,湛江博康海洋生物有限公司;批号:0603132,灵敏度:0.25 EU/ml,湛江安度斯生物有限公司;规格均为0.1 ml/支]。细菌内毒素工作标准品(批号:061225,规格:10 EU/ml,湛江博康海洋生物有限公司)。细菌内毒素检查用水[(BET水)批号:060207,规格:2 ml/支,湛江博康海洋生物有限公司]。血塞通注射液(批号:070622、070618,规格:10 ml/250 mg,江苏康宝制药有限公司;批号:20070411、20070306,规格:10 ml/250 mg,昆明兴中制药厂)。实验所用仪器均符合《中国药典》2005版二部要求。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核[2,3]

按《中国药典》2005版二部附录“细菌内毒素检查法”操作,用BET水将细菌内毒素工作标准品稀释成2.0、1.0、0.5、0.25λ的系列浓度后进行试验。结果表明,所用鲎试剂灵敏度均在0.50~2.00λ范围内,符合规定。

2.2 细菌内毒素限值(L)的确定[4]

根据公式L=K/M,其中,K为按规定的给药途径,人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量。注射剂K=5 EU(kg·h)。M为人或家兔用每千克体重每小时最大剂量,标准规定血塞通注射液热原用剂量为0.5 ml/kg。因此,L=K/M=50.5=10 EU/ml。

2.3 最大有效稀释倍数计算

根据公式MVD=cL/λ计算,选用灵敏度为0.25 EU/ml的鲎试剂检测血塞通注射液,其MVD为40倍。

2.4 干扰预试验[5]

选用λ为0.25 EU/ml的鲎试剂,用BET水将供试品稀释20、40、80、160倍,得到一系列供试品的稀释液(NPC),用上述供试品稀释液将细菌内毒素工作标准品制成2λ细菌内毒素标准溶液(PPC),同时作阴性对照(NC和阳性对照(PC),进行预试验。结果见表1。表明供试品至少稀释40倍对细菌内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用。

2.5 干扰试验

根据干扰预试验结果,选择供试品稀释倍数为40倍进行干扰试验。用BET水将4批供试品分别作40倍稀释,取供试品稀释液及BET水分别将细菌内毒素工作标准品稀释为2.0、1.0、0.5、0.25λ的系列浓度,分别用2个厂家λ为0.25 EU/ml的鲎试剂,按《中国药典》2005版(二部)附录细菌内毒素检查法对供试品进行干扰试验[6,7],结果见表2。结果显示,供试品稀释40倍以上时Es 0.50~2.00λ之间且Et在0.5~2.0 Es之间,可认为将供试品稀释40倍以上时,对细菌内毒素检查无干扰。

2.6 供试品细菌内毒素检查

取4批热原检查合格的血塞通注射液,按《中国药典》2005版二部附录细菌内毒素检查法,以灵敏度为0.25 EU/m的鲎试剂检查,结果见表3。结果表明,4批供试品细菌内毒素检查均符合规定。

3 讨论

血塞通注射液应用家兔法、细菌内毒素检查法2种方法检查,结果完全吻合,用细菌内毒素检查法试验操作简便、快捷且灵敏度高,克服家兔动物实验个体差异大、耗时、浪费资源的缺点,可用于日常检测。

本试验采用2个厂家的鲎试剂对4个不同批号的样品进行干扰试验。通过试验表明血塞通注射液稀释40倍后,对细菌内毒素检查法无干扰作用。证明血塞通注射液经40倍稀释后,可用细菌内毒素检查法代替热原检查法控制其质量;其细菌内毒素限值可定为:每毫升应小于10 EU/ml。

摘要：目的:建立血塞通注射液中细菌内毒素检查法。方法:用不同厂家的鲎试剂对不同批号的血塞通注射液分别进行干扰试验,考察确立血塞通注射液细菌内毒素检查法。结果:血塞通注射液经40倍稀释后可消除干扰。结论:用本法检查血塞通注射液中的细菌内毒素是可行的。

关键词：血塞通注射液,鲎试剂,细菌内毒素

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部药品标准:中成药成方制剂[S].第19册:77.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京:化学工业出版社,2005:附录85-88.

[3]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S].北京:中国医药科技出版社,2005:287.

[4]张军红.复方泛影葡胺注射液细菌内毒素检查法[J].中国药品标准,2006,7(3):56-58.

[5]王宗春.灯盏细辛注射液中细菌内毒素检测方法的研究[J].中国现代应用药学杂志,2006,23(2):148-150.

[6]雷卫平.痰热清注射液中细菌内毒素检测方法[J].中国药业,2006,15(8):31.

细菌内毒素检查 篇7

1 仪器与试药

注射用复方甘草酸苷(批号:050412、050415、050418,规格:复方制剂,每瓶含甘草酸苷40 mg、甘氨酸400 mg、盐酸半胱氨酸20 mg,安徽省新星药物开发有限责任公司)。鲎试剂(批号:04102012,规格:0.25 EU/ml、0.1 ml/支,福州新北生化工业有限公司;批号:0406072,规格:0.25 EU/ml,0.1 ml/支,浙江安度斯生物有限公司),以上鲎试剂灵敏度经复核符合规定。细菌内毒素工作标准品(批号:2003-10,规格:100 EU/支,中国药品生物制品检定所)。细菌内毒素检查用水(批号:030619,规格:5 ml/支,湛江安度斯生物有限公司)。

2 方法和结果

2.1 细菌内毒素限值L的确定

根据细菌内毒素的计算公式:L=K/M,其中L为细菌内毒素的限值,即按规定的给药途径人每公斤体重每小时可接受的内毒素剂量;K为人体静脉注射液的致热域,即K=5 EU/kg,M为每公斤体重每小时最大的药物剂量,为200 mg/60 kg/h(按甘草酸苷计算),L=K/M=1.5 EU/mg,据此将本品的细菌内毒素限值确定为1.5 EU/mg(按甘草酸苷计算)。

2.2 供试品干扰试验预试验

根据供试品内毒素限值(L)为1.5 EU/mg,取本品1瓶,加细菌内毒素检查用水2 ml溶解后,分别用细菌内毒素检查用水稀释成1∶10、1∶60、1∶120、1∶240系列浓度的溶液,将1∶10、1∶60、1∶120、1∶240的系列溶液记为NPC(供试品阴性对照),同时在1∶10、1∶60、1∶120、1∶240的系列溶液中添加等体积细菌内毒素工作标准品制成的溶液记为PPC(供试品阳性对照),每个浓度平行做2支,同时作阳性、阴性对照管,结果见表1。

结果表明,注射用复方甘草酸苷对细菌内毒素检查有干扰,需稀释240(即试验中的1∶120)倍以上,方能消除干扰作用。

2.3 供试品干扰性试验

用供试品溶液(1∶240)及细菌内毒素检查用水分别将细菌毒素工作标准品稀释成0.500λ、0.250λ、0.125λ、0.060λ不同浓度的细菌内毒素溶液,每一浓度平行做4支,另取细菌内毒素检查用水和供试品稀释液各做2支阴性对照管。取两个不同厂家生产的鲎试剂,依法进行供试品干扰试验(《中国药典》2005版二部附录ⅪE)。结果见表2-a,2-b。

鲎试剂(批号:04102012,规格:0.25 EU/ml)

鲎试剂(批号:0406072,规格:0.25 EU/ml)

经用两个厂家生产的鲎试剂进行的干扰性试验,结果Es为0.5~2.0λ,Et在0.5~2.0 Es,本品按1∶240稀释后对细菌内毒素检查无干扰作用。

2.4 供试品的细菌内毒素检测

取本品,依法检查(中国药典2005版二部附录ⅪE),按甘草酸苷计算,每毫克甘草酸苷中含内毒素量应<1.5 EU,结果见表3。

结果表明,三批样品的细菌内毒素检查符合规定。

3 讨论

经采用两个厂家的鲎试剂,对注射用复方甘草酸苷连续三个批号进行了干扰确证试验,结果表明本品经1∶240稀释后无干扰作用,可进行细菌内毒素检查代替热原检查。根据以上结果,确证注射用复方甘草酸苷的细菌内毒素检查方法如下:取本品,依法检查(《中国药典》2005年版二部附录ⅪE),按甘草酸苷计算,每毫克甘草酸苷中含内毒素量应<1.5 EU。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:化学工业出版社,2005:附录ⅪE86-87.

[2]桑国卫.中国药品检验标准操作规程[S].北京:中国医药科技出版社出版,2005:287.

[3]张德波.注射用水溶性维生素细菌内毒素检查法质量标准研究[J].中国药品标准,2008,9(3):198-201.

[4]国明.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析[J].中国药品标准,2008,9(1):46-49.

[5]童立年.注射用盐酸兰地洛尔的细菌内毒素检查法[J].中国药业,2008,17(24):29.

细菌内毒素检查 篇8

1 仪器与试药

1.1 仪器

ZH-2自动旋涡混合器(天津药典标准仪器厂);BET细菌内毒素检查仪(天津药典标准仪器厂)。细菌内毒素检查用器具均经250℃干烤1 h以上去除热原,放冷使用。

1.2 试药

细菌内毒素工作标准品(CSE)(中国药品生物制品检定所,批号:150601-200963,规格:120 EU/支);鲎试剂(TAL,λ=0.5 EU/ml,湛江安度斯生物有限公司,批号:0904172、0912181;湛江博康海洋生物有限公司,批号:0903113、0912260);细菌内毒素检查用水(WBET,湛江安度斯生物有限公司,批号:0908280,规格:50 ml/支)。复方磷酸盐注射液(自制,批号:100204、100523、100613,规格:10 ml/支,家兔热原检查合格)。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确定[2]

根据公式:细菌内毒素限值(L)=K/M。依据药品使用说明书,成人每次用量为1支(10 ml),将本品加入5%或10%葡萄糖注射液500 ml中进行输注,在2 h内缓慢输注完毕。公式中,M为人用每公斤体重每小时最大剂量,中国人均体重按60 kg计,则M=10 ml/(60 kg·2 h)=0.083 3 ml/(kg·h),K为人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,静脉给药时K=5.0 EU/(kg·h),则L=5.0 EU/(kg·h)/0.083 3 ml/(kg·h)=60 EU/ml。考虑到临床联合用药的安全性和细菌内毒素的累加性[3,4],在上述计算限值基础上将限值要求提高10倍,由此确定复方磷酸盐注射液的细菌内毒素限值为6 EU/ml。

2.2 鲎试剂灵敏度(λ)复核

按照《中国药典》2010年版二部鲎试剂“灵敏度复核”项下对2个厂家的TAL进行复核,λc在0.5λ~2.0λ之间,均符合规定。其中阳性指形成凝胶且倒置不变形滑落,阴性指指未形成凝胶或形成凝胶但倒置后变形滑落。鲎试剂灵敏度复核试验结果,见表1。

注:“+”代表试验结果呈阳性,“-”代表试验结果呈阴性

2.3 供试品的干扰试验

2.3.1 最大有效稀释倍数(MVD)的确定

按公式MVD=CL/λ,式中L为供试品的细菌内毒素限值,λ为测试用鲎试剂的灵敏度标示值,C表示供试品的浓度,目前市售鲎试剂λ通常在0.50~0.03 EU/ml之间,对应的有效稀释倍数为12、24、48、100、200。

2.3.2 干扰预试验

取复方磷酸盐注射液原液,并用WBET分别将其稀释6、12、24、48、100、200倍制成溶液,作为供试品溶液(NPC)系列。另制备具有相同浓度的供试液,且每一浓度的供试液中均含2λ内毒素浓度(1 EU/ml)的供试液,作为供试品阳性(PPC)系列。取2个厂家的TAL(λ为0.5 EU/ml)分别与上述NPC、PPC系列反应,每一浓度重复2次,并按常规设阳性管(PC)和阴性管(NC)对照。预试验结果表明,复方磷酸盐注射液原液对鲎试剂凝集反应不存在干扰现象。见表2。

注:“+”代表试验结果呈阳性,“-”代表试验结果呈阴性

2.3.3 正式干扰试验

为了最终确认复方磷酸盐注射液原液对鲎试剂凝集反应是否存在干扰,将供试品原液和WBET分别将CSE制成含内毒素浓度为1.000、0.500、0.250、0.125 EU/ml的系列溶液(分别为PPC系列和NPC系列),与2个厂家共4个批号的TAL(λ均为0.5 EU/ml)反应,每一浓度平行4管,并设阴性对照(NC)。正式干扰试验结果见表3。

注:“+”代表试验结果呈阳性,“-”代表试验结果呈阴性

结果表明,2个厂家4个批号的TAL结果Es均在0.5λ~2.0λ范围内,Et均在0.5Es~2.0Es之间,符合《中国药典》2010年版(二部)附录细菌内毒素检查法中的规定。由此确定复方磷酸盐注射液原液为细菌内毒素检查中无干扰的最小有效稀释倍数。

2.4 复方磷酸盐注射液细菌内毒素检查

取3批经热原检查合格的复方磷酸盐注射液原液,使用灵敏度为0.5 EU/ml的2个不同厂家的鲎试剂,按《中华人民共和国药典》2010年版(二部)附录XI E规定的细菌内毒素凝胶限量检查法对样品分别进行检测。复方磷酸盐注射液细菌内毒素检查结果,见表4。

注:“+”代表试验结果呈阳性,“-”代表试验结果呈阴性

综上所述,3批复方磷酸盐注射液的细菌内毒素含量均小于6 EU/ml。结果提示,复方磷酸盐注射液原液对鲎试剂与细菌内毒素凝集反应无干扰作用,可适用于细菌内毒素的检查。

3 讨论

细菌内毒素限值标准要求定太高可能会使很多批次不能通过检查,从而造成浪费;标准要求定太低则不能保证药品质量,危及临床用药安全,所以细菌内毒素限值的确定需结合临床用药实际,要具合理性。

对复方磷酸盐注射液样品进行细菌内毒素检查时,可以在MVD范围之内,即小于MVD的倍数下进行试验,从而减少污染环节,使操作更为便捷、经济。如果供试品溶液在以不超过MVD的某个稀释倍数稀释,检测结果为阳性时,可对供试品溶液进行进一步稀释但不能超过MVD,再重新进行试验。

复方磷酸盐注射液原液对鲎试剂凝集反应无干扰作用,可采用《中国药典》2010年版二部细菌内毒素检查法,用灵敏度为0.5 EU/ml的鲎试剂对复方磷酸盐注射液进行检测。结果表明,本法操作简单,灵敏快捷、实用性强,并经我院多年临床使用验证,该方法安全可靠,可用于复方磷酸盐注射液的细菌内毒素检查。

摘要：目的:建立复方磷酸盐注射液细菌内毒素检查方法。方法:采用《中国药典》2010年版二部细菌内毒素检查法进行干扰试验。结果:复方磷酸盐注射液原液对细菌内毒素的检测无干扰作用。结论:复方磷酸盐注射液的细菌内毒素限值确定为6 EU/ml,所建方法可用于复方磷酸盐注射液的细菌内毒素检查。

关键词：复方磷酸盐注射液,细菌内毒素检查法,干扰试验

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录XI85-88.

[2]王海燕.从细菌内毒素累加的性质看全面质量管理[J].中国现代医生,2007,45(13):102-103.

[3]李楚云,陈健红,詹云丽.开展药学服务控制输液热源反应[J].中国现代药物应用,2010,4(6):218-219.

细菌内毒素检查 篇9

1 材料与方法

1.1 材料

鲎试剂(规格:灵敏度λ=0.5 E U·m L-1,0.1 m l/支,批号:0508221,湛江安度斯生物有限公司;批号:0509240,湛江海洋生物有限公司)。细菌内毒素检查用水(批号:0503120,规格:5mL/支),无热原安瓿,无热原吸头,均由湛江安度斯生物有限公司提供。细菌内毒素国家标准品(批号:2 0 0 5-1 2,规格:1 5 0 E U/支,中国药品生物制品检定所);银杏达莫注射液(规格:5mL/支,贵州益佰制药股份有限公司产品,批号:20051003,20051209,20060304)。

1.2 仪器

细菌内毒素检查干式恒温器,上海跃进医疗器械厂,型号DC-3A型;旋涡混合器,上海医科大学仪器厂,型号:XW-80A型;电热恒温水浴箱,上海跃进医疗器械厂,型号:HHS-I型。

1.3 细菌内毒素限值(L)的确定

根据公式L=K/M[5],K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量以EU/(kg·h-1)表示,静脉用药为5EU/(kg·h-1);M为人用每千克体重每小时最大供试品剂量,以mg/(kg·h-1)表示,人均体重按60kg计,本品每日每次用量25mL,加500mL氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液中静脉缓慢滴注,约4小时滴完,其细菌内毒素限值:

L=K/M=5EU/(kg·h-1)/(25mL/60kg×4h)=48EU·mL-1。鲎试剂灵敏度(λ)复核试验[5]按细菌内毒素检查法(中国药典2005年版二部附录)试验。

1.4 最大有效稀释倍数(MVD)的确定

根据公式MVD=LC/λ,其中L为供试品的细菌内毒素限值,C为供试品溶液的浓度,λ为鲎试剂的灵敏度值,当鲎试剂的灵敏度值为0.5EU·ml-1时,银杏达莫注射液的最大有效稀释倍数MVD1=LC/λ=48×1/0.25=96倍。

1.5 供试品干扰试验

1.5.1 干扰试验预试验

加水将供试品配制成8、1 6、3 2、6 4、9 6、1 9 2倍6个浓度稀释溶液。另外配制的上述相同浓度的稀释溶液,并且每个浓度含2λ(1EU·ml-1的细菌内毒素)。

取鲎试剂若干支,先分别加入0.1mlBET水溶解,再分别取0.1ml上述供试品稀释溶液和含有(2λ)细菌内毒素的供试品稀释溶液制成样品反应管,同时设阴性对照,37摄氏度孵育60分钟后观察结果。

1.5.2 干扰试验

由干扰初筛试验结果可知,用细菌内毒素检查用水将3批供试品64倍稀释溶液进行确证试验。取水分别将细菌内毒素工作标准品稀释成1.0、0.5、0.25、0.125倍四个浓度的细菌内毒素溶液,另用3批64倍的供试品稀释溶液将其制备成含有1.0、0.5、0.25、0.125倍细菌内毒素的供试品溶液,再用细菌内毒素检查用水和3批64倍的供试品稀释液各做2支阴性对照,每稀释浓度做4管,37摄氏度孵育60分钟后观察结果。

1.6 银杏达莫注射液的成品检查

将供试品用水配制成64倍供试品稀释溶液,然后用λ=0.5EU·ml-1的鲎试剂进行试验,并设供试品阳性对照(2?),阴性对照和阳性对照(2λ),再取λ=0.5EU·ml-1的鲎试剂32支,分别用0.1mL水溶解,再加入各种配制好的药品稀释液0.1mL,每种药液平行做2管,37摄氏度孵育60分钟后观察结果。

2 结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核结果

见表1,试验结果表明,复核灵敏度λc=λ,鲎试剂灵敏度均在合格范围。

2.2 干扰试验预试验结果

求最高无干扰浓度试验结果见表2,从求最高无干扰浓度试验结果看,供试品溶液稀释倍数在64倍或64倍以上时,对以上两个厂家的鲎试剂均未产生干扰作用,因此根据上述结果初步选定供试品溶液的有效稀释倍数为64倍。

2.3 干扰试验结果

供试品64倍稀释溶液的干扰试验结果表3,从表3可知,Es和Et都在0.5～2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时,供试品64倍稀释溶液使用0.5EU·ml-1的鲎试剂(批号0408221和0409240),通过干扰试验验证说明供试品64倍稀释溶液对细菌内毒素检查无干扰作用。

2.4 样品细菌内毒素检查试验

结果见表4,由样品细菌内毒素检查试验结果可知,银杏达莫注射液按细菌内毒素检查指导原则试验,可以用稀释方法排除干扰,对供试品可以用细菌内毒素检查法来检测细菌内毒素。

注:B液:样品管;P C:阳性对照管;P P C:样品阳性对照管;NC:阴性对照管

3 讨论

细菌内毒素检查是指热原检查的体外检查方法,中国药典1995年版收载细菌内毒素检查品种14种,发展到2000年版已达69个品种,2005年版增加到205个品种。为了尽早与国际接轨,增加细菌内毒素检查法的品种和数量,笔者通过试验验证建立银杏达莫注射液的细菌内毒素检查法的可行性。银杏达莫注射液说明书中规定用法为静脉滴注,通常静脉滴注须做热原或细菌内毒素检查。本试验表明,通过干扰试验预试验可知银杏达莫注射液的64倍以上稀释溶液对鲎试剂干扰作用消失,三批样品检查结果均表明,银杏达莫注射液细菌内毒素含量小于48EU·ml-1,由于细菌内毒素检查法具有操作简单、灵敏度高、重现性好、实用性强的优点,故可以用本方法来检查银杏达莫注射液的细菌内毒素含量,以达到安全用药的目的。本文先通过干扰初筛试验确定供试品的有效稀释浓度,再由干扰试验进一步验证,从而减少干扰试验的盲目性。不同鲎试剂对样品的反应是有差异的,本试验采用两种不同厂家的鲎试剂同时进行试验,得到了一致的结果,说明鲎试剂可以用于本品的细菌内毒素检查。本品经64倍稀释,用0.5EU·ml-1的鲎试剂进行细菌内毒素检查是可行的。

摘要：目的建立银杏达莫注射液的细菌内毒素检查法。方法按《中国药典》2005年版(二部)收载的细菌内毒素检查方法及指导原则进行实验。将银杏达莫注射液经64倍稀释,用标示灵敏度为0.5Eu.ml-1的鲎试剂检测其细菌内毒素。结果银杏达莫注射液稀释64倍对鲎试剂无干扰作用。结论可以用细菌内毒素检查法对银杏达莫注射液进行热原检查。

关键词：银杏达莫注射液,细菌内毒素检查法,干扰试验

参考文献

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