高效液相色谱/质谱分析蘑菇柄中5′-核苷酸

高效液相色谱/质谱分析蘑菇柄中5′-核苷酸（精选5篇）

篇1：高效液相色谱/质谱分析蘑菇柄中5′-核苷酸

高效液相色谱/质谱分析蘑菇柄中5′-核苷酸

采用高效液相色谱/质谱法，对蘑菇柄中5′-核苷酸进行了分析。在C18柱上，以含0.05%磷酸的水-甲醇(95/5,V/V)为流动相进行了分离，检测波长260 nm。以HPLC与LC/MS复合定性蘑菇柄中5′-核苷酸为5′-鸟苷酸、5′-尿苷酸、5′-腺苷酸和5′-胞苷酸。采用外标法定量，它们的回收率分别为98.9%、95.1%、94.1%和101.4%，检测限分别为2.8、2.7、3.5和4.3 mg/L。

作 者：邹耀洪 曹学增 汪学英 作者单位：常熟高等专科学校生物化学系,刊 名：分析化学 ISTIC SCI PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY年，卷(期)：29(7)分类号：Q5关键词：高效液相色谱/质谱 蘑菇柄 5′-核苷酸

篇2：高效液相色谱/质谱分析蘑菇柄中5′-核苷酸

液质联用(HPLC-MS)又叫液相色谱-质谱联用技术,它以液相色谱作为分离系统,质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补,将色谱对复杂样品的高分离能力,与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来,在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。

本文就工作中使用高效液相色谱-质谱分析仪器对氮杂环类有机物的测试方法开发做出讨论。分析的样品来自实验室合成的药物中间体的一部分,做LC-MS测试的目的在于得知样品真实的纯度和质谱信息,确定有机化合物的含量和结构。

1 液相色谱-质谱联用技术

1.1 液相色谱技术

1903年,俄国植物学家茨维特创立了液相色谱[1]。他在研究植物叶的色素组成时将一玻璃管中放入碳酸钙,将含有植物色素(植物叶的提取液)的石油醚倒入管中。此时,玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗,随着石油醚的加入,谱带不断地向下移动,并逐渐分开成几个不同颜色的谱带,继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素,并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。现在的色谱法早已不局限于色素的分离,其方法也早已得到了极大的发展,但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。

到20世纪60年代以后,随着使用方便的紫外检测器的发明和微粒型硅胶的出现,液相色谱才得以飞速发展,并成为分析分离的利器。从色谱出现的百年历史说明,色谱仪是揭开生命奥秘的有力工具,是应用最为广泛和应用十分成功的仪器[2,3]。

高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。高效液相色谱不受样品挥发度和热稳定性的限制,非常适合于分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的离子型化合物、高聚物等的分离及分析。这些物质大约占有机化合物总数的70%-80%[4]。

1.2 液质联用技术

LC和MS的联用,使得液相色谱可以获得比紫外检测更多的信息。HPLC可以直接分离不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物(包括蛋白质、多肽、多糖和多聚物等);MS灵敏度高,样品用量少,分析速度快,可得到更多的化合物的结构信息。目前先进的质谱仪,还同时具备了分析分子结构的能力,即通过应用母离子扫描、子离子扫描、中性丢失等先进技术,对待测样品的结构进行分析判定[5,6]。

2 液质联用技术在核苷类有机物分析中的应用

含氮碱与糖组分缩合成的糖苷叫核苷。原指来自核酸的嘌呤和嘧啶糖苷,现已扩展至其他天然和合成的杂环碱基核糖苷,也包括糖上的C1连接到杂环碱的氧原子或碳原子上的化合物。由碱基和五碳糖(核糖或脱氧核糖)连接而成,即嘌呤的N-9或嘧啶的N-1与核糖或脱氧核糖的C-1通过β糖苷键连接而成的化合物,包括核糖核苷和脱氧核糖核苷两类。构成RNA的核苷是核糖核苷,主要有腺苷、鸟苷、胞苷和尿[7,8,9]。构成DNA的核苷是脱氧核糖核苷,主要有脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸腺苷。

核苷是核酸的主要组分。有些核苷及其衍生物具有显著的生理功能,如次黄嘌呤核苷(肌苷)可治疗急性和慢性肝炎及风湿性心脏病,并有增加白血球等功效。

核苷类化合物的化学稳定性较差,在LC-MS分析过程中需要尽量避免强酸性的流动相检测环境。

当LC-MS的流动相酸性较高时,化合物会分解,反映到液质谱图中则出现无法解释的杂质峰(图1)

图5中保留时间为2.602的峰无法解释,怀疑是在检测过程中接触了酸性流动相而分解,于是更换偏中性的流动相的检测体系,问题得以解决(图2):

改变流动相组成和洗脱梯度之后,可以判定样品的纯度较高。因此核苷类化合物的LC-MS分析中需要控制流动相的PH值以便检测结果真实准确。

3 结论

本文主要针对LC-MS检测有机化合物过程中遇到的几种问题展开讨论,在分析过程中需要针对不同化合物的物理化学性质进行分析方法的开发。

对于核苷类化合物,需保证样品在检测过程中不发生化学变化,真实反映样品的纯度。核苷类化合物的化学稳定性较差,在LC-MS分析过程中需要尽量避免强酸性的流动相检测环境。

摘要：高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术的应用领域极为广阔,有机化合物中有许多可以用液相来进行分析,再加上ESI能够产生多电荷离子的特点,已经让LC-MS技术开始应用到了许多新类型化合物的分析。本文首先介绍了LC-MS联用的基本原理以及发展情况;然后主要运用LC-MS方法对核苷类有机物的定性研究。

关键词：高效液相色谱-质谱联用,色谱分析,核苷类有机物

注释

1[1]贺浪冲.色谱分析发展简史及文献.西北药学杂志,1996, 11(S1):59-61.

2[2]Snyder L R,et al.Introduction to modern liquid chromatography. 2nd.New York:Wiely Interscience,1979.

3[3]林炳承等.高效液相色谱在生命科学中的应用.济南:山东科学技术出版社,1996.

4[4]Skoog D A,et al.Principle of instrumental analysis.5 edition.New York:Saunder college publishing,1997.

5[5]Niessen W M A,Tinke A P.Liquid chromatography-mass spectrometry General principles and instrumentation.Journal of Chromatography A,1991,703(1-2),37-57.

6[6]Niessen W M A.Stae-of-the-art in liquid chromatography-mass spectrometry,Journal of Chromatography A, 1999,856,179-197.

7[7]Chen Ping,et al.J chromatogr B,2006,843(2),183

8[12]吴皓等,RP-HPLC法同时测定半夏中5中核苷含量的研究.Chin J Pharm Anal,2007,27(7),1051-1054

9[8]程舟等,HPLC定量分析冬虫夏草的主要核苷类有效成分.Journal of Chinese Medicinal Marrials,2008,3 1(1),58-60

篇3：高效液相色谱/质谱分析蘑菇柄中5′-核苷酸

关键词：核苷酸,婴幼儿配方奶粉,静电场轨道阱高分辨质谱

核苷酸是生物体内重要的低分子化合物, 具有许多生理功能, 可作为脱氧核糖核酸 (DNA) 、核糖核酸 (RNA) 的前体, 也可作为生理、生化过程的调节物质参与体内物质代谢。核苷酸的主要生理功能是广泛参与人体的能量代谢、蛋白质合成, 具有提高各种酶的活性、活化细胞功能、促进抗体形成、增强免疫力的功能。一些临床上的研究发现, 添加核苷酸的婴儿配方奶粉可减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育[1]。

牛奶中一般不含有核苷酸, 作为添加剂添加的核苷酸主要有5种———一磷酸胞嘧啶核苷 (CMP) 、一磷酸脲嘧啶核苷 (UMP) 、一磷酸腺嘌呤核苷 (AMP) 、一磷酸鸟嘌呤核苷 (GMP) 和一磷酸次黄嘌呤核苷 (IMP) 。在现行的婴幼儿配方奶粉国家标准中未规定核苷酸的指标, 但因为核苷酸对婴幼儿有特殊功效, 许多企业特别是国外独资或我国大型乳品企业的标准中都将其作为重要指标[2], 为此必须尽快研究制定适用于乳制品核苷酸添加剂的检测方法。

目前, 国内外测定核苷酸的方法主要有高效毛细管电泳法[3,4]、高效液相色谱法[5,6]及离子交换色谱法等[7,8]。毛细管电泳法受到进样量小、检测池光路短等限制, 存在定量重现性差、灵敏度低等不足;高效液相色谱法则受到色谱柱柱效的制约, 造成GMP和IMP无法基线分离以及实际奶粉样品中干扰物无法与AMP分离, 从而无法准确定性和定量;在离子交换色谱分离5种核苷酸时, 由于奶粉中还存在大量其他寡核苷酸而极易受到干扰, 且离子色谱分析时间较长, 不适用于日常监测。

本研究利用高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术的高灵敏度和强抗干扰能力等特点, 通过高分辨质谱全扫描模式提取目标化合物的精确质量数, 利用阈值自动触发全扫描二级质谱, 在一定程度上消除了基质干扰, 且样品前处理方式较为简单, 可同时快速筛选和确证婴幼儿配方奶粉中的5种核苷酸。通过实际样品检测, 验证了该方法的有效性, 为相关部门制定相应法律法规提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料

四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪Q-Exactive (赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific公司) , 配置有H-ESI II源, 液相色谱系统为Dionex3000高压液相色谱, 带自动进样器;ELGA-Q15高纯水发生器 (英国ELGA公司) 。

一磷酸胞嘧啶核苷 (CMP) 、一磷酸脲嘧啶核苷 (UMP) 、一磷酸腺嘌呤核苷 (AMP) 、一磷酸鸟嘌呤核苷 (GMP) 和一磷酸次黄嘌呤核苷 (IMP) 5种核苷酸均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司, 纯度大于等于99%, 5种核苷酸的详细信息见表1;乙腈和甲酸 (色谱纯) 购自德国Merck公司;实验用水均为去离子水。

1.2 标准溶液的配制

分别称取5种核苷酸标准品各100 mg于10 m L容量瓶中, 用超纯水溶解, 配制成10 g/L的标准储备液, 密封保存于4℃冰箱中。再分别准确吸取10 g/L的5种标准储备液各1 m L于100 m L容量瓶中, 用超纯水定容得100 mg/L的混合标准溶液。使用前用初始流动相将混合标准溶液稀释成系列标准溶液。

1.3 样品前处理

准确称取奶粉样品5.0 g于50 m L聚四氟乙烯塑料离心管中, 用20 m L温水涡旋溶解充分后转移至50 m L容量瓶中;采用3种方式沉淀蛋白:乙腈沉淀, 0.1% (v/v) 甲酸沉淀, 调p H值沉淀;定容混合均匀, 35℃水浴超声振荡15 min, 取出冷却至室温;于4℃以8 000 r/min离心5 min, 取适量中层清液过0.22μm的水相滤膜至进样瓶中, 供高效液相-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪测定。对3种沉淀方式进行比较。

1.4 仪器条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-Aq (250 mm×4.6mm×5.0μm) ;

流动相:A, 0.1% (v/v) 甲酸水溶液;B, 乙腈。梯度洗脱程序:0.0~3.0 min, 90%A;3.0~4.0 min, 90%~50%A;4.0~8.0 min, 50%A;8.0~9.0 min, 50%~90%A;9.0~12.0 min, 90%A。流速:0.40 m L/min;柱温:室温;进样体积:10μL;分析时间:12 min。

质谱条件:加热电喷雾离子化源 (ESI) 320℃;毛细管电压:3 200 V (负离子) ;扫描范围:100~5 000m/z;分辨率:R=35 000;鞘气、辅助气和碰撞能量均优化至最佳。

2 实验结果和讨论

2.1 前处理条件优化

按照1.3节所述方法处理加标奶粉样品。采用3种方式沉淀蛋白, 即乙腈沉淀、0.1% (v/v) 甲酸沉淀、调p H值沉淀 (用稀盐酸溶液调p H至1.7, 静止1 min后再用氢氧化钠调p H至4.6) 。通过溶液的澄清度以及选择离子流色谱图中杂质峰的数量来判断3种沉淀方式的好坏。结果表明, 在3种沉淀方式中, 0.1% (v/v) 甲酸和调p H值沉淀后的溶液澄清度要优于乙腈沉淀。但在调p H值沉淀蛋白的选择离子流色谱图中, 一磷酸脲嘧啶核苷 (UMP) 和一磷酸次黄嘌呤核苷 (IMP) 均存在干扰物质影响, 分析物无法与干扰物基线分离, 从而影响定量的准确性, 如图1所示。而采用0.1% (v/v) 甲酸沉淀时, 5种核苷酸选择离子流色谱峰形最佳, 如图2所示, 杂质峰去除较干净。最终选择0.1% (v/v) 甲酸作为沉淀方式。

2.2 色谱柱和流动相的选择

考虑到核苷酸的极性较大, 在普通碳十八色谱柱上没有保留, 因此本实验选择Agilent ZORBAX SB-Aq (250 mm×4.6 mm×5.0μm) 、 (150 mm×4.6 mm×5μm) 、Phenomenex NH2柱 (250 mm×4.6 mm×5μm) 和Phenomenex HILIC (50 mm×2.1 mm×2.6μm) 三种亲水性较好的色谱柱对化合物进行测试。结果发现, 5种核苷酸标准溶液在3种不同性质的亲水色谱柱上均有较好的保留, ZORBAXSB-Aq柱和HILIC柱上色谱峰形优于NH2柱。但在加标和实际样品分析过程中, 发现HILIC色谱柱耐用性较差, 随着分析样品数量的增加, 色谱峰变形, 结果重复性下降。因此, 选择耐用性相对较好的Agilent ZORBAXSB-Aq (250 mm×4.6 mm×5.0μm) 作为分析色谱柱。当流动相为水和乙腈时, 5种核苷酸的峰型不佳, 而流动相加入适量甲酸不仅有利于5种核苷酸保留, 且峰型相对对称。本实验先后比较了0.05%、0.1%和0.5%甲酸对5种核苷酸对Agilent ZORBAX SB-Aq保留效果的影响, 结果表明在0.1%甲酸条件下, 5种核苷酸的保留和峰型最好, 且不影响离子化效率。因此最终将流动相定为0.1%甲酸水溶液和乙腈。

2.3 质谱条件的优化

在全扫描采集模式下得到一级全扫描质谱图, 以各化合物的准分子离子[M-H]-理论精确质量数提取色谱图。图2为婴幼儿配方奶粉中添加5种核苷酸选择离子流色谱图 (添加水平50 mg/kg) 。在分辨率R=70 000的情况下, 5种核苷酸分析物相对质量偏差小于10×10-6。使用高分辨质谱进行残留分析, 只采集一个母离子不能满足相关法规指令中规定的定性最低要求[9,10], 必须进行二级质谱离子扫描以获得足够多的定性息。本方法中采用自动触发二级质谱采集5种核苷酸的二级质谱图, 选择丰度相对较高的碎片离子作为第二定性离子。

2.4 方法的线性范围、回收率、精确度

按1.2制备5种核苷酸的标准储备液各100 mg/L, 用乙腈-水 (10:90, v/v) 稀释标准工作液, 依次得到含量为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/m L的标准溶液, 按优化后的仪器条件测定, 外标法定量。以5种核苷酸特征离子的质量色谱峰面积为纵坐标、含量为横坐标, 绘制标准曲线。5种核苷酸的相关系数 (r) 均大于0.99, 表明5种核苷酸在1.0~50.0μg/m L范围内线性关系良好。以信噪比S/N大于10且回收率和精密度较好的浓度点确定定量下限 (LOQ) , 得到5种核苷酸的LOQ均为10.0 mg/kg (AMP5.0 mg/kg, CMP5.0 mg/kg, UMP10.0 mg/kg, IMP5.0 mg/kg, GMP10.0 mg/kg) 。

本实验选择了一种常见品牌的婴幼儿配方奶粉, 其5种核苷酸本底值依次为AMP50.0 mg/kg、CMP82.0 mg/kg、UMP57.0 mg/kg、IMP33.0 mg/kg、GMP17.0 mg/kg, 添加水平分别为10.0、50.0、100.0 mg/kg, 每个添加水平测定5次, 计算得到的平均回收率见表2。通过表2可看出在10.0、50.0、100.0 mg/kg这3种加标水平下, 5种核苷酸的平均加标回收率分别为76.7%~99.1%、78.2%~100.9%、75.7%~101.9%;相对标准偏差 (RSD) 分别为6.5%~14.9%、5.1%~13.7%、4.7%~13.7%, 可以满足日常样品分析要求。

3 结论

本实验建立了高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法同时检测确证婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸的检测方法。奶粉样品用0.1% (v/v) 甲酸沉淀蛋白质、脂肪等杂质, 高速离心后直接进样。该方法具有准确度高、适用性强、简单、快速等特点, 可用于日常婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸的检测。

参考文献

[1]邓泮, 钟大放, 陈笑艳.LC/MS技术在寡核苷酸类药物生物样品定量分析和代谢物鉴定中的应用[J].质谱学报, 2011, 32 (1) :13-23.

[2]张秋梅, 郝岩平, 宋戈.高效液相色谱法测定乳粉中的核苷酸[J].中国乳品工业, 2009, 37 (4) :51-54.

[3]薛雄志, 邓永智, 袁东星.高效毛细管电泳法分析单核苷酸[J].福建分析测试, 1995, 4 (1) :197-200.

[4]Cubero J, Sanchez J, Sanchez C, et al.A new analytical technique in capillary electrophoresis[J].J Appl Biomech, 2007, 5 (2) :85-90.

[5]Gill B D, Indyk H E.HPLC method for analysis of nucleotides and nucleosides in milk and infant formulas[J].Int Dairy J, 2007, 17 (6) :596-605.

[6]Czarnecka J, Cieslak M, Michal K.Application of solid phase extraction and high-performance liquid[J].J Chromatogr B, 2005, 822 (1/2) :85-90.

[7]KidewB, WilcoxM, 田洁.离子交换色谱和ELSD检测分析核苷酸[J].药物分析杂志, 2000, 20 (5) :359-360.

[8]王添琦, 吴海棠, 王慧, 等.核苷酸测定方法研究进展[J].理化检验 (化学分册) , 2012, 48 (9) :1119-1122.

[9]European Community (EC) .No.657/2002.Commission Decision of Implementing Council Directive96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results.

篇4：高效液相色谱/质谱分析蘑菇柄中5′-核苷酸

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器:Micromass, QuattroUltimamPt质谱仪 (Waters) ;匀浆机 (PRO公司, PR0300A) ;离心机 (Beckman公司, X-22R型) ;旋转蒸发仪 (Heidolph公司, LABOROTA4000) ;固相萃取仪 (Waters公司) ;超声波 (Waters公司, D-78224Singen/Htw) 。试剂:甲醇、乙醇、正己烷都为HPLC级色谱纯, 三氯甲烷、正丙醇、无水硫酸钠均为分析纯, 所有用水均为超纯水。磺胺:磺胺噻唑 (ST) 、磺胺 (SA) 、磺胺嘧啶 (SDZ) 、磺胺二甲氧嗪 (SDM) 。六味地黄丸 (国药准字ZZ2222002255557722, , 吉吉林林修修正正药药业业集集团团) ) 。。

1.2 试验前处理

称取10.0克无水硫酸钠、10.0克样品置于30mL离心管中, 加入15mL乙腈匀质1min, 40℃8000r/min离心10min, 取上清液, 用20mL正己烷液液萃取, 取下层溶液加入5mL正丙醇, 在30℃水浴旋转蒸干。用3.6mL正己烷和0.4mL三氧甲烷混合液溶解, 超声处理30s, 溶液采用固相萃取。质谱柱用55L正己烷活化, 6mL甲醇、丙酮1∶1的混合液和6mL丙酮洗脱干燥, 用最初的流动相比例溶液定容1.0mL, 加入2mL正己烷, 涡旋混合1min静止2min, 取下层用于高效液相色谱-质谱测定。

1.3 洗脱液的选择

由于4种磺胺的极性范围较宽, 本文用甲醇和丙酮的混合液洗脱, 再用丙酮洗脱, 回收率63.9%~86.4%, 显示了良好的效果。

1.4 流动相梯度条件的改变

我们对同一个样品重复进样5次, 发现可以产生的累积效应。本研究为此在样品出完峰后将色谱柱用100%甲醇冲洗10min, 再回到初始的平衡条件。见表1。

(%)

注:流动相a:水 (2.5mmol/L甲酸胺和0.1%甲酸) ;流动相b:甲醇 (2.5mmol/L甲酸胺和0.1%甲酸) ;流动相c:甲醇。

2 结果

将10g六味地黄丸样品加入上述分别含有4种磺胺的混标溶液进行高效液相色谱-质谱分析, 得到磺胺的回收率、标准偏差和方法检出限如表2。

(%)

3 讨论

磺胺类药物以其抗菌谱广、使用方便、性质稳定、价格低廉等优点当前在农业与畜牧业得到了广泛应用, 但是大量的使用可造成土壤含量超标, 从而造成以相关原料制造的中成药中的磺胺类抗生素超标[4]。药物残留超标问题已成为影响中成药质量与信誉、阻碍中医药走向世界的关键。有的可以在人体内与蛋白质和酶等物质发生强烈的相互作用, 使失去活性, 也可能在人体器官中累积造成慢性中毒。六味地黄丸由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮、茯苓6味中药组成, 其具有增强免疫、抗衰老、抗疲劳、抗低温、降血压、降血糖、改善肾功能及较强的强壮作用, 但是原料在生长过程中可能被污染, 同时药材制药清洗、熬制的过程中也有可能被污染[5]。

由于磺胺类抗生素具有非离子性脂溶物的特点, 采用好的提取溶剂会造成提取液中混入大量的干扰成分, 采用低残留量富集往往首先浓缩的是样品的内源性物质, 结果使得干扰更为严重。高效液相色谱-质谱具有定性、快速、准确、高灵敏度优势, 该方法经过液相分离、光谱定量、质谱定性而最终实现对中成药中磺胺类抗生素的检测[6,7]。本文结果显示, 高效液相色谱-质谱检测方法回收率在65.2%~112.1%之间, 方法检出限为0.01~1.0ng/g, 方法精密度1.0%~17.6%, 灵敏度远低于欧盟最大残留量的要求。

总之, 高效液相色谱-质谱法在中成药中农药残留的检测具有灵敏度高、回收率高、重现性好等优势, 能促进我国中药质量的提高。

参考文献

[1]井乐刚.食品中残留农药检测技术的新进展[J].食品科学, 2002, 23 (148) :148-151.

[2]杨瑞芬, 施治国, 冯钰锜, 等.磺胺类药物的毛细管高效液相色谱与电色谱研究[J].药学学报, 2003, 38 (2) :68-69.

[3]余辉菊, 杨晓松, 杨胜利.基质固相分散-高效液相色谱法测定蜂蜜中10种磺胺类药物[J].中国食品卫生杂志, 2011, 23 (2) :156-157.

[4]谢强胜, 谢春红, 王坤, 等.橘红丸 (大蜜丸) 及蜂蜜中5-羟甲基糠醛含量测定[J].中国药事, 2013, 27 (6) :48-49.

[5]汪祺, 谢黔峰, 刘丽娜, 等.六味地黄丸 (大蜜丸) 中蜂蜜辅料的质量考察 (2) 糖转化产物5-羟甲基糠醛的测定[J].药物分析杂志, 2010, 30 (12) :331-332.

[6]马皎洁, 胡骁, 邵兵, 等.超高效液相色谱-串联质谱法测定面粉、玉米及其制品中的伏马菌素研究[J].山东大学学报:医学版, 2012, 50 (4) :84-85.

篇5：高效液相色谱/质谱分析蘑菇柄中5′-核苷酸

白杨素由Caco-2 和鼠肝细胞代谢为葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物[9,10],文献[11]报道了人口服白杨素400 mg后血浆、尿液和粪样中的代谢产物,结果在血浆中检测到白杨素及白杨素硫酸结合物(chrysin sulphate),硫酸结合物的含量是原型成分的30 倍,在尿液中检测到白杨素及白杨素葡萄糖醛酸结合物(chrysin glucuronide),葡萄糖醛酸结合物的量是原型成分的10 倍,同时通过对大鼠粪便样品的检测,发现其中含有大量的白杨素;此外在大鼠胆汁中也发现了高浓度白杨素葡萄糖醛酸结合物的存在。 说明白杨素在体内生物利用度低,主要由粪便排出体外。 大鼠口服白杨素与人空肠微粒体或大鼠肠微粒体共孵育后,产生两种单葡萄糖醛酸结合物[12]。 文献[13]报道了大西洋鳉鱼对白杨素的代谢,在鱼胆汁中检测到很少量原型白杨素,但却检测到两种含量很高的葡萄糖醛酸结合物。 课题组前期研究发现,白杨素经模式生物斑马鱼代谢后产生两种单葡萄糖醛酸结合物和一种硫酸结合物[14]。

为了系统了解白杨素的代谢规律,本实验采用的方法是电喷雾质谱联用技术(LC-ESI-MS)与高效液相色谱法[15,16],用以检测大鼠尿、粪便、血浆和胆汁中白杨素的代谢产物,进而推测出大鼠体内白杨素的代谢途径,为之后的科研奠定了基础[17,18,19]。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

对照品:白杨素(S36906)(纯度>97%,江苏万邦生化医药股份有限公司);肝素(江苏万邦生化医药股份有限公司),生理盐水(南京小营药业集团有限公司,批号:2010070203);乙腈(色谱纯,德国Merck公司);超纯水(Milli-Q)。 其余试剂为分析纯。

1.2 动物

SD大鼠6 只,雄性,年龄6 个月,清洁级,健康状态良好,体重(250±50)g,来源:上海斯莱克实验动物有限责任公司。 实验动物许可证号:SYXK(苏)2007-0026。

1.3 仪器

天平型号:METTLER AB135-S型(1/10 万,梅特勒-托利多仪器有限公司), 高速离心机型号:TGL-16G型(上海安亭科学仪器厂);低速自动平衡离心仪型号:TDZ5B-WS(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);MS3 旋涡混合器(德国IKA公司);氮吹仪型号:Organomation N-EVAP TM 112(美国Organomation公司)。

液相色谱-质谱联用仪型号:Waters Alliance 2695-ZQ 2000(美国Waters公司),色谱工作站:Masslynx 4.0。

1.4 供试药制备

称取白杨素适量,以0.8%CMC-Na为溶剂配制成含白杨素2 mg/m L的溶液,供大鼠灌胃用。

1.5 分析条件

1.5.1液相分析条件

色谱柱:Agilent SB-C18柱(5μm,4.6 mm×150 mm),柱温:25℃;流动相:0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水;采用梯度洗脱:0~5 min,90%B,5~7 min,90%~80%B,7~20 min,80%~75%B,20~35 min,75%~25%B,35~37 min,25%~10%B,37~40 min,10%B。流速:1 m L/min。

1.5.2质谱分析条件

电喷雾离子源的各项参数中锥孔电压:35 V(ESI-)(ESI负离子模式)、30 V(ESI+)(ESI正离子模式);离子源温度:120℃;辅助气温度:310℃;毛细管电压:2.50 k V;干燥气流流速:320 L/h;离子极性设定为:负离子(negative)扫描模式;离子检测方式:全扫描(SCAN)模式,离子化方式:气动辅助电喷雾离子化模式(ESI),扫描范围:从100 m/z至800 m/z,提取离子流(TIC):[M-H]-,[M+HCOO]-。

1.6 给药方法和样品采集

1.6.1大鼠尿样

取SD大鼠6只,雄性,体重(250±50)g,实验分组为白杨素给药组与空白对照组,随机平均给予每组3只大鼠。需注意实验前12 h禁食但不禁水。给药组分别一次灌胃3只大鼠以0.8%CMC-Na溶液配制的25 mg/kg白杨素溶液,同时空白组灌胃3只大鼠等体积0.8%CMC-Na水溶液。24 h后,同时分别收集6只大鼠的尿液。立刻将收集到的尿液保存在-70℃冰箱中以备用。

1.6.2大鼠粪便

上述SD大鼠在收集24 h尿液的同时,分别收集这6只大鼠24 h内的粪便。同样,立刻冷冻保存在-70℃冰箱中以备用。

1.6.3大鼠血浆

在收集上述6只大鼠尿样和粪便同时,分别在给药0.5、1、2、4、6 h,以眼眶采血方式采集大鼠血液样品,置于装有肝素的试管中,混匀抗凝。将血液样品进行离心操作,3000 r/min离心10 min后取上清液,将各时间点血浆分别合并,立即放入-70℃冰箱中冷冻保存以备用。

1.6.4大鼠胆汁

上述6只大鼠在上述实验后,经过10 d以上的恢复期开展下一步实验。禁食不禁水12 h,肌肉注射1 g/kg浓度的乌拉糖溶液麻醉,麻醉后进行腹部胆管插管手术。待大鼠清醒时,白杨素给药组给以0.8%CMC-Na溶液配制的25 mg/kg的白杨素溶液,空白组则给以与给药组等体积的0.8%CMC-Na水溶液,于给药12 h后分别收集各鼠的胆汁,立刻放入-70℃冰箱中冷冻保存以备用。

1.7 样品处理

1.7.1大鼠尿样、血浆、胆汁处理

分别取白杨素给药组的3只大鼠在各个时间段收集的尿液、血浆、胆汁2 m L,加入3倍体积的乙腈后,置于涡旋振荡仪上涡旋混匀3 min,随后3000 r/min离心10 min后用移液枪取上清液,转移到EP管中,随后在40℃条件下用氮气吹干,接着在残渣中加入1 m L乙腈溶解,再13 000 r/min离心15 min后取上清液,精密量取20μL用高效液相色谱的方法进行检测分析。空白对照组同法处理。

1.7.2大鼠粪便

分别取白杨素给药组的3只大鼠在各个时间段收集的粪便样品进行混合,置于研钵中进行研碎,精密称取2 g,加入10倍量的70%乙腈浸泡后超声30 min,3000 r/min离心10 min后取上清液,转移到EP管中,用氮气吹干(条件为40℃),在得到的残渣中加入2 m L乙腈,溶解后再13 000 r/min离心15 min后取上清液,精密量取20μL后用高效液相色谱的方法进行检测分析。空白对照组同法处理。

2 结果

在“1.5”项下的分析条件下,对白杨素给药组大鼠尿液、粪便、血浆和胆汁的成分进行LC-MS分析:采用负离子模式检测白杨素及其代谢产物。 与空白组对照,提取离子流,根据负离子模式分子离子峰[M-H]-、[M+HCOO]-推测出可能分子量,检出代谢产物。

2.1 白杨素在大鼠体内代谢产物的分析

检测出白杨素在大鼠的4 个代谢产物为M1~M4。 大鼠血浆、尿液、胆汁和粪便的总离子流图(TIC)及代谢产物提取离子流图(EIC)见图2。

在大鼠尿、 粪便、 血浆检测到原型成分白杨素M1,准分子离子峰[M-H]-253.1,[M+HCOO]-299.3, 分子量为254;在大鼠粪、胆汁中检测M2,分子量均为334,准分子离子峰为[M-H]-333.0,同时中性丢失80 Da而得到碎片峰[M-H]-253.1,因此推测该代谢物为白杨素(MW254)与硫酸的结合物;此外,在大鼠尿液、血、胆汁等样品中检测到代谢成分M3-M4, 准分子离子峰为[M-H]-429.3 , 同时中性丢失176 Da得到碎片峰[M-H]-253.1, 分子量为430, 据此, 推测为白杨素(MW254) 与葡萄糖醛酸的结合物及其异构体。 白杨素及其代谢产物质谱数据见表1,质谱图见图3。

A:鼠尿质谱总离子流图(TIC);B:鼠粪(TIC);C:鼠血(TIC);D:鼠胆汁(TIC);M1:白杨素提取离子流图(EIC);M2:白杨素硫酸结合物(E-IC);M3,M4:白杨素葡萄糖醛酸结合物(EIC)

实验结果表明,白杨素在大鼠体内主要以Ⅱ相代谢为主,白杨素可以原型存在,5 或7 位羟基与葡萄糖醛酸、硫酸形成结合型代谢产物。

3 讨论

本研究通过液质联用技术精确系统地检测了白杨素在大鼠血浆、胆汁、尿和粪便中的代谢产物,发现白杨素在大鼠体内主要以Ⅱ相代谢反应为主;并且大部分是以葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物的形式存在,葡糖醛酸结合反应要显著强于硫酸结合反应。这符合文献[2]、文献[9-11]和文献[20]的研究发现,同时也验证了作者团队前期斑马鱼对白杨素代谢的合理性[16]。本研究较为全面地反映了白杨素在大鼠体内的代谢途径。