结核菌素实验

结核菌素实验（精选九篇）

结核菌素实验 篇1

1细菌学检测

1.1 涂片镜检法

抗酸染色是最基本的细菌学检查方法, 但对于肺外结核标本阳性率报道却不尽一致[3,4,5,6,7,8,9], 应用USP技术等方法处理标本后可提高其阳性率。浓缩涂片的临床意义等同于常规涂片, 检测阳性的是抗酸杆菌, 但无法区分死菌、活菌, 但灵敏度得到很大提高。荧光染色具有比抗酸染色更高的灵敏度, 尤其是在少菌的部位, 特异度与之相当[4]。

1.2 结核分枝杆菌培养

培养现阶段仍是诊断结核的“金标准”, 但对于肺外结核病而言, 标本具有含菌量少、细菌分布不均衡和敏感度低等特点。分离培养法存在以下不足: (1) 阳性率低, 国内外报道基本一致[8,9,10]; (2) 费时, 一般需4～8周; (3) 需要较严格的实验环境, 易受污染, 广泛应用存在难度; (4) 分离培养易受结核分枝杆菌生物学性状、生长活性、培养基的选择及抗结核药物的影响, 从而导致临床培养结果通常为阴性。BACTEC系统为标准化的培养系统, 自20世纪70年代以来已广泛用于世界各地, 其培养阳性的平均时间为10.5d。金宇等[10]报道BACTEC960诊断肺外结核病的阳性检出率为21.4%、特异度为100.0%, 有效地控制了临床误诊率, 且阳性标本还能获得鉴定和药敏试验结果, 给临床和患者能提供及时可靠的治疗方案。

2血清学检测

血清学检测主要有特异性抗原检测、特异性循环免疫复合物检测、免疫印记技术、酶联免疫斑点技术、蛋白芯片技术、结核杆菌抗原或抗体检测、细胞因子 (IFN-α、CXCL9、CCL2) 检测[11], 由于年龄、卡介苗接种史、营养状况、HIV是否阳性等因素可对结果产生影响, 所以上述结果在一定程度上存在假阳性和假阴性[3,12]。

3分子生物学检测

3.1 聚合酶链式反应 (PCR)

PCR是一种简便、快速、灵敏的实验方法。孙永生等[9]报道用PCR技术检测95例关节结核阳性率为82%, 同时培养的阳性率为16%, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。不足之处在于实验难以统一操作规范, 扩增产物通过电泳只能确定分子量且易发生交叉污染, 较高的假阳性以及抑制物质导致的假阴性, 尚有待改进。

3.2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术是现阶段应用最广泛的检测结核分枝杆菌技术, 较传统的PCR而言, 灵敏度和特异度提高, 减少了污染的机会, 但并未从根本上解决假阳性及抑制物质的缺点。国内外均报道肺外结核标本的阳性率不一致[13,14,15], 主要涉及到引物设计、试剂、标本前期去污处理、DNA的提取及仪器的选择和操作等因素。所用引物主要为IS6110和devR (Rv3133c) , Chakravorty等[7]报道当IS6110和devR (Rv3133c) 同时作为引物检测时其灵敏度为83.0%, 特异度为93.8%。Noussair等[16]报道了一种培养加强的PCR技术对早期诊断肺外结核病的灵敏度为88.6%, 特异度为100.0%, 在培养第15天做目的基因的扩增, 225份肺外结核病标本与培养的最终结果一致, 但时间都短于结核分枝杆菌培养。实时荧光定量PCR技术在诊断肺外结核病的应用比其他的试验方法研究的较为透彻, 与传统方法相比具有不可比拟的优越性, 但临床医师不能仅靠其结果就开始或停止抗结核药物治疗, 其特异度仍是限制其广泛应用的问题。

3.3 PCR限制性片段长度多态性分析 (PCR-RFLP)

PCR-RFLP是鉴定结核分枝杆菌菌种的可靠程序, 比血清学、实时荧光定量PCR等更准确快速, 但该实验要求很高, 尤其是引物的设计和内切酶的选择很重要, 一般的实验室难以开展。

3.4 DNA探针技术

探针主要包括cDNA探针、寡核苷酸探针等, 特异度较高但同时灵敏度较低, 这限制了其在临床中的应用。

3.5 生物芯片检测

根据芯片上的探针不同可分为蛋白芯片、基因芯片, 是指将大量已知序列的探针分子固定于支持物, 与待检标本中标记的蛋白、DNA或RNA进行杂交, 通过检测每个探针的杂交信号强度, 从而获取标本的信息, 该技术可用于分枝杆菌菌种鉴定、耐药基因检测、基因组比较分析。该技术拥有快速、高效、结果可靠、重复性好的优点, 但由于仪器昂贵及芯片成本过高等因素限制了其广泛普及。

4展望

尽管各项试验技术都在快速发展, 但结核病尤其肺外结核病的诊断治疗却成为一个愈来愈亟待解决的棘手问题。笔者认为将微生物学、病理学、免疫学、分子生物学等学科有机结合不失为遏制肺外结核病发生和发展的一种较理想途径。

检验科结核实验室主要存在的问题 篇2

尊敬的院领导：

至从结核病的管理从县疾控中心转到县医院以来，检验科主要负责结核涂片镜检、培养和部分结核耐药监测。但是由于检验科目前没有单独的结核涂片、检测的实验室，结核的管理一直与微生物室放在一起进行处理，这样管理不符合规范要求，结核传染性较高，对工作人员存在较大的潜在的危害。因此导致结核的培养和耐药监测目前检测的较少。目前科室已经向设备科申请购置专用于观察结核涂片的显微镜和购置一台专用于结核培养的CO2培养箱。争取更好的开展结核的防治工作。科室安排有专门工作人员（李意刚）负责结核的管理的相关工作。

检验科

结核菌素实验 篇3

关键词 结核 结核杆菌耐药性检测

为摸清我院结核病人的耐药情况，为制定相应的有效化疗方案提供依据，我们收集2003年8月～2005年10月的162例结核病人的结核菌培养阳性菌株，分别用10种抗结核药物进行了药敏实验，并对耐INH、RFP及HR者的菌株分别与利福喷丁（RFT）、左氧氟沙星（L-OFLX）和力排肺疾（DIP）进行了药物敏感性检测。现将结果报告如下。

资料与方法

收集我院2003年8月～2005年10月的162例结核病人的痰培养阳性菌株，其中男87例，女75例，年龄13～71岁，平均29岁。有85例检测为耐R菌株，59例检测为耐H菌株，其中对32例耐HR病人进行了临床治疗观察。

方法：①菌株：经BACTEC-960-TB系统中12B培养基对结核分支杆菌进行初分离，菌型鉴定或应用改良罗氏培养基培养提取并菌型鉴定。②结核杆菌耐药性测定：应用改良罗氏培养基按《结核病诊断细菌学检验规程》制定的标准，由本院检验科自制。③疗效判定：依据《肺结核化学疗法》所制定标准。

统计学方法：组间率的差异采用卡方检验。

结 果

耐药率：共对162例结核病人耐药菌株进行了10种药物的药物敏感实验，其耐药率结果顺位次序分别为链霉素（SM）（89/162）54.9%，RFP（85/162）52.5%，INH（59/162）36.4%，吡嗪酰胺（PZA）（38/162）23.5%，乙胺丁醇（EMB）（18/162）11.1%，丁胺卡那霉素（KM）（16/162）8.0%，對氨基水杨酸钠（PAS）（11/162）6.8%，左氧氟沙星（L-OFLX）（7/111）6.3%，DIP（7/111）6.3%，卷曲霉素（CPM）（5/111）4.5%。其中初始耐药率分别SM（24/162）14.8%，RFP（22/162）13.6%，INH（17/162）10.5%，PZA（12/162）7.4%，EMB（7/162）4.3%，继发耐药率分别为SM（65/162）40.1%，RFP（63/162）38.9%，INU（42/162）25.9，PZA（26/162）16.0%，EMB（14/162）8.6%，耐HR率为（49/162）30.2%。从结果可以看出，我院为高耐药区域，耐药种类以SM、RFP、INH为主，耐多药结核病（MDR-TB）发生率亦很高。

耐HR菌株与其他药物的耐药情况：对耐RFP85例菌株和耐INH59例菌株及耐HR49例菌株分别与RFT、与OFLX和DIP之间进行耐药敏感测定，其耐RFP菌株结果为RFT（82/85）96.5%，L-OFLX（4/85）4.94%，力排肺疾（3/85）3.66%，耐INH菌株结果为L-OFLX（4/49）8.16%，DIP（6/49）12.24%，经卡方检验：RFP与RFT之间的耐药率差异无显著性P>0.05而耐RFP、INH及HR菌株与OFLX、DIP各组间耐药率差异有显著性，均为P<0.05。见表1。

以上结果说明，RFP与RFT之检存在明显交叉耐药性，而耐RFP、INH及HR菌株则对L-OFLX和DIP具有很高敏感性。

治疗与转归：我们对32例MDR-TB病则进行了应用L-OFLX、DIP、EMB、PZA四联用药方案的临床观察，其结果有效率95.83%。从而说明我院的MDR-TB病人对OFLX和DIP具有很高的敏感性。以痰菌阴转率、病变吸收与症状好转率三者综合治疗有效率，OFLX组为95.83%。

讨 论

化学疗法是目前控制结核病的最主要手段，INH和RFP是当今抗结核治疗的最主要的药物，如结核菌对HR耐药则化疗的成功率将受到极大影响，尤其是同时还对其他抗结核药耐药。

我国长期以来，抗结核药物广泛使用并仅限于数种常用药，这必然引起结核菌耐药性的变迁。由此而引起的耐药率的增加现已成为结核病疫情回升的主要因素之一。我国属于高耐药区域，耐药率顺次序以INH、SM、REP居前三位，平均初始耐药率为45.9%、继发耐药率为52%、耐HR率为15%。

由于单耐药和MDR-TB菌株的不断扩散有可能使结核病难以用现有的化疗方案加以控制，对耐药菌的监测及相应的敏感药物选择，在目前结核病治疗中已是一个重要课题。所以针对性地开展本区域内耐药结核病的的监测与相应敏感药物的选择，是我市控制耐药结核病的有效手段。

通过我所耐药结核杆菌的监测及相应的药敏试验结果提示，耐药率顺位次序为SM54.9%、RFP52.5%、INH36.4%、HR30.2%。以继发耐药为主，我市耐药顺位次序与国内报道基本相同。我市属于高耐药区域。

通过对耐HFR、LXH、HR菌株的敏感药物选择的实验研究，其结果证明，RFP与RFT之间存在明显的交叉耐药性，耐INH、RFP及HR菌株则对L-OFLX和DIP均敏感。目前国内对L-OFLX治疗耐药结核病的报道很多，均取得了良好疗效，但对应用DIP者则少见报道，所以DIP对耐药结核杆菌的作用有待于进一步深入探讨的价值。

龙岩市结核病实验室现状分析 篇4

1 资料和方法

1.1 资料

2007～2009年龙岩市辖区内7个县 (市、区) 一年两次的现场评价结果。

1.2 方法

按照我国结核病防治规划《痰涂片镜检质量保证手册》的要求对各实验室进行现场评价, 详细记录, 并对结果进行分析。

2 结果

2.1 痰检专业技术人员

我市各疾控机构痰检人员每县1个, 以兼职为主 (85.7%) , 中专学历占85.7%, 且人员不够稳定, 3年内人员变换2次的有3个县 (42.9%) , 详见表1。

2.2 房间布局、仪器设备和耗材

我市从2002年开始实行卫十项目时就建立独立的结核病实验室, 各实验室布局合理, 均能满足痰检需要;所有试剂与耗材均由省参比室提供, 染色剂、镜油等耗材数量充足、质量良好;具备基本仪器设备, 但各县都无专用高压灭菌器, 详见表2。

2.3 2007～2009年结核病实验室痰涂片室间质控结果

我市痰涂片工作开展良好, 但存在很多不足:部分实验室定性错误、涂片质量不合格等, 详见表3。

3 讨论

3.1 我市结核病实验室基本条件良好, 基本能满足工作需要:我市从2002年开始实行卫十项目时就建立独立的结核病实验室, 所有试剂与耗材均由省参比室提供;每个县均配置2台显微镜。2005年7个县 (市、区) 均由国家统一配置通风柜, 大大改善了结核病实验室的工作条件。

3.2 确保结核病实验室专业技术人员是有效开展痰检工作提高实验室工作质量的首要因素。人员情况: (1) 我市县级结核病实验室人员学历较低 (仅1名大专, 其余为中专) 。 (2) 有3个县结核病实验室存在痰检人员不稳定, 调动频繁的情况。痰检工作本身是一项环节较多, 流程较复杂而且专业性、及时性强、工作量大的工作, 从痰标本的接收、编号、登记到涂片、染色、镜检再到结果报告、资料录入, 最后还要按实验序号规范保存痰涂片, 每天的工作完成后还应对实验室和所有废弃物进行消毒处理。每位新调入的痰检人员首先要接受必要的技术培训, 对整个工作有一个了解、熟悉的过程, 在这个过程中势必影响痰检工作质量[2]。结合表1和表3可见:存在人员变更的实验室, 在痰涂片制作、痰检结果等方面明显存在不足。 (3) 兼职现象普遍, 全市仅有1名专职人员 (占14%) 。在兼职的情况下特别是只有1名兼职痰检人员的实验室, 痰检人员还要做其他的工作, 很多时候不能及时对痰标本进行有效处理, 严重影响了痰检工作质量。建议各级领导加强认识, 给痰检人员提供安全舒适的工作环境和相应的岗位补贴, 至少保证各结核病实验室配备1名专职痰检人员, 并保持人员的相对稳定。

3.3 生物安全方面。在市级结核病实验室指导下各县级实验室已全部制定了《结核病实验室SOP文件》, 各实验室基本能按操作规程完成各项工作, 但在生物安全方面仍有不足: (1) 各县级结核病实验室均无专用高压灭菌器, 个别实验人员有时实验用品或废弃物未经灭菌直接使用或丢弃; (2) 虽然实验室人员防护用品均有配备, 但大部分痰检人员年龄大, 安全意识差, 以前的一些陋习很难改正:如痰检时不带口罩和手套、室内没有每天消毒、实验完不洗手等;甚至还有一小部分痰检人员习惯在火焰上直接涂片, 这些都大大增加了痰检人员受感染的机会。建议各县加大结防实验室投入, 尽量配齐实验设备, 同时加强生物安全方面知识培训, 尽可能保证痰检人员有一个安全的工作环境。

摘要：目的 了解我市各县 (市、区) 结核病实验室的运转状况, 提高结防机构实验室的工作质量。方法 通过对龙岩市辖区内7个县 (市、区) 实验室20072009年运转状况和痰涂片质量控制3年监测结果进行分析。结果 设备、耗材统一配备数量充足、质量良好;痰检技术人员以兼职为主 (85.7%) , 人员变换率较高 (42.9%) ;痰涂片工作开展良好。结论 各实验室基本情况良好, 但存在很多不足, 提高实验室人员的素质是结核病实验室质量的保证。

关键词：结核病实验室,现状分析,质量

参考文献

[1]赵雁林。痰涂片镜检质量保证手册[M]。北京:中国协和医科大学出版社, 2009。

龙岩市结核病实验室质控效果分析 篇5

1 材料和方法

1.1 材料

2002～2003年与2005～2006年龙岩市结防所对辖区内七个县 (市、区) 痰涂片质量控制汇总表。

1.2 方法

1.2.1 新手册实施前市对县级实验室进行督导方法:

每年二次由县级实验室抽取30张痰片 (阳性片10张、阴性片20张) 送市级实验室进行复验。

1.2.2 新手册方法为:

按中国结核病防治规划《痰涂片镜检实验室质量保证手册》的要求, 对辖区内县级实验室进行一年四次盲法复验和现场督导。

2 结果

2.1 新手册实施后实验室布局、试剂与耗材、显微镜、通风柜和人员培训等方面有明显改善, 主要情况见表1。

2.2 制片质量与评价结果我市从2004年开始实施新指南后, 制片质量明显提高, 但同时发现一些问题:如痰片缺失、定性错误等, 结果见表2。

3 讨论

3.1 新手册实施后所有试剂与耗材均由项目提供

每个县均配置2台显微镜和一台通风柜, 并制定了相应的实验室生物安全程序, 大大改善了结核病实验室的工作条件;县级实验室人员于2005、2006年各参加一次省级和市级培训, 所有实验室人员均培训合格上岗。

3.2 大大完善了室内资料的完整性

新手册实施后, 室内资料的规范与完整是省级和市级疾控机构对县级督导工作的重中之重, 实验室资料包括实验室登记本、室内质控记录、显微镜维护记录、废弃物处理记录、室内消毒记录等, 均未发现缺失。而在实施前仅有实验室登记本。

3.3 大大提高了实验室总体制片质量

阳性符合率98.6%, 阴性符合率100%, 痰细胞、大小、厚薄、染色、脱落符合率分别为97.5%、97%、98%、98.8%、100%, 各项指标均比新手册实施前有了较大提高。

3.4 新方法更能发现下级实验室存在的问题

3.4.1 存在定性错误, 究其原因主要有:

(1) 痰片保存不够规范, 片子未按规定排列或片子未按规定标记; (2) 染色问题:染色液浓度不够或热染时间不够; (3) 读片:读片时不够认真误把杂质当杆菌或视野不够多漏检; (4) 其它:因某些原因 (水分) 造成。

3.4.2 能发现痰检人员的稳定性

辖区内几个县都存在痰检人员不稳定和 (或) 痰检人员不是专人专职, 大部分痰检人员或多或少地兼任其它工作 (如统计、取药、督导等) , 从而影响其实验室工作质量。

3.4.3 痰片保存不规范

实施现场督导发现大部分县都存在痰片缺失现象, 追其原因有: (1) 作假, 盲目地追求高发现率, 以致以阴充阳或无中生有。由此导致出现“高发现率”的现象和统计数字不能真实地反映实际的疫情, 最终导致耐药性涂阳患者增多, 结核病疫情蔓延; (2) 三份痰标本只做一张痰片; (3) 痰片保存不完整。

综上所述, 新质量控制方法更能准确地反映下级实验室的工作质量, 发现其存在的问题, 同时通过加强督导使其能认识到自身的不足而加以改进, 将大大提高我市县级结核病实验室工作质量, 为我市结防工作做出更大的贡献。

摘要：目的评价实施新手册后龙岩市结核病实验室质量控制效果, 发现痰检工作中存在的问题。方法对龙岩市七个县 (市、区) 结核病实验室实施项目前后两年痰涂片质量控制结果进行统计分析。结果实施新手册后龙岩市县级结核病实验室基本达标。结论新质量控制方法更能准确地反映下级实验室的工作质量。

关键词：结核病实验室,痰涂片,质量控制

参考文献

[1]刘剑君, 主编。痰涂片镜检质量保证手册[M]。

结核菌素实验 篇6

1 分期

结核病根据不同的症状, 临床上可以分为早、中、晚3个病症期, 此三期是结核病在治疗前自然发展的临床表现, 不同类型的结核病, 各个病症期的临床症状各不相同, 在众多的结核病中, 结核性脑膜炎是最为严重的一种, 我们以结核性脑膜炎为例来了解一下这3个病症分期[1]。

1.1 前驱期 (早期)

一般见于起病的1~2周, 临床表现为结核中毒症状, 患者可有发热、食欲不振、睡眠不安、头疼、烦躁、精神呆滞等病症, 一般较轻微。

1.2 刺激期 (中期)

这一期间, 患者头疼并且持续加重, 伴呕吐, 多为喷射性呕吐, 感觉过敏, 易激怒, 烦躁或嗜睡交替出现。可有惊厥发作, 但发作后意识尚清, 同时可以出现脑神经麻痹、颅压增高及脑积水以及偏瘫症状。脑脊液呈典型的结核性脑膜炎变化。

1.3 昏迷期 (晚期)

一般为发病后3周之后, 在昏迷期, 上述症状将逐渐加重, 神智开始由意识朦胧、半昏迷而进入昏迷, 阵挛性或强直性痉挛发作频繁, 颅压增高及脑积水症状更加明显, 可呈角弓反张, 去脑或去皮层强直。此时头疼、呕吐可以不显著或者只间断出现, 严重患者最终可因伴呼吸心血管运动中枢麻痹而死亡。

2 治疗

结核病目前治疗手段较多, 其治疗效果主要与以下因素有关[2,3,4]:

2.1 治疗早晚

早期治疗的病例基本可以治愈, 中期治疗的病例病死率为2.3%, 而晚期治疗的病例病死率则高达23.8%。

2.2 年龄

年龄越小, 结核病病症发展越快, 病情越严重, 病死率越高。

2.3 结核菌耐药性

原发耐药菌株感染, 此类菌株感染后的疗效差, 病死率高。

2.4 治疗方法

剂量不足或疗程不够可以使病程迁延、复发, 并出现并发症。

3 临床意义

在结核病的检查中, PPD实验是一种普遍采用的方法。PPD为结核菌纯蛋白衍生物, PPD实验是在受试者的左前臂或右前臂掌面皮内注射6~10mm2皮丘, 48~72h观察局部反应。PPD实验以硬结直径判断反应强度。阳性的局部反应主要是被结核菌致敏的淋巴细胞和巨噬细胞浸润而形成的红肿硬结。PPD实验阳性的程度用“+”表示, 相关临床检测意义如下:

+, 硬结直径5~9mm;++, 硬结直径10~20mm;+++, 硬结直径20mm以上;++++, 除硬结外局部有水泡及坏死。

PPD实验呈阴性:硬结直径<5mm。PPD实验结果具有十分重要的临床意义, 对于结核病的分类和确诊以及后续的治疗都有很强的指导意义, 归纳起来, 主要包含了以下几个方面:

3.1 阳性反应

(1) 卡介苗接种4~8周之后; (2) 已受结核病感染, 但目前尚无活动性病灶; (3) 正在患结核病; (4) 曾患过结核病, 经临床治愈, 但病灶内结核菌尚未全部死亡。

3.2 阴性反应

(1) 未受结核菌感染 (包括卡介苗接种失败) ; (2) 已感染结核而尚未产生变态反应, 即初感染4~8周内; (3) 机体免疫反应受到抑制, 可出现假阴性反应:a.传染性疾病, 如麻疹、百日咳、流感等病毒感染后1个月内;b.严重的结核病如结脑或急性肺结核;c.身体极度衰弱, 如严重营养不良、艾滋病肿瘤晚期;d.长期使用 (6周以上) 免疫抑制剂;e.免疫缺陷病;f.PPD失效或错误注入皮下。

3.3 接种卡介苗或自然感染之后, 结核菌素实验均呈阳性, 但是二者还是存在一些明显差异, 主要有:

(1) 硬结物差异, 自然感染后的直径一般>10mm、质地较硬、颜色深红、边缘清楚, 而接种后的则一般在5~9mm、质地较软、颜色浅红、边缘显得不清楚; (2) 阳性反应差异, 自然感染后每次阳性持续时间会超过7d、消退后有色素沉着及脱屑、同时阳性反应不会减弱, 可持续10~20年时间;而接种后每次阳性持续时间会在3~4d后消退, 同时阳性反应会逐年减弱, 在3~5年之后消失。

结核病作为一种恶性传染病, 经过多年的临床诊治, 相关理论和实践经验有了很大的突破, 相信随着人类医疗技术的进步, 我们诊治结核病的水平一定可以迈上更高的发展平台。

参考文献

[1]Leiner BM, Nielson DL, Tobagi FA.PacketRadio Networks Special Issue[J].Proc.IEEE, 2002, 90 (2) :121-132.

[2]郑少仁, 王海涛, 赵志峰等.结核病的防治[M].北京:人民卫生出版社, 2005:34-45.

[3]秦海.PPD技术在结核病检测中的运用[M].北京:中国人民大学出版社, 2008:11-13.

结核菌素实验 篇7

1 资料和方法

1.1 资料

2007~2009年龙岩市辖区内七个县 (市、区) 一年二次的现场评价结果。

1.2 方法

按照中国结核病防治规划《痰涂片镜检质量保证手册》的要求对各实验室进行现场评价, 详细记录, 并对结果进行分析。

2 结果

2.1 结核病检验实验室人员信息见表1。

由表1可见, 龙岩市辖区内实验室人员整体学历不高 (仅一名大专, 其余为中专) , 兼职现象普遍, 人员较为不稳定。

2.2 房间布局、仪器设备和耗材

龙岩市从2002年开始实行“卫十项目”时就建立了独立的结核病实验室, 所有试剂与耗材均由省参比实验室提供;数量充足、质量良好。

2.3 三年盲法复验结果, 见表2。

由表2可见, 七个县在本级实验室工作中出现29个量化误差、10个定性错误, 但在承担第一复验者的过程中仅9个量化误差且没有一个定性错误。

3 讨论

龙岩市各县 (市、区) 从2002年开始实行“卫十项目”时就建立了独立的结核病实验室。所有试剂与耗材均由省参比实验室提供;每个县均配置了2台显微镜。2005年七个县 (市、区) 均由国家统一配置通风柜, 大大改善了结核病实验室的工作条件, 排除了实验室基础条件对实验过程的干扰。实验室的建立和完善为全市结核病控制工作的开展提供了有力的保证。

盲法复验不是为了验证单个患者诊断正确与否, 而是评价整个实验室操作水平。评价的内容除了涂片镜检结果存在的误差之外, 还包括涂片样品的质量、涂抹的大小和厚度、染色质量如何等, 以便采取纠正措施, 改善实验室工作质量。从表2可见我市各实验室在完成第一复验者工作的过程中没有出现定性错误, 量化误差少, 而在自己本级的日常工作中却出现了多个定性错误, 量化误差也明显增多。究其原因为: (1) 制片过程不认真, 痰膜厚薄不均, 导致褪色不彻底, 影响读片。 (2) 读片时粗心大意, 没有按手册要求的方法和视野数进行, 导致漏看或局限于某一部位。 (3) 检验从业人员不专职, 5个县的检验人员是兼职人员。无力从事结核病门诊检验繁重的工作。同时, 不少实验室的检验人员频繁更换, 实验技能令人怀疑。

结核病控制工作是个系统工程, 只有全社会的参与才能达到控制结核病的目标。目前龙岩市各县结核病实验室的条件只能满足于门诊患者的痰涂片检查。但必须在人员专职、稳定和接受上级技能培训的前提下才能胜任本项工作。因此, 除加强各县实验室硬件建设外, 应加强人员、经费及培训等软件建设的投入, 才能满足结核病控制工作的要求。

摘要：目的 了解龙岩市七个县级结核病实验室质量控制现状, 提高实验室涂片镜检的质量。方法 对龙岩市辖区内七个县级实验室进行三年监测。结果 七个县级实验室布局、设备、耗材基本达标, 20072009年七个县在本级实验室工作中出现10个定性错误, 而在承担第一复验过程中未发现定性错误。结论 七个县级结核病实验室硬件基本能满足痰涂片需要, 人为因素是造成定性错误的主要原因。

关键词：结核病实验室,基层,痰涂片,定性错误

参考文献

[1]赵雁林.痰涂片镜检质量保证手册[M].北京:中国协和医科大学出版社, 2009.

结核菌素实验 篇8

1材料和方法

1.1材料材料来源为全省结核病实验室信息专项调查和日常督导报告信息。

1.2方法

1.2.1调查表设计河南省结核病信息调查表,采取逐级填写信息和报告的方法收集材料[3]。内容包括目前实验室工作人员数量、年龄、学历职称构成、从事专业领域构成、从事专业年限构成、培训情况等。在质量控制方面,对数据出现明显偏离的调查表,即向市级实验室进行询问,核对后重新填写。对没有重新填写的不纳入分析范围。河南省全部18个市级和108个县级结核病实验室填写的材料都收集齐全。

1.2.2日常数据2013年全年开展痰涂片镜检的市、县级实验室盲法复检数据。

1.2.3数据分析数据处理用SPSS11.0软件对收集的数据进行录入和统计分析。

2结果

2.1基本情况河南省结核病实验室网络涵盖省、 市、县三级,省级结核病参比实验室1个设在河南省疾病预防控制中心结核病预防控制所;市级结核病实验室有18个,其中归属独立结核病防治所的6个,归属结核病防治所与传染病医院合署机构的7个,归属疾病预防控制中心的4个,归属传染病医院的1个; 县级结核病实验室108个,其中101个设在疾病预防控制中心,7个设在独立结核病防治所。截至2013年底,省级结核病参比实验室已经具有开展结核杆菌分子鉴定能力,18个市级结核病实验室均开展了药敏试验,108个县级实验室有78个开展了痰培养。

2.2人力资源河南省结核病参比实验室有6位技术人员,其中具有高级职称2人,中级职称3人和初级职称1人;具有博士、硕士和学士学位各2人。18个市级结核病实验室共有65名技术人员,男性17人 (21.65%),女性48人(73.85%),平均年龄35岁,平均从事结核病检验年限12年,平均每个城市拥有检验人员3.6人。65名实验室技术人员中拥有本科学历43人(66.15%),专科学历19人(29.23%);具有高级职称仅1人,中、初级职称26人(41.27%)和38人 (57.14%);65名技术人员中医学检验专业占84.62% (55/65)、专职人员占93.85%(62/65)。65名技术人员中接受市级以上培训的有46人(70.77%),未接受过培训的19人(29.23%)。108个县级结核病实验室共有技术人员197人,男性33人(16.75%),女性164人 (83.25%),平均年龄36岁,平均从事结核病检验年限10年,平均每县有检验人员1.8人。197名技术人员中具有本科学历87人 (44.16%),专科学历97人 (49.24%);高级职称有4人,中、初级职称有44人 (26.51%)和118人(71.08%)。197名技术人员中医学检验专业占56.85%(112/197)、医学非检验专业占35.03%(69/197);主要为专职实验室人员占86.29% 人(170/197),兼职人员占13.71%人(27/197);接受市级以上培训1次者142人(72.08%),未接受过培训的55人(27.92%)。见表1。

2.3仪器设备18个市级结核病实验室主要的设备有显微镜63台 (荧光显微镜12台、LED显微镜5台),平均每个市3.5台;生物安全柜31台,平均每市1.7台;恒温培养箱42台,平均2.3台;18个市装备了23台高压灭菌器;16个市配备了BD960全自动分枝杆菌培养 / 药敏系统和荧光定量PCR仪。108个县级均配备了显微镜、生物安全柜和恒温培养箱,显微镜平均每个县1.9台,但高压灭菌器仅配备了46台。见表2。

2.4试剂耗材省级利用中央转移支付资金以“河南省结核病防治质量控制及耐药检测能力建设项目” 采购了试剂、耗材供全省结核病实验室使用。其中L-J培养基24400套,一线药敏培养基8300套,二线药敏培养基5450套,染色液2500套。其他还有试管架、50孔培养架、痰液消化管、冻存管、一次性无菌吸管、磨菌管、接种棒以及N95口罩等。这些试剂耗材的采购下发保证了全省结核病实验室分离培养和药敏试验工作的顺利开展。

2.5技术培训2013年全省开展了多种形式的技术培训,2013年4月23-25日举办了“河南省2013年结核病实验室网络工作会议暨生物安全、耐药结核病新型检测技术培训班”,2013年5月31日 - 6月19日又利用日元贷款“河南省公共卫生基础设施完善后期培训项目”举办了2期培训班,这三次培训涉及结核病实验室诊断、新检测方法研究进展、实验室生物安全、痰涂片镜检、痰培养、药敏试验技术等方面,并着重从痰培养、药敏试验实践技能方面开展操作培训。2013年9月又下发了“关于开展2013-2014年市、县级结核病实验室技术人员能力培训的通知”,自2013年10月 - 2014年12月对全省市、县级两级结核实验室人员进行现场操作培训,每班4~6名人员, 培训在河南省结核病参比实验室进行。该培训涉及实验室管理、质量控制、生物安全、痰涂片染色镜检、分离培养、传统及快速药敏试验、结核杆菌分子检测技术、结核病免疫学检测技术等等,以操作技能为主,以提高市、县两级实验室人员的实践操作技能。

2.6质量控制2013年河南省按照《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册(200版) 》要求,下发了“河南省疾病预防控制中心关于进一步加强全省结核病实验室网络痰涂片镜检质量保证的通知”,对全省实验室网络开展质量控制。108个县级实验室有8个接受了2次盲法复检,21个接受了3次盲法复检,79个接受了4次盲法复检,省级对39个县进行了督导,在108个县中仅发现有2个涂片低假阳性县。

为对全省药敏试验工作质量进行评价,河南省疾控中心下发了《关于开展2013年结核分枝杆菌药物敏感性试验质量保证工作相关事宜的通知》。2013年全省18个市均开展了药敏试验,其中10个市参加了一、二线药敏熟练度测试、8个市进行了一线药敏熟练度测试,结果有16个市达到了药敏熟练度测试标准,2个市正在进行结果复核。为了保证全省开展结核病分子检测试验质量,2014年1月省结核病参比实验室联合河南省卫生厅临床检验中心对各市级结核病实验室开展“河南省第八期PCR实验室检验人员培训班”,通过培训使得各市级实验室检验人员取得了从事临床基因扩增检验工作的资质。

3讨论

自2001年《全国结核病防治规划(2001-2010年)》颁布实施,至2005年全国范围内成功地实现了DOTS策略[4],但2010年全国第五次结核病流行病学调查显示活动性肺结核病人的患病率下降较缓慢, 活动性肺结核患者中无症状者所占的比例明显的增加[5]。同时,结核杆菌的耐药谱不断地增加[6],结核病疫情特点也发生了很大变化,这对实验室工作提出了新的要求。为适应结核病疫情的新特点,全国结核病防治规划 (2011-2015年) 提出结核病实验室达到2个100%、1个80%的目标,即省级实验室全部具备开展结核杆菌分子鉴定能力,全国市级实验室都能进行药敏试验,80%的县级实验室具备痰培养能力。县级实验室的检测能力由涂片镜检的形态检查方法过渡到标本培养的细菌性分离方法,这将使得全国基层实验室的检测、设备、设施、生物安全及实验室管理水平整体得到提升。全国市级全部开展结核杆菌药敏试验也全方位提升了市级实验室结核病检测能力,将为全国提高耐药结核病人的发现、治疗、管理,以及加强耐药结核病的防治提供坚实的基础。

河南省每年结核病人发现数约占全国的1/10,同时也是耐药结核病的高负担地区。调查显示,全省肺结核病人中MDR-TB为23.3%(1996年)、12.9%(2001年)[7]。河南省的结核病实验室投入还远远不足,特别是人力投入。本次调查显示,市级实验室平均拥有技术人员3.6人 / 市,县级为1.8人 / 县,但县级技术人员的学历水平较低,约一半试验人员为专科学历,非检验人员占到了35%,还有约30%的技术人员尚未接受培训,全省大部分市、县两级实验室人员配置尚未达到国家要求的技术人员数量。

河南省结核病实验室检查主要以涂片显微镜检查为主,按照国家结核病防治规划实验室涂片显微镜检查质量保证手册的要求开展质量控制,2013年全省进行了295次盲法复检,仅2个实验室1次出现了涂片镜检问题。经省级督导,这两个实验室的质量得到了及时纠正,显示了全省整体痰涂片检查工作质量的稳定。

河南省各县均具备了开展分离培养的基础条件, 但尚有约1/3的县级实验室未开展分离培养,主要因为技术人员未接受培训,检测能力欠缺。此外,尚无统一的分离培养质量控制方法,对各个实验室的培养工作质量控制还需要探索,这些都困扰着全省实验室网络建设,使得县级实验室能力达到国家要求尚有一定距离。

结核菌素实验 篇9

1资料与方法

1.1一般资料

收集2014年10月~2015年5月徐州市传染病医院结核科收治的237例患者,分为结核组和非结核组,分别为195例和42例,诊断均符合中华结核病诊治指南诊断标准。 结核组包括: 肺结核组160例,男77例 ,女83例 ,年龄5~78岁 ;肺外结核组35例 ,男22例 ,女13例 ,年龄3~72岁 ,主要包括结核性腹膜炎10例、结核性脑膜炎3例、骨结核3例、淋巴结核6例 、 肠结核7例 、 肾结核3例 、 女性生殖系统结核3例 。 非结核组42例 ,主要是肺炎 、肺癌等患者 ,男26例,女16例,年龄22~83岁。

1.2方法

嘱咐患者清晨嗽口后用力咳出深部浓痰,一式3份, 一份用于结核分枝杆菌(MTB)培养,一份用于痰涂片检查,一份用于Xpert MTB/RIF检测。 标本收集的注意事项:1痰液标本收集以清晨为最佳,因为该时间段患者痰量多,含菌量多;2在医生或护士指导下取样, 不得私自取样;3嘱咐患者漱口3遍以上,以除去浅表固有细菌。 如果患者昏迷或无力咳嗽,不宜收集样本,医护人员应该协助患者采取合适体位,叩背以使痰液松动,再用吸痰器吸引,在吸痰器吸管中段搜集痰液,按吸痰法将痰液吸入集痰器内。

1.3结核感染T细胞斑点(T-spot)、液体培养、XpertMTB/RIF及药敏实验

T-spot实验:采集肝素抗凝外周血5 m L,分离外周单个核细胞(PBMC)放入包被 γ-INF抗体的微孔板,加入结核特异性抗原早期分泌靶向抗原(early se creting antigen target 6 , ESAT - 6 ) 和培养滤 过蛋白 (culture filtrate protein 10,CFP-10)作为刺激原 ,温箱培养24 h后,洗去抗原致敏效应T淋巴细胞,加入生物素标记的二抗,再经酶联显色,在细胞因子分泌的地方形成斑点,通过记录斑点读数检测结核特异抗原致敏效应T淋巴细胞数量。 结果判定:当空白对照孔内斑点数为0~5个时,任一实验孔斑点数减去空白孔斑点数≥6个,结果为阳性;如果空白对照孔斑点数> 6个时, 任一实验孔斑点数≥空白孔斑点数的2倍, 结果同样表明阳性结果;如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时,检测结果为阴性。

液体培养及药敏试验:在Ⅱ级生物安全操作柜中接种环刮取菌落,涂抹至罗氏培养基斜面,旋紧螺旋盖,在涡旋振荡器上振荡10~20 s,制成均匀的菌液。 静置10 min后,用吸管接种约0.1 m L至中性罗氏培养及斜面上。 传代后的培养基放置在36℃培养,每周观察菌落生长情况,于肉眼可见菌落出现后1~2周进行药敏试验。 制备菌液:在磨菌瓶中加入1~2滴10% 吐温-80℃水溶液,用无菌吸管尖端刮取2~3周新鲜菌落,置于磨菌瓶中。 旋紧瓶盖,在涡旋振荡器上振荡10~20 s。 静置5 min,小心打开瓶盖,加入约2 m L灭菌生理盐水,静置片刻,使菌液中的大块物质沉淀。 用无菌吸管吸取上部的菌液,约1 m L,转移到另一无菌试管中,与标准买时比浊管比浊。 逐渐滴加灭菌生理盐水,直至菌液浊与标准麦氏比浊管一致,即得到1 mg/m L的菌液。 接种:在无菌带有螺旋盖的试管中以无菌手法加入2m L灭菌生理盐水备用,每株待测菌准备2管。 菌液静置,带颗粒或菌块沉淀。 用22 SWG标准接种环2满环1 mg/m L的菌液,平移至2 m L灭菌生理盐水中,即稀释成1×10-2mg/m L菌液。 用同样方法再进行100倍稀释,即成1×10-4mg/m L菌液 。 用22 SWG标准接种环分别取1满环1×10-2mg/m L和1×10-4mg/m L的菌液,用划线法均匀接种菌量为1×10-4mg和1×10-6mg。 接种后的培养基直立放置于恒温培养内,36℃培养, 培养4周后报告结果。

标本符合以下特点可直接用于药敏试验:1出现肉眼可见菌落后1~2周的新鲜菌落;2没有其他污染菌共存;3涂片确认为抗酸菌。

Xpert MTB/RIF实验:以1:2的比例,往痰液标本中加入处理液,在涡旋振荡器上涡旋振荡15~30 s,室温静置15 min,使痰标本充分液化。 再将混合液转移至反应盒中,将反应试剂盒放入Gene Xpert仪器(美国Cepheid公司生产)中,按说明书进行检测,约2 h即可读取结果。 结果判断: 依照探针的循环阈值(Ct值),当内对照探针Ct值≤38时为阳性,反之则为无效, 提示标本的DNA提取不合格或含有PCR抑制物。 5个探针中至少2个探针Ct值≤38即为检测到MTB,可进一步按照Ct值对MTB进行半定量。 Ct值< 16为高含量,Ct值为16~22为中等含量,Ct值为22~ 28为低含量,Ct值>28为极低含量。 检测利福平耐药的基础在于MTB特异性分子信标早期Ct值和晚期Ct值之差。 即△Ct值 。 系统设置的结果判断标准为 △Ct>3.5提示对利福平耐药,△Ct<3.5提示对利福平敏感。 由于终止循环数为38个循环,因此当早期探针Ct值>34.5或晚期探针Ct值>38时,利福平耐药结果为不确定。 目前研究表明95%的利福平耐药菌株在rpo B基因81 bp区域(RRDR)存在基因突变。

1.4结果判定

1.4.1痰涂片结果判定按照中国防痨协会基础专业委员会制订的实验室检查规程进行[6,7]。 1抗酸杆菌阴性(-):连续观察300个不同视野,未发现抗酸杆菌。 2报告抗酸杆菌菌素:1~8条/300个视野。 3抗酸杆菌阳性(+):每100个视野发现3~9条抗酸杆菌。4抗酸杆菌阳性(++):每10个视野发现1~9条抗酸杆菌。 5抗酸杆菌阳性(+++):每个视野发现1~9条抗酸杆菌。 6抗酸杆菌阳性(++++):每个视野发现平均10条抗酸杆菌。

1.4.2药敏结果判定 (-):无菌落生长;报告实际菌落数:<50个菌落;(+):50~100个菌落;(++):100~200个菌落;(+++):大部分融合(200~500个菌落);(++++): 融合(>500个菌落)。

1.5统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析,计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。 Kappa>0.4,表示两种实验检验一致性结果较好;Kappa<0.4,表示检验结果一致性较差。 以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1XpertMTB/RIF实验与其他结核检测方法的结果比较

结核组患者Xpert MTB/RIF实验检测敏感性显著高于液体培养(χ2=36.691,P = 0.000)和痰涂片 (χ2= 6.934,P = 0.008),与T-spot比较差异无统计学意义 (χ2=0.347,P = 0.541)。 非结核组4种方法特异性均较高且差异无统计学意义(χ2=0.346、0.346、1.012, P = 0.557、 0.557、0.314)。基于入组情况将患者分为肺结核 、肺外结核进行分析,4种检测方法均表明肺结核组结核分枝杆菌检测敏感性(Xpert MTB/RIF、T-spot痰涂片、 液体培养)明显高于肺外结核组(χ2=8.915、5.880、7.142、 7.457,P = 0.003、0.015、0.008、0.006)。 见表1。

注:与本组 Xpert MIB/RIF 比较,*P < 0.01;与肺结核组比较,△P < 0.05, △P < 0.05;敏感性 (结核组 )=结核组阳性例数/结核组总例数×100%;特(非结核组)=非结核组阴性例数/非结核组总例数×100%

2.2XpertMTB/RIF实验与其他几种检测结果一致性的比较

Xpert MTB/RIF实验与T-spot实验检出结果符合率为86.9%,一致性Kappa=0.737,一致性结果较好;Xpert MTB/RIF实验与痰涂片检出结果符合率为61.2% , 一致性Kappa=0.200, 一致性结果较差 ;Xpert MTB/RIF实验与液体培养检测结果符合率为78.5%, 一致性Kappa=0.563,一致性结果较好。 见表2。

2.3利福平耐药检测结果

在237例可疑结核患者中,液体培养阳性有85例, 9例Xpert MTB/RIF实验检测失败,共76例可进行利福平耐药检测效能分析。 传统比例法药敏实验检测出耐药菌9株,耐药率为11.8%(9/76)。比例法耐药的的患者标本中,Xpert X系统检测出8株为耐药菌,敏感性为88.9%,比例法药敏实验检测敏感菌67例中,有1例Xpert系统检测出为耐药菌 ,特异性为98.5%(66/ 67)。 见表3。

3讨论

我国是世界上22个结核病高负担国家之一,结核病患者数量约500万例,居世界第二位,每年新增患者130万,死亡病例约13万例[8,9,10,11]。 《2011年中国卫生统计年鉴》资料显示,在甲乙类法定报告传染病中, 我国现阶段结核病发病率为74.27/10万,仅次于病毒性肝炎,位居第二,其死亡率为0.22/10万,仅次于艾滋病,亦位居第二,而且发病人群以青壮年为主[12]。 结核病的疫情控制与结核病的早期发现、合理规范治疗、管理密切相关。 尽管结核病的诊断水平有了很大提高,但传统的结核病诊断方法依旧存在很多不足之处,严重影响结核病的诊断工作开展。 Xpert MTB/RIF实验是针对结核分枝杆菌rpo B基因利福平耐药决定区设计引物、探针,检测其是否发生突变[13,14],2 h内即可诊断患者是否感染结核分枝杆菌以 及耐药性情况[15,16]。 本次研究旨在比较Xpert MTB/RIF实验与其他3种检测方法检测结核分枝杆菌的效能,并以药敏实验为金标准,分析其检测利福平耐药的应用价值。

本研究采用可疑结核患者血液、痰标本分别进行T-spot实验 、Xpert MTB/RIF实验 、涂片镜检 、液体培养以及传统比例法药敏实验检测患者是否感染结核分枝杆菌及其对利福平耐药情况。 结果显示,以临床诊断为金标准,Xpert MTB/RIF实验检测结核分枝杆菌敏感性为56.9%,与国内赵冰等[17]研究结果基本一致。 Xpert MTB/RIF实验检测结核分枝杆菌敏感性略高于T-spot实验,明显高于痰涂片镜检、液体培养。 一致性检验结果表明,Xpert MTB/RIF实验与液体培养、T-spot实验检测结果一致性较好。

研究表明将Xpert MTB/RIF实验检测利福平耐药情况应用于耐药高危人群(耐药率>20%)中开展,检测结果更具有价值[17]。 以比例法药敏实验作为金标准,Xpert MTB/RIF实验检测利福平耐药的敏感性为88.9%,特异性为98.5%,与既往的研究[18,19]结果基本一致。但敏感性低于Boehme等[20]研究结果。由于本次研究中76例培养阳性标本进行药敏实验, 耐药率仅为11.8%,目标人群利福平耐药率较低,敏感性过低可能是由于利福平耐药患者过少所致。 因此世界卫生组织建 议如果在 利福平耐 药率较低 人群中应 用Xpert MTB/RIF检测技术检测利福平耐药情况 ,检测结果为耐药,样本仍需采用药敏实验进一步验证Xpert检测结果。

综上所述,Xpert MTB/RIF实验操作简单、检测快速、敏感性高并且对实验室要求较低,因此可以很好的辅助临床医生及时诊断目标疾病,具有一定的使用前景。

摘要：目的 评价利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)实验在结核病诊断中的检验效能。方法收集2014年10月2015年5月徐州市传染病医院的237例可疑结核病患者进行结核菌检测,将患者分为结核组和非结核组,其中结核组195例,非结核组42例。两组患者均行Xpert MTB/RIF实验、T-spot实验、涂片镜检法、液体培养以及药敏实验,以临床诊断为金标准,比较各项检测的敏感性和特异性。结果 以临床诊断为金标准,Xpert MTB/RIF实验检测结核分枝杆菌敏感性为56.9%,T-spot实验、痰涂片、液体培养敏感性依次为53.8%、26.7%、43.6%,Xpert MTB/RIF检测敏感性明显高于涂片镜检(χ2=36.691,P=0.000)和液体培养(χ2=6.934,P=0.008),但与T-spot实验无差别(χ2=0.347,P=0.541)。以传统药敏实验结果作为金标准,Xpert MTB/RIF实验检测利福平耐药的敏感性和特异性分别为88.9%和98.5%。结论 Xpert MTB/RIF实验较传统的结核病实验室诊断方法具有较好的敏感性和特异性,可作为结核病诊断的辅助手段。