体外共培养（精选七篇）
体外共培养 篇1
1 资料与方法
1.1 主要试剂及仪器
SD大鼠(第四军医大学提供)3只,低糖改良Eagles培养液(DMEM)(GIBCO),胎牛血清(杭州四季青),兔抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白抗体(Merk公司),二抗羊抗兔辣根过氧化物酶IgG(武汉博士德),焦碳酸二乙酯(DEPC)(北京鼎国生物技术公司);TRIZOL试剂、逆转录试剂盒(上海生工生物技术公司),SYBR GreenI荧光染料(Invitrogen),倒置显微镜(Olympus);CO2培养箱(Heraeus,德国);6孔培养板(Costor,美国);插入式培养皿(Millipore);FTCTM-2000system实时定量PCR循环仪(上海枫岭公司);低温高速离心机(Eppendorf,德国);水平式电泳仪(BioRad,美国)。
1.2 BMSCs分离培养
无菌条件下剥离大鼠股骨和胫骨,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后,用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔,细胞悬液接种于培养瓶中置于37℃,5%CO2孵箱中培养。24小时后弃去培养液,PBS冲洗2～3次去除未贴壁细胞,加入培养液继续培养。每3天换液1次,细胞约80%融合时用0.125%胰酶+0.02%EDTA消化传代。分别于原代、传代培养的各个时期,用倒置显微镜观察BM-SCs形态变化及生长情况。
1.3 大鼠子宫韧带成纤维细胞的分离培养
取成年雌性大鼠双侧子宫韧带组织自行分离传代并冻存,经复苏后获得。
1.4 BMSCs与大鼠子宫韧带成纤维细胞共培养体系的建立
细胞非接触式共培养体系的组成:六孔细胞培养板加插入式培养皿。取第3代80%融合BMSCs和大鼠子宫韧带成纤维细胞用0.25%胰酶、0.01%EDTA消化、计数后,BMSCs接种于六孔板中,每孔加2ml含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液,成纤维细胞接种于插入式培养皿中,每孔加入1ml相同培养液。两种细胞间被插入式培养皿的半透膜隔开,只允许两种细胞间分子信号传递,两种细胞不允许通过。对照组内外培养室均为BMSCs。在间接培养3、6、12天后,收集六孔板内的BMSCs。间接共培养实验分组及各组细胞种植密度见表1。
1.5 免疫细胞化学染色
分别取间接共培养组、对照组BMSCs以1×104/孔的细胞浓度接种在24孔板中,孵育24小时后采用过氧化物酶标记的链霉素抗生物素-过氧化酶连接(SP)法做免疫细胞化学染色,主要步骤:(1)10%甲醛室温固定30分钟;(2)H2O2灭活,室温30分钟;(3)5%BSA封闭液,37℃20分钟;(4)加1∶100稀释的一抗,室温1小时;(5)加二抗,室温,1小时;(6)DAB显色10分钟;(7)苏木素复染,镜检。阴性对照组用PBS缓冲液代替一抗。
1.6 实时定量RT-PCR检测BMSCsⅠ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达
按Trizol试剂说明书一步法分别提取大鼠BMSCs和子宫韧带成纤维细胞内的总RNA,按常规方法获取逆转录cDNA。Light-Cycler毛细管实时定量PCR仪及SYBRGreenⅠPCR合成试剂盒用于检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA转录的检测。每毛细管反应体系总量为20μl,含样本2μl,反应条件按照说明书进行。
1.7 统计分析
所有数据均用均数±标准差表示,在免疫组化和实时定量PCR的结果处理中,采用onewayANOVA检验样本与对照组之间的组间差异,以P<0.05为组间差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠BMSCs和子宫韧带成纤维细胞形态和生长变化
BMSCs原代培养过程中,约24小时即可出现贴壁生长,细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显,出现以梭形为主的多种形态,10～14天70%～80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一,呈梭形或扁平型,增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。
子宫韧带成纤维细胞采用组织块培养法,原代成纤维细胞自贴壁组织块爬出,为长梭形,向四周成放射状排列,7～8天即可融合80%达到传代标准。传代培养后,细胞形态未发生改变,排列紧密,长梭形。经冻存复苏后细胞复苏率约85%,复苏后细胞生长,增殖旺盛,功能不受影响。
2.2 BMSCs的鉴定
流式细胞仪检测第3代BMSCs表面分子表达情况,98.6%的细胞阳性表达CD 90,98.8%的细胞阳性表达CD 44,细胞CD 34、CD 45为阴性表达,且所得细胞可以被诱导为成骨和成脂细胞。上述结论已被本实验室前期工作证实。
2.3 免疫细胞化学法检测胶原蛋白合成
大鼠BM-SCs未共培养时,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达较低,仅在胞浆区有轻微黄色阳性淡染区(见图1、图2);共培养6、12天后阳性染色逐渐增强,呈现棕黄色染区(见图3、图4)。共培养3天间接共培养组和对照组差异不明显均为轻微黄色淡染区。随即选取5个不重叠高倍镜视野,用Powersite显微图像采集分析系统分别计算每高倍视野的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的平均灰度值,用灰度值代表Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在大鼠BMSCs中的表达。间接共培养6天后,I型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的灰度值在间接共培养组分别为116.86±2.24和108.53±1.12,对照组分别为82.71±3.04和76.25±1.26。6天间接共培养组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和对照组之间灰度值比较,差异有统计学意义(P<0.05)。间接共培养12天后,I型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的灰度值在间接共培养组分别为121.28±3.11和112.19±2.62,对照组分别为86.56±1.28和81.82±1.36。12天间接共培养组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和对照组之间灰度值比较,差异有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组胞质未着色。
2.4 I型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达
由电泳结果可知,所获得的产物分别为I型胶原352bp,Ⅲ型胶原244bp,与理论值产物片断大小相同。而且,实时定量PCR的溶解曲线光滑平整,只有一个T溶解峰,说明产物中无杂物,定量结果可靠。同时,实时定量RT-PCR检测BMSCsⅠ、Ⅲ型胶原mRNA的表达情况:与对照组相比,间接共培养3天后,Ⅰ、Ⅲ型胶原mR-NA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。间接共培养6天后,I型胶原和Ⅲ型胶原mRNA与内参照GAP-DH的相对表达量在间接共培养组分别为3.9±0.1和1.8±0.2,对照组分别为2.0±0.2和0.9±0.2,I型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的比例与对照组相比显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。共培养12天后,它们的相对表达量在间接共培养组分别为4.1±0.1和2.0±0.1,对照组分别为2.1±0.1和0.9±0.1,I型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达比例增高与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
POP是盆底功能障碍性疾病中的一种类型,近年发病率呈逐年上升趋势。POP是一种多因素参与的复杂疾病,其确切的发病机制尚不清楚,但大量研究均证实盆底肌肉、筋膜及子宫韧带等支持组织的损伤及胶原代谢的异常,致其张力下降和支持功能的减弱是导致POP发生的主要因素之一。
BMSCs来源于中胚层,为多能干细胞,其具有很强的自我复制和多向分化潜能,可产生具有各种表型的子代细胞。在体内、外不同的诱导条件下BMSCs具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、肌细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力[2,3]。另外,骨髓BM-SCs获取相对简便,且可从自身获取,细胞来源丰富,对体外培养条件要求不高,分裂增殖能力强,具有无异体排斥反应、生物相容性好以及外源基因易于导入和表达等多种优点。使BMSCs成为组织工程学中重要的种子细胞。
有研究表明,韧带修复部位周围可见新的成纤维样细胞聚集,且这些细胞均由BMSCs分化而来[4]。Watanabe等[5]将转基因大鼠的BMSCs注射到受损的野生大鼠韧带组织中,28天后在已经愈合的野生大鼠韧带中检测到存活的转基因细胞,其性状与周围的韧带成纤维细胞相似。Young等[6]用种植了BMSCs的胶原纤维替代兔的跟腱,4、8、12周后检测发现,种植了BMSCs的胶原纤维比未种植组排列更加整齐有序、更具方向性,且新形成的韧带纤维明显比对照组韧带纤维直径粗大。以上实验初步表明,BMSCs可转化为韧带成纤维细胞,在韧带组织修复过程中发挥重要作用。但如何稳定诱导BMSCs的定向分化是目前组织工程学急待解决的问题。
本实验利用大鼠BMSCs贴壁早于骨髓基质细胞的特性,通过骨髓冲出内容物完全培养,再经过差速贴壁法进行反复纯化。实验将初次纯化换液在培养24小时后进行,而并非采用普遍文献报道的72小时后换液,此外在原代培养的集落形成时间上与部分报道也不尽一致[7]。这可能与实验所选BMSCs来源物种不同而造成细胞在生长特性上存在一定差异有关。组织块培养法用于韧带成纤维细胞的原代培养,效果理想,7～8天即可达到70%～80%融合,达到传代标准。
从培养的大鼠BMSCs形态学观察结果来看胞内细胞核较大,胞浆较少,细胞呈三角形、多角形和长梭形等多种形态,在传代培养中细胞生长旺盛,大多呈长梭型,这些形态上的特征均与目前报道的BMSCs的形态相吻合[8]。子宫韧带成纤维细胞原代传代培养均为长梭形,生长旺盛,经冻存后复苏细胞成活率高。
细胞外基质的合成是细胞的重要特性和功能。韧带成纤维细胞虽没有特异性的标记性蛋白表达,但细胞基质Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达量及其在总蛋白中的百分比是韧带组织和韧带成纤维细胞的重要标志[9]。因此,细胞对Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的合成能力是衡量组织工程化韧带质量的重要标准之一。目前,BMSCs高表达Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白作为细胞向某一方向分化的重要标志之一[10]。
本实验室采用免疫细胞化学和实时定量RT-PCR的方法对间接共培养组和对照组细胞分泌的Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和mRNA表达进行了定量检测。PCR产物电泳结果显示产物片段大小与预期值相同,另外PCR熔解曲线分析示熔解曲线光滑,只有单一的熔解峰,进一步证实定量结果可靠。实验结果检测到与子宫韧带成纤维细胞共培养后,BMSCsⅠ型、Ⅲ型胶原蛋白含量6天、12天增高明显,免疫细胞化学染色可见胞质内棕黄色颗粒。间接共培养6天和12天,Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA的表达明显增加,其增高与对照组相比差异有统计学意义。BMSCs在子宫韧带成纤维细胞的影响下分泌的胶原增多,说明间接共培养可以促进BMSCs向子宫韧带成纤维细胞分化。但有学者认为,细胞与细胞直接相互作用在诱导细胞分化中起着重要作用,单纯的细胞共培养对细胞分化几乎没有作用。但实验结果表明间接共培养时细胞分泌的生长因子、调节信号等也会对周围的其他细胞有调节作用,另外,间接共培养后Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的比例较对照组增大,这一点符合韧带成纤维细胞的特征有研究表明,韧带成纤维细胞较其他细胞分泌更多的Ⅲ型胶原蛋白,韧带成纤维细胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白比例为0.55,而皮肤成纤维细胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白比例仅为0.25[11]。因此我们推测,受韧带成纤维细胞的影响,BMSCs的性质与韧带细胞更接近了,使其有潜力作为替代韧带成纤维细胞的来源。为BMSCs在体内分化的机制提供一定的理论依据,为从BMSC中获取构建韧带组织工程种子细胞提供了初步实验基础。
参考文献
[1]王建六.女性盆底功能障碍性疾病研究进展[J].中国医刊,2005,40(1):10-11.
[2]Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues[J].Science,1997,276(5309):71-74.
[3]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.
[4]Awad HA,Butler DL,Boivin GP,et al.Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon[J].Tissue Eng,1999,5(3):267-277.
[5]Watanabe N,Woo SL,Papageorgiou C,et al.Fate of donor bone mar-row cells in medial collateral ligament after simulated autologous transplantation[J].Microsc Res Tech,2002,58(1):39-44.
[6]Young RG,Butler DL,Weber W,et al.Use of mesenchymal stemcells in a collagen matrix for Achilles tendon repair[J].J Orthop Res,1998,16(4):406-413.
[7]张黎,刘靖,周畅.体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(10):1881-1885.
[8]Beyer NN,da silya ML.Mesenchymal stem cells:isolation,in vitro Expansion and characterization[J].Hand b Exp Pharmaco1,2006,174:249-282.
[9]Vunjak-Novakovic G,Altman G,Horan R,et al.Tissue engineering ofligaments[J].Annu Rev Biomed Eng,2004,6:131-156.
[10]Liu T,Zhang J.Detection of V,ⅠandⅢtype collagens of dermal tissue skin lesions of patients with systemic sclerosis and its implica-tion[J].J Hua zhong Univ Sci Technolog Med Sci,2008,28(5):599-603.
体外细胞培养的污染和控制 篇2
细胞培养中使用的培养基和血清含有大量热不稳定的营养成分，不能使用高压灭菌的方法排除微生物的污染。因此，培养基和血清普遍采用0.22μm微孔滤膜过滤的方法除菌，对于气体的无菌过滤，通常采用0.22μm的疏水过滤膜。根据不同的用途，无菌过滤膜有各种型号和规格可供选用。
细胞培养工作需要保持良好的环境和执行规范的操作程序。超净工作台是细胞培养中普遍使用的无菌操作装置，它需要合理地布置及经常性地维护。超净工作台的工作原理是驱动经高效过滤净化后的空气，通过工作台面形成气流屏障，从而阻止外界污染物的侵入并使操作过程中产生的飞沫限制在超净工作台中。因为操作过程中可能产生有毒的物质，所以采用垂直气流比水平气流安全。
细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。体外细胞培养污染可分为3类：物理性污染、化学性污染及生物性污染。
1 物理性污染
物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。细胞、培养液或其他培养试剂暴露在放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制，甚至细胞死亡。
对物理性污染，通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，减少环境中物理因素对细胞的影响。培养箱应放在恒温的环境中，培养液及试剂应放在固定的位置，而且要注意避光，试剂周围不能放置同位素等。从冰箱中取出的培养液应在室温条件中放置一段时间后再进行使用，以避免过冷的温度对细胞的影响。
2 化学性污染
培养环境中许多化学物质都能引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质(如激素)就能促进细胞的生长。不同化学物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分(如氨基酸)若浓度超过了合理的范围，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系在最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源，玻璃制品在清洗过程中残留的变性剂或肥皂是最常见的化学性污染。
针对化学污染的来源及性质，应采取以下措施来控制污染：
细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行纯度鉴定，同时正确配制和储存培养液及试剂也是非常重要的。应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。
为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体和清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。血清是细胞培养中常用的天然培养基，但血清又是潜在的生物污染和化学污染源。为了保证实验的可重复性，最好选用同一批次的血清。
细胞培养过程中会使用各种不同的培养器皿及容器，培养器皿的大小和构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的pH值和细胞生长密度，培养器皿的工艺及灭菌过程中的差异可能对培养体系产生影响。因此在选用器皿时，根据被培养细胞的生长特性、培养方式和所用培养液的性质来选用适合的器皿来达到实验的准确性和可靠性。
3 生物性污染
体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，培养液中的抗生素抗污染能力有限，培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。外界的微生物如昆虫、节肢动物、原虫、霉菌、病毒、细菌、无细胞壁的微生物(通常支原体)和其他类型的细胞都可能侵入培养环境引起污染，只要在一个开放的环境中进行培养，都难以避免发生污染。发生污染的可能性取决于操作方法和培养室的无菌环境以及实验室的规章制度。生物性污染对细胞代谢的影响，可因污染源和细胞的种类不同而表现各异。
细菌和真菌的污染较易发现并能及时清除，而大多数实验室对支原体的污染缺乏足够的认识。最为致命的是，即使存在很严重的支原体污染，细胞外观无明显变化。因为支原体污染后不会使细胞死亡，它们可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常的感觉。如果继续使用这种已被支原体污染而貌似正常的细胞做试验或生产，将会严重影响结果。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染、培养液的污染、被污染细胞造成的交叉污染及实验器材的污染等。
细胞培养过程中引起污染的因素很多，要从多方面来预防和控制生物污染。为了防止支原体及其他微生物污染的发生和传播，必须建立规范的无菌操作程序及各种规章制度，并严格执行。控制环境污染，同时注意实验人员的防护及无菌服的洁净和无菌，应做到使用一次、清洗一次、灭菌一次，杜绝操作者人为的因素造成环境污染。保证细胞培养基和器材无菌，在细胞培养基中加入适量的抗生素，都是行之有效的控制措施。抗生素主要添加于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择，但是抗生素的使用受到生物制品生产规程的限制。
体外循环进修医师培养方法探讨 篇3
1 进修医师现状和存在的问题
1.1 专业水平参差不齐
进修医师大部分来自基层医院, 其专业背景不一, 绝大部分是非体外循环专业毕业, 基本上是临床麻醉医师、胸心外科医师兼职, 甚至是护士转学体外循环[2]。从事专业工作时间差异较大, 有些从事体外循环工作数年, 具有较为丰富的临床工作经验;而有的却为初学者, 几乎没有临床实践, 对体外循环知之甚少。这些进修医师所在单位一般没有开展心脏外科或者每年心脏外科手术量少于100例, 因此不仅存在进修前知识贫乏的状况, 还存在进修后长时间无法进行临床实践的情况。因此如何保证进修医师在较短时间内掌握体外循环理论知识及临床技术, 并且长时间维持良好的进修效果至关重要。
1.2 重实践, 轻理论
多数基层体外循环医师在进修前并未经过系统、正规的基础知识学习和训练, 只是依靠所在科室教师的指导进行学习, 因而理论知识欠缺, 所掌握的专业知识不系统。在基层, 特别是非教学医院的培养方式为“言传身教”, 只进行基本体外循环操作, 而不讲为什么是这样的操作, 常常是知其然, 不知其所以然。更无从谈起与相关疾病的病理生理理论。在工作中只是满足于应付日常工作, 不重视基本理论、基本知识的学习, 对体外循环专业的新理论、新技术缺乏学习兴趣。
1.3 临床工作不规范
多数基层进修医师在实际工作中承担着体外循环及麻醉或者护士工作, 由于体外循环不是其专业, 并且心外科手术动手机会的减少, 造成其临床工作存在不熟练、不规范的缺陷。
2 针对进修医师的特点, 采取以下措施进行进修培养
2.1 理论实践统一化, 两者并重
理论联系实际是人类认识或学习活动的普遍规律之一, 是教学必须遵守的。对于体外循环进修医师的培养尤其应该注意。与医学生培养容易“重理论轻实践”不同的是, 进修医师的培养更容易“重实践轻理论”。如何做到两者并重是做好进修医师培养工作的首要课题。根据理论实际相结合的方针, 理论与实践操作应做到“先理论后实践, 理论实践相印证, 时间比例三七开”的原则。
首先, 由于多数进修医师并非体外循环专业毕业, 甚至从未接触过心脏外科, 因此所有进修医师在进修初期均需强化相关理论知识学习, 进行相关阶段考试, 方可进入手术室进行实践操作;其次, 指导教师应在各种操作过程中, 培养进修医师较强的思维判断能力, 手和脑高度结合能力, 进修医师也应注意临床操作中的每个细节与所学理论之间的关系, 多思考, 勤发问:为何如此操作、如何实施、操作步骤、注意事项有哪些和意外情况如何处理等等问题。学会用“脑”进行一切操作, 在进行各种操作之前都应将之前所学的具体步骤熟记于心, 指导教师应引导进修医师先作一个详细而周密的计划。之后督促进修医师进行回顾和总结, 不断提高其自身临床实践能力;第三, 所谓的“时间比例三七开”并不是将理论学习和临床实践的时间僵化的固定下来, 而是指对绝大多数进修医师来说, 临床实践还是相对重要的, 在理论学习的基础上应多进行实际操作。理论学习与实践操作穿插进行可以取得良好的学习效果。
2.2 教学计划个体化, 针对进修医师特点, 制定详细的培养计划
体外循环专业是一门实践性很强的学科。由于进修生的来源和工作、学习经历不同, 临床基础差别较大, 造成临床技能水平参差不齐, 导致培养的难度加大。在体外循环科进修的医师通常是基层医院里具有一定年资及手术技术的医生, 通常是各级医院的麻醉或胸心外科医师, 能够独立处理临床工作。他们具有一些共同特点:教育背景、工作经验参差不齐, 临床实际工作能力差别较大, 理论基础较薄弱, 操作欠规范, 兴趣偏重于临床操作、偏重于学习临床技术, 对体外循环技术及病理生理知识认识不够。因此, 针对这些特点, 既不能像对本科生一样简单感性地教学, 也不能像对研究生那样大量讲解最新的研究动态, 而是针对进修生的特点以及进修目的, 制定有针对性的培养计划。
对于进修医师来说, 最重要的是完善其理论知识体系, 规范操作。所以, 既要手把手教学, 规范操作、规范手术, 同时又要开展理论课教学, 答疑补漏, 巩固完善他们的理论知识。通常进修医师的进修时间为1年, 应根据每一个进修医师的进修目的、进修时间和他们的临床工作能力加以综合判断, 制定出符合个体化特点的进修计划, 并制定相应的进修轮转表。例如对于理论基础好、临床经验较丰富的进修医生, 可相对放手一些, 使之有机会独立处理临床问题, 从中发现其理念、操作的欠缺之处加以指正, 同时指导其将一些比较前沿的理论、操作技术运用于实际, 并督促其总结临床工作中的经验体会。对于基础较差、经验较少的进修医生便指定学习内容, 安排理论讲座、病例分析、操作技术演示等。在较短时间内力争有大幅度提高, 获得扎实的理论基础知识和一定的临床经验。
与其他学科不同的是, 体外循环水平的提高不仅需要操作技巧, 更需要对不同情况下患者的病理生理状态有深入的认识。因此要求所有进修医师深入学习体外循环相关病理生理变化, 有助于深入理解体外循环期间与非体外循环期间的不同。
2.3 教学手段多样化, 尤其是情景教学模式
情景式模拟教学方法在基础医学教学中的应用能很好地弥补传统教育的不足, 在理论和现实中具有一定可行性[3]。
全部理论课采用多媒体授课方式, 由具有中、高级职称的医师负责授课。多媒体教学具有巨大优势: (1) 丰富和增大了理论教学信息量, 可及时获取、充实和更新课堂授课内容, 提高单位时间内的教学进度, 实现了多种教学信息地有效整合和利用; (2) 利用幻灯片及录像等多媒体教学手段使教学过程中的一些抽象、静止、局限的知识变得直观、形象、动态和全面, 有助于进修医师的理解; (3) 所有多媒体资料均可在科室公用电脑上反复观看, 有助于进修医师随时学习。
情景式模拟教学方式对教师的要求: (1) 保证多媒体课件的质量, 幻灯片上的文字不易过多, 要少而精, 提纲携领、简明扼要, 切忌全文照搬; (2) 在授课过程中要把握好教学的节奏和气氛, 适当给予进修医师一定的提问时间, 以便掌握和解决学习中反馈上来的问题; (3) 重视教师的主导作用和进修医师的主体作用; (4) 强调课前预习, 做到心中有数。在授课前告知授课题目, 鼓励进修医师根据题目自己查阅资料, 整理问题, 在授课后进行提问讨论。授课教师要加强与学生的交流, 活跃课堂气氛, 及时备课。从课前准备, 课堂教学, 实践教学到成绩考核及记载等均有明确的质量要求。对青年医师授课前科室先进行集体备课, 并严格执行试讲制度, 先在科内试讲, 经教研室考核合格后方可授课。保证授课内容的准确与课时安排的合理性。严格按照教学计划编写教案, 保存教案以供检查。按教学计划的进度教学, 按规定时间辅导答疑。定期征求进修医师教学意见和建议, 改进教学方法, 提高教学质量。
通过多媒体授课方式实现理论与实践的结合, 在课堂上与进修医师进行有效互动。授课结束后鼓励进修医师积极提问。
临床实践教学采用“时间轴”方式, 即将体外循环操作过程与同时进行的外科操作相互对照理解。通过此种方式, 使进修医师明确体外循环各个步骤的操作的原因以及方式, 有助于提高体外循环医师与外科医师的默契程度, 保证手术顺利进行。
体外循环模拟系统的使用。科室内常规安装一套体外循环系统供进修医师使用。体外循环系统包括配套管、膜式氧合器以及动脉过滤器, 完全模拟临床实际情况。进修医师从最基本的组装系统, 到各种体外循环意外的发生及处理, 均可通过此系统进行模拟。按照教学大纲的要求, 对不同病种及情况进行模拟。细化每一步操作流程。根据自己制定的评分系统进行评价。此系统既可以在教学过程中提高进修医师的操作技能及应对各种意外情况的能力, 又可以在进修结束前进行考试。
2.4 教学评估标准化
教学评估包括两个方面, 即带教教师授课能力的评价和进修医师学习成果的评价。定期考核和评估是教与学的重要方法和手段。首先, 对带教教师的评价包括教师内打分体系和进修医师对教师的打分。每个授课周期结束时进行, 从基础知识能力、临床能力以及授课能力三方面综合评定教师能力, 做到主客观结合, 知识储备与授课能力结合的综合评价。这样既保证了进修教学工作的质量, 也给全体带教教师增加了压力和动力, 调动带教教师进行继续学习的积极性, 进一步提高自身的理论和实际工作能力。其次, 对于进修医师的考核分阶段进行, 内容主要包括学习期间的新内容。考核包括理论考试和临床实践考试。通过考核可以评价带教效果, 检验是否完成计划目标, 从而帮助进修医师总结成绩和发现不足, 激励他们在今后的学习中再接再励。
总之, 体外循环进修医师的培养工作应从理论与实践两方面入手, 既要制定标准化培养计划, 又要因材施教, 多种教学方式相结合, 充分调动进修医师的积极性, 为我国培养合格的体外循环医师。
摘要：随着心脏外科的发展, 对体外循环医师的需求越来越大。相关进修医师的培养方法需总结提高。根据体外循环进修医师的现状及特点, 北京安贞医院体外循环科总结出具有特色的培养方法。
关键词：心脏外科,体外循环,进修医师
参考文献
[1]金振晓, 赵璧君, 雷兰萍, 等.美国体外循环学教育发展简介[J].西北医学教育, 2010, 18 (1) :97-99.
[2]肖娟, 刘梅, 肖颖彬.心血管外科住院医师体外循环教学方法探讨[J].局解手术学麻醉, 2012, 12 (1) :92.
功能性人体肝细胞可在体外培养增殖 篇4
肝脏是人体内最大的内部器官, 是代谢的主要场所。肝细胞在肝脏中占85%, 通常用于制药企业做肝毒性、药物清除率和药物间相互作用的研究。另外, 在细胞疗法也有纠正遗传缺陷、逆转肝硬化或为应用肝辅助装置的患者提供支持的临床应用。
遗憾的是, 尽管人类肝脏在体内可以迅速再生, 但是肝细胞移至体外后增殖功能会很快丢失。到目前为止, 努力在实验室扩展人类肝细胞会导致代谢功能低的永生化癌细胞。人体肝细胞的稀缺和肝细胞扩展时功能丧失是科学、医学和药学发展的主要瓶颈。
为了解决这一问题, 耶路撒冷希伯来大学Alexander G rass生物工程中心主任Yaakov Nahmas教授与u p cy te技术有限公司 (原M edlcyte) 的首席德国科学家, 发现了一个新的方法, 能在实验室中迅速扩展人类肝细胞数量, 并不会失去其独特的代谢功能。
根据德国癌症研究中心 (DKFZ) 对人乳头状瘤病毒 (HPV) 开展的早期工作, 研究团队证明了HPVE6和E7蛋白的弱表达能将肝细胞从细胞周期阻滞中释放出来, 并使得肝细胞增殖以应答〇ncosta tin M (〇SM) , 0SM是白细胞介素6 (IL-6) 超级家族的成员, 参与肝脏再生过程。然而以往的研究引起肝细胞不受控的增殖, 肝细胞变为了代谢功能低的肿瘤细胞, 研究人员细致筛选只对0SM应答的增殖肝细胞。0SM刺激引起细胞增殖, 倍增时间为33〜49 h。去除0SM会造成生长抑制, 4 d内发生肝脏分化, 产生高功能的细胞。这种方法, 称为up cy te过程, 能将人类肝细胞扩增35倍, 每个肝脏可分离出1015 (万亿) 细胞。相比之下, 健康器官仅能分离出109 (十亿) 细胞。
“这一方法的发现是革命性的”, 德国小组的负责人Jorls Braspennlng博士说, “它的厉害在于我们可以从多个供体中扩增肝细胞, 促进患者变异和特殊毒性的研究。”研究小组从可连续遗传的种族多样背景中生成肝细胞线, 同时保持与重要人体肝细胞相同水平的CYP450活性、上皮分化和蛋白表达。重要的是, 增殖肝细胞对2 3种不同药物呈现出与原始人体肝细胞相同的毒理学应答。
体外共培养 篇5
目前, 应用最广泛的是Tilly和Terry (1963) 提出的一步法和此后改进的两步法 (即两级离体法) 。它是将瘤胃液过滤后与待测饲料在厌氧环境、适宜的温度 (38℃~39℃) 和p H (6.7~6.9) 等条件下共同培养48h后, 再用瘤胃蛋白酶 (p H大约为2) 培养48h, 以模拟饲料在瘤胃、真胃和部分小肠的消化过程。根据发酵培养管内残留物的分析结果, 估测饲料消化率。测定饲料营养成分大多采用差值法。体外产气法是Raab, L.等 (1983) 和德国荷恩海姆大学动物营养研究所Menke K.H等人建立的, 是目前采用最多的用来评价饲料营养价值的方法之一。国外文献多称该方法为HFT技术。此方法是基于饲料样品在体外用瘤胃液消化所产生气体的比率来估计饲料消化率。饲料样品的活体外经瘤胃微生物发酵所产生的气体 (CO2、CH4、H2) 为微生物的代谢产物, 因此, 在一定的代谢途径下, 可以利用气体产生的数量或速度反映营养物质被瘤胃微生物发酵的程度和速度。消化率不同的各种饲料, 在相应的时间内 (一般为24h) 产气量与产气率不同。
本文针对利用两步法和体外产气法 (HFT技术) 进行饲料的营养价值评定做进一步的概述, 即采用瘤胃液对饲料进行体外培养, 以达到近似于瘤胃内发酵环境来评定饲料的营养价值。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
2011年3月至2011年5月, 内蒙古农牧业科学院动物营养所。
1.2 试验动物
营养所试验基地的 (具瘤胃瘘管的) 绒山羊2只。
1.3 试验材料
市售精补颗粒料, 羊草由动物营养所试验基地提供, 试验日粮为按表1配制的全混日粮。
瘤胃液采自装有永久性瘤胃瘘管并饲喂精粗料比为40∶60饲粮的内蒙古白绒山羊。
实验试剂:缓冲液、胃蛋白酶溶液;培养液;0.2M盐酸、工作液、A液、B液。
1.4 试验方法
1.4.1 概略养分分析试验方法
营养成分测定方法参照杨胜 (1999) 的《饲料分析及饲料质量检测技术》。
干物质 (DM) :用105℃干燥法测定。
粗脂肪 (EE) :采用SZF-06A脂肪测定仪, 将烘干后的样品用滤纸包裹后由玻璃入口放入, 再加乙醚, 使之反应。4h后取出样品烘干称重, 计算出脂肪含量。
粗灰分 (Ash) :茂福炉中550℃~600℃下灰化测定。取烘干后的样品移入坩锅碳化、灰化 (600℃) 至恒重;测定每批样品的粗灰分重量。
粗蛋白 (CP) :用凯氏半微量定氮法测定。取烘干后的样品移入消化管进行消化, 每份样品中分别加入适量的催化剂和15ml的H2SO4后开始消化。消化完毕后, 测定每批样品的粗蛋白含量。
中性洗涤纤维 (NDF) :取烘干后的样品移入袋后按Van soest中性洗涤剂法测定。
非纤维性碳水化合物NFC%=100- (NDF%+CP%+Fat%+Ash%)
1.4.2 两极离体试验方法
首先在厌氧、39℃条件下, 用瘤胃液的稀释液消化1.5g底物样品 (称取样品1.5g, 放入培养瓶中, 每管加入120m L的缓冲液混匀, 通入CO2, 直到其处于饱和状态。放入培养箱中, 使其温度达到38℃, 然后加入30m L瘤胃液, 测定p H并通入CO2, , 达到饱和。p H应保持在6.7~6.9, 利用1mol/L的Na CO3来加以调整) 放入培养箱中培养48h, 每天摇动2~3次。在培养开始后6小时和24小时测定p H值并进行调整。然后加入1m L 5%Hg Cl2, 2m L1mo L/L的Na CO3以抑制微生物的活动, 促进沉淀, 弃上清液。然后加入胃蛋白酶150m L在39℃、酸性条件 (p H应在1.5左右) 下, 消化48h。培养结束后, 测定残渣中的DM、CP和NDF含量, 计算出DMD、CPD和NDFD含量。
1.4.3 体外产气试验方法
产气量的测定:同时进行3个重复的培养, 将0.4000g待测样品干物质置于特制的150m L酸奶瓶中, 用60m L瘤胃稀释液 (20ml瘤胃液+40ml培养液) 消化。记录1、2、3、6、8、12、24、36、48各时间点的产气量。采用Groot等 (1996) 描述的多相组合模拟模型gas (ml) =a1/ (1+ (k1/t) ) c1+……+an/ (1+ (kn/t) ) cn计算动态消化产气参数。式中:Y为a代表每一饲料组分理论上的最大产气量 (m L) ;k为对应饲料组分达到最大产气量一半时所需时间, h;而c是决定曲线形状的参数;t为培养时间 (h) 。从产气开始后, 按照时间点记录产气量, 每次记录完进行放气, 使注射器的刻度为零, 等下一次记录完毕后又返回到零刻度。由于前几个小时产气较多, 记录时间稍微密集一点, 以后间隔的时间稍长一点, 以此减少试验误差。
活体外p H、NH3-N测定:在39℃、厌氧条件下, 将0.2000g待测样品干物质置于特制的150m L酸奶瓶中, 用30m L瘤胃稀释液 (10ml瘤胃+20m培养液) 消化。每个培养设3个重复, 待培养至24 h时立即测定发酵液p H (采用上海雷磁仪器厂产PHS-3B型高精度酸度计测定) , 氨态氮含量测定参照冯宗慈等 (1993) 方法。
NH3-N测定方法为:依次量取工作液0、1、2、4、6ml置于5个编号的50ml容量瓶内, 接着依次加入蒸馏水10、9、8、6、4ml, 使之成为10ml。再用0.2M盐酸定容到刻度处, 此系列标准溶液每100ml的含氮量依次为0、0.2、0.4、0.8、1.2。准确量取各标准溶液0.4ml分别置于5个10ml试管内, 各管内依次加入A液2ml和B液2ml摇匀, 静置10分钟后, 用722分光光度计于波长700nm处比色, 0.5cm的比色皿, 用蒸馏水的0号试管作为空白对照, 测定各溶液消光值 (0号标液保存, 测样品时调零点用) 。用消光值作为自变量、溶液含N量作为从变量导出回归方程式。做出标线后, 从培养液中取10ml于3500~4000r/min下离心10min, 量取0.5ml上清液置于15ml试管内, 再加入9.5ml0.2M盐酸至10ml摇匀 (稀释倍数为20) , 比色操作同上所述。把测得的消光值代入回归公式, 算得的结果再乘以样品的稀释倍数即为原样品中的氨氮含量。
1.5 试验目的
本试验采用的日粮1为羔羊开口料, 日粮2为羔羊育肥料。
在饲养羔羊的过程中, 羔羊提前补饲可以促进前胃的发育, 增加羔羊营养来源, 提高羔羊安全越冬能力, 一般羔羊从10日龄开始到断奶前都需进行补饲。补饲前期用开口料饲喂槽羔羊。这个阶段是羔羊由吃母乳逐渐到采食草料的过渡时期, 从开始补饲到6周龄以母乳为主, 补饲开口料为辅。6周龄到断奶期间以补饲育肥料为主, 母乳为辅, 在补饲中逐渐增加优质干草与精补料的数量, 减少母乳的饲喂量。
羔羊开口料和羔羊育肥料都要求具有全面的营养以及在消化道内易消化降解, 因此本试验利用概略养分分析、两级离体和体外产气试验等来综合评价两种日粮的营养价值。
2 结果与分析
2.1 概略养分分析结果
从图1可以看出两种不同比例全混日粮的营养成分, 其中1号样品中的三大营养物质粗蛋白、粗脂肪和碳水化合物的含量较高。
2.2 两级离体实验结果
注:DMD:干物质消化率;Cp D:粗蛋白消化率;NDF:中性洗涤纤维消化率。
由上图可以看出, 不同比例全混日粮的消化率均为1号样品的高。
2.3 体外产气实验结果
由图3可知, 前3h两个样品的差距不大, 3~24h内1号样品的产气量明显高于2号样品的产气量, 而24h后产气量极少。
注:a:每一饲料组分理论上的最大产气量 (m L) ;k:对应饲料组分达到最大产气量一半时所需时间 (h) ;c:决定曲线形状的参数。
由图4可以看出, 两种日粮最大产气量分别为91.194 (m L) 、92.737 (m L) 。从不同发酵参数之间的相关关系可以看出, 在发酵时间比较短的情况下, 理论最大产气量受产气速率及延滞时间的影响。而产气速率与主要营养成分的含量之间存在着极显著的相关性。
由图5可知, 标线y=1.094x-0.022 (y:浓度, x:吸光度, 原样稀释倍数为20倍) 。
由表5可以看出, 1号样品的氨氮浓度明显高于2号样品。
由表6可以看出, 两个样品间p H值差距不大, 和绒山羊瘤胃内环境相差不大, 均处于正常生理范围 (p H值5.5~7.5) 内, 不会影响瘤胃的发酵功能。
3 讨论与结论
3.1 讨论
(1) 不同精粗比日粮对消化率的影响
两级离体技术测定的结果 (表2) 显示, 不同精粗比的饲料其消化率也不同, 相对而言1号精补料的消化率比2号精补料的消化率高一些, 差异不显著。其粗蛋白的消化率最明显, NDF在瘤胃的消化率是1号样品高于2号样品。这说明, 消化率受粗蛋白质的影响, 饲料中粗蛋白含量越高其消化率越高。高含量的NDF会降低微生物对全混日粮的降解速率, 从而延缓发酵的启动。然而, 当日粮中非结构性碳水化合物或易发酵物质的含量较高时, 微生物会利用降解产物迅速繁殖, 从而提高消化率。
(2) 不同精粗比日粮对产气量的影响
一般来说, 产气量是反映底物中碳水化合物组分被瘤胃微生物利用程度的标志。体外产气法发酵后的主要产物为CO2、CH4和VFA。然而, VFA在被缓冲剂中和后也会产生少量的气体。因此, 可以说产气量反映了底物发酵。产气量多, 说明底物中碳水化合物组分含量高或被利用的比例大;产气量少则反之。然而, 在底物粗蛋白含量不同的条件下, 瘤胃微生物产气量的高低不能完全反映底物被利用的程度。Picard等曾报道, 当底物蛋白质含量高时, 底物的DMD明显提高, 但底物的发酵产气量明显减少。
本试验利用体外产气法研究了2种不同全混日粮的营养价值。从图中可以看出, 前3h 1号日粮和2号日粮的产气量差距不太明显, 而3~24h的产气量1号日粮明显高于2号日粮, 24h以后2号日粮的产气量比1号日粮的高。总的来说, 1号日粮的产气量均高于2号日粮。在瘤胃中, 2种不同比例全混日粮发酵参数不同, 可以说, 在瘤胃中被消化吸收的程度不同。精饲料本身较易被动物的瘤胃液消化。不同比例全混日粮的最大产气量为91.194、92.737。从不同发酵参数之间的相关关系可以看出, 在发酵时间比较短的情况下, 理论最大产气量受产气速率及延滞时间的影响。而产气速率与主要营养成分的含量之间存在着极显著的相关性由此可以推断其通过营养成分对底物发酵速率起到促进或抑制作用。
(3) 不同精粗比日粮对瘤胃氨氮浓度的影响
NH3-N是饲料蛋白质、肽、氨基酸、氨化物、尿素和其它非蛋白质氮化合物分解的终产物, 同时又是微生物合成菌体蛋白的原料, 其浓度反映的是饲料中蛋白质的降解情况。瘤胃NH3-N浓度在一定程度上反了特定日粮组成下蛋白降解与合成间所达到的平衡状态。由表4可知两试验组氨氮浓度范围是6.56~25.33mg/100m L, 处于已报道的最佳NH3-N浓度 (6.3~27.5 mg/100ml) 范围之内 (Murphy等, 1987;Ortega等, 1979) 。所以, 本试验中两种精粗比日粮均使瘤胃发酵产生了适当的NH3-N浓度。本试验表明, 添加不同日粮会直接影响饲料蛋白质在瘤胃内的降解。
(4) 不同精粗比日粮对瘤胃p H值的影响
瘤胃碳水化合物发酵的主要产物是乙酸、丙酸和丁酸等VFA, 它们是反刍动物主要的能量来源及合成乳脂和体脂的原料。VFA浓度在很大程度上影响瘤胃的p H值, 而反过来瘤胃p H值对瘤胃微生物群落也有重要影响。p H值是反应瘤胃发酵情况的发酵水平的综合指标, 在1和2试验组中, 瘤胃p H值的范围是6.43~6.52, 处于Murphy等 (1987) 所报道的正常范围内。表明两组日粮条件下瘤胃均处于正常发酵状态。正常的瘤胃发酵p H值范围, 验证了试验是在正常的发酵环境中进行的同时也证明了试验数据的可靠性。
3.2 结论
从结果可知, 1号样品的消化率均高于2号样品, 而体外产气量也表明1号样品的产气量比2号的高。在p H值正常的发酵情况下氨氮浓度也是1号样品的高于2号样品。可以说不同比例的全混日粮在瘤胃中的消化和利用率不同, 营养价值也有所不同。
然而, 体外培养技术广泛地应用于反刍动物营养研究, 得益于其技术简便、费用低, 以及相应测定装置的发展。但是, 目前仍缺少对不同实验室之间的试验比较, 各个实验室之间的数据往往无法比较。同时, 各个实验室采用的具体的技术细节和装置不同, 难以制定统一的标准化程序。此外, 作为一种动物消化模拟技术关键在于与体内环境相似, 所以本实验只给饲料营养价值评定中提供理论依据。
参考文献
[1]杨胜.饲料分析及饲料质量检测技术[M].北京农业大学出版社, 1999.
[2]闫贵龙, 鲁琳等.氮肥追施量对玉米秸秆营养价值的影响[J].畜牧兽医学报, 2006, 37 (8) :785～792.
[3]Tilly J M A, Terry R A.A two stage technique for the in vit ro digestion of forage crop s[J].J Br Grassland Soc, 1963, 18:104～111.
[4]卢德勋等.现代反刍动物营养研究方法和技术[M].农业出版社, 1993.
[5]谢春元, 杨红建等.体外发酵产气技术在饲料营养价值评定中的应用[J].中国饲料, 2007, 10:16-19.
[6]彭健, 陈喜斌.饲料学 (第二版) [M].科学出版社, 2008.
[7]杨凤.动物营养学 (第二版) [M].中国农业出版社, 1998.
[8]Picard D G, Tesser OB, Bianco R A M.Interference of nitorgenous in techniques of in-vitro ruminal gas production[J].Ciencia e Investigacion Agraria, 1998, 25 (2) :227～232.
滑膜细胞原代体外培养体系的建立 篇6
1材料与试剂
1.1 主要试剂
DMEM/F12粉剂 (Gibco产品, 美国) ;胰蛋白酶 (上海华美公司) ;Ⅲ型胶原酶 (Sigma公司产品) ;乙二胺四乙酸二钠 (EDTA) (上海试剂一厂) ;胎牛血清 (中国医学科学院生物工程研究所) 。
1.2 取材
滑膜组织取自中国医科大学附属一院骨科4例患者, 其中类风湿性关节炎3例, 风湿性关节炎1例, 全部为女性, 均在无菌条件下取出, 并且术后病理证实滑膜非感染性、非肿瘤性病变。
2方法
2.1 滑膜成纤维细胞 (FLS) 的分离和培养
参照文献[1]所描述的方法并略加改进:将临床无菌取材的滑膜组织, 用无钙镁的PBS洗3次, 剪成约1～2mm3小块, 放入6孔板, 加入2ml 10%小牛血清F12+DMEM和2mlⅢ型胶原酶 (2mg/ml) , 在37℃5%CO2培养箱内消化2h, 将未粘附的细胞 (贴壁细胞为滑膜组织的巨噬细胞) 移入离心管离心1 000转10min, 弃上清;再加入0.25%胰酶4ml在37℃ 5%CO2培养箱内消化30min, 经200目不锈钢网过滤, 滤液离心1 000转10min。计数6孔板每孔铺1×105/ml个细胞, 在37℃ 5% CO2培养24h, 弃去未粘附细胞 (如单核细胞、淋巴细胞、红细胞) , 此时贴壁的细胞为原代的滑膜细胞;将不锈钢网没滤过去的组织块, 用小镊子一块块贴在6孔塑料板底, 每孔4～5块, 每块有间隙, 轻轻翻转倒贴放在CO2温箱2h, 细胞靠重力向组织边缘爬, 然后翻到正面加10%F12+DMEM 2ml, 液面刚好过组织块, 尽量少晃动, 24h见组织块周边有少许细胞爬出, 以后逐渐增多。初期呈网状分布生长, 以后随着细胞数量的增加, 逐渐紊乱, 无明显的方向性排列特征。10d左右, FLS细胞分裂增殖迅速, 呈梭形或柱形, 细胞核呈卵圆形位于细胞中央, 核仁明显, 周围见分泌物聚集, 成纤维型滑膜细胞放射样相连成片, 布满皿底时进行传代培养。传代时FLS在胰酶作用下, 逐渐回缩, 轻轻吹打易于脱离皿底, 用胎牛血清中和后离心去上清, 接种新培养瓶中, 12h内完全贴壁。我们用反复消化传代、反复贴壁法相结合纯化细胞, 获得了形态学较纯的滑膜成纤维细胞 (FLS) , 达到了预期效果, FLS可以传6代。
2.2 HE染色
将细胞制成细胞悬液, 接种到24孔培养板中[2], 密度为2×104个/ml, 48h后成片, 用4%的多聚甲醛固定20min, PBS洗一次5min, 苏木素染5min, 自来水洗5min, 1%的伊红染色1min, 双蒸水振洗2min甩干, 明胶甘油封片剂封片, 倒置显微镜下观察照相。
2.3 滑膜细胞存活率的测定
用0.15ml细胞悬液, 加入0.15ml的0.4%台盼蓝溶液, 充分混匀, 在显微镜下观察, 如细胞核未被染色, 提示滑膜细胞存活, 如细胞核被蓝染, 提示滑膜细胞死亡, 计算细胞存活率。
2.4 免疫细胞化学鉴定
将细胞制成细胞悬液, 直接铺到24孔培养板中, 密度为2×104个/ml, 48h后细胞长成单层, 用10%的多聚甲醛固定, 用0.02mol/L的PBS振洗3min×2次, 3% H2O2去离子水孵育5min, 蒸馏水洗3min×2次, 滴加5%BSA (封闭液) 室温孵育20min, 勿洗。分别滴加50μl稀释的 (1∶50) 鼠抗人CD68[3]、鼠抗人波形蛋白单克隆抗体 (抗体均为Pharmingen产品) , 置湿盒内4℃孵育过夜, 并设空白对照组 (无一抗, 加PBS) 。PBS振洗3min×3次, 滴加生物素羊抗鼠IgG 37℃孵育20min, PBS振洗3 min×3次, 滴加SP37℃孵育20min, PBS振洗3 min×3次, DAB显色, 苏木素复染, 明胶甘油封片剂封片, 倒置显微镜下观察照相。
3结果
3.1 细胞形态
HE染色FLS细胞呈梭形或柱形, 细胞核呈卵圆形位于细胞中央, 核仁明显, 细胞核周围细胞质见分泌物聚集 (见图1) 。
3.2 原代培养的鉴定
3.2.1 活力鉴定:
用台盼蓝排斥实验检测其活力大于95%。
3.2.2 FLS免疫组化鉴定:
见图2、图3。
vimentin (+) ×400
CD68 (-) ×400
4讨论
类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis, RA) 是一种以关节组织慢性炎症性病变为主的自身免疫性疾病, 其特征性病变是滑膜组织的异常增生, 滑膜细胞分泌多种炎症介质, 如白细胞介素1 (IL-1) 、肿瘤坏死因子 (TNF) 等参与关节损伤的病理过程。RA细胞因子相互作用、相互促进形成一个复杂的网络, 是引起炎症、免疫蛋白质水解、细胞募集和增殖的重要媒介, 在RA滑膜病中起核心作用[4,5,6]。
目前, 滑膜细胞的原代培养方法大致有两种, 即组织块培养法和酶消化法, 两者各有利弊。组织块培养法组织块种植困难, 贴附不牢, 易脱落, 培养周期长, 需2～3周, 消化时间不易控制, 如消化酶浓度过大或时间过长, 细胞膜受损导致细胞死亡, 细菌易污染, 成功率下降。酶消化法的不足是:消化酶的种类浓度不同, 不好控制, 浓度大, 时间长, 细胞膜受损;浓度小、时间短则不易产生细胞, 短时间内难以达到实验所需数量, 且过筛网时堵塞网孔, 培养比较困难。
本实验扬长避短, 具有如下优点:先采用最佳的消化时间和浓度, 0.4%的胶原酶2h, 以柔缓方式消化细胞间的纤维成分, 又能将贴壁的巨噬细胞去掉, 然后用0.25%胰酶消化30min, 使细胞间的蛋白质水解, 用200目的网过滤, 将滤下的细胞铺板培养24h弃上清[滑膜细胞一般需24h可贴壁, 即可将滑膜细胞以外未贴附的细胞 (淋巴细胞、红细胞) 分开]。同时将滤网上未消化的组织块, 贴在6孔板上倒贴2h后翻过来培养。因消化过的组织块松软粘糊更易贴壁, 不易脱落, 培养潜伏期短, 周期缩短为7～10d。我们采用滤网上下收集分别培养细胞, 二者合一, 细胞产量多, 即可短期内用于实验研究, 故本法是一种快速有效的分离培养滑膜细胞的方法。
本文旨在寻求一种较为满意的滑膜细胞体外培养体系, 原代培养细胞传代有限, 但细胞的性质与体内的状态趋于相同, 笔者认为, 利用本研究提供的方法具有更广泛的前景和实用价值。
摘要：目的:改善体外分离、培养滑膜细胞的方法, 并对其鉴定。方法:取人滑膜组织采用机械分离、复合酶消化后再将组织块塑料孔板倒贴法, 差速贴壁法纯化后培养, 倒置显微镜观察生长情况, HE染色, 细胞活力测定, 免疫组化鉴定。结果:分离培养的滑膜细胞呈梭形或柱形, 核呈卵圆形位于细胞中央, 生长好、纯度高。细胞活力测定大于95%, 免疫组化鉴定:波形蛋白vimentin (+) , CD68 (-) 。结论:成功分离了人滑膜细胞, 方法简便易行, 为进一步研究提供良好的实验模型。
关键词：滑膜细胞,原代培养,体外培养体系,纯化
参考文献
[1] Cho Cs, Cho ML, Min SY, et al.CD40 engagement on synovial fi-broblast up-regulates production of vascular endothelial growthfactor〔J〕.J I mmunol, 2000, 164 (10) :5055-5061.
[2]贾兰玲, 陈相, 贾心善, 等.塑料孔板原位免疫细胞化学、免疫荧光、特染方法的建立〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志, 2009, 18 (1) :113-114.
[3]蒋建平, 朱志刚, 易朝辉, 等.人关节滑膜A型和B型细胞的纯化分离和体外培养〔J〕.解放军医学杂志, 2001, 26 (6) :387-388.
[4] Miossec P.An update on the cytokine network in rheumatoid ar-thritis〔J〕.Curry Opin Rheumatol, 2004, 16 (3) :218-222.
[5] Veroordeldonk MJ, Tak PP.Cytokines in rheumatoid arthritis〔J〕.Curr Rheumatol Res, 2002, 4 (3) :208-217.
体外共培养 篇7
1 材料与方法
1.1 样本及主要材料
脐带来源于中南大学湘雅二医院健康产妇足月妊娠分娩后的新生儿脐带。Ⅱ型胶原酶(Gibico),M199培养液(Hyclone),胎牛血清(Gibico),0.05%胰蛋白酶及EDTA(Gibico),HEPES(Sigma),VEGF(Sigma),兔抗人内皮细胞Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体(Sigma),细胞用PBS自制。无菌输液延长管(江苏康进医疗器械有限公司生产)一根,三通接头一个。
1.2 方法
1.2.1 原代人脐静脉内皮细胞培养
(1)在无菌条件下于健康产妇分娩后(剖宫产为佳)立即取新生儿脐带,无破损、夹痕及血栓,扭曲较少,长度约20~30cm,用无菌纱布挤除脐带内血液,止血钳夹闭两端,依次用75%酒精、生理盐水将脐带表面冲洗干净,置于无菌台上。(2)把接上无菌三通的输液延长管剪去圆锥接头端后插入脐静脉,并用7号丝线缝扎固定妥善。接三通并连于50 mL无菌注射器,用无菌PBS液冲洗脐静脉中残留的红细胞,直至洗出液清亮为止。然后,用7号丝线结扎脐带另一端,从三通注入PBS溶液使脐静脉充分充盈,检查确保脐静脉两端无渗漏且回抽通畅,记下脐静脉的容量,用装有含青、链霉素的PBS液的无菌广口瓶转移到细胞培养室(图1)。(3)将脐带平铺于预先盛有100 mL温PBS液的无菌弯盘中,置于超净工作台上,抽取相当于脐静脉2/3容积的0.1%Ⅱ型胶原酶注入脐静脉封闭消化,其间转动、轻拍脐带,使酶溶液充分接触血管内壁。37℃孵育10~15 min后,用20 mL无菌注射器抽出含有内皮细胞的酶溶液,并用30 mL温PBS液分次冲洗脐静脉,将所有溶液一并收集在50m L离心管中,1 000 r/min离心10 min。弃上清液,加入完全培养基(M199及20%新生小牛血清、2 m ML-谷氨酰胺、6.67%HEPES、8 ng/m L VEGF、100μg/m L肝素)5 mL,轻轻吹打悬浮细胞后转入一次性培养瓶(Corning,T25),置入二氧化碳培养箱,37℃,5%二氧化碳条件下培养。6 h后换液,除去未贴壁细胞及杂质,以后每隔2 d换液1次,以维持细胞的营养和内环境的稳定。约3~5 d细胞融合成单层细胞后传代。
1.2.2 原代人脐静脉内皮细胞的传代培养
弃培养瓶中培养液,用3~4 mL,37℃预温的无钙、镁PBS溶液洗2~3遍。0.05%胰蛋白(Gibico)酶和0.02%EDTA(Gibico)各1 mL混匀后,加入到培养瓶中消化细胞。倒置显微镜下观察,细胞皱缩、变圆、彼此分离或呈片状分离时终止消化,耗时约1 min左右。吹打、悬浮细胞并移入离心管中,1000 r/min离心10分钟。弃上清液,1∶2进行传代培养。
1.2.3 人脐静脉内皮细胞鉴定
(1)光镜形态学观察:在倒置显微镜下,常规观察HUVEC生长状态、形态及均一性,观察是否单层生长,有无接触抑制现象等细胞生长特性。(2)免疫细胞化学染色法鉴定:24孔板孔内铺盖玻片,接种HUVEC细胞悬液。待细胞长满后取出盖玻片,采用免疫细胞化学染色的常规方法鉴定。一抗为兔抗人内皮细胞Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体(稀释比例为1∶100)(Sigma),阴性对照用PBS替代。
2 结果
2.1 光镜形态学观察
原代培养细胞接种30 min后细胞开始贴壁。早期细胞呈球形、团状,少数细胞伸展,24~48 h生长最快,逐渐生长成铺路石样。核清晰,呈圆形或椭圆形,核分裂相多见,可见1~2个核仁,胞浆丰富,内含小颗粒。于3~5 d后融合为单层呈铺路石状排列(图2)。
2.2 免疫细胞化学染色法鉴定
免疫细胞化学染色法表明胞浆中有红色颗粒的细胞为Ⅷ因子抗原阳性的细胞,即人脐静脉内皮细胞。绝大多数实验细胞(97.5%)为内皮细胞。(图3)
A图为阴性对照PBS组:蓝色的为苏木素复染的内皮细胞核,B图胞浆中有红色颗粒(箭头所示处)的细胞为Ⅷ因子抗体阳性的细胞,即人脐静脉内皮细胞。
3 讨论
血管内皮细胞的培养是体外研究人体血管内皮功能的重要技术。人脐静脐是它的常用来源,具有取材方便,获得细胞数目较多等优点。但是,由于血管内皮细胞的培养操作过程中极易发生细菌、杂细胞等污染,细胞产出量及成活率较低,研究成本较高,因而它的普及和应用都受到一定的限制。获取血管内皮细胞的方法有机械刮取法和酶消化法两种。机械刮取获得的血管内皮细胞容易混杂其他的血管壁细胞,因此近年已逐渐被酶消化法取代。
在具体操作过程中,文献报导在进行脐静脉酶消化时,常使用注射针头及止血钳夹闭脐静脐消化[5,6]。针长度过短不易夹稳,过长则易穿破血管且回抽不顺利。本实验中使用的输液延长管大小合适且硬度适宜(不会损坏血管),丝线缝扎固定容易、可靠。操作时通过连接的三通管,不需与脐带直接接触。既杜绝与外界接触而造成污染的可能,又便于后面消化酶的充分作用。消化下的内皮细胞由注射胶原酶的注射器吸出并直接注入离心管,冲洗液也通过三通注入和抽出,避免了与外界空气和脐带外表面接触,经过作者的多次验证,这样收集得到的内皮细胞在培养时无需添加抗生素也极少发生污染。
酶消化法中,酶的作用要均匀,时间不宜过长,否则会损伤内皮细胞,增加成纤维母细胞和平滑肌细胞脱落混入内皮细胞,不仅影响内皮细胞培养的纯度,而且也会降低内皮细胞的成活率[7]。本实验中,没有使用全量的胶原酶注入脐带至脐带膨胀,而是选择了2/3体积的消化酶注入脐静脉酶解消化,收获到了数量较多、纯度较高的血管内皮细胞。作者经过多次实验发现,使用2/3体积的消化液,既可节约胶原酶的用量,又保证消化转动脐带的时候有充分接触的空间,这样内皮细胞的消化效率较完全充盈时要高。只要消化液的最适容量和孵育时间摸索得好,成纤维母细胞和平滑肌细胞很少脱落混入内皮细胞,内皮细胞培养的纯度和成活率高。通过对50余例脐静脉内皮细胞的分离培养,发现采用2/3体积酶消化法分离培养脐静脉内皮细胞较为可靠,所获取的细胞97.5%为内皮细胞,是体外研究血管内皮细胞的理想方法。
当原代细胞融合80%以上后,根据美国ATCC原代脐静脉内皮细胞传代培养方案的推荐加入0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA溶液(Gibico)消化,只需30 s到1 min左右即可将内皮细胞消化下来。在细胞生长液中加入终浓度为8 ng/m L VEGF、100μg/m L肝素,内皮细胞增殖良好,细胞传至第三代,细胞数可增多5~10倍。
总的来说,使用本方法体外培养的脐静脉内皮细胞,贴壁时间早,纯度高,污染少,产出量高,传代次数多,且方便易行,能获得较为满意的效果。
参考文献
[1]PETER J.KUHLENCORDT.Role of endothelial nitric oxidesynthase in endothelial activation:insights from eNOS knockoutendothelial cells[J].Am J Physiol Cell Physiol,2004,268:C1195-C1202.
[2]ZHENHUA XU.Vascular endothelial growth factor upregulatesexpression of ADAMTS1 in endothelial cells through protein ki-nase C signaling[J].Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2006;47:4059-4066.
[3]JOAN M.Active participation of endothelial cells in inflammation.[J].Leukoc.Biol.2005,77:487-495.
[4]JAFFE EA,Nachman RL,Becker CG,et al.Culture of human en-dothelial cells derived from umbilical veins[J].J.Clin Invest.,1973,52:2745-2756.
[5]PAN CH,LUO RC.A simple and uncontaminative culture meth-ods for endothelial cell of umbilical cord[J]Chinese Journal ofClinical Anatomy,2003,21(5):533.Chinese
[6]MARIN V,KAPLANSKI G,GRES S,et al.Endothelial cell cul-ture:Protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelialcells[J].Journal of Immunological Methods,2001,254(1-2):183-190.