制备型高效液相色谱法

制备型高效液相色谱法（精选九篇）

制备型高效液相色谱法 篇1

关键词：制备型高效液相色谱,动态轴向加压,天然发酵辅酶Q10,分离制备

1 辅酶Q10及其制备技术

辅酶Q10又名泛醌10, 是一种脂溶性醌, 其结构类似于维生素K, 因其母核六位上的侧链——聚异戊烯基的聚合度为10而得名, 是一种醌环类化合物[1]。

分子式:C59H90O4

分子量:863.36

结构式:

辅酶Q10是人类生命不可缺少的重要元素之一, 能激活人体细胞和细胞能量的营养, 具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能, 医学上广泛用于心血管系统疾病[2]。

制备型高效液相色谱 (Prep-HPLC) 作为一种高效的分离纯化技术, 具有单次分离时间短、易于操作、分离效率高等优点, 是天然产物、中草药、生物活性物质有效成分分离提纯的核心设备[3,4]。运用该制备型高压液相色谱系统进行分离提取高纯度的天然辅酶Q10, 具有分离效率高、节省溶剂等优点。同时, 设备采用动态轴向加压技术装填色谱柱, 具有柱床稳定性好、柱效高的特点, 可用于该产品的批量连续性生产。

2 制备实验

2.1 仪器与试剂

聊城万合工业制造有限公司生产的制备型高压高效液相色谱柱 (63 mm×630 mm, 含动态加压液压站) ;GLP3250制备型高压输液泵;UC-3292紫外—可见检测器;Rheodyne3725i六通进样阀 (配5 m L定量环) 、DM动态混合器、色谱工作站软件及电脑等。

填料选择球形硅胶 (富士硅化学有限公司) 。

流动相为正戊烷∶丙酮 (均为工业级, 使用前先经过蒸馏处理后用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤) 。

说明:实验所用到的流动相 (溶剂) 以及样品和实验室仪器 (如溶剂过滤器、超声波清洗器等) 由杭州华东医药集团康润制药有限公司提供。

2.2 样品配制

抽取样品溶液10～15 m L经针式滤膜过滤, 舍弃初滤液, 续滤液收集至洁净容器中备用。

2.3 制备色谱条件

(1) 进样方式:手动液体进样;

(2) 进样量:5 m L;

(3) 填料:球形硅胶;

(4) 流动相:正戊烷∶丙酮 (90∶10) ;

(5) 流速:200 m L/min;

(6) 洗脱方式:单泵等度;

(7) 检测波长:275 nm。

2.4 制备过程

(1) 称取800 g硅胶加入2 000 m L正戊烷超声、搅拌30 min并脱气, 将搅拌好的硅胶悬浊液缓慢注入柱体内, 沉降120 min, 装好柱头密封元件, 轴向加压压缩柱床至出液管无液体流出 (装柱压力为1 200 psi, 柱床高530 mm) ;

(2) 用进样针精密抽取样品5 m L, 手动注射进样;

(3) 按已设定流速进行等度洗脱;

(4) 根据检测器图谱收集层析流出液。

2.5 实验结果及讨论

在上述色谱条件下, 得到制备色谱图 (图1) :

将两次单峰收集液分别浓缩至约50 m L后取样HPLC检测, 其分析图谱分别如图2、图3所示:

经HPLC检测, 第一个峰保留时间为11.91 min[与起始样品杂质保留时间 (11.68 min) 一致], 归一化面积百分比为92.80%;第二个峰保留时间为9.75 min[与起始样品Q10保留时间 (10.45 min) 一致], 归一化面积百分比为94.81%。

3 结语

本实验建立了制备型高效液相色谱法分离提取天然辅酶Q10的实验条件, 通过检测分离结果发现, 该制备型液相色谱系统满足分离效果要求, 同时操作方便, 产品纯度高, 该设备和方法可用于天然辅酶Q10的大量制备提取;另一方面, 收集到的较高浓度的辅酶主要杂质, 也可供进一步分析研究。

参考文献

[1]Jones K, Hughes K, Mischley L, et al.Coenzyme Q10and cardiovascular health.Altern Ther Health Med, 2004, 10:22～30

[2]马志科, 昝林森, 陈芳.辅酶Q10制备技术及其在医学中的应用[J].动物医学进展, 2006, 27 (8) :76～81

[3]Hostettmann K, Marston A, Hostettmann M.Preparative Chromatography Techniques.Applications in Natural Product Isolation[J].Plant Growth Reg-ulation, 1997, 8 (4) :375～376

高效液相色谱法测定氟灭酸的含量 篇2

高效液相色谱法测定氟灭酸的含量

建立测定氟灭酸含量的高效液相色谱分析方法.采用Symmetry C18色谱柱(3.9 mm×150 mm,5μm),以含1%乙酸的甲醇-水(80:20)为流动相,流速为1.0 mL・min-1,紫外检测波长为287 nm,柱温35℃,进样量10 μL.实验结果表明:线性范围为0.5～50.0 mg・L-1(r=0.9997),检出限为22 μg・L-1,方法平均回收率99.8%,RSD为0.98%.本方法简便,快速,适合于氟灭酸的`定量控制分析.

作 者：雷小明 武宏科 史鸿鑫 LEI Xiao-ming WU Hong-ke SHI Hong-xin  作者单位：浙江工业大学,绿色化学合成技术国家重点实验室培育基地,浙江,杭州,310032 刊 名：浙江工业大学学报  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY OF TECHNOLOGY 年，卷(期)：2007 35(6) 分类号：O657.7 关键词：高效液相色谱法   氟灭酸   分析  

高效液相色谱法测定格列吡嗪片含量 篇3

【关键词】格列吡嗪片；格列吡嗪；测定

格列吡嗪为格列吡嗪片主要成分[1-5]。格列吡嗪化学名称为：1-环己基-3-{4-[2-（5-甲基吡嗪-2-酰胺）-乙基]苯磺酰}脲[6-9]。格列吡嗪片适用于经饮食控制及体育锻炼2-3个月疗效不满意的轻、中度2型糖尿病患者，且无急性并发症（如感染、创伤、酮症酸中毒、高渗性昏迷等）[10-13]。目前主要生产格列吡嗪片的厂家有潍坊中狮制药有限公司、山东仁和堂药业有限公司、北京优华药业有限公司、北京京丰制药有限公司、贵州圣济堂制药有限公司、海口奇力制药股份有限公司、黑龙江瑞格制药有限公司、北京天衡药物研究院南阳天衡制药厂、哈药集团制药总厂等。本文用高效液相法对格列吡嗪片中的格列吡嗪的进行了含量测定。

1.仪器与试药

DL-820E超声波清洗机（上海高创化学科技有限公司）； FA114电子分析天平（成都市科恒达仪器设备有限责任公司）；TG16-WS台式高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；XYJ-H帕恩特实验室中央超纯水系统（北京湘順源科技有限公司）；UV-1800紫外/可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；PHB恒温水浴箱（天津因赛科技发展有限公司）；LC-600高效液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）；CO-1000型色谱柱温箱（武汉恒信世纪科技有限公司）。盐酸（常州市弘裕化工有限公司）、甲醇（上海谱振生物科技有限公司）、冰乙酸（上海跃胜贸易有限公司）、乙腈（上海谱振生物科技有限公司）、磷酸（湖北巨胜科技有限公司）。

2.含量测定

2.1色谱条件

依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。色谱柱为依利特hypersil BDS C18 色谱柱（4.6*250*5u ）；乙腈-甲醇-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（pH至6.00）（22：32∶46）为流动相；检测波长为225nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按格列吡嗪峰计算应不得低于2000。

2.2供试品溶液的制备

取格列吡嗪片适量，研细，精密称定至容量瓶内，加流动相适量超声溶解，放凉，流动相定容，过0.45μm的滤膜，即得。

2.3对照品溶液的制备

精密称取格列吡嗪对照品约5mg，置50毫升棕色容量瓶中，用甲醇超声波振荡溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取10毫升，置100毫升棕色容量瓶中，用甲醇超声波振荡溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含格列吡嗪10μg）。

2.4阴性干扰试验

按方中比例取格列吡嗪片辅料，按照制备工艺方法制成阴性制剂，按2.3项下方法制成供试品溶液，按色谱条件测定。结果表明：在选定条件下测得的阴性液吸收曲线在与格列吡嗪相同保留时间处不存在吸收峰，说明此方法具有较强的专属性。

2.5标准曲线的制备

制备浓度为4、8、16、20、24、28、32μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，格列吡嗪对照品在4～32μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.6精密度试验

精密吸取格列吡嗪对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.59%。结果表明，本实验精密度良好。

2.7重现性试验

分别称取同批格列吡嗪片样品6份，分别制备成供试品，按色谱条件测定含量，并计算样品的RSD值为0.61%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。

2.8稳定性试验

取供试品溶液，分别在0，1，2，3，4h精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品格列吡嗪峰面积积分值的RSD为0.53%。结果表明格列吡嗪至少在4h内稳定。

2.9回收率试验

采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的格列吡嗪对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.2%，RSD为0.73%。

2.10样品含量测定

依照上述含量测定方法，测定格列吡嗪片三批样品中格列吡嗪的含量，结果三批样品的含量分别为标示量的100.5%、101.1%、100.6%。

3.讨论

分别考察乙腈-甲醇-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（pH至6.00）（22：32∶46），乙腈-甲醇-水（20∶10：70），乙腈-甲醇-冰乙酸-水（15：15∶3∶67），磷酸盐缓冲液（ 0.01mol/L磷酸氢二铵溶液， 用磷酸调节pH 值6.0）-乙腈（ 50：50）不同比例的流动相，结果以乙腈-甲醇-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（pH至6.00）（22：32∶46）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-甲醇-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（pH至6.00）（22：32∶46）为流动相。格列吡嗪片原有质量标准为分光广度法，没有采用高效液相法。本实验采用高效液相法对格列吡嗪片中格列吡嗪的含量进行测定，为今后对格列吡嗪片的质量标准修订提供依据。本实验方法是一种简便、准确、安全的测定格列吡嗪片含量的方法。格列吡嗪片中格列吡嗪的含量为标示量的95-105%。

【参考文献】

[1]刘晓平，郭祖峰，汪长生，王娟，崔海鞠，杨解人，宋建国.大鼠血糖的昼夜节律及格列吡嗪对糖尿病大鼠的时间治疗学[J].中国临床药理学与治疗学，2002（03）.

[2]王宪，高孝斗，许华强，马香稳，戴淑玲.格列吡嗪缓释片治疗35例2型糖尿病的临床观察[J].哈尔滨医药，2001（04）.

[3]郭秋慧.甘精胰岛素联合那格列奈治疗老年2型糖尿病疗效观察[J].中国医院药学杂志，2009（14）.

[4]毛玉山，李福军，周丽诺，叶红英，杜娟，陈长喜，申定国，黄童，洪中立.格列吡嗪控释片对2型糖尿病患者血管内皮功能的影响[J].心脑血管病防治，2005（02）.

[5]姬克.格列吡嗪控释片治疗2型糖尿病疗效和安全性观察[J].中国医院用药评价与分析，2003（04）.

[6]吴飞飞，张栋.二甲双胍与格列吡嗪降低2型糖尿病患者胰岛素抵抗的临床观察[J].长治医学院学报，2001（02）.

[7]张鹤凤，祁剑海.格列吡嗪控释片治疗2型糖尿病的临床疗效及安全性[J].中国实用医药，2011（05）.

[8]许白桦.格列吡嗪治疗2型糖尿病57例临床观察[J].中国校医，2003（04）.

[9]张祥捷.控释格列吡嗪治疗2型糖尿病的疗效观察[J].福建医药杂志，2000（03）.

[10]马铼枫，董露霖，魏军平，倪青.格列吡嗪控释片和格列美脲治疗2型糖尿病的对比研究[J].基层医学论坛，2009（01）.

[11]陈广原，张彤，张洁红，段敏虹，彭妙官.那格列奈用于老年2型糖尿病患者的临床优势[J].中国老年学杂志，2011（05）.

[12]刘述川，卫丽，马洪.格列吡嗪和格列苯脲治疗非胰岛素依赖型糖尿病的疗效分析[J].宜春医专学报，2000（04）.

制备型高效液相色谱法 篇4

1 材料

1.1 药材与试剂

十二烷基磺酸钠 (色谱纯, Sigma) , 磷酸二氢钾 (色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司) , 甲醇 (色谱纯, 赛默飞世尔科技有限公司) , 乙腈 (色谱纯, 赛默飞世尔科技有限公司) , 磷酸 (分析纯, 天津天力化学试剂有限公司) , 无水乙醇 (分析纯, 天津基准化学试剂有限公司) , 娃哈哈纯净水。本实验用标准品 (成都斯特曼科技有限公司生产与中国科学院生物研究所) :盐酸小檗碱 (含量98.95%) , 盐酸巴马汀 (含量≥98%) , 黄连碱 (含量≥98%) , 表小檗碱 (含量≥98%) , 盐酸药根碱 (含量≥98%) 。

1.2 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪, Waters2998发光二极管阵列检测器, 柱温箱, Waters C18色谱柱 (50mm×2.1mm, 1.7μm) , 精密PH计, 电子天平) , 台式离心机, 超声清洗器, 快速混匀器, 循环水真空泵。

2 方法

2.1 标准品以及方法学实验样品的准备

分析天平分别称取标准品小檗碱2.31mg, 巴马汀1.99mg, 黄连碱5.14mg, 表小檗碱2.11mg, 药根碱2.27mg, 然后用甲醇溶解各标准品, 每个标准品溶液均定容至1ml。合并混匀5中标准品溶液, 得标准品储备液, -20℃保存。取储备液, 分别用甲醇稀释10、100、500、1000, 2000, 5000, 10000, 20000倍。然后将以上7份溶液分别加入9倍体积的大鼠空白血浆中, 得7份样品用于线性考察实验。取储备液, 分别用甲醇稀释100倍, 300倍, 50000倍。再取储备液, 分别用甲醇稀释10倍, 30倍, 500倍, 再分别取样加入到9倍体积的大鼠空白血浆中, 所得样本用于精密度、回收率和稳定性考察实验。

2.2 血浆样本的处理

用移液枪吸取120μl血浆加入空白EP管中, 移液枪量取120μl乙腈加入血浆, 涡旋3分钟, 以13000r/min离心10min, 取上清进样分析, 进样体积100μl。

2.3 色谱条件:

C18色谱柱 (50mm×2.1mm, 1.7μm) ;流动相 (水:乙腈=430:570, 每升KH2PO44g, SDS 2.5g) , 流速1.0ml/min;检测波长345nm。

2.4 专属性与线性考察实验

取大鼠空白血浆分两份, 一份按2.1法加入稀释后的混标储备液, 另一份不加入任何成分。按2.2法处理这两份血浆进样分析, 根据色谱图考察专属性。根据预实验结果, 得小檗碱定量范围:4.5~0.002μg/ml, 巴马汀定量范围:4.0~0.002μg/ml, 黄连碱:10.~0.005μg/ml, 表小檗碱:4.5~0.002μg/ml, 药根碱:4.5~0.002μg/ml。于是在此线性范围内, 按照2.1法制备7个不同浓度血浆的样本, 并按2.2法处理进样, 并根据所测得的峰面积和浓度确定线性回归方程, 以考察线性关系。

2.5 精密度考察实验

根据上述5种生物碱的定量范围, 按照2.1法制备高、中、低三个浓度的血浆样本, 各浓度平行五个样本, 按2.1法处理并进样分析。连续测定5天。根据测得的浓度确定RSD值, 以考察日内和日间精密度。

2.6 回收率和稳定性考察实验

按照2.1法制备高、中、低三个浓度的血浆样本, 各浓度平行5个样本, 按2.2法处理血浆样本并进样分析, 所测得的浓度与实际稀释所得浓度的比值为回收率, 并计算每个浓度的回收率平均值和RSD值。

按照2.1法制备两组高、中、低三个浓度的血浆样本, 测定新鲜配制出的样本浓度后, 一组样本于4℃冷藏24h后测定其浓度, 另一组样本于-20℃冷藏30天后测定浓度。根据所测浓度与原始浓度的差异确定样品的稳定性。

2.7 数据处理

本实验数据运用Exel表格进行处理。

3 结果

3.1 专属性和线性

比较大鼠空白血浆和加入混标后大鼠血浆样本的色谱图, 见图1, 发现血浆对各生物碱的吸收峰无影响, 专属性良好。

根据测得的7个不同浓度点的样品浓度以及峰面积, 得小檗碱回归方程为y=2.9E+5x+1975.2, r2=0.9993, 巴马汀回归方程为y=3.8E+5x-3160.5, r2=0.9991, 黄连碱回归方程y=3.2E+5x-1791.4, r2=09991, 表小檗碱回归方程为y=4.2E+5x-3412.1, r2=0.9992, 药根碱回归方程为y=3.3E+5x-2678.6, r2=0.9992。说明在此线性范围内, 各生物碱的线性关系良好。

3.2 精密度

根据测得的5种生物碱的日内和日间精密度, 见表1, RSD值均在可接受范围内。

3.3 稳定性和回收率

根据所得5中生物碱在大鼠血浆中的回收率及RSD值, 见表2, 证明本实验结果可信且具有良好的重现性。

检测4℃冷藏24h和-20℃冷藏30天后的样本, 测得的样本浓度均在新鲜样本浓度的95%以上, 说明样本稳定性良好, 不存在分解现象。

4 讨论

我们采用乙腈沉淀蛋白法处理了大鼠血浆样本, 在此处理过程中, 可能会有一定的血药成分的损失, 较氮气吹干的方法来说, 检测所得浓度可能不是很高[2]。但在实验样本较多的实际情况下, 此法效率远远高于氮气吹干的方法。根据之前预实验的检验, 其效率高于氮气法2-3倍。本实验同时测定了大鼠血浆内小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱等5种生物碱的血药浓度。通过对该方法的专属性、线性、精密度、回收率和稳定性的考察, 证明本实验结果重现性好, 可信度高。

参考文献

[1]俞森, 俞蕴莉, 卢守四等.黄连中5种小檗碱型生物碱在糖尿病大鼠体内的药动学[J].中国药科大学学报, 2008, 39 (6) :526-529.

[2]Xia li, Haijing Liu, Ji Li.2009.Simultaneous Determination of Berberine and Palmatine in Rabbit Plasma by LC-MS-MS and Its Application in Pharmacokinetic Study After Oral Administration of Coptidis and Coptidis-Gardeniae Couple Extract.[J]Chromatographia.70:1113-1119.

[3]魏世超, 徐丽君等.黄连粉末中盐酸小檗碱及盐酸药根碱的体内肠吸收特性[J].华中科技大学学报, 2013, 42 (3) :333.

[4]安小平, 崔庆荣.黄连治疗糖尿病研究进展[J].甘肃中医, 2008, 21 (1) :57-58.

高效液相色谱法测定皮革中致癌染料 篇5

染料的致癌性是指某些染料对人体或动物体引起肿瘤或癌变的性能。欧盟指令1999/43/EC和欧盟委员会的纺织品生态标签Eco-label(欧盟2002/371/EC决议)禁止销售和使用酸性红26、碱性红9、碱性紫14、直接黑38、直接兰6、直接红28、分散蓝1、分散橙11、分散黄3等9种致癌染料。国际环保纺织协会颁布的生态纺织品标准Oeko—Tex Standard 100则要求纺织品中每种有害染料的检测限量为50 mg/kg,对纺织、皮革中致癌染料的检测提出定量要求。随着人们对生态纺织品理念的提高,许多国际著名的买家规定在样品上不得检测出具有致癌性的染料。

另外,由于分散黄23会还原分解出致癌芳胺对氨基偶氮苯,Oeko—Tex标准100在2006年修订本中将其列入禁用染料;Oeko—Tex标准100在2007年修订本中指出,分散橙149会还原分解出致癌芳胺对氨基偶氮苯,故也被列入禁用染料。

皮革及其制品是我国传统的大宗轻工产品之一,年产值高达4000亿元人民币以上,出口额达350亿美元,在我国经济建设和群众日常生活中占有重要地位。在皮革生产过程中,染色是一首重要工序。为了增添皮革的花色,包括致癌染料和禁用染料在内的多种染料被广泛应用于制革过程。

目前关于致癌染料测试的方法主要针对纺织品[1,2,3,4,5],还没有皮革中致癌染料的检测方法标准。本文应用高效液相色谱,研究皮革中致癌染料检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

乙腈,色谱纯,M-TEDIA;甲醇,色谱纯,M-TEDIA;氨水,分析纯,国药集团;磷酸二氢四丁基铵(纯度≥99.9%, Fluka),0.0025 mol/L,用5%氨水(4.3)调节pH至7.5;11种致癌染料标准品(纯度):酸性红26(84.0%)、碱性红9(87.5%)、碱性紫14(86.0%)、直接黑38(73.0%)、直接兰6(97.0%)、直接红28(93.0%)、分散蓝1(30.0%)、分散橙11(95.0%)、分散黄3(30.0%)、分散黄23(99.0%)、分散橙149(43.0%),均为德国Dr公司生产(CAS号见表 3)。

Agilent 1100 HPLC-DAD 安捷伦液相色谱仪,C18反相色谱柱,4.6 mm×250 mm,粒径5 μm,美国安捷伦;数控超声波清洗器,规格型号KQ-500E,昆山超声仪器公司;聚四氟乙烯有机系滤膜,孔径0.45 μm,上海兴业净化材料厂。

2.2 实验步骤

以甲醇为溶剂,配制200 mg/L 11种染料的标准储备液。

以甲醇为溶剂,配制1、2、5、10、20 mg/L 11种染料的标准工作液。

HPLC-DAD检测方案优化:考察磷酸二氢四丁基铵-乙腈、甲醇-水、乙腈-水、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液-乙腈流动相体系。分别考察这四种流动相对致癌染料的分离情况;将柱温分别设为30℃、40℃和50℃,考察柱温对致癌染料的分离情况影响。

皮革样品前处理方案的优化:考察超声提取时间、提取溶剂、微孔滤膜对前处理的影响。

方法的线性关系、检出限、回收率及精密度试验:取浓度为1.0,2.0,5.0,10.0,20.0 mg/L的混合标准工作液,供高效液相色谱分析测定;选用空白皮革样品为基质,加入浓度为5 mg/L的11种致癌染料,按照优化的条件进行前处理,平行测定7次,进行回收率及精密度试验。

3 结果与讨论

3.1 流动相的选择

使用磷酸二氢四丁基铵-乙腈、甲醇-水、乙腈-水、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液-乙腈流动相体系,分别考察这四种流动相对致癌染料的分离情况。图1中色谱图“1”为磷酸二氢四丁基铵-乙腈作为流动相的色谱图、色谱图“2”为甲醇-水作为流动相的色谱图、色谱图“3”为乙腈-水作为流动相的色谱图,从图中可见,乙腈-水、甲醇-水作为流动相时,一些在水中可电离的物质如直接红28、酸性红26等都电离成阴离子,在C18色谱柱上都难以保留,因此无法分离。并且,其他能出峰的物质,峰型矮胖;而磷酸二氢四丁基铵可以作为阳离子对试剂,作为流动相时可与染料阴离子相结合,从而增加了阴离子染料(主要是直接染料和酸性染料)的色谱保留;磷酸氢二钠-磷酸二氢钠-乙腈作为流动相,在水中能电离的染料也无法分离,如图2,酸性红26和直接红28的保留时间一致。所以最终选择磷酸二氢四丁基铵-乙腈作为流动相。

a. 酸性红26的色谱图;b 直接红28的色谱图; c 11种致癌染料的色谱图。 a. Spectrum of Acid red 26;b Spectrum of Direct Red 28;c Spectrum of carcinogenic dyestuffs.

3.2 柱温的选择

实验室将柱温分别设为30 ℃、40 ℃和50 ℃,其结果见图3,从图上可见,在较低温度时,致癌染料的峰型较宽,脱尾现象比较严重,而温度在50 ℃时,峰型较好。因此选择柱温为50 ℃。

3.3 提取溶剂的选择

由于致癌染料中包含酸性、直接和碱性染料,这三种染料都带有极性基团,易溶于水,不宜用乙酸乙酯、丙酮和正己烷等中等极性和弱极性的有机溶剂提取;另外分散染料极性较弱,不宜用水溶液提取,因此实验室参照GB/T 20383-2006采用甲醇作为提取溶剂。

3.4 超声提取时间对检测结果的影响

实验室制备了一块含直接黑38的阳性样品,准确称取1 g,分别用超声(输出功率:420 W,频率:40 kHz,温度:(70±2)℃提取10~60 min,比较超声提取时间对提取效率的影响,结果见表2,从表2可见,用超声波提取30 min已经足够。

3.5 用微孔滤膜过滤对检测结果的影响

对各种皮革样品进行前处理后,用市面上常见的聚四氟乙烯和尼龙有机滤膜用孔径0.20、0.45、0.70 μm进行实验,孔径0.20 μm的滤膜容易堵塞,而0.7 μm滤膜的滤液容易造成液相堵塞,因此,只选用了0.45 μm的滤膜进行试验。

针对11种标准溶液,用0.45 μm的聚四氟乙烯(TFL)和尼龙(NL)微孔滤膜进行试验,考察过滤对检测结果的影响,实验结果见图4。图4表明:(1) 聚四氟乙烯滤膜过滤的标准谱图,过滤前后,用在标准物质的色谱图中未发现有色谱峰消失或有新的色谱峰产生,且峰高相似;(2) 尼龙滤膜过滤的标准谱图,过滤前后,用在标准物质的色谱图中未发现有色谱峰消失或有新的色谱峰产生,但直接红28的峰面积严重降低,其他物质如直接黑38、分散黄3、分散黄23峰面积也有不同程度的减小。经滤膜过滤的结果表明聚四氟乙烯膜对致癌染料无明显的吸附/脱附作用,可用于样品前处理,不会影响检测结果,而尼龙膜对染料存在吸附/脱附作用,会影响检测结果,不可用于样品前处理。

3.6 保留时间以及检测波长确认

分别配制高浓度的11种致癌染料的单标溶液,并配置一定浓度的混合标准品,然后上液相色谱进行分析,通过液相响应值、峰面积以及紫外光谱图对11种致癌染料的保留时间以及最大检测波长进行确认,得到11种致癌染料的保留时间、最大检测波长(见表3)。

3.7 线性关系、方法的检出限和定量限

逐级稀释混合标准工作液,得到浓度为1.0,2.0,5.0,10.0,20.0 mg/L的混合标准工作液,供高效液相色谱分析测定,绘制标准工作曲线,在1.0~20.0 mg/L的浓度范围内,相关系数均大于0.99(见表4);与空白基质中加入低浓度的标准溶液,按照上述最佳分析步骤前处理,测试,采用Agilent 1200 软件的信噪比工具计算信噪比S/N,计算检出限和定量限(测定低限),即检出限=P×3(S/N),定量限=P×10(S/N),P为加标浓度,结果见表4。由表4可见,直接黑的测定低限最高,为9.43 mg/kg ,因此本标准中11种染料的测定低限设为10 mg/Kg。

3.8 回收率和精密度

选用空白皮革样品为基质,加入浓度为5 mg/L的11种致癌染料,按标准所述的方法进行前处理,平行测定7次,测回收率和精密度(见表5),本方法回收率均大于70%,相对标准偏差(RSD)均在5.0%以内。

4 结论

采用HPLC-DAD法对皮革中致癌染料进行测试的方法为:皮革样品经甲醇超声提取30 min,0.45 μm聚四氟乙烯滤膜过滤,采用磷酸二氢四丁基铵-乙腈作为流动相进行梯度洗脱,柱温50 ℃,DAD波长分别为380、450、500、540、590 nm处进行检测。当标样的浓度为1.0~20 mg/L时,线性相关系数≥0.99,空白样品的加标回收实验表明,在优化的试验

条件下回收率为>70%,检出限低于10.0 mg/kg,可满足皮革样品中致癌染料的测试要求。

参考文献

[1]丁友超,蔡建和,杨锦富,等.IP-HPLC法测定织物中致癌染料含量[J].印染,2008,15:38-41.

[2]丁友超,曹锡忠,吴丽娜,等.高效液相色谱-电喷雾串联质谱法快速分离鉴定纺织品中的9种致癌染料[J].色谱,2008,26(5):603-607.

[3]DIN 54231:2005 Textiles-Detection of disperse dye-stuffs.(纺织品-分散染料的测试).

[4]GB/T20382-2006,纺织品致癌染料的测定[S].

制备型高效液相色谱法 篇6

Hedgehog信号通路与多种肿瘤的形成与发展密切相关, 异常的Hedgehog信号转导通路可介导肿瘤, 尤其是基底细胞癌的发生发展, 同时, 在其他肿瘤, 如前列腺癌、胰腺癌、肠癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤和白血病中, 也显示了不规则的Hedgehog信号通路的激活与这些肿瘤密切相关。目前许多公司都在将小分子的Hedgehog信号转导抑制剂作为潜在的抗癌药物进行开发。

目前, 国内完整介绍Vismodegib合成的文献资料较少, 本文参考国内外各种中间体合成的文献资料[1—3], 获得了一种简单有效、反应条件温和的合成方法。本文采用高效液相色谱法对其含量进行了测定, 实验结果表明, 该法操作简便、灵敏度高、结果准确, 为其合成反应和质量控制提供保证。

1 仪器与试药

Waters Alliance 2996/2795高效液相色谱仪 (美国) , 自动进样器, Empower数据处理系统, BP211D型电子天平 (德国SARTORIUS) ;Vismodegib对照品 (自制, 批号20120926, 纯度99.82%) , Vismodegib供试品 (自制, 批号:20120902、20121016、20121108) 均由军事医学科学院放射与辐射医学研究所合成;乙腈, 色谱纯, 山东禹王实业有限公司;水, 纯化水, 杭州娃哈哈集团有限公司;其他试剂均为分析纯。

2 Vismodegib的含量测定

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品储备液

取Vismodegib对照品10 mg, 精密称定, 置100m L量瓶中, 加乙腈溶解并稀释至刻度, 制成每1 m L约含Vismodegib 0.1 mg的溶液, 作为对照品储备液。

2.1.2 供试品储备液

取Vismodegib供试品10 mg, 精密称定, 置100m L量瓶中, 加乙腈溶解并稀释至刻度, 制成每1 m L约含Vismodegib 0.1 mg的溶液, 作为供试品储备液。

2.2 色谱条件和系统适用性

色谱柱:Diamonsil C18色谱柱 (250 mm×4.6mm, 5μm) ;流动相:乙腈-水 (50∶50) ;检测波长:230 nm;流速:1.0 m L·min-1;进样体积:20μL;柱温:室温。在以上色谱条件下, Vismodegib主峰保留时间为11.29 min, 理论板数为8 000, 分离度为3.8, 对称因子为1.01, 色谱图见图2。

2.3 方法学验证[4]

2.3.1 线性范围

分别精密量取“2.1.1”项下对照品贮备液1m L、2 m L、4 m L、5 m L、6 m L、8 m L, 置10 m L量瓶中, 加乙腈稀释至刻度, 摇匀, 分别配制成10、20、40、50、60、80μg·m L-1的对照品溶液, 分别取20μL进样测定, 记录色谱图。以进样浓度X (μg·m L-1) 为横坐标, 峰面积 (Y) 为纵坐标, 绘制标准曲线, 进行回归分析。结果表明Vismodegib在10~80μg·m L-1的范围内浓度与峰面积具有良好线性关系。回归方程为Y=62 490X-57 487, r=0.999 6 (n=6) 。

2.3.2 检测限和定量限

在以上色谱条件下, 取对照品储备液逐步稀释进样。当信噪比3∶1时得出检测限为3.8 ng, 当信噪比约为10∶1时得出定量限为12 ng。

2.3.3 精密度

取2.3.1项下浓度为50μg·m L-1的对照品溶液, 连续进样6次, 记录色谱图并计算色谱峰面积的RSD, 结果RSD为0.30%, 表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性考察

取同一批的Vismodegib原料药按“2.1”项下方法制备浓度为40、50、60μg·m L-1的高、中、低三个浓度的标准溶液, 每个浓度平行配制三份, 共九份, 分别进样测定;同法对Vismodegib对照品进行测定, 并计算其原料药的含量, 结果平均含量为99.16%, RSD为0.45%, 表明本法的重复性良好。

2.3.5 溶液稳定性试验

取室温下放置的高、中、低三个浓度的供试品溶液, 分别于0, 2, 4, 6, 8, 10 h进样20μL, 测定峰面积, 计算高、中、低三个浓度的峰面积的RSD分别为0.31%, 0.52%, 0.56%, 表明供试品溶液在室温放置10 h内稳定性良好。

2.3.6 样品含量测定

取对Vismodegib对照品和三批样品 (20120902、20121016、20121108) , 按“2.1”项下方法分别制备对照品溶液和供试品溶液, 各取20μL进样, 按外标法以峰面积计算样品含量, 结果表明, 3批样品主峰含量均在99.0%以上 (见表1) 。

3 讨论

(1) 流动相的选择。考察了甲醇-水系统及乙腈-水系统, 其中, 甲醇-水系统分离度不如乙腈-水系统, 保留时间较长、柱效低, 乙腈-水 (50∶50) 主峰与各杂质峰分离良好, 保留时间适中, 确定乙腈-水 (50∶50) 为该试验的流动相。

(2) 检测波长的选择。二极管阵列全波长扫描得Vismodegib的最大吸收波长为230 nm, 有关物质在此波长也有较大吸收, 且溶剂在此波长无干扰, 选择230 nm为检测波长。

(3) 柱温、流速、进样体积的选择。考察不同柱温 (室温, 35℃, 40℃) 、不同流速 (0.8、1.0、1.2 m L·min-1) 及不同进样体积 (5、10、15、20、25、30μL) , 选定柱温为室温, 流速为1.0 m L·min-1, 进样体积为20μL。

(4) 在选定的色谱条件下, Vismodegib和杂质分离效果好, 方法的重现性好, 且简便, 快速, 可用于Vismodegib的含量测定, 为其合成及质量控制提供可靠依据。

摘要：建立反相高效液相色谱法测定Vismodegib含量。采用Diamonsil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , 以乙腈-水 (50∶50) 为流动相, 检测波长:230 nm, 流速:1.0 mL·min-1, 进样体积为20μL, 柱温为室温。在以上色谱条件下Vismodegib与有关物质完全分离, 且在1080μg·mL-1的范围内浓度与峰面积呈良好线性关系 (r=0.999 6, n=6) ;检测限为3.8 ng, 定量限为12 ng;精密度试验的RSD (n=6) 为0.30%;重复性试验的RSD (n=9) 为0.45%;稳定性试验结果表明供试品溶液在10 h内稳定。建立的液相方法精密度高, 准确度好, 测定灵敏, 可用于Vismodegib的质量控制。

关键词：Vismodegib,含量测定,高效液相色谱

参考文献

[1] Haddley K.Vismodegib.Drugs Future, 2010;35 (5) :379—384

[2] Castanedo G M, Wang S M, Robarge K D, et al.Second generation 2-pridylbiphenyl amide inhibitors of the hedgehog pathway.Bioorg Med Chem Lett, 2010, 20 (22) :6748—6753

[3] Janet G, Daniel S, Mark S, et al.Pyridyl inhibitors of hedgehog signaling.WO, 2006028958 (A2) , 2006-03-16

制备型高效液相色谱法 篇7

1 仪器与试药

1.1 实验仪器:

试验中需要用到的仪器包括:超声波清洗仪 (型号:KQ-250DB, 厂家:昆山市超声仪器有限公司) , 电子天平 (型号:Sartorius-BT124S/BT 25S电子天平, 常见:北京赛多利斯仪器系统有限公司) , 高效液相色谱仪 (Agilent 1100) 等。

1.2 试剂与试药:

试验所需试剂中乙腈为色谱纯, 水为纯净水, 其他试剂均为分析纯。试验中所需中药材钩藤样品经鉴定为茜草科植物钩藤的干燥钩藤茎枝。异钩藤碱购自上海中药标准化研究中心, 纯度不低于98%。

2 方法与结果

2.1 色谱条件:

高效液相色谱法所需色谱柱为Alltech C18柱, 规格为4.6 mm×250 mm, 5μm, 流动相为乙腈-水, 乙腈为流动相A, 水为流动相B, 并以1 m L/L三乙胺, 冰醋酸调节p H值至7.5, 梯度洗脱, 0~20 min时A在50%~55%, 流速为1.0 m L/min, 检测波长为246 nm, 柱温为25℃, 进样量为20μL;超高液相色谱法色谱柱为Waters AC-QIITY UPLCTMT3 C18柱, 规格为2.1 mm×50 mm, 1.7μL, 流动相为乙腈-水, 乙腈为流动相A, 水为流动相B, 并以1 m L/L三乙胺, 冰醋酸调节p H值至8, 梯度洗脱, 流速为0.6 m L/min, 检测波长为246 nm, 柱温为50℃, 进样量为1μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 供试品溶液的制备:

取钩藤粉末样品2 g, 称定后放置在圆底烧瓶中, 精密加入2 m L氨水, 闷润30 min后, 精密加入50 m L的乙腈, 称定重量后, 加热回流2 h, 冷却后再次称重, 经乙腈将损失重量补足, 摇匀后过滤, 取续滤液, 作为供试品溶液。同法制成超过液相色谱法供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液制备:

精密称取异钩藤碱对照品适量, 经乙腈溶解后制成每毫升中含有异钩藤碱50 g的对照品溶液, 同法制成超高液相色谱法的对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察:

超高液相色谱法:分别取食量的异钩藤碱储备液配制成浓度为0.4602、0.36816、0.27612、0.18408、0.09204、0.04602、0.02301、0.011505、0.002301和0.0004602 mg/m L的对照品溶液, 在2.1所示色谱条件下1μL进样检测, 以对照品的浓度作为横坐标, 峰面积作为纵坐标绘制标准去洗, 结果得到异钩藤碱的线性回归方程为Y=4×106X-4364.9, r2=0.9999, 证实异钩藤碱浓度在0.4602~460.2 g/m L时存在良好的线性关系。

高效液相色谱法:精密称取异钩藤碱5.05mg, 经乙腈溶解后配制成浓度为0.505 mg/m L的对照品溶液, 精密吸取该溶液配制成不同浓度的对照品溶液, 分别为:0.505、0.404、0.303、0.202、0.101、0.0505、0.02525、0.012625、0.002525、0.000505 mg/m L。在2.1所示色谱条件下20μL进样检测, 记录峰面积, 以异钩藤碱浓度为横坐标, 以峰面积作为纵坐标, 绘制标准曲线, 结果得到异钩藤碱的标准曲线为:Y=41.101X-0.233, r2=0.9999, 证实异钩藤碱浓度在0.505~505 g/m L之间时存在良好的线性关系。

2.3.2 精密度实验:

超高液相色谱法:选取浓度为0.036816 mg/m L的对照品溶液, 一日日重复进样3次, 连续进样3 d, 按照2.1所示色谱条件1μL进样检测, 记录峰面积, 结果得到RSD值为0.16%, 证实该仪器的精密度良好。高效液相色谱法:选取浓度为0.02525 mg/m L的对照品溶液, 日内重复进样3次, 连续3 d, 在, 2.1所示条件下20μL进样检测, 记录峰面积, 结果得到RSD值为0.16%, 证实该仪器的精密度良好。

2.3.3 稳定性实验:

超高液相色谱法:精密称定供试品2 g, 在2.2.1条件下制成供试品溶液, 在2.1所示色谱条件下分别在0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h时1μL进样检测, 记录峰面积, 结果得到RSD职位0.14%, 证实溶液在72 h内的稳定性良好。

高效液相色谱法:精密称定供试品2 g, 在2.2.1条件下制成供试品溶液, 在2.1所示色谱条件下分别在0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h时1μL进样检测, 记录峰面积, 结果得到RSD职位0.34%, 证实溶液在72 h内的稳定性良好。

2.3.4 重复性实验:

超高液相色谱法:取6份钩藤药材粉末, 在2.2.1条件下制成供试品溶液, 在2.1色谱条件下进样检测, 记录峰面积, 结果得到RSD值为0.6%, 证实该方法的重现性良好。高效液相色谱法:取6份钩藤药材粉末, 在2.2.1条件下制成供试品溶液, 在2.1色谱条件下进样检测, 记录峰面积, 结果得到RSD值为1.5%, 证实该方法的重现性良好。

2.3.5 回收率实验:

超高液相色谱法:取5份同一批次一直含量的钩藤药材样品, 分别精密加入一定量的对照品溶液, 在2.1所示条件下进样检测, 记录峰面积, 计算回收率, 结果发现, 平均回收率为96.41%, RSD值为3.1%;高效液相色谱法:取5份同一批次一直含量的钩藤药材样品, 分别精密加入一定量的对照品溶液, 在2.1所示条件下进样检测, 记录峰面积, 计算回收率, 结果发现, 平均回收率为98.01%, RSD值为4.1%。

2.4 样品含量测定:

取不同批次钩藤药材粉末样品, 在2.2.1条件下配制成供试品溶液, 在2.1条件下进样检测, 记录峰面积, 计算含量。结果发现, 超高液相色谱法测定钩藤中异钩藤碱的含量平均为0.09653%, 高效液相色谱法测定钩藤中异钩藤碱的含量平均为0.09159%, 二者无明显差异。

3 讨论

中药材钩藤为茜草科植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤的干燥带钩茎枝。钩藤的主要功效为熄风定惊、清热平肝, 在肝风内动、感冒夹惊、惊痫抽搐、小儿惊啼、妊娠子痫以及头痛眩晕等症的治疗中具有很好的效果[2]。经超高液相色谱法和高效液相色谱法对钩藤中有效成分异钩藤碱含量进行测定时具有方法准确可靠, 操作简单等优势, 值得关注。

参考文献

[1]张荣, 刘睿, 刘启德, 等.钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的提取与含量测定[J].中药新药与临床药理, 2009, 11 (4) :1001-1003.

食品添加剂高效液相色谱法应用研究 篇8

针对我国食品市场, 常见的食品安全威胁大概有:农药残留, 例如蔬菜水果;金属污染, 这大多是由土壤污染引起;违禁物品添加, 如诸多添加剂等。此外还有些生态污染, 如微生物污染等。其中食品添加剂污染最为常见, 量小, 不易检测, 但对人体健康危害重大。准确快速检测这些物质, 是对人民健康的保障, 也是对社会稳定的维护。

高效液相色谱法 (HPLC) 是20 世纪70 年代发展起来的一项效率高、快速的分离技术。在经典的液体柱色皮法基础上, 结合了色相谱法分析的理论, 采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器技术, 使得分析速度、分离效率都有明显提高, 而且实现了操作的自动化。高压、高速、高灵敏度——“三高”是高效液相色谱的三大特点。自20 世纪80年代以来, 高效液相色谱法凭借其“三高”在食品安全领域得到广泛引用, 液相色谱以其优势则广泛应用于食品添加剂、违禁物质添加等食品安全项目中。

高效液相色谱法作用原理

高效液相色谱又名为高压液相色谱、高分离度液相色谱。其是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程, 溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离。用公式表示液相色谱分离度为:

从公式中不难看出, 液相色谱柱分离度R与柱效率n、溶剂效率a、容量因子k相关, 且与n、a、k均是正相关。从色谱上来看, 将n当做变量, 改变的是色谱峰, n越大, 峰越窄;将k当做变量时, 改变的是液相色谱移动相积性, k增加, 色谱峰向后移动, 分离度增加;将a当做变量时, 改变的是分离度。因此为了增加高效液相色谱法灵敏度、分离度, 可以采用高效能的填充剂, 增加保留成分时间、适度增加k, 分离时间不宜过长, 否则会使峰形变得平坦, 影响检测灵敏度。K的有效范围一般为a<k<5。

食品添加剂

在我国食品安全法中规定, 食品添加剂是指“为改善食品品质的色香味, 以及防腐和加工工艺的需要而加入食品中的化学合成或者天然物质”, 其毒性是指添加剂对机体造成损害的能力。毒性除与物质本身的化学结构和理化性质有关外, 还与其有效浓度、作用时间、接触途径和部位、物质的相互作用与机体的机能状态等条件有关。

实验检测问题

由于食品成分复杂, 各成分的含量确定是个难题, 特别是各个食品添加剂含量一般较低, 若是检测是否含有一般较为简单, 而确定其所占百分比则涉及到一个精确度的问题。实验精度一般是由下列问题引起的。

样本数目过大, 色谱显示有限, 不能做到完全分离。

HPLC的相邻色谱峰保留时间差太短, 增加了分组的不确定性。

仪器设备的干扰和方法的局限性, 例如气相色谱法的分离强度、灵敏度、分离速度都很高, 但是由于条件的限制, 沸点太高的物质或者热稳定性较差的物质是很难引用这种气相色谱法来分析的。

以食用色素为例的检测

食物讲究色香味俱全, 为了改善食物外观, 食物中添加食用色素很常见。食用色素有天然色素和合成色素的区别, 从安全角度来说, 天然色素由于提取于动植物体内, 较为安全, 但是合成色素一般有慢性毒素和致癌作用, 其用量必须严格控制。

王春荣、吴敏等人曾就食品中的柠檬黄、胭脂红等进行实验研究, 试验分别用RP18 色谱柱、Zorbax 80A Extend-C18 色谱柱观察, 实验结果如表1 所示。

结论

高效液相色谱法自20 世纪70 年代发展以来, 不断优化, 凭借其高压、高速、高灵敏度的特点得到广泛引用, 通过与色谱技术的结合弥补了传统方法的不足, 不单单是检测灵敏度的提高, 更加增加了其可操作性, 为大范围食品检测样本提供了可能, 随时代的发展, 高效液相色谱法得到普及也是必然趋势, 同时气相色谱法的缺点也将虽技术的进步得到完善。

高效液相色谱法测定4AA的含量 篇9

1仪器与试药

Aglient 1100系列高效液相色谱仪, VWD紫外检测器 , AE200型电子分析天平 (梅特勒-托利多公司) , 4AA对照品 (自制) , 峰面积归一化法含量为99.5%, 乙腈 (Fairfield, 美国) 为色谱纯, 水为纯化水, 其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Aglient ZORBAX SB-C18柱 (250 nm×4.6 nm, 5 μm) ;流动相为乙腈-20 mmol/L磷酸二氢钠溶液 (用磷酸调pH3.0) =80:20;流速为1.0 ml/min, 检测波长210 nm;柱温25 ℃;进样量20 μl。

2.2 溶液的配制

对照品溶液的配制: 取经干燥至恒重的4AA对照品约50 mg, 精密称定后置于50 ml容量瓶中, 用乙腈:水 (4:1) 溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液。

供试品溶液的配制: 取4AA样品或组品约50 mg, 精密称定后置于50 ml容量瓶中, 用乙腈:水 (4:1) 溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为供试品溶液。

2.3 线性关系

分别精密量取1.0 mg/ml对照品溶液适量, 分置10 ml容量瓶中, 加乙腈:水 (4:1) 至刻度, 摇匀, 分别得到浓度为10.0, 20.0, 40.0, 60.0, 80, 100.0, 150, 200.0 μg/ml, 进样, 记录色谱图。按照最小二乘法原则, 以4AA的峰面积为纵坐标 (A) , 以相应的浓度 (C) 为横坐标进行线性回归, 得回归方程为:A=13458.5C +46.52, 相关系数r=0.999 9。结果表明4AA在10～200.0 μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。

2.4 精密度试验

分别取高、中、低 (100, 50, 10.0 μg/ml) 三种不同浓度的4AA对照品溶液, 进行测定, 记录色谱图, 试验结果表明, 不同浓度4AA对照品溶液日内精密度和日间精密度均小于3.2%。

2.5 稳定性试验

取浓度为10.0 μg/ml的4AA的对照液, 在0, 1, 2, 4, 8, 10 h (放置时避光) , 分别测定其峰面积。结果RSD=1.02%, 结果表明, 4AA的乙腈:水 (4:1) 溶液避光保存, 在10 h内较稳定。

2.6 重复性试验

取同一批次的4AA样品 (090202) 按供试品溶液的制备方法配制6份, 依法测定, RSD=0.95%, 表明本方法测定重复性良好。

2.7 样品含量测定

取4AA原料药三批, 每批取三份, 按照测定方法测定含量, 进样量20 μl, 用外标法计算4AA的含量, 结果见表2。

3讨论

3.1 检测波长的选择

用乙腈:水 (4:1) 配制4AA对照品溶液, 进行190～600 nm紫外吸收扫描, 其最大吸收波长为210 nm和230 nm, 且在210 nm处摩尔吸收较大。由于4AA在210 nm处吸收更灵敏, 可以减少样品取样量, 故选择210 nm波长为检测波长。

3.2 流动相的选择

本实验曾分别选用乙腈-水 (70:30) 和乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钠溶液 (用氢氧化钠调pH6.5) (70:30) , 前者出现倒峰, 后者与相邻的杂质峰不能达到较好的分离。而用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钠溶液 (用磷酸调pH3.0) (80:20) , 避免了上述两者的弊端, 故作为本方法的流动相。

3.3 4AA纯度的检测

由于4AA是3个手性中心的单一异构体手性药物中间体, 具有光学性质, 需要测定其光学纯度, 通过测定其物质的旋光度和光学纯度, 控制异构体手性药物的光学纯度, 只有化学纯度和光学纯度皆达到要求, 4AA才能是合格的产品。

参考文献

[1] PERBONI B ROSSI T, DONATI D, et al.Tribactama:a novel class of β-lactam antibiotics.bently pH, ponsford red.recent advances in the chemistry of anti-infective agents.Cambridge.UK:The Royal socity of Chemisty, 1993:21-66.

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