体外诱导耐药

体外诱导耐药（精选八篇）

体外诱导耐药 篇1

1 仪器与试剂

1.1 实验菌株

实验菌株为临床分离的对环丙沙星敏感的铜绿假单胞菌5株;质控菌株为ATCC27853。

1.2 主要试剂及耗材

环丙沙星,购自拜耳公司,批号:BXCCL41;碳酰-氰-间氯苯腙(CCCP),购自Sigma公司;丙酮,购自北京化工厂;血琼脂培养皿,购自天津金章科技发展有限公司;M-H琼脂,购自BD公司;HEPES,购自Sigma公司;十二烷基肌氨酸钠,购自Sigma公司;Tris,购自Sigma公司。

1.3 实验设备

光电比浊仪,美国,生物梅里埃公司;电热恒温培养箱DH6000AB型,天津市泰斯特仪器有限公司;QYC200Rocking incubator,上海福玛实验设备有限公司;国产KA-1000离心机;Eppendorf Centrifuge 5417R 4℃离心机,德国;Eppendorf Minispin离心机,德国;JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;PW2003台式培养箱,中国重庆;BIO-RAD power/pac 3000电泳仪;紫外凝胶成像仪,Bio-Rad GELDOC 2000PC;VITEK全自动微生物分析系统,美国,生物梅里埃公司。

2 方法与结果

2.1 药物敏感性试验及环丙沙星(CIP)多步法诱导性耐药试验

选取临床分离的对环丙沙星敏感的铜绿假单胞菌5株,分别命名为Pa1～Pa5,采用琼脂对倍稀释法测出环丙沙星对上述5株铜绿假单胞菌的MIC值,质控菌株为ATCC27853(药物敏感试验的操作及结果的解释参照美国临床实验室标准委员会(CLSI)2006版标准)。

将实验菌制备成1.5×108CFU/ml的菌悬液,并稀释成3.1×103CFU/ml浓度,取50μl均匀涂布于含有(CIP的琼脂平板,35℃培养24h为一代,收集耐药突变株。通过连续接种培养,每个药物浓度培养3代,CIP药物浓度为(1～32)μg/ml。在接种含药物平板的同时,接种无药平板进行同期培养,观察细菌生长情况。对诱导出的耐药菌株进行琼脂对倍稀释法测定MIC值,比较诱导前后耐药性变化。将诱导的耐药菌接种于不含抗菌药物的MH平板,35℃培养每24h转种一代,连续培养5代后进行药敏试验测定,选择MIC值无明显变化者。见表1。

2.2 诱导后外排泵阳性菌株的选择

抗生素对倍稀释琼脂培养基中加入CCCP,CCCP的浓度为5μg/ml(CCCP浓度依据国内外文献对喹诺酮类药物与外排泵抑制剂相互作用的研究[6,7],该浓度对外排泵有较好抑制作用,而对细菌生长无影响[8])。将诱导后的5株铜绿假单胞菌菌悬液及质控菌株菌悬液接种于含有CCCP和环丙沙星的琼脂平皿上,接种量均为105CFU,35℃温箱中培养24h,测出在有CCCP的情况下环丙沙星对上述5株铜绿假单胞菌的MIC值。

将上述两组MIC值相比较,如在有CCCP的情况下MIC值下降至原来的1/4或以下,即认为该菌株为外排泵阳性菌株[9]。见表2。

由上表可以看出,诱导后的Pa2、Pa3、Pa5为外排泵阳性菌株。

2.3 外膜蛋白提取

将诱导前后的Pa2、Pa3、Pa5细菌纯培养物分别接种于2mlLB肉汤中,37℃振荡过夜,取1mlLB培养液于100mlLB肉汤中,37℃培养15h,将菌液4 000rpm离心15分钟,取沉淀悬浮于3ml 10mmol/L的HEPES(pH7.4)中,低温超声裂解90s,裂解物于7 000rpm离心15min,收集上清,加入0.75ml 2%的十二烷基肌氨酸钠溶液充分混匀,室温作用10min,4℃10000g超速离心1h,沉淀用3ml 10mmol/L HEPES和等量的2%十二烷基肌氨酸钠溶解,室温作用20min,再次4℃10000g超速离心1h,取沉淀溶于10mmol/L HEPES中,分装,-20℃冰箱保存备用。

2.4 外膜蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.4.1 制胶10%分离胶15ml(水5.9ml,30%Acy5ml,Tr is3.8ml,10%SDS1 50μl,10%Aps150μl,TEMED6μl)取7.5ml备用;5%浓缩胶3ml(水2.1ml,30%Acy 0.5ml,Tris0.38ml,10%SDS 30μl,10%Aps 30μl,TEMED 3μl)。垂直电泳槽,加入分离胶7.5ml,缓慢加入1ml水,待0.5h后倒出水,滤纸吸干水分,加入浓缩胶,插入梳子,凝固后拔梳。

2.4.2 电泳取样品24μl,样品缓冲液24μl(含4%SDS,20%甘油,5%B-巯基乙醇,0.002%溴酚兰,0.11mmol/l TrisHcl,pH6.8),100℃水浴10min,待冷却至室温后上样,浓缩胶100V(30min),分离胶200V(30min)。

2.4.3 染色0.25%考马斯亮兰R250,40%甲醇,7%冰醋酸染色液,染色过夜。

2.4.4脱色30%甲醇,10%冰醋酸脱色液,脱色至条带清晰为止。

2.5 紫外凝胶成像和蛋白含量分析

脱色后的凝胶上显示出各蛋白条带,我们所选取的条带(OprM)分子量为49KD[10]。将电泳后的蛋白凝胶放入紫外凝胶成像仪中成像,然后应用软件分析各条带蛋白的相对含量变化来推测环丙沙星诱导铜绿假单胞菌耐药的作用机制。见图1。下面是环丙沙星诱导前后Pa2、Pa3、Pa5外膜蛋白电泳图及OprM相对含量表。见表3。

图中1-2为Pa2、3-4为Pa3、5-6为Pa5诱导前后外膜蛋白电泳图

3 讨论

喹诺酮类抗生素为临床常用的抗铜绿假单胞菌感染的药物,随着其广泛应用,耐药率逐渐上升。铜绿假单胞菌对喹诺酮类抗生素获得性耐药的主要机制是由于主动外排和药物作用靶位的改变[11],药物主动外排系统普遍存在于多种细菌中,如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等。

本实验中,环丙沙星诱导后外排泵阳性的铜绿假单胞菌外膜中外排泵蛋OprM含量明显增多,以此可以推测环丙沙星体外诱导铜绿假单胞菌耐药的机制之一是增加细菌外膜外排蛋白的含量。因此,为了减缓和控制铜绿假单胞菌耐药性的发展,临床抗感染治疗中应合理使用抗菌药物,足量短疗程和根据药敏结果选择用药,减少长期抗生素作用于细菌的诱导耐药和外排泵系统的激活。

参考文献

[1] 袁喆,肖永红,王其南.体外诱导铜绿假单胞菌对环丙沙星及亚胺培南交叉耐药[J].中国抗感染化疗杂志,2001;1(2) :70～72

[2] 陈瑞,唐英春,朱家謦,等.亚抑菌浓度亚胺培南体外诱导铜绿假单胞菌耐药[J].中华医院感染学杂志,2005;15(2) :131～134

[3] 周丹秋,李敏,蒋晓飞,等.全耐药铜绿假单胞菌中多药外排泵mRNA表达的定量RT-PCR检测[J].临床检验杂志,2006;24(2) :103～105

[4] 张永,唐英春.病原菌质子驱动型外排泵分子机制研究进展[J].国外医药抗生素分册,2004;25(1) :6～11

[5] Li XZ,Poole K,Nikaido H.Contributions of MexAB-Op rM and an EmrE homolog to intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa to aminoglycosides and dyes[J].Antimicrob Agents Chemother,2003;47:27～33．

[6] 陶传敏,吕晓菊,李萍.氟喹诺酮类药物对嗜麦芽窄食单胞菌主动外排泵表型特征研究[J].中国临床药理学杂,2004;20(5) :381～384

[7] Olga Lomovskaya,Mark S.Warren,Angela Lee.Identification and characterzation of inhibitors of multidrug resistence efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa:novel agents for combination therapy[J].Antimicrob Agents Chemother,2001;45(1) :105～116

[8] 颜英俊,糜祖煌.耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及其耐药机制的研究[J].中华医院感染学杂志,2007;17(6) :627～630

[9] Valdezate S,Vindel A,Echeita A.Topiosomerse Ⅱ and Ⅳ quinolone resistance-determining Regions in Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates with defferent levels of quinolone susceptibility[J].Antimicrob Agents Chemother,2002;46(3) :665～671

[10] 吴安华,罗晓燕.临床铜绿假单胞菌多重耐药株外排泵机制研究[J].中国感染控制杂志,2006;5(4) :293～297

体外诱导耐药 篇2

黄连提取物对耐药金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch,三角叶黄连 Coptis deltoidea C.Y.Chenget Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎.多年生草本,苦,寒.归心、脾、胃、肝、胆、大肠经.

作 者：李俊超 赵迎虎 李伟奇 刘湘新 作者单位：湖南农业大学动物医学院,湖南长沙,410128刊 名：中兽医医药杂志英文刊名：JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：28(3)分类号：S853.74关键词：

体外诱导耐药 篇3

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人膀胱癌T24细胞来源于中国科学院上海生物细胞研究所,实验时取对数生长期的细胞,在含10%小牛血清的细胞培养基(DMEM)培养液中培养,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下生长,0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2 MTT实验

T24细胞以5×104/mL、100μL/孔,接种于96孔培养板,培养24 h后,分别加入浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L的MS-275作为5个实验组,阴性对照组不加MS-275,空白对照组为单纯DMEM培养液,每组各设5个复孔。继续培养48 h,每孔加入5 g/L的MTT溶液10μL,再培养4 h,吸出孔内培养液,每孔加100μL二甲基亚砜(DMSO),酶标仪测定吸光度,选择492 nm波长,用空白对照组调零,计算细胞生长抑制率(%)=(1-实验组吸光度/对照组吸光度)×100%。以细胞生长抑制率与药物浓度的对数作图,在图上求出MS-275对T24细胞的半抑制浓度(IC50)值。选取接近于IC50值的浓度用于下一步实验。

1.3 荧光显微镜观察凋亡的形态学变化

将T24细胞以1×105/孔接种于6孔培养板,观察细胞贴壁且生长良好后,加入浓度为4.0μmol/L的MS-275作为实验组,非药物处理组作为对照组,继续分别培养12、24、48 h,细胞经胰蛋白酶消化收集后,以磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞密度为1×106/mL,制成单细胞悬液,取95μL细胞悬液,加人100μg/ml的吖啶橙染液5μL混匀,取10μL混合液于载玻片上,加盖玻片后于荧光显微镜(Olympus BX60)下(515 nm激发光)观察细胞形态学变化并摄片。

1.4 原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡

4μmol/L的MS-275分别处理细胞12、24、48 h,设阴性对照,每个时间点设3个复孔,培养结束后收集细胞悬液,做细胞涂片,行TUNEL法处理及染色,并以二氨基联苯胺显色。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,分析细胞凋亡率。

1.5 流式细胞仪(FCM)检测细胞内Bcl-2和Bax的变化

4μmol/L的MS-275分别处理细胞12、24、48 h,收集后4%多聚甲醛固定,PBS液漂洗2次,加入1.5 mL破膜剂透化15 min后,离心去上清,重悬于150μL破膜剂中,分别加入Bcl-2和Bax的单克隆抗体,留取空白对照(不加单抗),避光反应30 min,PBS漂洗2次,每管加入FITC荧光标记的二抗,避光反应30 min,PBS漂洗2次,上FCM检测。

1.6 统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件进行分析,计量资料数据以均数±标准差表示,采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT实验结果

经MTT法测定,浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L的MS-275处理T24细胞48 h后,细胞的生长抑制率分别为(4.59±2.37)%、(9.86±6.74)%、(22.82±7.55)%、(41.17±6.14)%、(65.02±6.21)%,通过作图求得IC50为(5.21±0.61)μmol/L。选用接近IC50的4.0μmol/L浓度作为实验浓度。

2.2 荧光显微镜观察结果

对照组基本为正常细胞,表现为细胞核形态规则,胞核DNA呈现黄绿色均匀弥散荧光。MS-275处理12 h和24 h凋亡细胞逐渐增多,48 h后出现大量凋亡细胞,细胞呈现核固缩,呈现致密浓染的黄绿色荧光,部分细胞表现为核碎裂,还可见典型的出泡现象。见图1。

2.3 MS-275诱导T24细胞凋亡率(AI)的升高

MS-275诱导T24细胞凋亡呈明显的时间依赖性,T24细胞的凋亡率随MS-275作用时间的延长而升高。MS-275作用12、24、48 h的AI分别为(9.52±2.61)%、(17.76±3.75)%和(37.5±5.26)%,AI在MS-275作用12 h以上各组,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 MS-275对Bcl-2和Bax表达的影响

MS-275作用6、12 h,T24细胞内Bcl-2蛋白的表达率即出现明显降低,而同时Bax蛋白的表达率出现明显升高(P<0.05或P<0.01);24 h Bax的蛋白表达率逐渐降低(P<0.01);此后随着作用时间的延长,Bcl-2的蛋白表达率逐渐升高,而Bax的蛋白表达率逐渐降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

诱导肿瘤细胞凋亡是HDAC抑制剂抗肿瘤作用的重要机制之一。本实验用荧光染色法及TUNEL法观察到,微摩尔数量级的MS-275即可诱导T24细胞出现特征性的凋亡形态学改变,并且随作用时间的延长,凋亡细胞的相对数量呈增多趋势。随后的实验对其诱导膀胱癌细胞凋亡的机制进行了初步探讨。

抗肿瘤治疗可诱发肿瘤细胞对细胞内的损伤信号起反应,而细胞是否凋亡很大程度上决定于Bcl-2家族蛋白之间的相互作用[4]。Bcl-2是Bcl-2基因家族中调节细胞凋亡的一个重要分子,能广泛抑制各种凋亡诱导因素引发的凋亡,其很可能影响凋亡最终通路上的中心环节。另一个Bcl-2家族蛋白Bax是重要的异二聚体伴分子,可与Bcl-2构成异二聚体,而Bax自身组成同二聚体。Bcl-2必须结合Bax才能发挥作用。Bcl-2与Bax蛋白量的比率决定异二聚体(Bcl-2/Bax)与同二聚体(Bax/Bax)的比值,这对决定细胞的凋亡易感性起关键作用[5]。本实验的检测结果表明,MS-275作用T24细胞后Bcl-2的表达减弱,Bax的表达增强,说明MS-275可下调Bcl-2表达,上调Bax表达,这与HDAC抑制剂诱导其他恶性肿瘤细胞凋亡时对凋亡相关因子表达的影响相一致[6,7]。本实验还观察到MS-275引起Bax表达的改变较Bcl-2的改变更明显,而由于Bcl-2和Bax表达的改变是同步的,这样就引起Bax/Bcl-2发生更显著的变化。更重要的一点在于,凋亡率发生显著变化之前,Bcl-2和Bax的表达即已发生显著的改变,这更表明Bcl-2和Bax表达的改变是MS-275诱导凋亡的启动环节上的作用因素。

本实验结果表明,HDAC抑制剂MS-275通过诱导膀胱癌T24细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用,Bcl-2和Bax蛋白表达分别下调和上调是其诱导膀胱癌细胞凋亡的机制之一。HDAC抑制剂为膀胱癌的治疗提供了新的思路。

参考文献

[1]Ploeg M,Aben KH,Kiemeney LA.The present and future burden ofurinary bladder cancer in the world[J].World J Urol,2009,27:289-293.

[2]Nishioka C,Ikezoe T,Yang J,et al.Simultaneous inhibition of DNAmethyltransferase and histone deacetylase induces p53-independentapoptosis via down-regulation of Mcl-1 in acute myelogenous leukemiacells[J].Leuk Res,2011,35(7):932-939.

[3]Altmann A,Eisenhut M,Bauder WU,et al.Therapy of thyroid carcinomawith the histone deacetylase inhibitor MS-275[J].Eur J Nucl Med MolImaging,2010,37(12):2286-2297.

[4]Adams JM,Cory S.The Bcl-2 apoptotic switch in cancer developmentand therapy[J].Oncogene,2007,26(9):1324-1337.

[5]Cory S,Adams JM.Killing cancer cells by flipping the Bcl-2/Bax switch[J].Cancer Cell,2005,8:5-6.

[6]H.a.cker S,Karl S,Mader I,et al.Histone deacetylase inhibitors primemedulloblastoma cells for chemotherapy-induced apoptosis byenhancing p53-dependent Bax activation[J].Oncogene,2011,30(19):2275-2281.

体外诱导耐药 篇4

近年来发现槲皮素 (Quercetin, QUE) 对肿瘤细胞具有耐药逆转作用备受人们关注。本实验以QUE作为逆转剂, 通过观察其逆转后, K562/ADM对阿霉素 (Adriamycin, ADM) 的耐药性变化、逆转前后细胞内的GST含量的变化, 为QUE在逆转白血病的应用上提供部分理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型人红白血病具有多药耐药表型的细胞株K562/ADM购自中国医学科学院天津血液学研究所, K562/ADM在含1.0 pg/ADM的RPMI1640培养液中连续传代培养, 实验前在不含ADM培养液中进行无药培养2周。

1.2 主要试剂

QUE (四川成都福润德实业有限公司) ;ADM (浙江海正药业公司) ;RPMI1640培养基 (Gibcobrl公司) ;谷胱甘肽S-转移酶 (GSTs) 测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所) 。

1.3 实验分组

(1) 不给药组:1640培养液+K562/ADM (D组) 。 (2) 给药组:ADM单独给药组 (A组) :K562/ADM细胞分别加入不同水平ADM , 浓度依次为10, 30, 90μmol/L, 记为A1, A2, A3组。QUE单独给药组 (B组) :K562/ADM细胞分别加入不同水平QUE, 浓度依次为10, 30, 90μmol/L, 记为B1, B2, B3组。QUE+ADM联合给药逆转组 (BA组) :K562/ADM细胞分别加入不同水平QUE+ADM, 记为B1A1组, B1A2组, B1A3组, B2A1组, B2A2组, B2A3组, B3A1组, B3A2组, B3A3组。

1.4 四唑盐 (MTT) 法药物敏感性实验

包括D组、A组 (A1、A2、A3) 、B组 (B1、B2、B3) 、AB组 (B1A1、B1A2、B1A3、B2A1、B2A2、B2A3、B3A1、B3A2、B3A3) 总共16组。实验步骤:将对数生长期的K562/ADM细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞数为2×105/mL。取2块96孔板, 分上述16个处理组, 即16行, 每组设8个复孔, 每组均进行药物孵育, 37℃、5%CO2保温培养48h后, 每孔加入5mg/mL的MTT20μL, 在同样的条件下保温培养4h后, 离心后弃上清, 每孔加100μL双甲亚砜 (DMSO) , 再置于37℃、5%CO2培养箱中15min。用酶标仪检测OD值 (570nm吸收值) 。计算公式:求抑制率= (1-T/C) ×100%, 其中T为给药孔OD570, C为不给药孔OD570。求IC50 (半数细胞抑制浓度) 值:将抑制率与药物浓度关系转化为直线方程, 计算50%抑制率下药物的浓度, 即IC50。求逆转倍数=IC50逆转前细胞/IC50逆转后细胞。

1.5 GSTs实验

包括A组 (A1、A2、A3) 、AB组 (B1A1、B1A2、B1A3、B2A1、B2A2、B2A3、B3A1、B3A2、B3A3) 总共12组。取一块96孔板, 分为12组, 即12行, 每组设8个复孔, 其中6个为测定管 (酶管) 孔, 2个为对照管 (非酶管) 孔, 37℃, 5%CO2培养箱中进行药物孵育48h后, 分别收集每组细胞于一个玻璃试管, 离心, 弃去上清液, PBS液洗, 重复上述步骤2次, 每管最终用PBS配成细胞悬液1600μL。以40Hz超声分别破碎每管细胞悬液 (试管始终保持在冰块中) 高速离心后, 留取上清液。按试剂盒说明书操作, 显色反应后, 用721分光光度计, 测定各管0D值, 并按公式计算其酶活性。GSTs酶活性 (U/mL) = (非酶管OD-酶管OD) ×标准管浓度×反应稀释倍数/[ (标准管OD-酶管OD) ×反应时间×取样量]

1.6 统计学处理

采用SPSS10.0统计学软件处理, 进行多因素方差分析, 检验水准a=0.05。

P<0.05, B单药组VS相同浓度A单药组。

*P>0.05 B1逆转组VS相同浓度A单药组;●P<0.01 B2逆转组VS相同浓度A单药组;◆P<0.01, B2逆转组VS相同浓度B1逆转组;★P<0.01 B3逆转组VS相同浓度A单药组;▲P<0.01 B3逆转组VS相同浓度B2逆转组。

*P>0.05, B1逆转组VS相同浓度A单药组;●P<0.01, B2逆转组VS相同浓度A单药组;◆P<0.01, B2逆转组VS相同浓度B1逆转组;★P<0.01, B3逆转组VS相同浓度A单药组;▲P<0.01, B3逆转组VS相同浓度B2逆转组。

2 结果

QUE单独给药组对K562/ADM有抑制作用, 随着浓度增加抑制率增加, 但在相同浓度下其抑制强度均小于ADM单药组 (F值分别为5.125, 5.852, 6.234) , 差异有显著性 (P<0.05) , 见表1。在相同浓度ADM作用下, 逆转组ADM对K562/ADM抑制率增加, 见表2, IC50值下降, 见表3。 逆转组 (10μmol/L) QUE B1A1、B1A2、B1A3对K562/ADM, 无显著抑制率增加作用 (P>0.05) , 但随着QUE逆转浓度增加, ADM对K562/ADM细胞抑制率逐渐增强, 差异均有非常显著性 (P<0.01) , 见表2, IC50值逐渐降低, QUE对耐药细胞的逆转倍数逐渐增强, 见表3。

经QUE逆转作用后, 相同浓度ADM作用下, K562/ADM内GST含量下降, 10μmol/L QUE逆转后, 与未经逆转ADM作用下比较, 无显著性下降 (P>0.05) 。30, 90μmol/L QUE逆转作用后, 相同浓度ADM作用K562/ADM后, 细胞内GST含量显著下降, 差异均有非常显著性 (P<0.01) , 且随着QUE逆转浓度增加, GST含量下降, 见表4。

3 讨论

细胞的耐药在化疗前就存在, 为原发性耐药或内源性耐药。化疗是白血病治疗的主要方法, 但白血病细胞对化疗药物产生的耐药性及化疗药物对机体产生的严重副反应是治疗白血病的主要障碍。目前研究表明白血病耐药是多因素、多途径综合作用的结果, 其中机制有:原癌基因 (包括p53、Rb、bcl-2) 突变[1]。多药耐药基因 (MDR) 及多药耐药相关蛋白 (包括P-g糖蛋白、肺耐药相关蛋白、乳腺癌耐药蛋白) 过度表达[2]。DNA损伤修复能力增强[3]。酶介导机制, 包括GST、氧化解毒P450酶系统表达增多[4]。一种细胞耐药白血病细胞往往同时存在数种耐药机制, 因此寻找低毒、有效的MDR逆转剂已经成为了白血病治疗上的新突破点。 近些年发现QUE对HL-60/ADM、K562/ADM细胞具有逆转作用, 主要涉及到下调MDR、P-g糖蛋白表达, 但尚未有报的指出QUE逆转K562/ADM耐药机制是否与GST有关, 本实验QUE能够下调K562/ADM细胞内GST活性, 减少GST对ADM的外排作用, 增加ADM在细胞内存留时间及存留浓度, 提高ADM的细胞毒性作用。单独应用QUE对K562/ADM有抑制作用, 但抑制强度不如ADM, 而经过QUE联合逆转后, 能够显著提高ADM对K562/ADM的抑制率。提示其主要机制不是QUE自身细胞毒作用, 而是通过降低K562/ADM细胞内GST活力, 减少化疗药物排出, 增加药物的细胞毒性作用, 达到增加抑制率作用。并随着QUE逆转浓度的增加, 细胞内GST含量逐渐降低。QUE在基因水平上对GST表达的调控, 有待今后进一步的研究。

参考文献

[1]郑志宏, 陈志哲, 张学敏.Bcl-2基因和肿瘤细胞耐药的研究[J].福建医科大学学报, 2000, 34 (6) :1-3

[2]姜夕锋, 徐功立.肿瘤细胞耐药表型及其机制的研究进展[J].山东医药, 2001, 41 (5) :56-57

[3]康楷, 黄林.肿瘤细胞耐药及逆转的研究进展[J].贵阳医学院报, 2002, 27 (1) :42-46

体外诱导耐药 篇5

1资料与方法

1.1菌株来源

收集2011年6月 -2012年6月武汉大学人民医院ICU分离鉴定的MDRAB,共计收集116株MDRAB(排除同一患者同一部位重复分离的菌株)。 其中,痰97株、分泌物7株、血液3株、尿2株、脓液2株、脑脊液2株、组织2株和咽拭子1株。随机选取24株已鉴定的MDRAB菌株。

1.2质控菌株

大肠埃希 菌ATCC25922, 铜绿假单 胞菌ATCC27853,金黄色葡萄球菌ATCC12593,均购于卫生部临床检验中心。

1.3主要药物、试剂

增菌培养液(营养肉汤):杭州天和微生物试剂有限公司,头孢哌酮 / 舒巴坦干粉:美国瑞辉制药, 米诺环素标准品:国家标准物质中心,CCCP干粉、 二甲亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO):美国Sigma公司。

1.4主要仪器设备与耗材

Heal Force生物安全柜 (力康生物医疗科技控股有限公司),BCM1000型超净工作台(苏州净化有限公司),二氧化碳培养箱(美国Forma Sciantific公司),Heraeu恒温恒湿培养箱(美国Thermo Scientific公司),VITEK比浊仪 (法国Biomerieux公司), AG245电子天平(瑞士Mettler Tolrdo公司),酶标仪 (德国BIORAD公司),Costar 96孔培养板 (美国Corning公司)。

1.5方法

1.5.1菌悬液配 制将已选取 鉴定的24株MDRAB菌株,在血琼脂培养皿复活后,挑取4、5个菌落置于2 ml生理盐水中,采用比浊仪校正浊度为0.5个麦氏单位,用营养肉汤1∶9稀释至3×105cfu/ml。

1.5.2药物溶液配制1抗生素溶液配制:参考美国临床实验室 标准委员 会 (USA Committee for Clinical Laboratory Standards,CLSI)2012年标准,采用肉汤稀释法测定药物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),SCF和MH助溶剂均为无菌蒸馏水,终浓度为5 120μg/ml。抗菌素贮存液浓度为10倍最高测定浓度,根据所需要的药物粉剂量进行计算,头孢哌酮∶舒巴坦:2∶1。药物的稀释浓度的配制方法,按照CLSI(2012)推荐的方法, 以减少实验误差;2CCCP溶液配制:取50 mg CCCP溶解于240μl DMSO中,配制成208 mg/ml的CCCP溶液,保存备用。使用前用肉汤1∶999稀释, 再倍比梯度稀释。

1.5.3单药的MIC值测定1取100μl倍比稀释后不同浓度的药物溶液依次加到96孔细胞培养板中,第1孔为阴性对照,加入100μl营养肉汤,第2~11孔中依次加入梯度药物溶液,第12孔为阳性对照,加入100μl菌悬液,整个过程在生物安全柜中严格按照无菌操作规范进行;2取浓度为3×105cfu/ml的菌悬液100μl加入2~11孔中,孔中菌悬液最终浓度为1.5×105cfu/ml;其中第1孔为阴性对照,加100μl营养肉汤,第12孔为200μl的菌悬液,整个过程在生物安全柜中严格按照无菌操作规范进行;3将上述96孔板置于35℃孵箱中孵育, 12~18 h后肉眼观察每孔中液体的浊度改变,并用酶标仪检测各孔中液体浊度,以此标准判断各药物单独使用时的最低抑菌浓度(MIC甲药单用、MIC乙药单用和MIC丙药单用)。

1.5.4联合药敏试验利用棋盘法进行联合药敏试验,步骤如下:1根据步骤1.5.3检测的各单药MIC, 选择其中6个药物浓度梯度作为联合药敏试验梯度。横向、纵向分别是两种单药的降梯度方向。取相应梯度浓度的药物各50μl两两组合加入相应孔中。当抗生素与CCCP联合药敏试验时,抗生素与CCCP按照1∶9的体积比例进行混合,CCCP浓度是步骤1.5.3中检出MIC的1/4;2将浓度为3×105cfu/ml的菌悬液100μl加入各孔中,使每孔中菌悬液最终浓度达到1.5×105cfu/ml,以上两步骤均在生物安全柜中严格按照无菌操作规范进行;3将上述96孔培养板置于35℃孵育箱中孵育,12~18 h后直接观察每孔中液体的浊度改变,然后用酶标仪检测各孔中液体浊度,并以此标准判断联合用药时两种抗生素的MIC(MIC甲药联用和MIC乙药联用)。

1.5.5抑菌浓度(fractional inhibitory concentration, FIC) 指数计算与判断FIC指数 =MIC甲药联用 /MIC甲药单用 +MIC乙药联用 /MIC乙药单用。判断标准:协同作用:FIC指数≤0.5;相加作用:0.5<FIC指数 <1.0;无相关作用:1.0<FIC指数 <2.0;拮抗作用:FIC指数 >2.0。

1.6统计学方法

应用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析, 计量资料如呈正态分布以均数±标准差 (±s)表示,两组计量资料之间比较采用t检验,计数资料采用 χ2检验,以P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1单药对MDRAB的抑菌效果

MIC范围为2.600~20.800, 平均 (10.067 ± 0.033)mg/L。

2.2联合用药对MDRAB的抑菌效果

表1和2显示,由上述两表可以看出SCF和MH单用MIC与联合使用时的MIC比较,联用明显低于单用,差异具有统计学意义(t =2.19,P <0.01;t =1.68,P <0.05;t =2.68,P <0.01)。

2.3CCCP的抑菌效果

CCCP分别与SCF和MH联用时,对MDRAB的MIC明显低于二者单用时的MIC (见表1~2); CCCP分别与SCF和MH联用时,对MDRAB的MIC明显低于SCF和MH两者联用时的MIC,差异具有统计学意义(t =1.76,P <0.01;t =2.20,P <0.01), 而且SCF和MH各自所用的浓度均在敏感范围内。

2.4浓度-累积抑菌率

由图1可以看出,联合用药时浓度 - 累积抑菌率曲线左移较为明显,与CCCP联用时曲线左移更加明显。在相同累积抑菌百分率下,联合用药比单独用药时所需的药物浓度低;在相同的给药浓度下,联合用药比单独用药具有更明显的抗菌效能。

2.5FIC指数分布

由图2可以得出:SCF与MH联合使用时FIC指数0.0~0.5占50.00%,0.5~1.0占45.83%,1.0~2.0占4.17%。由此可以得出,SCF与MH联合使用具有协同和相加作用。

(μg/ml,n =24)

(μg/ml,n =24)

3讨论

MDRAB具有强大的获得性耐药及克隆传播的能力,是我国医院内感染的最重要的病原菌之一,采用积极、有效治疗,消除病原菌,是切断其传播的重要措施。《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》指出[3]:MDRAB感染的抗菌治疗既要遵循根据药敏结果选择抗生素的原则,也要联合用药,特别是对于MDRAB、XRAB及PRAB感染的患者。

对于MDRAB、XRAB及PRAB感染的治疗,除应用抗生素药代动力学 / 药效动力学参数,选择适当的给药的剂量、给药的次数和给药的时间等提高疗效,也可以选择联合用药治疗,联合用药方案可参考国内外相关的指南,也可根据药敏结果进行组合。 MDRAB感染的治疗:根据药敏试验单用头孢菌素类、β- 内酰胺酶抑制剂复方制剂,或者联合氨基糖苷类与氟喹诺酮类药物进行治疗。XRAB感染的治疗:常采用二联方案。二联方案:β- 内酰胺酶抑制剂或 β- 内酰胺酶抑制剂复合制剂为基础的联合方案,选择米诺环素 / 多西环素、多粘菌素E、氨基糖苷类、碳青霉烯类等抗生素中的一种进行联合治疗[4];多黏菌素E为基础的联合方案,选择 β- 内酰胺酶抑制剂 /β- 内酰胺酶抑制剂复合制剂、碳青霉烯类抗生素中的一种进行联合治疗[5];替加环素为基础的联合方案,选择 β- 内酰胺酶抑制剂/β- 内酰胺酶抑制剂复合制剂、碳青霉烯类、多粘菌素E、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素中的一种进行联合治疗[6,7]。PRAB感染的治疗:MDRAB易对多黏菌素产生异质性耐药,但产生异质性耐药菌株可部分恢复对其他种类的抗生素的敏感性[8]。因此,可选择多黏菌素与 β- 内酰胺类或替加环素进行联合治疗,但尚缺少大规模临床研究来验证该方案的效果。对于外排泵导致的耐药菌株,更应慎重的使用单独用药方案,应根据药敏结果选择最优的组合方案进行联合治疗。

在本试验中,结合本院分离的MDRAB的药敏信息,选择敏感率高的MH和SCF进行试验。联合用药可以明显降低MDRAB的MIC。此外,联合用药在迅速杀灭细菌的同时,还能减少药物的使用量,从而减少不良反应以及毒副作用的发生。本次研究菌株的FIC指数主要集中于0.0~0.5和0.5~1.0,说明药物联用有非常好的协同、相加作用。虽然体外的抑菌试验不能完全代表临床疗效,但是国内外很多试验、临床研究及本试验研究的结果都表明联用的优越性。因此,临床医生应根据药敏试验的结果选择适当的抗生素药物进行联合应用。

体外诱导耐药 篇6

1 材料与方法

1.1冻干Uu3标准株

由中心实验室提供。

1.2解脲支原体菌液接种于固体培养基培养至对数期, 传代2~3次后提取其LAMPs。

1.3 LAMPs提取

按照有关参考文献的方法进行, 对数期的UU培养液离心后, 沉渣置入37℃水浴箱中孵育使其发生相分离, 第二次相分离结束, 收集沉淀LAMPs, BCA测定蛋白浓度后备用。

1.4实验标本

取自10例健康的因社会因素晚孕引产妇女绒毛膜组织, 将其剪碎成糊状在冰生理盐水中反复吹洗后称取组织 (湿重) 300mg, 均匀接种于培养瓶。

1.5培养液为高糖型条件下培养24h, 除去未贴壁细胞并换入新鲜培养液。每日更换培养液, 原代的细胞80%汇合后, PBS洗1次, 胰蛋白酶消化后, 吹打成单细胞, 以1.0×105/mL接种于新的培养皿传代培养。

1.6 LAMPS刺激试验

绒毛膜细胞于细胞培养板6孔板中密度为5×105/mL, 每孔细胞加入不同浓度 (0, 0.1, 1, 2, 3ug/L) 的LAMPS加以刺激, 提取细胞总RNA及细胞胞浆蛋白, 每个实验均重复。

1.7 RT-PCR检测hBD-2 mRMA表达

上皮细胞总RNA的提取采用上海飞捷生物公司的总RNA极速抽提试剂盒, 按其说明进行。引物设计根据Genbank hBD-2cDNA序列, 设计特经检查扩增片段均跨跃内含子hBD-2跨内含子引物:上游5-CCA GCC ATC AGC CAT GAG GGT-3, 下游5-GGA GCC CTT TC T GAA TCC GCA-3, 产物长255bp, 符合内参照, 扩增片长度为RT-PCR要求, 同时用PCR试剂盒里看家基因GAPDH引物为544bp。RT-PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳, 紫外线下观察结果, 并摄相。取诱导因素刺激过的细胞提取总蛋白, 测定蛋白质浓度, 电泳hBD-2蛋白, 电转印后Western blotting检测, 出现条带后观察、照相。

1.8统计分析

数据以均值正负号标准差表示。采用SPSS 12.0统计软件进行统计, 实验数据进行单因素方差分析, (P<0.05) 为差异显著, (P<0.01) 为差异非常显著。

2 实验结果

LAMPs能明显诱导绒毛膜产生hBD-2, HBD-2mRNA表达与LAMPs浓度呈明显的剂量依赖性。相同浓度的LAMPS刺激绒毛膜12h, 24h后绒毛膜的HBD-2mRNA表达呈现出时间依赖性。用SPSS12.0统计软件分析表中数据, LAMPs与细胞内sBD-2基因相对表达量的关系, P<0.05显著差异, 添加不同浓度LAMPs, sBD-2基因的相对表达量均有显著差异, 其中添加LAMPs3μg/mL与LAMPs0.1μg/mL之间差异极显著, 而且2个不同培养时间之间略有差异。结果表明在较低的浓度下, LAMPs浓度与sBD-2基因相对表达量变化基本呈正相关。

3 讨论

UU缺乏细胞壁, 细胞膜是UU与外界环境发生相互作用的唯一结构, 细胞膜由脂质双层和膜蛋白组成, 一类为膜本体蛋白, 另一类外周膜蛋白。膜本体蛋白和外周膜蛋白统称为脂质相关膜蛋白 (LAMPS) , 是暴露在表面与周围环境各种成分不断相互作用因是影响机体免疫系统的一种主要蛋白。该膜蛋是介导支原体黏附宿主细胞表面, 进入侵宿主细胞导致细胞受损与死亡的物质基础。因此对支原体LAMPS的研究是了解UU入侵宿主后与宿主免疫系统相互作用的关键。孕期UU感染与胎膜早破密切相关[1], 而支原体感染者发生胎膜早破是正常分娩者的8倍[2]。宫内感染UU造成绒毛受损, 最终导致妊娠终止, 其机制可能与Uu产生的磷酯酶A、C促使细胞膜中游离的花生四烯酸释放, 而花生四烯酸是前列腺素的必需前体物质, 能损伤胚胎组织及其附属物而影响妊娠结局[3]。实验证实Uu产生的高分子质量物质能刺激宿主免疫活性细胞产生释放多种细胞因子而造成绒毛膜的局部免疫损伤, 这些都可以导致病理妊娠的发生。

防御素2在正常女性阴道、子宫颈、子宫内膜、输卵管、卵巢、绒毛膜、绒毛及胎盘组织中广泛表达[4], 提示防御素2的基因表达调控、生物学活性对于维系正常妇女及孕妇生殖道内环境稳定、宿主天然抗感染机制中起着重要的作用。宫颈粘液具有强大而广谱的抗菌活性, 防御素在子宫颈组织中固有表达, 是子宫颈抗感染作用的重要介质[5]。

β-防御素毫摩尔浓度时具有杀伤细菌的能力, 纳摩尔浓度时就具有趋化活性, 具有间接的免疫启动作用, 在较低的分子浓度下, β-防御素能够与这些细胞表面特异性的趋化因子受CCR6相结合, 趋化这些细胞朝着受致病微生物侵袭的皮肤或粘膜病灶部位迁移, 从而提高机体抵抗微生物感染的获得性免疫反应水平。

本实验发现β-防御素-2在正常产妇绒毛膜组织中表达量较低, LAMPs能明显诱导绒毛膜产生hBD-2, HBD-2mRNA表达与LAMPs浓度与刺激时间呈明显的依赖性。Ganz等在纯化的防御素对人及小鼠肿瘤的作用中发现, 其活性由微丝、钙调节蛋白和溶酶体调节, 裂解作用呈剂量和时间依赖性。目前在对β-防御素表达分泌量的影响、作用机理研究还不很清楚, 有待进一步研究。

摘要：目的探讨UU的LAMPs对β-防御素表达分泌量与作用时间的研究。方法应用LAMPs体外诱导绒毛膜hBD-2基因表达, RT-PCR检测hBD-2mRMA表达。结果不同浓度的LAMPs均能明显诱导绒毛膜产生hBD-2, 相同浓度的LAMPS刺激绒毛膜12h, 24h绒毛膜的HBD-2mRNA表达量不同。结论绒毛膜HBD-2mRNA表达与LAMPs呈明显的剂量依赖性;24h内绒毛膜的HBD-2mRNA表达呈现出时间依赖性。

关键词：解脲支原体,hBD-2基因表达,研究

参考文献

[1]林娟, 翁云钦, 郑巧玲, 等.504例妊娠妇女性传播感染疾病相关行为分析[J].中国妇幼保健杂志.2005, 20 (3) :3587.

[2]乐杰.妇产科学[M].第5版, 北京:人民卫生出版社, 2000:164.

[3]王敬云, 刘杰.支原体感染与妊娠[J].中国实用妇科与产科杂志, 2001, 17 (12) :713～715.

[4]冯艳, 潘小玲, 黄宁, 等.女性生殖道人Beta-防御素基因的表达[J].中国病理生理杂志, 2003, 19 (11) :1564.

体外诱导耐药 篇7

随着抗菌药物的长期、广泛使用, 葡萄球菌的耐药性越来越严重, 尤其是自上世纪80年代以来分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) , 是获得甲氧西林抗性因子mec A基因后产生的一种高耐药性菌株。因此, 准确报告致病菌对抗菌药物的敏感性是临床微生物实验室的主要工作之一。

大环内酯类、林可酰胺类和链阳菌素B类 (MLSB) 因其具备抗菌活性强、抗菌谱广、不良反应少且经济、方便等优点, 临床广泛用于治疗葡萄球菌感染性疾病。链阳菌素类因其对MRSA很好的疗效己在国外广泛应用多年, 而国内目前应用尚少。经研究发现, 红霉素可诱导克林霉素耐药, 会影响克林霉素的抗菌效果。笔者对2011年6月—12月分离的179株葡萄球菌进行了D试验检测, 现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株

收集我院2011年6月—12月从临床各种标本 (咽拭子、痰、血液、各种分泌物等) 分离的葡萄球菌179株。以金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌株。

1.2 仪器

仪器为广东惠州阳光生物有限公司生产的SS-1000全自动微生物鉴定分析系统。

1.3 培养基与纸片

培养基为M-H琼脂干粉, 实验室配制成4 mm厚的平皿, 药敏纸片为红霉素 (15μg/片) 、克林霉素 (2μg/片) 。

1.4 药敏试验

将待测菌液浓度调为0.5麦氏单位, 均匀涂布于4 mm厚度的M-H平皿上, 距离红霉素纸片边缘15 mm~26 mm处放置克林霉素纸片, 35℃孵育过夜判读结果。当克林霉素纸片的抑菌环在靠近红霉素纸片一侧出现平截现象, 即克林霉素纸片的抑菌环看似一个大写的D字形, 或克林霉素抑菌圈内有雾状生长时, 即为D试验阳性, 提示存在诱导克林霉素耐药。两纸片抑菌环均为圆形, 即为D试验阴性。关于红霉素和克林霉素纸片放置的距离, 美国临床实验室标准化研究所 (CLSI) 推荐为15 mm~26 mm, 否则将会产生错误的结果。

美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 2006抑菌环判断标准如下:

2 结果

2.1 葡萄球菌对红霉素和克林霉素不同的耐药表型见表1。

注:E为红霉素, CL为克林霉素, R为耐药, S为敏感。

2.2葡萄球菌D试验阳性结果见表2。

注:E为红霉素, CL为克林霉素, R为耐药, S为敏感。

由表2可见, 62株葡萄球菌均为红霉素耐药, 克林霉素敏感。

3 讨论

本试验共分离出179株葡萄球菌, 对红霉素和克林霉素均耐药48株 (26.8%) ;对红霉素和克林霉素均敏感48株 (26.8%) ;红霉素敏感而克林霉素耐药21株 (11.7%) ;红霉素耐药而克林霉素敏感62株 (34.6%) , 其中D试验阳性36株 (58.1%) 。179株葡萄球菌中, D试验阳性36株 (20.1%) 。

70株金黄色葡萄球菌对红霉素和克林霉素均耐药19株 (27.1%) ;对红霉素耐药而克林霉素敏感23株 (32.9%) , 其中D试验阳性12株 (52.2%) ;109株凝固酶阴性葡萄球菌中对红霉素和克林霉素均耐药29株 (26.6%) ;对红霉素耐药而克林霉素敏感39株 (35.8%) , 其中D试验阳性24株 (61.5%) 。

本文金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌D试验阳性率分别为52.2%, 61.5%, 与深圳中医院报道54.13%的结果大致相当。葡萄球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制可能是: (1) 抗生素进入菌体量减少和外排增加, 如革兰阴性菌可增强脂多糖外膜屏障作用, 药物难以进入菌体; (2) 抗生素作用靶位改变:即产生一种由erm基因编码23Sr RNA甲基化, 降低了MLSB类抗生素对核糖体的结合从而耐药; (3) 葡萄球菌外排泵作用增强, 药物排出增加, 或细菌产生了灭活大环内酯类的酶, 如酯酶﹑磷酸化酶及葡萄糖酶;细菌改变了与抗生素结合的核蛋白体结合部位, 使其结合能力下降。由erm基因介导的金黄色葡萄球菌对大环内酷类耐药可以是结构型和诱导型两种, 前者一般可通过试验检测;后者进行D试验后克林霉素诱导耐药, 用一般的药敏试验检测不出来[1]。

总之, 金黄色葡萄球菌对大环内酯类抗生素耐药的机制复杂, erm基因介导金黄色葡萄球菌对大环内酯类耐药是主要原因。因此, 监测葡萄球菌对大环内酯类等抗菌药物的耐药性具有重要意义。

对于不断出现克林霉素体外敏感而临床治疗无效的病例, 有必要开展D试验, 可以避免克林霉素在体外敏感而体内耐药的发生, 为临床治疗争取宝贵时间。

参考文献

体外诱导耐药 篇8

1 材料与方法

1.1 实验动物、仪器和试剂

1.1.1实验动物

选取昆明小鼠10只, 雌雄不限, 4~5周龄, 体重20~30 g, 常规饲养, 健康。

1.1.2主要仪器和试剂

低糖DMEM和胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 购自Hyclone;DMEM-F12购自Gibco;5-氮胞苷 (5-azacytidine) 购自Sigma;兔源HCN4一抗、小鼠来源NF-160一抗和TRITC标记山羊抗兔Ig G购自Abcam;FITC标记山羊抗小鼠Ig G和DAPI购自武汉博士德生物工程有限公司;RNAextraction kit购自Qiagen;PCR引物购自生工生物工程 (上海) 有限公司;SYBR Green Real Time-PCR Master Mix购自Invitrogen。免疫磁珠分选系统 (Miltenyi Biotec) , 激光共聚焦显微镜 (Nikon EZ-C1) , PCR仪 (Roche Light Cycler480) 。

1.2 小鼠骨髓 CD45-细胞纯化、扩增

随机取5只小鼠经2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后, 70%乙醇浸泡30 min, 超净台无菌条件下取出小鼠股骨和胫骨数根, 用低糖DMEM反复冲洗髓腔, 收集冲洗液, 经400目尼龙筛网过滤, 1000 r/min离心6 min, 弃上清。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培养基重新混悬细胞, 37℃, 5%CO2, 饱和湿度培养 , 1 d后换液, 弃去未贴壁细胞 , 以后每2天换液1次。细胞长至80%融合时, PBS洗涤2次, 0.25%胰蛋白酶消化, 1000 r/min离心5 min, 弃上清, 10%FBS的低糖DMEM培养基重新混悬 , 以1∶3传代。培养大约1个月后, 采用免疫磁珠分选系统, 选取CD45抗体, 按照说明书操作, 使细胞通过分选柱, 收集CD45-细胞。采用添加 了10%FBS的低糖DMEM培养基 , 37℃、5%CO2、饱和湿度培养。

1.3 小鼠窦房结组织分离、培养, 收集培养基上清液

余下5只小鼠经2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后, 70%乙醇浸泡30 min, 超净台无菌条件下取出心脏, 解剖显微镜下将心脏界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm大小组织块, 剪成1 mm左右大小的碎块 , 添加0.07%胰蛋白酶消化 , 经筛网过滤后, 1000 r/min离心5 min, 加入添加了20%FBS的DMEM-F12培养基, 37℃、5%CO2、饱和湿度培养4 h, 吸出未贴壁细胞重置于6孔板中, 继续培养。每天半量换液。

1.4 条件培养基诱导分化骨髓 CD45-细胞

收集窦房结细胞培养后的培养液, 经1000 r/min离心10 min, 取上清与10%FBS的低糖DMEM培养基1∶1混合, 并添加10 mmol/L的5-氮胞苷, 作为CD45-细胞的条件培养基。CD45-细胞经条件培养基培养后2~3周, 选取生长稳定细胞, 进行检测。

1.5 免疫荧光检测分化细胞起搏标志物表达

将生长良好的分化细胞接种至8孔Chamber中, 培养过夜, 常规免疫荧光染色, 一抗兔HCN4 (1∶200) 、小鼠NF-160 (1∶300) , 二抗TRITC标记山羊抗兔Ig G (1∶500) , FITC标记山羊抗小鼠 (1∶500) 。激光共聚焦显微镜下观察, 拍照。

1.6 q RT-PCR 检测诱导分化细胞起搏基因表达

选择生长良好的分化起搏样细胞和小鼠窦房结细胞作为对照, 采用RNA extraction kit提取两种细胞的总RNA, 稀释浓度为200 ng/μL, 然后逆转录合成c DNA, 再采用SYBR Green Real Time-PCR Master Mix方法检测小鼠NF-160、HCN4和HCN2基因表达, 选取GAPDH作为内参, 引物序列见表1。NF-160、HCN4和HCN2基因表达结果以倍数变化表示。设立对照以确定无DNA污染。反应体系为20μL, 其中c DNA模板1μL, Nuclease-free water 8.2μL, NF-160、HCN4、HCN2基因引物序列上游引物和下游引物各0.4μL, 2X SYBR Green Master Mix 10μL。PCR反应条件 :94℃预变性3 min, 进行35个循环 (94℃30 s, 52℃30 s, 72℃30 s) , 然后72℃再延伸10 min, 4℃保存。实验重复3次。

2 结果

2.1 小鼠骨髓 CD45-细胞及诱导培养基诱导分化细胞

CD45-细胞贴壁后多为短梭形、三角形、多边形, 排列无规律, 细胞体积较小, 分散生长 (图1A) 。生长良好的CD45-细胞更换为条件培养基后, 细胞形态发生明显变化, 体积变大, 大小比较一致, 多呈长梭形, 向同一方向生长 (图1B) 。

2.2 分化细胞起搏标志物表达

经免疫荧光染色后, 发现绝大多数分化细胞NF-160和起搏离子通道HCN4表达阳性 , 可见胞质内呈丝状表达的NF-160和HCN4, 胞核未着色 (图2, 见封三) 。

2.3 诱导分化起搏样细胞起搏基因 q RT-PCR 检测

与培养的窦房结细胞比较, 分化起搏样细胞NF-160、HCN4、HCN2基因表达水平不同 , 以倍数形式表示, 其中NF-160、HCN4表达水平较培养的窦房结细胞高 (P < 0.01) , 而HCN2表达水平低于培养的窦房结细胞 (P < 0.01) 。见表2和图3。

注:与小鼠窦房结细胞比较, *P<0.01

与小鼠窦房结细胞比较, *P<0.01;误差线表示实验结果为3次实验平均值

3 讨论

20世纪末 , Makino等 [8]首次以5- 氮胞苷诱导培养骨髓间充质干细胞, 发现能够体外分化为心肌样细胞, 部分细胞的动作电位与心脏起搏细胞相似。随后, 大量研究围绕起搏样细胞的诱导分化展开。目前, 常用方法有应用5-氮胞苷诱导分化方法[8,9]、起搏离子通道基因转移方法[10,11]和窦房结细胞裂解液诱导分化方法[12]。但是这些体外诱导分化条件仍不完善 , 单独应用成功率低, 所以本实验联合应用5-氮胞苷和窦房结细胞培养上清液, 提高诱导效率。

5-氮胞苷诱导分化机制是可引起细胞DNA中某些胞嘧啶的去甲基化, 激活表达肌细胞的特异性启动或分化调控基因, 从而使启动细胞向心肌分化, 并表达心肌细胞特异性标志物, 并有一部分细胞具有自律性[8,13]。由于窦房结是一个多态性的结构, 心脏成纤维细胞能通过缝隙连接提高心肌细胞间的交通, 因而稳定培养心肌的自发性收缩节律。因此, 体外培养时不必将窦房结细胞完全分离纯化。窦房结细胞培养液对CD45-细胞的诱导分化作用依赖于窦房结细胞分泌的细胞因子, 可以为干细胞向起搏样细胞分化提供一个接近于窦房结细胞生长的环境。

研究表明, 窦房结起搏细胞的电生理特性为舒张期自动除极化, 起主要作用的是起搏电流, 其分子基础是HCN, 包括HCN1~HCN4, 小鼠心脏主要表达HCN4和HCN2, 以窦房结细胞HCN表达水平最高, 所以选择HCN4和HCN2作为检测指标[14,15,16,17]。

本实验采用全骨髓细胞直接接种, 然后经免疫磁珠分选其中的CD45-细胞, 换用条件培养基诱导分化的方法, 从成年小鼠骨髓源干细胞得到窦房结起搏样细胞。该方法操作简便, 得到细胞量大, 细胞成活率高, 传代后, 细胞形态渐趋同一, 排列趋同一个方向, 光镜下可见胞体呈梭形, 胞质淡染, 胞核明显, 位于胞体中央。笔者采用小鼠窦房结细胞培养基上清液, 并添加5-氮胞苷作为条件培养基, 得到的起搏样细胞能够表达起搏离子通道HCN4和神经丝蛋白NF-160, 由q RT-PCR结果看出, 分化细胞表达起搏离子通道, 符合起搏细胞特点, 说明得到的细胞大部分是起搏样细胞。形态学和免疫组织化学染色研究显示, 得到的细胞具有较好的生物学活性, 证明诱导分化方法有效, 得到起搏样细胞在体外能够存活较长时间, 并保持其生物学活性, 为生物起搏器奠定实验基础。

目前仍有尚未解决的问题, 比如得到的细胞并非全部是起搏样细胞, 还包含有其他细胞成分, 这些混杂的细胞会对进一步研究带来干扰, 因此进一步完善诱导分化条件或增加分化后的筛选指标, 利用流式细胞分离技术或免疫磁珠分选, 对得到的细胞进行分离提纯, 以提高细胞纯度。

摘要：目的探讨体外诱导小鼠骨髓CD45-细胞向窦房结起搏样细胞定向分化的方法 。方法 免疫磁珠分选小鼠骨髓CD45-细胞, 体外培养扩增后, 采用添加了5-氮胞苷和小鼠窦房结组织培养上清液的诱导培养基培养, 经免疫荧光染色检测起搏样细胞标志物神经丝蛋白-160 (NF-160) 和超级化激活环核苷酸门控阳离子通道 (HCN) 4表达, 并采用q RT-PCR定量检测起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表达。结果 小鼠骨髓CD45-细胞经体外诱导培养后得到的分化细胞表达NF-160和HCN4;q RT-PCR分析显示, 与体外培养的小鼠窦房结细胞比较, 分化起搏样细胞NF-160和HCN4的表达升高, HCN2的表达降低。结论 体外培养能够将小鼠骨髓CD45-细胞诱导分化为窦房结起搏样细胞, 为构建生物起搏器种子细胞提供选择。