体外模拟消化

2024-06-02

体外模拟消化（精选五篇）

体外模拟消化篇1

关键词：鱼油,体外模拟消化,TBARS,氧化

鱼油所含的磷脂是动物脑、神经组织、骨髓、心、肝、卵和脾中不可缺少的组成部分, 同时有助于脂的消化吸收、转运和形成, 又是生物膜的重要结构物质, 具有降血脂、降血压、抗血栓、抗肿瘤、提高机体免疫力、健脑促智和抗衰老等功效, 对于心脑血管疾病具有良好的疗效。

鱼油富含二十碳五烯酸 (EPA) 和二十二碳六烯酸 (DHA) 等ω-3系多不饱和脂肪酸, 极易氧化酸败。经人摄食后, 在消化吸收过程中, 其稳定性会受到消化环境的p H值、温度、金属离子以及氧化性食物成分的影响, 造成鱼油结构和品质的破坏, 从而降低鱼油的功效和食用价值。

本项目通过测定不同鱼油经体外模拟消化前后的TBARS值, 以探究人体消化系统对鱼油品质的影响, 从而为发挥鱼油在人体内的功效、降低鱼油氧化对人体的危害提出一定的参考依据。

1 试验材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鱼油, 购于超市;Span80、胃蛋白酶 (3 800U/g) 、胰蛋白酶 (1∶250) 、盐酸、磷酸二氢钾 (AR) 和氢氧化钠 (AR) , 均购于国药集团化学试剂有限公司;二次蒸馏水。

轻度氧化鱼油:新鲜鱼油在36~38℃恒温烘箱中5h。

新鲜乳化鱼油:在8g新鲜鱼油中加入2g Span80, 通过均质制成含有20%乳化剂的鱼油。

胃消化液:稀盐酸16.4mL (0.9%HCl溶液) , 加水约800mL与胃蛋白酶10g, 摇匀后, 加水稀释成1 000mL, 即得。

肠消化液:磷酸盐缓冲液 (pH值6.8) , 取磷酸二氢钾6.8g, 加水500mL使之溶解, 用0.1mol/L NaOH溶液调节pH值至6.8, 另取胰酶10g, 加水适量使溶解, 将两液混合后, 加水稀释成1 000mL, 即得。

MDA测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

AR224CN型精密电子天平, 奥豪斯仪器有限公司;SHZ-82A型水浴恒温振荡器, 国旺电器有限公司;721型分光光度计, 上海精密科学仪器有限公司;TD5A-WS台式低速离心机, 湖南湘仪试验室仪器开发有限公司;HH-4型速显恒温水浴锅, 国华电器有限公司;PHS-3C酸度计, 上海虹益仪器仪表有限公司;JZ-Ⅱ型均质器, 中国铁道部电化院四方电气设备厂。

1.3 鱼油过氧化值的测定原理

由于鱼油中脂质过氧化物 (LPO) 生成机制复杂, 降解产物较多, 因此所使用的分析方法有很多种。其中硫代巴比妥酸反应法 (TBARS) 因操作简便、重复性好而被广泛地用于食品、生理组织中过氧化物的测定, 该法利用LPO在酸性条件下加热分解所生成的丙二醛 (MDA) 与硫代巴比妥酸 (TBA) 反应, 生成的红色缩合物MDA·TBA2在532nm处有最大吸收峰, 通过测其吸光值的变化, 可间接地测定脂质过氧化程度。根据公式A=-lgI/Io=-lgT=KCL可知, 吸光度值随丙二醛浓度的增加而增大。

1.4 鱼油过氧化值的测定方法

1.4.1 鱼油过氧化值的测定

精确移取1.0mL新鲜鱼油、轻度氧化鱼油、新鲜乳化鱼油于10mL容量瓶中, 用0.01mol/L的HCl定容, 摇匀。按照试剂盒操作说明要求测定532nm处的吸光度值, 按下式计算样品的丙二醛含量CMDA (nmol/mL) 值, 每个样品平行测定3次, 取平均值。

式中:A测为测定管吸光度;A空白为测定空白管吸光度;A标为标准管吸光度;A°空白为标准空白管吸光度;C标为标准品浓度, 10nmol/m L;N为样品测试前稀释倍数 (此试验中为10) 。

1.4.2 模拟消化后鱼油过氧化值的测定

分别准确称取5g新鲜鱼油、轻度氧化鱼油和新鲜乳化鱼油于3支250mL锥形瓶中, 加入配制好的30mL胃消化液或肠消化液, 封口, 将锥形瓶置于 (37±0.5) ℃台式恒温器中, 以80次/min的速度振荡消化3h后, 按1.4.1方法测定3个样品的吸光度值, 计算MDA值。

2 结果与分析

选择新鲜鱼油、轻度氧化鱼油和新鲜乳化鱼油在体外进行模拟消化, 比较消化前后3种鱼油的过氧化值, 结果见表1、表2、表3和图1。

由表1可知:3种鱼油样品中未经消化的新鲜乳化鱼油过氧化值最低, 与新鲜鱼油的过氧化值比较, 差异显著, 表明span-80对新鲜鱼油的氧化有较强的抑制作用。

由表2和表3可知:经模拟胃液和肠液消化后, 3种鱼油的过氧化值均显著增加, 且经肠液消化的鱼油比经胃液消化的鱼油过氧化值增加更大, 说明胃液、肠液的化学环境都会加速鱼油的氧化, 且肠液环境影响更大, 表示在碱性条件下鱼油更易氧化。

由图1可知:经体外模拟胃液和肠液消化后, 新鲜乳化鱼油的氧化值最大, 说明消化对新鲜乳化鱼油的氧化催化能力最强, 分析与乳化剂span-80的化学性质有关, span-80为失水山梨糖醇脂肪酸酯, 是一种很强的亲油性乳化剂。

3 讨论

鱼油中含有大量的EPA和DHA等多不饱和脂肪酸, 极易被氧化, 本试验根据硫代巴比妥酸反应物法 (TBARS) 原理, 采用MDA试剂盒测定了新鲜鱼油、轻度氧化鱼油和新鲜乳化鱼油在体外模拟消化前后的丙二醛含量, 从而推断人体消化环境对鱼油氧化的影响。本文的研究表明:当人体摄入这3种鱼油后, 在人体的消化道内都会产生不同程度的氧化, 特别是为了增强稳定性, 某些鱼油中添加一定量的乳化剂, 这类产品在消化过程中更易被氧化。脂类的氧化产物对人体的危害严重, 可以诱发高血压、冠心病、肾病、糖尿病及癌症等疾病。目前越来越多的人选择鱼油作为保健食品, 以改善心血管功能及增强智力发育, 因此, 建议尽量选择不含添加剂、特别是乳化剂的鱼油产品, 在摄食鱼油的同时, 多吃具有较强抗氧化性能的食物, 如富含Vc、VE、VA或胡萝卜素等的食品, 一般多数水果、蔬菜、坚果和动物内脏等含较多此类营养素, 它们能对鱼油的氧化产生一定的抑制作用, 从而最大限度的发挥鱼油的功效, 减少过氧化物对人体的危害。

参考文献

[1]Mclennan P.P., Abbeydena M..The cardiovascular protective role of docosalexaenoic acid[J].Phammco1, 1995 (300) :83-89.

[2]徐飞, 黄茂芳, 李积华, 等.体外消化模型下香蕉果肉中铬元素的初级形态分析[J].食品科学, 2009, 30 (19) :114-116.

[3]Reinhard Marcuse, Lars Johansson.Studies on the TBA test for rancidity grading:II.TBA reactivity of different aldehyde classes[J].Journal of the American Oil Chemists Society, 1971 (10) :387-391.

芸豆蛋白的营养评价和体外消化研究篇2

本研究以产自甘肃平凉的泾川白芸豆为材料,以芸豆蛋白为研究对象,从蛋白组成成分、营养价值及体外模拟消化等方面进行系统研究,以期为芸豆等杂粮作物的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泾川白芸豆(蛋白质含量22.47%,脂肪含量2.56%),采自甘肃平凉;胃蛋白酶(1:3000)和胰蛋白酶(1:250),济宁和美生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

TGL-16高速冷冻离心机,湘仪离心机公司;FD-1-55冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司;835-50氨基酸自动分析仪,日本Hitachi公司。

2 试验方法

2.1 芸豆蛋白的分离制备

芸豆蛋白分离制备采用碱溶酸沉法[3]。

2.2 蛋白主要理化指标分析

水分的测定参照GB/T5009.3-2003;灰分的测定参照GB/T5009.4-2003;粗脂肪的测定参照GB/T14772-2008;总蛋白含量的测定参照GB/T5009.5-2003。

2.3 7S和11S球蛋白的超速离心分析

参考文献[4]中采用的改良Nagano法。

2.4 蛋白氨基酸组成分析

准确称取研细的待测样品0.5g,装于10mL水解管中,加入8mL 6mol/L的盐酸,真空泵抽至真空后充入高纯氮气,重复3次,用酒精喷灯封管,1 10℃水解24h。取出,打开水解管,转入50mL容量瓶中并用水稀释至刻度,过滤,取滤液10mL于蒸馏烧瓶中55℃水浴蒸发至干,加样品稀释液10mL,超声溶解后过0.45μm膜,于2mL进样瓶中供仪器测定用。用碱水解法测定色氨酸。

2.5 蛋白营养价值的评价

2.5.1 比值系数法

以FAO/WHO推荐的必需氨基酸模式和鸡蛋氨基酸模式作参比,计算氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)、氨基酸比值系数(RC)、必需氨基酸比率(A/E)、必需氨基酸指数(EAAI)、氨基酸比值系数分(SRCAA)、生物价(BV)和营养指数(NI)[4,5]。

2.5.2 模糊识别法

参考文献[6]中兰氏距离法计算芸豆蛋白与标准蛋白α的贴近度。

2.6 体外模拟消化研究

2.6.1 复合酶体系消化

将一定量样品分散于pH1.5 HCL溶液中,37℃孵育5 min,按照m(酶):m(底物)=1:50加入胃蛋白酶,消化不同时间后用1mol/L NaOH调pH至7.0中止反应,取样分析;最终所得的消化液以m(酶):m(底物)=1:50比例加入胰蛋白酶,再消化一段时间后测定氮释放量[7]。

2.6.2 氮释放量的测定

采用TCA-NSI法。取5mL的不同消化液于5mL10%TCA溶液中,4000 r/min离心20 min,用10%TCA溶液洗涤沉淀2次,离心得到TCA不溶组分。TCA不溶性氮含量采用凯氏定氮法测定。氮释放量由下式计算:

式中:Nt为消化t时间的TCA不溶性氮(mg);N0为样品中的TCA不溶性氮(mg)。

3 结果与分析

3.1 芸豆蛋白的组分分析

经测定,以干基计芸豆蛋白的蛋白质含量为95.48%,脂肪和灰分含量较低,说明提取的蛋白纯度较高。根据离心沉降法分析芸豆蛋白组分可知,7S和11S球蛋白含量分别为4.61%和10.22%。这与孙鑫[8]报道的芸豆蛋白主要成份为不含二硫键的7S球蛋白有所不同,原因可能是芸豆品种差异所致,文献中所用原料为东北红芸豆,而本实验中原料为泾川白芸豆。

3.2 氨基酸分析与营养价值评价

3.2.1 氨基酸组成分析

芸豆蛋白中共含有18种氨基酸(见表1),氨基酸总量达85.30%,其中谷氨酸含量最高(13.69%),其次是天门冬氨酸(10.13%)。谷氨酸在人体内可促进氮基丁酸的合成,从而降低血氨,促进脑细胞呼吸,可以用于治疗神经精神疾病,如精神分裂症和脑血管障碍等引起的记忆和语言障碍、小儿智力不全等。天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂,可用于治疗心脏病、肝脏病、高血压症,具有防止和恢复疲劳的作用[9]。由表1还可知,蛋白中人体必需的8种氨基酸含量为41.34%,必需氨基酸占总氨基酸的比值(EAA/TAA)为48.46%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)=94.04%。这与FAO/WHO提出的EAA/TAA比值为40%左右,EAA/NEAA为60%以上的参考蛋白模式相近,说明芸豆蛋白属于优质蛋白。

3.2.2 营养价值评价

一种营养价值较高的蛋白质,不仅必需氨基酸种类要齐全,而且比例也要适宜,最好能与人体需要相符合,这样氨基酸才能吸收完全。由表2可知,芸豆蛋白中必需氨基酸各自占总氨基酸的质量分数,除异亮氨酸、亮氨酸和苏氨酸略低于模式谱外,其它均高于FAO/WHO标准模式,必需氨基酸评分为91.25,与标准模式接近,可见芸豆蛋白必需氨基酸比例均衡,有很高的营养价值。从蛋白的RC可以看出,异亮氨酸、苏氨酸和亮氨酸的RC<1,其余氨基酸均大于1,说明异亮氨酸和苏氨酸含量偏少,分别为第一和第二限制性氨基酸。

表2芸豆蛋白的各种营养评价指标

现代营养学更多强调蛋白质的氨基酸平衡,氨基酸不足或过剩同样严重影响蛋白质的营养价值。氨基酸比值系数分(SRCAA)就是从各种必需氨基酸偏离氨基酸模式的离散度这个角度来评价其质量。SRCAA越接近100,其氨基酸组成与FAO/WHO模式越一致。同样,贴近度(μ)值反映了被评价蛋白的质量与标准蛋白质的接近程度。μ值越接近1,其蛋白质营养价值相对越高。营养指数(NI)综合衡量蛋白质的含量与其氨基酸组成,蛋白质的百分含量越高,EAAI值越大,NI值就越高,营养价值就高。由表3可知,芸豆蛋白的AAS、CS、EAAI和NI值均高于大豆蛋白和乳清蛋白,只有SRCAA和BV略低。另外,芸豆蛋白的贴近度为0.92,与大豆和牛奶贴近度值相近[10,11]。尽管不同的评价指标对蛋白质进行营养评价,结果会有所差异,但综合各种指标充分说明了芸豆蛋白可以作为一种良好的优质植物蛋白源。

注:a,b,c表示营养价值从高到低排列。

3.3 模拟消化过程的氮释放量变化分析

由图1可知,KBP、11S和7S组分的氮释放量在胃蛋白酶和胰蛋白酶两消化阶段总体呈逐渐上升趋势,并且在消化初始阶段急剧增加,随后增加速度逐渐放缓。胃蛋白酶阶段的氮释放量增速大小依次为

7 S>11S>KBP。

消化30min后,7S组分的氮释放量明显高于后两者,因为7S组分小分子蛋白质含量居多,结构简单,有利于胃蛋白酶的作用。消化60～120min过程中,11S和KBP的氮释放量增加趋势几乎一致。

进入胰蛋白酶阶段,KBP的氮释放量仅增加了9.8%,而其余两者均有较多的增加,尤其是11S组分增加量高达18.36%,这可能是由于经过胃蛋白酶消化后暴露了更多的胰蛋白酶作用位点,较易被胰蛋白酶消化,释放了大量的可溶性氮。该阶段氮释放增加量大小依次是11S>7S>KBP。完全消化结束后,7S和11S组分的氮释放量显著高于KBP,此时三者氮释放量依次为84.56%、79.88%和73.11%。

4结论

芸豆蛋白的氨基酸种类齐全,必需氨基酸组成符合FAO/WHO标准模式,其氨基酸评分(A AS)、化学评分(CS)、必需氨基酸指数(EAAI)、生物价(BV)、营养指数(NI)和氨基酸比值系数分(SRCAA)分别为91.25、67.59、78.07、43.54、7455和62.38。7S、11S组分和KBP经240min体外模拟消化后的氮释放量依次为84.56%、79.88%和73.11%。说明芸豆蛋白营养价值高,容易消化,可作为一种优质植物蛋白资源开发利用。

摘要：以芸豆蛋白(KBP)为研究对象,采用比值系数法和模糊识别法全面评价其营养价值。结果表明,芸豆蛋白的必需氨基酸组成符合FAO/WHO标准模式,其氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)、必需氨基酸指数(EAAI)、生物价(BV)、营养指数(NI)和氨基酸比值系数分(SRCAA)分别为91.25,67.59,78.07,43.54,74.55和62.38。胃蛋白酶和胰蛋白酶体系模拟消化研究发现,KBP、11S和7S组分的氮释放量分别为73.11％、79.88％和84.56％,说明芸豆蛋白是一种营养价值丰富、容易消化的优质蛋白资源。

关键词：芸豆蛋白,营养评价,体外消化

参考文献

[1] 柴岩,冯佰利,孙世贤.中国小杂粮品种[M].中国农业科学技术出版社,2007:1-20

[2] 周大寨,朱玉昌,周毅锋.芸豆蛋白质的提取及超滤分离研究[J].食品科学,2008,29(8) :386-390

[3] 任海伟,李志忠,王鸣刚,等.超滤对芸豆蛋白酶解物抗氧化活性的影响[J].食品科学,2009,30(18) :212-216

[4] 张国华,王常青,王海凤.变性葵粕分离蛋白特性的研究[J].食品工业科技,2009,30(6) :149-151

[5] 曲晓婷,张名位,温其标.米糠蛋白提取工艺的优化及其特性研究[J].中国农业科学,2008,41(2) :525-532

[6] 杨琴,杜双田,郜小娟,等.博湖大蘑菇蛋白质营养价值评价[J].食品科学,2009,30(5) :100-103

[7] 王金梅,张占琴,王学军.菜籽蛋白的制备及其体外模拟消化[J].中国油脂,2008,33(9) :10-15

[8] 孙鑫,唐传核,尹寿伟.芸豆7S球蛋白的热性质研究[J].现代食品科技,2008,24(8) :777-780

[9] 周侃,熊华,陈升军.高蛋白含量米蛋白肽制备及产品营养成分分析[J].食品与生物技术学报,2009,28(1) :28-32

[10] 张泽生,郭宝芹,刘素稳.乳清浓缩蛋白和大豆分离蛋白的营养价值评价[J].大豆通报,2007,5:22-24

体外模拟消化篇3

1 材料

1.1 动物

SPF级SD大鼠, 雄性, 体重 (250±10) g, 由中山大学 (实验动物中心东校区) 提供, 动物合格证号:SCXK (粤) 2011-0029。

1.2 仪器

SHIMASZU高效液相色谱仪 (LC-20AT泵、SPD-20A紫外检测仪、LCsolution色谱工作站) ;UV2450紫外分光光度计 (日本岛津) ;ME204E电子分析天平 (梅特勒-托利多仪器有限公司) ;混合气体 (广州市骏旗气体有限公司) ;高速冷冻离心机 (Eppendorf 5427R) ;恒温水浴锅 (上海-恒仪科学仪器有限公司) 。

1.3 试药

东阿阿胶 (山东东阿阿胶股份有限公司) ;L-羟脯氨酸标准品 (中国食品药品检定研究院, 批号:111578-200201) ;甘氨酸 (阿拉丁, 分析标准品) ;牛血清白蛋白 (阿拉丁, ≥96%) ;胃蛋白酶 (阿拉丁, 1:3000) ;胰蛋白酶 (阿拉丁, 1:250) ;茚三酮 (阿拉丁, AR级) ;乙腈为色谱纯, 其他试剂均为分析纯;水为实验室去离子水。

2 方法

2.1 实验样品的制备

采用Madureira等[6]的方法对阿胶经行体外人工消化:阿胶胃酶解物:阿胶12.5g, 加入人工胃液定容至1L, 保持恒温37℃, 搅拌转速100r/min;阿胶胰酶解物:阿胶12.5g, 加入人工肠液定容至1L, 保持恒温40℃, 搅拌转速120r/min;阿胶胃-胰酶解物:阿胶25g, 先加入人工胃液1L, 恒温37℃, 搅拌转速100r/min, 反应2h后, 用NaOH调节pH至中性, 再加入人工肠液定容至2L, 使阿胶终浓度为12.5g/L, 保持恒温40℃, 搅拌转速120r/min。

2.2 阿胶水解度测定

阿胶经酶处理后分别于0、5、10、15、20、30、40、60、90、120min取样, 沸水浴10min使酶灭活终止反应, 水解度 (Degree of hydrolysis, DH) 测定采用茚三酮法[7]。

2.2.1 羟脯氨酸及甘氨酸含量的测定

羟脯氨酸及甘氨酸含量的测定采用柱前衍生化-HPLC法测定:取样品溶液0.5mL, 加入0.25mL 0.1mol/L PITC乙腈溶液与0.25mL 1mol/L三乙胺乙腈溶液, 充分混匀, 室温放置1h后, 加1mL 50%乙腈, 混匀, 加入正己烷2mL, 混合均匀后4 000r/min离心5min, 取下层溶液, 用0.45μm微孔滤膜过滤, 取续滤液备用。

色谱条件:色谱柱:Diamonsil C18色谱柱 (150mm×4.6mm, 5μm) ;柱温:30℃;流动相A:乙腈-0.1mol/L乙酸钠 (7:93) , 用醋酸调节pH值至6.5;流动相B:乙腈-水 (4:1) 。梯度洗脱:设定程序0~11min, 100%→93%A;11~13.9min, 93%→88%A, 13.9~14min, 88%→85%A;14~29min, 85%→66%A;29~30min, 66%→0%A;30~35min, 0%→100%A;35~40min, 100%A;流速1.0mL/min;检测波长为254nm;进样量:20μL。

K-R营养液与肠囊内其他物质在254nm处对Hyp及Gly的出峰无干扰, 专属性较好, 见图1;Hyp在2.29~152.52mol/L浓度范围内线性关系良好, 标准曲线方程为:A1=2 251C1-1 114.9, R2=0.999 6;Gly在16.65~532.84μmol/L浓度范围内线性关系良好, 标准曲线方程为:A2=3 283.3C2+40 332, R2=0.999 2。

2.2.2 总氨基酸含量的测定

茚三酮与游离α-氨基作用的性质适用于氨基酸含量的测定, 以甘氨酸作为标准物质, 空白K-R液作为对照, 测定肠吸收液中总游离α-氨基的数量。精密量取待测样品0.1mL置于5mL容量瓶中, 加入3%抗坏血酸溶液0.1mL, 加入茚三酮显色剂2mL, 最后加入0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液 (pH=5.8) 定容至5mL, 摇匀, 105℃反应15min后迅速放入冷水中冷却, 如有蒸发, 可用乙酸-乙酸钠缓冲液补齐5mL[8];样品在450~800nm范围内经行扫描, 在570nm处具有最大吸收峰;在26.91~376.72mol/L浓度范围内线性良好, 标准曲线方程为:A3=5.483 5C3-0.028, R2=0.999 7。

2.3 阿胶外翻肠囊实验

实验前大鼠禁食24h, 自由饮水, 以每只100g腹腔注射20%乌拉坦0.5mL经行麻醉, 待大鼠无知觉后打开腹腔;分别迅速取十二指肠、空肠、回肠 (十二指肠从幽门开始, 空肠段离幽门15cm处开始, 回肠自盲肠上行20cm开始) 各约10cm;用预冷的K-R液冲洗至无内容物, 清除浆膜表面肠系膜及脂肪等, 使用圆头玻璃棒翻转肠段, 肠段一端用手术线扎紧, 另一端固定于取样管, 制备为肠囊[9];每个肠囊分别加入1mL空白K-R液, 将其放入装有200mL阿胶供试液的烧瓶中, 烧瓶中持续通入混合气体 (95%O2及5%CO2) 以保持肠段实验期间的活性, 整个体系在实验期间放置于 (37±0.5) ℃恒温水浴锅内;实验结束后处死大鼠, 取下被考察肠段, 测量其长度 (L) 和内径 (r) 。设置阿胶组、阿胶胃酶解物组、阿胶胰酶解物组、阿胶胃-胰酶解物组、K-R液组, 每组重复3次。

分别在0、20、40、60、80、120min时从肠囊内取出肠吸收液1mL, 置于1.5mL离心管内, 并补加相同体积的37℃的K-R液。收集的肠吸收样品经沸水煮沸10min, 在4℃下12 000r/min离心10min。收集上清液过0.45μm的滤膜, 分别按“2.2.1”及“2.2.2”项下操作, 测定吸收液中Gly、Hyp及总氨基酸的含量。

2.4 数据处理

2.4.1 阿胶水解度计算

DH为水解度, h为水解后每克蛋白质被裂解的肽键毫摩尔数 (mmol/g) , htot为每克原料蛋白质的肽键毫摩尔数 (mmol/g) [10], 本实验取6.04。

2.4.2 阿胶肠吸收后氨基酸累积吸收量及吸收速率

Qn为药物各时间点单位肠面积的累积吸收量 (μmol/cm2) , Ci为样品浓度 (μmol/mL) , V为取样体积 (mL) , A为肠囊面积 (cm2) ;以Qn (μmol/cm2) 对时间T (min) 进行线性回归, 所得斜率即为药物的吸收速率常数Ka (μmol·cm-2/min) 。

3 结果

3.1 消化酶对阿胶的水解作用

胰蛋白酶对阿胶的水解作用较强, 在合适的条件下可以迅速水解阿胶, 酶水解120min后水解产物DH为5.66%;而胃蛋白蛋白酶对阿胶的水解作用较弱, 阿胶胃酶解120min后水解度为1.24%;胃蛋白酶解后水解物再经胰蛋白酶酶解也可以被迅速水解, 且120min后水解产物DH为6.26%;阿胶的胰酶解物及胃-胰酶解物的水解度显著高于胃酶解物, 差异具有统计学意义 (P<0.05) , 见图2。取酶解120min时的各水解产物进行肠吸收实验。

3.2 消化酶酶解对阿胶中羟脯氨酸在不同肠段吸收的影响

羟脯氨酸是阿胶中驴皮胶原的特征氨基酸, 在胶原蛋白中含量稳定且几乎不存在于其他蛋白中, 因此羟脯氨酸可以一定程度表征阿胶中胶原成分的吸收;阿胶中羟脯氨酸在十二指肠、空肠、回肠都有少量吸收, 见表1。吸收趋势为:十二指肠≈空肠>回肠;阿胶的胰酶解物、胃-胰酶解物在各肠段的Q120 (μmol/cm2) 、Ka (μmol·cm-2/min) 都有一定程度的提升, 其中对回肠部位的提升最为显著 (P<0.05) ;阿胶胃蛋白酶酶解组其羟脯氨酸的吸收与阿胶组相比差异无统计学意义 (P>0.05) 。

(±s, n=3)

注:与阿胶组比较, *P<0.05。

3.3 消化酶酶解对阿胶中甘氨酸在不同肠段吸收的影响

甘氨酸是阿胶中含量最多的氨基酸, 广泛存在于阿胶的各类蛋白质中, 占总氨基酸含量的20%左右;阿胶中甘氨酸的吸收趋势为:十二指肠>空肠>回肠, 差异不具有显著性, 见表2;阿胶经胃-胰酶解后甘氨酸在十二指肠、空肠、回肠的Q120 (μmol·cm-2) 、Ka (μmol·cm-2/min) 都有显著提升 (P<0.01) , 阿胶经胰酶解后甘氨酸在十二指肠、回肠的Q120 (μmol·cm-2) 、Ka (μmol·cm-2/min) 的提高 (P<0.01) 较空肠部的提升 (P<0.05) 更为显著;胃蛋白酶组的甘氨酸吸收与阿胶组相比, 不具有统计学差异 (P>0.05) ;表明阿胶经胰酶解或胃-胰酶解作用均可显著提高阿胶中甘氨酸的吸收。

(±s, n=3)

注:与阿胶组比较, *P<0.05、**P<0.01。

3.4 消化酶酶解对阿胶中总氨基酸在不同肠段吸收的影响

阿胶中总氨基酸在三个肠段的吸收规律为:十二指肠>空肠>回肠, 见表3;阿胶经胰蛋白酶酶解及胃-胰蛋白酶酶解后, 三个肠段对阿胶中氨基酸的Q120 (μmol·cm-2) 、Ka (μmol·cm-2/min) 都有显著提高 (P<0.01) , 但没有改变其吸收规律;十二指肠向来被认为是氨基酸类物质的主要吸收部位, 不仅是它位于小肠上端具有丰富的蛋白酶类, 并且有文献报道十二指肠部位的小肠上皮细胞对氨基酸及多肽转运载体的表达较丰富, 阿胶酶解后游离的氨基酸及寡肽数量增加, 但小肠部位载体的分布没有变化, 因此胰酶解及胃-胰酶解可以极大地提高阿胶中氨基酸的吸收速率, 并且水解度越大吸收速率越快, 但是并不会改变阿胶的吸收规律;胃酶解对阿胶水解度影响较小, 对阿胶在小肠部位的吸收没有显著影响;可见阿胶的水解度是影响阿胶吸收速率的关键。

(±s, n=3)

注:与阿胶组比较, *P<0.05、**P<0.01。

4 讨论

茚三酮法是一种灵敏的用于检测游离α-氨基的方法, 茚三酮可以与水解液中游离α-氨基在加热条件下脱氨, 最终与还原性茚三酮反应生成蓝紫色物质, 颜色深浅与α-氨基的数量呈正比, 以此可以表征α-氨基的数量;同时, 在水解过程中, 胶原成分每断裂一个肽键均会释放出一个游离端α-氨基, 水解液中游离氨基数量越多, 则胶原成分水解的程度越大, 以此可以表征阿胶的水解度。

研究表明, 阿胶中蛋白质组成主要包括驴血清白蛋白及驴胶原蛋白。阿胶经胰蛋白酶或胃-胰蛋白酶酶解作用后对羟脯氨酸、甘氨酸及总氨基酸在整个小肠肠段的吸收都有提升, 其中甘氨酸及总氨基酸的吸收规律基本相符, 但是羟脯氨酸与二者的吸收规律有些许差别, 可能是因为羟脯氨酸主要存在的是阿胶的驴皮I型胶原的长链中, 而胃蛋白酶及胰蛋白酶对胶原的水解能力较弱, 因此经酶解作用后释放的游离的羟脯氨酸含量较少, 因此对阿胶中羟脯氨酸的吸收促进作用较弱。

本实验中经胃蛋白酶酶解后的阿胶水解产物并没有起到增强阿胶吸收的作用, 这可能是因为胃蛋白酶对阿胶的水解能力较弱, 阿胶胃酶解物并未获得较大的水解度;另一方面, 胰蛋白酶对阿胶的水解作用较强, 阿胶的胰酶解物及胃-胰酶解物都获得较大的水解度, 并且在整个肠段的吸收都有显著提升, 表明胰蛋白酶解更有助于阿胶在小肠部位的吸收。

摘要：目的:研究胃蛋白酶及胰蛋白酶在体外对阿胶的酶解作用及酶解对阿胶在小肠部位吸收的影响。方法:采用茚三酮法测定阿胶酶解物的水解度。建立大鼠离体外翻肠囊模型, 通过测定在120mim内羟脯氨酸、甘氨酸及总氨基酸的吸收情况, 并计算其累积吸收量及吸收速率Ka, 评价阿胶在小肠部位的吸收情况。结果:阿胶经胰蛋白酶酶解或胃-胰蛋白酶酶解120min后水解度分别为5.66%、6.26%, 可以显著提高阿胶在整个小肠部位的吸收, 差异具有统计学意义 (P<0.01) ;而经胃蛋白酶酶解后的阿胶水解度仅为1.24%, 对阿胶在小肠部位的吸收无明显促进作用, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论:胰蛋白酶水解作用是影响阿胶小肠部位吸收的关键步骤。

关键词：阿胶,水解度,离体外翻肠囊法,吸收速率

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典[M].一部.北京:中国医药科技出版社, 2015:189-190.

[2]张飘飘, 阎晓丹, 杜鹏程, 等.阿胶的化学成分及其药理毒理学研究进展[J].山东医药, 2016, 56 (9) :95-97.

[3]高景会, 王蕊, 范锋.阿胶现代研究进展[J].中国药事, 2011, 25 (4) :396-401.

[4]李辉, 王静凤, 赵芹, 等.阿胶的活性成分及其对运动小鼠的抗疲劳作用研究[J].食品工业科技, 2011, 32 (8) :374-376.

[5]汪冰, 肖新月, 程显隆, 等.凝胶排阻色谱法研究阿胶中蛋白质及多肽相对分子质量分布规律[J].药物分析杂志, 2009 (11) :1886-1891.

[6]Madureira A R, Amorim M, Gomes A M, et al.Protective effect of whey cheese matrix on probiotic strains exposed to simulated gastrointestinal conditions[J].Food Research International, 2011, 44 (1) :465-470.

[7]赵新淮, 冯志彪.大豆蛋白水解物水解度测定的研究[J].东北农业大学学报, 1995 (2) :178-181.

[8]应贤强.茚三酮比色法测定水中微量氨含量[J].化肥工业, 2011, 38 (3) :27-30.

[9]畅静, 田莉, 张慧慧, 等.离体外翻肠囊法研究安石榴苷的大鼠肠吸收特性[J].中国实验方剂学杂志, 2014, 20 (24) :122-126.

体外模拟胶原纤维矿化的研究进展篇4

矿化胶原纤维是骨组织的主要成分。从材料学角度,它是由磷灰石晶体和胶原纤维组成的复合材料;从来源上,它是生物体矿化形成的天然材料。掌握体内胶原纤维的生物矿化过程、原理和调控机制可为骨修复材料的设计和制备提供新的思路和方法。近年来国内外学者开展了大量胶原纤维生物矿化的体外模拟研究[1,2,3,4,5,6]。本文从理论分析和体外模拟实验研究阐述矿化胶原纤维的研究进展,重点介绍胶原纤维内矿化机理和非胶原蛋白(Non-collagen proteins,NCPs)对胶原矿化的作用。

1 矿化胶原纤维的结构和组成

从材料学角度,骨是一种多级有序的无机/有机复合材料,其中有机成分主要是Ⅰ型胶原[7],无机矿物主要是羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAp)[8]。生命体内,胶原自组装形成严格分级有序结构。它的基本结构单元是原胶原分子,由三股左手螺旋的肽链缠绕形成右手超螺旋,长约300nm,直径1.5nm,5个原胶原分子侧向聚集形成一条微纤。侧向聚集时,相互平行的原胶原分子按67nm的周期沿纤维长度方向交错排列,形成了40nm的空隙区(Hole)与27nm的重叠区(Overlap)[9]。原胶原分子间通过N端与相邻分子C端的赖氨酸或羟赖氨酸间形成共价键稳定,微纤进一步组装成胶原纤维,进而组装成三维结构[9,10,11],如图1(a)所示。胶原纤维能够为矿物沉积提供模板。Xue等[12]利用单分子胶原膜作为基底,通过生物矿化过程,使得无定形碳酸钙转化为单晶方解石,且晶体的c轴沿纤维长轴排列,证明了胶原纤维的模板作用。对于矿物的沉积过程,有研究认为矿物在组装胶原纤维的空隙区成核生长[13],如图1(c)所示,而且晶体相互平行排列[9]。

骨中的矿化物,即矿化胶原纤维中的无机物主要是片状的碳酸羟基磷灰石(C-HAp)晶体,晶体c轴与胶原纤维的长轴方向一致,且晶体的片层状排列与胶原纤维的排列协调一致,但部分C-HAp晶体出现在胶原纤维之外,即纤维外(间)矿化。骨中的无机物还有磷酸八钙(Octacalcium phosphate,OCP)、无定形磷酸钙(Amorphous calcium phosphate,ACP)、二水磷酸氢钙(Calcium hydrogen phosphate dihydrate,DCPD)等[14]。从热力学角度,在人体生理条件下,OCP是最易生成的相。研究证实,在接近生理环境条件下,早期的矿化物是无定形的,之后转化为OCP,最后形成HAp[15]。Crane等[16]用拉曼光谱在小鼠的颅盖骨中也发现了类似OCP的中间相。后来又在鼠的牙釉质中,斑马鱼的鳍骨中,鼠的颅骨和长骨中发现了短暂的前体相ACP[17,18]。Mahamid等[18]指出在骨生长区细胞释放小液滴(推测可能是ACP),小液滴散布到胶原纤维中,然后转化为磷灰石。上述研究表明,矿化胶原中的无机相有可能经历相变,最终形成稳定的HAp晶相。

图1胶原纤维的二维、三维结构(a);低温冷冻透射电子显微镜下胶原纤维结构(插入图为胶原纤维结构示意图)(b)[11];HAp在纤维空隙区形成示意图(c)Fig.1 The 2Dand 3Dorganization,assembly of collagen molecules(a),electron microscopy image of a collagen fibril(inset:schematic representation of a collagen fibril)(b)[11],schematic representation of hydroxyapatite crystals forming in the gap regions of collagen(c)

2 胶原纤维内矿化

胶原纤维内矿化是指矿化物在胶原纤维内空隙区及相邻的互相平行的胶原分子间(0.24nm)形成。该过程中Ⅰ型胶原的立体化学结构起到模板作用,似乎不需要其他非胶原分子参与即可[2]。Xu等[19]用计算机模拟的方法研究胶原纤维内矿化的分子机理,采用位于胶原纤维空隙区的高电荷密度的e1、e2带来模拟胶原分子的特征结构。从垂直于胶原分子链方向观察,空隙区附近环绕6个胶原分子,分子中带电荷的氨基酸侧链大多聚集在一起,带相反电荷的氨基酸侧链通过静电力形成“盐桥”网络,最终使带电荷的氨基酸侧链指向空隙区。当引入Ca2+和Pi离子(PO43-),Ca-Pi离子簇(磷酸钙)主要位于空隙区。在该空隙区带负电荷的甘氨酸(Gly)或天冬氨酸(Asp)的-COO-吸引并键合Ca2+,Ca2+被带电荷的侧链固定,然后Ca2+再结合Pi离子形成Ca-Pi网络,Ca-Pi簇之间通过静电力结合最终诱导成核。由此说明胶原在矿化过程中确实为非均质成核提供了成核位点,且矿物在空隙区形成。Bing Yang等[20]也根据Ⅰ型胶原特有的Gly-X-Y氨基酸重复序列结构用多肽链CH3CO-(Gly-ProPro)10-NHCH3模拟Ⅰ型胶原,研究胶原初期矿化过程。依次将3个Ca2+放置在距离C=O基团特定位置处,结果Ca2+被吸引处于平衡位置,3个Ca2+在结构中所处的位置与其在HAp中的位置相同,说明胶原与Ca2+间确实存在相互作用。但该上述模型过于简单化,没有进一步引入PO43-和水分子,不能说明离子与胶原及各离子间相互作用。胶原纤维内矿化的理论模型证明了胶原分子在矿化中作为模板,其矿化机制如图2((a)为胶原分子的1/4交错排列结构,形成40nm的空隙区和27nm的重叠区;(b)为空隙区相邻胶原分子e1、e2带的排列分布及其对Ca2+、PO43-的吸引键合示意图)所示。纤维空隙区胶原分子中带电荷的氨基酸侧链能够吸引并键合Ca2+、PO43-,诱导成核。

在实验研究方面,体外模拟胶原生物矿化也获得了纤维内矿化,证实了胶原纤维在矿化中的模板作用。Wang等指出不存在任何细胞外基质分子(蛋白质、多糖等)下胶原能够调控HAp的取向、生长、尺寸和分布[21,22]。低浓度胶原基质在模拟体液(SBF)中矿化后,Cryo-TEM下观察到单个胶原纤维的条带结构,晶体主要位于纤维的空隙区;高浓度时无条带结构,推测可能是因为矿化物占据了整个纤维,即无生物大分子存在下形成了整条纤维的纤维内矿化。由此推测,在自然体中纤维内矿化过程中,存在物质诱导矿化在特定区域形成[1,9,11,23,24]。如DPP(Dentin phosphophoryn),在中性条件下,以较低浓度的DPP与胶原混合,电镜下观察到DPP与胶原分子在距离N端210nm处特异性结合,成为磷灰石成核的位置[25]。Liang等[26]将树状高分子聚酰胺氨基化(PAMAM-NH2)作为NCPs类似物诱导胶原纤维内矿化,与空白组相比,PAMAM-NH2处理后的胶原形成纤维内矿化。除此之外,一些小分子具有相似的功能。Yan Liu等[27]使用聚丙烯酸(Polyacrylic acid,PAA)模拟牙本质基质蛋白1(Dentin matrix protein 1,DMP1)的功能,使用三聚磷酸盐(Sodium tripolyphosphate,TPP)模拟磷蛋白的功能。当只有PAA存在时,形成纤维内矿化(见图3(a)、(b)),但纤维内矿物是连续的,如图3(a)右下角插入的矿化纤维的SAED衍射花样所示,可看出是磷酸钙的特征衍射环;当PAA与TPP共同作用时,形成多级纤维内矿化(见图3(c)),图3(c)插入的SAED表明微晶是磷灰石,纤维内晶体周期排列,磷灰石是区域分布的。Zhang等[28]利用氨基化的中孔结构的SiO2纳米粒子(AF-MSNs)作为载体,负载了PAA稳定的ACP前驱体(Pa-ACP),将胶原浸入负载Pa-ACP的AF-MSNs溶液中矿化,TEM显示形成了纤维内矿化。

图3在PAA存在时矿化72h后TEM下观察到纤维内矿化(a);高倍下的矿化纤维(连续的矿物链(标箭头处))(b);PAA和TPP共同存在时形成了具有周期带状结构的分级纤维内矿化(c)[27]Fig.3 TEM showing non-hierarchical intrafibrillar mineralisation in the presence of PAA after 72hof mineralisation(a);high magnification of a mineralised fibril(b);TEMshowing hierarchical intrafibrillar mineralisation in the presence of PAA and TPP(c)[27]

对于纤维内矿化物的形成,无论是体内还是体外矿化试验中均发现了无机前体相ACP的存在。ACP进入胶原纤维内的机理有两种:(1)溶解再沉积,ACP在细胞外基质中形成后能够重新溶解,Ca2+、PO43-再扩散进入胶原纤维[22],但目前并没有ACP溶解及在胶原内再沉积的证据。(2)ACP自己进入胶原,有研究者提出ACP与NCPs形成类似液晶的聚集体,以类似液体状态存在,能够通过毛细管力扩散进入胶原[29],即PILP(聚合物诱导的液态前体理论)。ACP渗入胶原是由于聚合物/矿化物复合物与胶原纤维上特殊位点间的电荷作用[30,31]。但聚合物是否和矿物一起进入胶原,矿物进入胶原时是依靠毛细管力还是电荷作用,是否还有其他因素影响等问题还需进一步研究。除此之外,ACP的尺寸也影响矿化结果。无定形阶段所形成的ACP(直径较大的为50~100nm,较小的小于10nm),小尺寸的ACP能更快速地进入胶原,加速磷灰石形成[27]。Jee[32]使用分子量较高的聚天冬氨酸(pAsp)进行矿化研究,高分子量的聚合物对磷灰石成核有较高的抑制作用,会稳定ACP形成小颗粒或纳米液滴,这些纳米液滴较小,能够更多地进入胶原纤维内(间)。ACP的稳定性也对纤维内矿化有影响。Laush等[33]采用3种亚稳磷酸钙溶液作为矿化液,添加pAsp作为稳定剂。矿化速率较低的体系只有ACP形成;矿化速率较高的体系ACP转化为HAp,晶体c轴取向沿胶原纤维长轴。综上所述,体外矿化实验表明ACP进入胶原纤维并转化为磷灰石晶体与其尺寸、稳定性以及与生物大分子的相互作用有关。

3 纤维外矿化

纤维外矿化发生在纤维表面和纤维之间,在纤维附近或表面形成磷灰石晶体。目前对于纤维外矿化机理还不清楚。SAED显示纤维外矿物衍射花样为完整的衍射环,表明晶体是杂乱取向的。William J[9]指出纤维外矿化时,胶原也作为模板,但需要其他分子的共同作用。这些分子与胶原表面键合,分子上所带的电荷或基团与Ca2+和PO43-形成成核前体离子簇,形成纤维外矿化。Liu用TPP诱导纤维外矿化,与胶原结合的TPP使ACP直接在胶原纤维表面形成;生成的ACP颗粒(图4(a)箭头所指)太大无法进入纤维内部而粘附在纤维表面(三角箭头所指)(见图4(a))。Kim[34]的实验表明不存在苯乙烯膦酸(Polyvinylphosphonic acid,PVPA,基质磷蛋白的类似物)和PAA的矿化介质中,纤维本身没有矿化(图4(b)、(c),三角箭头所指为胶原纤维)。如图4(b)所示,矿化4h形成球形ACP(图4(b)手指所指);24h后,ACP无定形物转化为六方形的微晶片(图4(c)中箭头所指),与胶原纤维没有结合。这些结果表明纤维外矿化也需要其他分子共同作用,这些分子在溶液中抑制颗粒长大,使其能够与胶原纤维结合。然而,胶原纤维表面是否有特殊的氨基酸侧链与分子结合,分子是否能键合Ca2+和PO43-,都还没有得到证明。因此,还需要对胶原纤维表面的化学结构、胶原表面与分子间作用特点等进一步研究,从而更好地理解胶原纤维外矿化机理。

图4纤维外矿化(TPP存在时)24h后TEM下的纤维形貌(a)[27];不存在仿生大分子时TEM下胶原纤维本身并没有矿化(b、c)[34]Fig.4 TEM showing only extrafibrillar mineralization(only TPP in mineralization medium)after 24h(a)[27],collagen fibrils from the control medium(open arrowheads)did not mineralise in the absence of biomimetic analogues(b,c)[34]

4 非胶原蛋白的作用

NCPs和NCPs的类似物能调控矿化物的形成、生长取向及种类。下面就一些特征性的NCPs对胶原纤维矿化的影响进行阐述。

(1)聚天冬氨酸(Polyaspartic acid,pAsp)

pAsp是一种NCPs的类似物,具有NCPs带负电荷的特点。Olszta等[24]把pAsp加入到矿化液中,第一次成功得到纤维内矿化,见图5(a)、(b),且纤维内晶体与骨中的磷灰石有相同结构和结晶取向。对于pAsp促进纤维内矿化有两种不同的机理[24,35]:①PILP。pAsp抑制磷灰石在溶液中成核,形成pAsp稳定的类似液体的高度水化的ACP,ACP通过毛细管力渗透到胶原内(见图5c(1));ACP充满胶原内部(见图5c(2));最后在胶原内部转化为有取向的磷灰石晶体(见图5c(3))。②pAsp与胶原结合,形成Ca2+的局部过饱和溶液,直接在纤维内发生矿化[36]。随着对胶原纤维矿化研究的深入,越来越多的实验结果更偏向于PILP机理[37],无论体内还是体外矿化实验均证明ACP的存在,而一些蛋白质和小分子物质也被证明具有抑制磷酸钙成核、结晶的能力,能够稳定ACP使之进入纤维内后晶化。如PAA诱导下,矿化24h后纤维内矿物是ACP,72h后矿物为磷灰石晶体[27]。

图5 pAsp存在下含ACP的胶原纤维的TEM图(a);pAsp存在下胶原纤维TEM图(插图为矿化胶原纤维的衍射花样)(b)[24];pAsp诱导的胶原矿化过程示意图(c)Fig.5 TEM image of a collagen fibril containing ACP during mineralization inpresence of pAsp(a);TEM image of a collagen fibril mineralized in presence of pAsp(Inset:electron diffraction of the fibril)(b)[24];schematic representation of the proposed mechanisms of collagen mineralization directed by polyaspartic acid(pAsp)(c)

(2)DPP

DPP是一种磷酸化的聚阴离子蛋白质,它能够选择性地与胶原空隙区的e带结合,诱导磷灰石成核的能力与其磷酸化程度有关[38]。没有磷酸化的DPP仅仅诱导了ACP在纤维表面形成,磷酸化后的DPP(p-DPP)形成了纤维内矿化[36],p-DPP与pAsp作用机理相同,即抑制溶液中磷酸钙在纤维外结晶,使稳定前体相渗入胶原,最后在纤维内形成晶体。但磷酸化后增加了蛋白电荷密度,从而提高对磷酸钙结晶的抑制作用,这是由于高负电荷密度的大分子键合Ca2+能力高,Ca2+与大分子键合后减少了溶液中的Ca2+浓度,从而降低了矿物沉积的驱动力。

(3)DMP1

DMP1也是磷酸化的蛋白质,DMP1的N端能稳定ACP形成,C端是磷灰石成核剂。与DPP相比,DMP1诱导矿化的产物是取向杂乱的晶体,晶体的晶轴排列不一致[36,39]。磷酸化后,即p-DMP1作用下矿化后,晶体的c轴沿胶原纤维长轴,(002)晶面的衍射弧角度为(19±7)°(见图6),说明pDMP1比p-DPP作用下形成的纤维内晶体结晶度更高。

(4)胎球蛋白

这种蛋白存在于血浆中,能够抑制磷酸钙沉积,在体内促进胶原纤维内矿化[30]。胎球蛋白能阻止溶液中矿物的形成,使Ca2+和PO43-进入胶原,但胎球蛋白(48kDa)太大,不能渗入胶原而留在溶液中。Toroin[40]提出了一种“尺寸排除机理”,即分子量大于40kDa的不能进入纤维内部,分子量小于6kDa能够扩散进入纤维内部。Price[41]指出磷灰石成核抑制剂要足够小以便进入胶原并抑制纤维内矿化。因此,要使矿物在纤维内形成,胎球蛋白被排除在纤维外至关重要。而Olszla[21]的实验中pAsp和矿物一起进入胶原诱导纤维内矿化,与此相反,胎球蛋白的实验表明并不需要大分子进入胶原来诱导纤维内矿化[41]。

(5)骨钙素(Osteocalcin,OC)

OC是由成骨细胞合成并分泌,含有约50个氨基酸,3~5个γ-羧基谷氨酸残基,能够键合Ca2+,分子量约为5.7kDa[42],根据“尺寸排除机理”,OC能够诱导纤维内矿化。但关于OC的研究中一直未能证明其与胶原间有特殊的键合作用。近期Chen等[43]利用免疫细胞化学研究法发现,OC位于胶原纤维空隙区和重叠区的a4-1、c2、b1和d带,指出OC与胶原结合共同调控片状磷灰石晶体的成核和生长。

NCPs及其类似物在矿化液中抑制矿化物的成核,促进了胶原纤维内矿化;而一些磷酸化程度较低的蛋白与胶原表面键合形成纤维外矿化。除了大分子蛋白质外,一些小分子也具有类似的诱导矿化的作用,如TPP、PVPA[31,34]。

5 结语

胶原纤维矿化包括纤维内矿化和纤维外矿化。纤维内矿化过程胶原作为模板,不需要其他分子参与即可完成,矿物可能是在纤维空隙区成核。NCPs在矿化过程中,调控ACP使其渗入胶原纤维内,其渗入过程与ACP团聚体的大小、稳定性、电荷等因素有关。纤维外矿化可能需要胶原与NCPs等矿化诱导物共同作用。

体外预应力效应的有限元模拟方法篇5

应用有限元方法对体外预应力混凝土桥梁结构进行受力分析和数值模拟, 具有重要的工程应用和学术研究价值, 但目前对有限元解法的研究尚少。Wu等提出了基于平面应力有限元方法的预应力混凝土结构的分离式模型, 能较好的模拟结构应力场及混凝土和钢筋的接触面, 但单元数量较多, 使用不方便。直接采用杆单元模拟外预应力钢索更为简单和实用。文中给出了体外索单元的切线刚度矩阵并将其转换成两端带刚臂体外索单元的刚度矩阵, 在不增加单元和节点的条件下, 直接采用有限元方法较精确地模拟了体外预应力效应及体外索和混凝土梁体之间的传力机理。

1体外预应力混凝土桥梁结构的有限元分析方法

体外预应力混凝土桥梁从最初的简单构件到最终的承重结构, 经历了一个结构体系转换与受力变化的成型过程。体外预应力筋仅在转向构造处与混凝土梁体接触, 组成了一个内部超静定结构体系, 因此结构计算可以采用有限单元分析方法[3,4]。在有限元计算过程中, 必须能反映体外预应力混凝土桥梁结构的受力变形特点。体外预应力钢筋在桥梁结构中只承受拉力, 与一般的杆单元不同。在外荷载作用下, 除转向座外, 体外筋的变形与梁的挠度不一致, 这与有粘结体内预应力钢筋的受力也有很大差别。考虑体外索的这些特点, 体外预应力混凝土桥梁的计算模型见图1。

体外预应力钢筋在转向构造处与混凝土梁上节点的连接以刚臂模拟, 在其余位置与混凝土梁体之间不存在变形协调关系, 这样体外索单元就成为两端带刚臂的只受拉杆单元。张拉体外预应力钢筋后, 体外索对梁施加了力的作用, 当体外索与梁接触处的约束状况确定后, 各段预应力筋的张拉力都随之确定。体外预应力筋的受力作用便自动形成, 同时桥梁结构体系上增加数个两端带刚臂的体外索单元。对体外预应力效应的模拟转换为在结构有限元求解方程中正确地添加体外索单元。将体外预应力钢筋作为构件反映在结构分析模型中, 除能较真实的体现体外预应力筋的作用外, 还能解决体外预应力筋回缩和分批张拉引起的预应力损失、混凝土收缩徐变引起的预应力损失的计算问题。因此, 体外预应力效应有限元模拟的重点问题是正确建立体外索单元的刚度矩阵并在结构分析中将其转换为两端带刚臂单元的刚度矩阵。

2体外预应力索单元的切线刚度矩阵

对体外预应力混凝土桥梁结构, 应考虑受力过程中的几何非线性问题。结构几何非线性采用Updated Lagrangian[6]描述, 即参考构形是基于结构的前一相邻构形。设定t时刻单元应变为0, t+Δt时刻的单元应变为单元的应变增量, Piola-Kirchhoff应力增量即为Cauchy应力增量。于是, 根据虚功原理, 有增量形式的体外预应力索单元的切线刚度矩阵为:

[K]=[K]L+[K]G (1)

[K]L=∫V[B]T[D][B]dV (2)

$[Κ]_{G} = \int_{V} [\frac{\partial Ν}{\partial x}]^{Τ} [σ] [\frac{\partial Ν}{\partial x}] d V$ (3)

式中:[K]L——常规的弹性刚度矩阵;

[K]G——几何刚度矩阵或初应力刚度矩阵, 其含义是由于结构几何变形引起总体刚度矩阵的修正;

[B], [D], N——应变矩阵、线性本构矩阵和位移形函数。

根据式 (2) 和式 (3) , 不难得出弹性刚度矩阵和几何刚度矩阵的表达式为:

$[Κ]_{L} = \frac{E_{p t} A_{p}}{l_{p}} [\begin{matrix} 1 & 0 & 0 & - 1 & 0 & 0 \\ 0 & 0 & 0 & 0 & 0 & 0 \\ 0 & 0 & 0 & 0 & 0 & 0 \\ - 1 & 0 & 0 & 1 & 0 & 0 \\ 0 & 0 & 0 & 0 & 0 & 0 \\ 0 & 0 & 0 & 0 & 0 & 0 \end{matrix}]$

(4)

$[Κ]_{G} = \frac{Ν_{p}}{l_{p}} [\begin{matrix} 0 & 0 & 0 & 0 & 0 & 0 \\ 0 & 1 & 0 & 0 & - 1 & 0 \\ 0 & 0 & 0 & 0 & 0 & 0 \\ 0 & 0 & 0 & 0 & 0 & 0 \\ 0 & - 1 & 0 & 0 & 1 & 0 \\ 0 & 0 & 0 & 0 & 0 & 0 \end{matrix}]$

(5)

式中:Ept——体外索单元的切线弹性模量;

Ap——体外索单元的横截面积;

Np, lp——体外索单元的轴向拉力和长度。

矩阵[K]L和[K]G相加, 即得到体外预应力钢筋单元的切线刚度矩阵。

3体外预应力索单元切线刚度矩阵的转换

体外索单元的两端以刚臂和梁上节点联系, 如果专门推演带刚臂杆单元的刚度矩阵, 会使分析求解的计算量增加。本文根据体外预应力钢索和混凝土梁体之间的传力特点, 直接对式 (1) 中的刚度矩阵做一些转换, 得出两端带刚臂的体外索单元刚度矩阵, 可以直接用于桥梁结构的有限元分析计算。这种做法不增加节点和单元的数目, 且便于有限元程序的编制。

节点i和j为原混凝土梁上的节点, 节点a和b为体外预应力钢索上的节点。节点a与b之间为一个体外索单元, 两端的偏心距分别为ea和eb。i点与a点之间以及j点与b点之间均以刚臂连接。坐标系 $\bar{X}$ $\bar{Y}$ 为混凝土梁上的局部坐标系;坐标系X′Y′为体外索单元上的局部坐标系;而XY为结构的整体坐标系 (见图2) 。

在坐标系X′Y′中, 得到体外索单元的切线刚度矩阵为[K]′, 记[T]为坐标系 $\bar{X}$ $\bar{Y}$ 到X′Y′的转换矩阵, 则在 $\bar{X}$ $\bar{Y}$ 坐标系中, 体外预应力筋单元的刚度矩阵表达式为:

$[\bar{Κ}] = [Τ]^{Τ} [Κ^{'}] [Τ]$ (6)

由于刚臂本身没有变形, 故可按不同坐标系表达刚臂连接两点之间的位移关系。基于混凝土梁上的局部坐标系, i点与a点之间的位移关系描述为:

${\bar{δ}_{a}} = {\begin{cases} \bar{u}_{a} \\ \bar{v}_{a} \\ \bar{θ}_{a} \end{cases}} = [\begin{matrix} 1 & 0 & e_{a} \\ 0 & 1 & 0 \\ 0 & 0 & 1 \end{matrix}] {\begin{cases} \bar{u}_{i} \\ \bar{v}_{i} \\ \bar{θ}_{i} \end{cases}} = [\begin{matrix} 1 & 0 & e_{a} \\ 0 & 1 & 0 \\ 0 & 0 & 1 \end{matrix}] {\bar{δ}_{i}} = A_{a} {\bar{δ}_{i}}$

(7)

同理, j点与b点之间的位移关系为:

${\bar{δ}_{b}} = {\begin{cases} \bar{u}_{b} \\ \bar{v}_{b} \\ \bar{θ}_{b} \end{cases}} = [\begin{matrix} 1 & 0 & e_{b} \\ 0 & 1 & 0 \\ 0 & 0 & 1 \end{matrix}] {\begin{cases} \bar{u}_{j} \\ \bar{v}_{j} \\ \bar{θ}_{j} \end{cases}} = [\begin{matrix} 1 & 0 & e_{b} \\ 0 & 1 & 0 \\ 0 & 0 & 1 \end{matrix}] {\bar{δ}_{j}} = A_{b} {\bar{δ}_{j}}$

(8)

因此, 体外索单元两端节点的位移和梁上两节点的位移间的关系由下式确定:

${\begin{cases} \bar{δ}_{a} \\ \bar{δ}_{b} \end{cases}} = [\begin{matrix} A_{a} & 0 \\ 0 & A_{b} \end{matrix}] {\begin{cases} \bar{δ}_{i} \\ \bar{δ}_{j} \end{cases}} = [A] {\begin{cases} \bar{δ}_{i} \\ \bar{δ}_{j} \end{cases}}$

(9)

若以 ${\bar{S}_{p}}$ 表示体外索节点a与b上的杆端力, ${\bar{S}_{p}}$ 等效移至梁上节点i和j, 得到的杆端力为 ${\bar{S}_{L}}$ , 由虚功原理可得它们之间的关系为:

${\bar{S}_{L}} = [A]^{Τ} {\bar{S}_{p}}$ (10)

在坐标系 $\bar{X}$ $\bar{Y}$ 中, 体外预应力筋单元的杆端力和节点位移之间的关系为:

${\bar{S}_{p}} = [\bar{Κ}] {\begin{cases} \bar{δ}_{a} \\ \bar{δ}_{b} \end{cases}}$

(11)

将式 (9) 和式 (10) 代入式 (11) , 得到:

${\bar{S}_{L}} = [A]^{Τ} [\bar{Κ}] [A] {\begin{cases} \bar{δ}_{i} \\ \bar{δ}_{j} \end{cases}} = [\bar{Κ}]_{E} {\begin{cases} \bar{δ}_{i} \\ \bar{δ}_{j} \end{cases}}$