猪瘟诊断方法研究

猪瘟诊断方法研究（精选八篇）

猪瘟诊断方法研究 篇1

猪瘟隶属于黄病毒科、瘟病毒属成员，病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，粒子直径为34～50nm，从电镜照片观察，可见病毒粒子表面有脆弱的纤突结构，病毒核衣壳呈二十面体对称，内部核心直径约为30nm。病毒在蔗糖密度梯度中的浮密度是1.15～1.16 g/cm3，等电点是4.8。在脂蛋白囊膜上，存在着病毒基因组编码的囊膜糖蛋白E0(也被称为ERMS)、E1和E2，组成核衣壳蛋白的C蛋白与病毒基因组相连，以维持核酸的稳定性。

2 猪瘟诊断方法研究进展

2.1 猪瘟实验室常规诊断技术

2.1.1 免疫荧光试验

免疫荧光试验(FAT)是猪瘟的常用诊断方法。猪瘟荧光抗体染色技术是将提纯后的抗CSFV抗体IgG标记上荧光物质，制成猪瘟荧光抗体染色试剂。用该试剂去着染猪病料(如病猪扁桃体、淋巴结、肾等)的冰冻切片或触片，然后利用荧光显微镜观察组织细胞内是否有亮绿色荧光。如果被观察的组织细胞内有亮绿色荧光，就是猪瘟病毒荧光抗体染色阳性，说明被检病料中有CSFV感染。反之，被观察的组织细胞内没有亮绿色荧光，就是猪瘟病毒抗体染色阴性。

利用荧光抗体技术检测病猪内脏器官可能存在的CSFV，对CSF的早期诊断具有十分重要的意义。猪瘟荧光抗体染色技术在CSFV感染早期检出率较高，不仅能检出强毒抗原，还能检出低毒力病毒感染的带毒母猪，猪瘟的常规诊断需要4～5 d，而该项技术可在12 h内作出判断，既快速又客观、准确，在规模化猪场临床上得到了广泛应用。所以目前许多规模化大猪场利用荧光抗体染色技术，有计划地对猪场进行猪瘟净化。

Robert son等首次将FA运用于猪瘟病料和组织培养物的检测。张淑霞等从抗猪瘟高免血清中提取IgG，标记荧光素(FITC)，制备出了猪瘟荧光抗体(CSFV-FA)。该抗体能够检测人工感染猪扁桃体中的病毒抗原，而且这种荧光反应能够被抗CSF高免血清特异性抑制。应用CSFV-FA可在病死猪的扁桃体、脾、肾、回肠末端等器官的触片或冰冻组织切片中发现病毒抗原，也可先将可疑病料经无菌处理后接种于细胞培养物，随后再用CSFV-FA检测出感染细胞中的猪瘟病毒抗原。FAT法简单、快速、可靠，许多国家将它作为执行猪瘟消灭计划的法定诊断试验。

2.1.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)具有高度敏感性和特异性，而且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害，特别是商品试剂盒和自动化仪器的应用，使其成为一种适用于各级检验部门的免疫标记技术。随着检验医学的不断发展，酶联免疫测定的技术方法也得到发展和更新，Dot-ELISA、发光酶联免疫测定、免疫印迹法、BAS-酶联免疫吸附试验等方法都不断得到应用。

周宗元等应用猪瘟兔化弱毒PEG沉淀抗原和HRP-SPA建立了HRP-SPA-ELISA检测CSFV抗体的方法，通过对5份阴性血清和32头仔猪注射疫苗前后不同时期的256份血清进行检测，证明本法有较高的敏感性和特异性。余兴龙等以在大肠杆菌中高效表达的CSFV的E2基因产物为抗原，以HRP标记的的兔抗猪IgG为二抗，建立了检测CSFV抗体的间接ELISA方法，结果表明用E2基因产物蛋白作为诊断猪瘟的抗原，具有特异性高、易纯化和成本低等特点。陆芹章等(2004)制备了猪瘟单克隆抗体，以ACI-ELISA法检测CSFV，并用PCR方法作比较，结果表明30份猪瘟阴、阳性病料的ACI-ELISA试验结果与PCR检测结果相符，本方法与动物接种、免疫荧光、血清中和等CSF常规诊断方法比较，更加快速、准确、经济，且一次可检测大量样品，同时比PCR方法耗时短、费用低，便于推广。陈振海(2005)等以CSFV GST-Erns融合蛋白作抗原进行间接ELISA，结果表明用该方法检测CSFV抗体具有很高的特异性和敏感性。

目前，已有很多采用基于中和性单抗的竞争ELISA方法来检测某些病原中和抗体的报道，说明利用CSFV中和性单抗作为竞争抗体检测CSFV中和抗体是可行的。梁冰冰等利用杆状病毒表达猪瘟病毒(CSFV)，以重组E2蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的E2蛋白中和性单克隆抗体作为竞争抗体，建立了一种用于检测CSFV中和抗体的重组E2蛋白竞争抑制ELISA(CI-ELISA)方法，该法操作简便、快速，适于现场应用，同时具有一般ELISA的操作优点，可以用于大量现场样品的检测和流行病学监测。

2.2 分子生物学诊断方法

2.2.1 常规反转录-聚合酶链反应

聚合酶链反应(PCR)技术的建立带动了分子生物学的飞速发展，应用反转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)成功测定了多株CSFV的全基因序列，为猪瘟的致病机理、免疫机制、检测防控提供了坚实的基础。因为在临床检测中要经常检测RNA病毒，而通常所用的PCR试剂盒是DNA聚合酶，不能以RNA为模板直接扩增，故在进行PCR前，先将病毒RNA逆转录为cDNA，所以建立了RT-PCR技术。随着人们对CSFV分子生物学研究的深入，尤其是对CSFV Alfort株和Bresica株基因组全序列的成功测定，使得RT-PCR技术在CSFV的研究中被广泛应用。RT-PCR作为检测CSFV的一种方法，其特异性强、灵敏度高、重复性好，操作也很简单，整个过程在1 d内即可完成，能达到快速检测的目的，并且适合于各种含毒材料的检测，也可用于临床。此外，RT-PCR技术还可区别与CSFV相关的病毒，如BVDV，以及能引起和CSF相似临床症状的猪病病毒，如亚洲CSFV、伪狂犬病病毒，其灵敏度可达100%。

2.2.2 实时荧光定量PCR技术

荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术，因其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为核酸检测中的重要工具。它是在常规PCR引物之外加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。该技术的研究也逐渐成为猪瘟诊断方法研究的方向。由于实时定量荧光PCR仪可以同时检测多种荧光，因此可以进行多重检测，即在同一个反应体系中，将不同探针标记上不同的荧光基团，这样就可以同时检测多种疾病的病原，这也是疫病诊断的一个研究方向。Risatti等(2003,2005)建立了一种实时荧光定量RT-PCR方法检测CSFV，并与病毒分离作了比较，证明其敏感性高于病毒分离(100%/72.4%)，特异性略低于病毒分离(98.9%/100%)。日本学者Ophuis等(2006)应用荧光定量RT-PCR方法对攻毒猪各组织脏器中的病毒进行了检测，结果发现早在攻毒后1 d就在扁桃体中检测到了病毒的存在。Cho等应用不同荧光基团标记的两条TaqMan-MG探针建立了一种能鉴别韩国CSFV野毒株和LOM疫苗株的荧光RT-PCR方法。

2.2.3 核酸探针技术

核酸探针技术是在分子标记的基础上，以病毒RNA基因组为模板制备探针，在cDNA合成之后，进行Southern blot，特异的核酸探针会在不同病毒基因组cDNA上产生特异的条带。此方法具有特异性强、准确可靠的优点，但诊断费用较高。此法可用于不同毒株的分离和鉴定。Cruciere等、Dable等、Colijn等利用CSFV基因组RNA构建cDNA，与BVDV进行序列分析和比较，合成了6个探针，按照它们在病毒基因组的位置，根据特异的杂交条带可以区别CSFV、BVDV和BDV。我国赵启祖等研制了石门血毒P80核酸探针，可对病毒RNA进行定量检测，灵敏度达220 pg。核酸探针技术有特异性强、准确可靠的优点，但需要合成核酸探针，诊断费用较高。

2.2.4 基因芯片检测技术

基因芯片是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术，在基因表达谱、功能基因组、疾病基因诊断等基础研究及临床应用中已经显示出重要的理论意义和广泛的应用前景。它被誉为又一次生命科学领域的革命，世界各国争相投入研究。

基因芯片是指在一个很小的表面，通常是硅化玻璃，覆盖上成千上万的寡核苷酸，每一个固定在芯片上的特定位置都可以找到这个点，每个寡核苷酸反应芯片上有成千上万的拷贝互补信息，包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因组芯片，主要目标是用于DNA序列的测定、病原检测、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析，以及基因组的功能研究等。基因芯片技术为动物疾病诊断提供了新的技术理念，出现可以替代传统方法的新技术，并形成新产品。目前，我国也正在研究应用基因芯片检测技术来诊断猪瘟，这将对我国猪瘟的防控具有深远意义。

3 结语

我国现阶段CSF流行形势复杂，没有明显规律性，CSF仍是我国动物疫病防制的一大难题，防控任务艰巨。在目前已有的检测手段中，分子生物学方法高度灵敏特异，且检测迅速，十分适合大面积检测，有着不可替代的优势。分子标记疫苗一旦成熟，血清学方法就能够进行鉴别诊断，ELISA方法也具有广阔前景。基因芯片诊断技术是一种高效、灵敏和特异性好的诊断技术，在不久的将来将会广泛应用于猪瘟诊断。

摘要：猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、发热性、接触性传染病,可引起各种年龄猪发病。随着对猪瘟病毒研究的深入,猪瘟在一定程度上得到了有效控制。但是近年来,世界各国流行的猪瘟在流行病学、临床症状和病理变化等方面出现了一些新的变化,猪瘟的防控出现了许多新的情况。我国猪瘟的发病率亦呈上升趋势,严重威胁着我国养猪业的发展,给养猪业造成了极大的经济损失。因此,建立准确的实验室诊断方法,对于预防和控制猪瘟有重要意义。本文综述了猪瘟诊断技术方面的研究进展,为猪瘟的及时诊断提供参考。

猪瘟的诊断与防治 篇2

1.临床症状

猪瘟潜伏期一般为5～7天，根据病情和病程，在临床上可将猪瘟分为4种病型，即最急性、急性、慢性和温和型四种类型。通常体温升高的病猪，血液中白细胞明显减少。

1.1最急性型 猪发病后病猪常无明显症状，突然死亡，一般出现在初发病地区和流行初期。潜伏期短，一般为2～3天，突然发病，表现为高热稽留，体温升高，全身痉挛，四肢抽搐，四肢末梢、耳尖和黏膜发绀，全身多处有出血点或出血斑，很快死亡。病程一般不超过5天。

1.2急性型 病猪精神差，发热，体温在40℃～42℃，呈现稽留热，喜卧、弓背、寒颤及行走摇晃。食欲减退或废绝，喜欢饮水，有的发生呕吐。结膜发炎，流脓性分泌物，将上下眼睑粘住，不能张开，鼻流脓性鼻液。初期便秘，干硬的粪球表面附有大量白色的肠粘液，后期腹泻，粪便恶臭，带有粘液或血液，病猪的鼻端、耳后根、腹部及四肢内侧的皮肤及齿龈、唇内、肛门等处粘膜出现针尖状出血点，指压不退色，腹股沟淋巴结肿大。公猪包皮发炎，阴鞘积尿，用手挤压时有恶臭浑浊液体射出。小猪可出现神经症状，表现磨牙、后退、转圈、强直、侧卧及游泳状，甚至昏迷等。

1.3慢性型 多由急性型转变而来，体温时高时低，食欲不振，便秘与腹泻交替出现，逐渐消瘦、贫血、衰弱，被毛粗乱，行走时两后肢摇晃无力，行走不稳。有些病猪的耳尖、尾端和四肢下部成蓝紫色或坏死、脱落，病程可长达一个月以上，最后衰弱死亡，死亡率极高。

1.4温和型 又称非典型猪瘟，主要发生较多的是断奶后的仔猪及架子猪，表现症状轻微，不典型，病情缓和，病理变化不明显，病程较长体温稽留在40℃左右，皮肤无出血小点，但有淤血和坏死，食欲时好时坏，粪便时干时稀，病猪十分瘦弱，致死率较高，也有耐过的，但生长发育严重受阻。

2.猪瘟的诊断

猪场一旦发生猪瘟，应迅速做出诊断。猪瘟的病情复杂，病变多种多样，而且易与其他传染病混合感染，给诊断增加许多困难。及时做出正确诊断，必须采取多种诊断方法。

2.1病理剖解诊断 急性猪瘟主要呈败血症变化，有诊断价值的变化是：皮肤或皮下有出血点；颚凹、颈部、鼠蹊、内脏淋巴结肿大，呈暗红色，切面周边出血；肾脏色淡，不肿大，有数量不等的小点出血；脾脏边缘梗死；喉头黏膜、会厌软骨、膀胱黏膜、心外膜、肺及肠浆膜黏膜有出血。慢性病猪特征的变化是盲肠、结肠及回盲口处黏膜上形成扣状溃疡。

2.2临床诊断 在规模化猪场，如猪群中先后或同时有几个或更多的病猪出现高热不退，精神高度沉郁，食欲减退，全身衰弱，后躯无力，粪便干燥，后期拉稀，呈黄色、绿色不等，有时带血，皮肤的薄皮有出血点，耳朵发紫，死亡率较高，可初步判断为疑似猪瘟。

2.3尸体剖检 典型猪瘟病理解剖学变化在现场即可做出正确判断，如见全身淋巴结呈现出血性淋巴结炎，切面呈大理石样外观，皮肤有出血斑点，肾贫血有点状出血，脾不肿大，有出血梗死，膀胱、喉头粘膜及心外膜和胃肠浆膜有出血点。慢性型猪瘟大肠有扣状肿，然后结合临床流行病学调查进行分析，通常可做出诊断。

2.4动物接种试验 易感猪接种是检测猪瘟病毒的最敏感方法。采取发病猪的血液或病死猪的淋巴结、脾脏、扁桃体等组织制成乳剂，无菌处理后接种易感猪（10～20kg），观察发病情况，然后再分离病毒。通常采用兔体交叉免疫试验。

2.5检测血清抗体 检测血清抗体可为猪瘟免疫提供依据，特别是酶联免疫吸附试验对检测非典型猪瘟和温和型猪瘟有重要作用。

2.6检测猪瘟病 直接免疫熒光抗体技术是检测猪瘟病毒的一种快速诊断方法，该方法是采取猪的扁桃体或者猪肾、脾等组织做冰冻切片或触片，经丙酮固定，荧光抗体染色，在荧光显微镜下观察，如果这些组织细胞内发现有亮绿色荧光，说明细胞内存在猪瘟病毒，即可诊为猪瘟。

3.猪瘟的防治

3.1加强饲养管理 加强饲养管理和卫生工作十分重要，尤其是规模化猪场，舍内需定期大消毒，粪肥指定地点生物热处理，以减少猪瘟病的传播机会。凡确诊为猪瘟和带病毒的猪一律扑杀销毁且深埋，严重的可做群体销毁处理，避免加剧猪瘟的传播。同时，应严格消毒病猪地和圈舍，并空圈3个月以上，在此期间，每20天进行一次严格的消毒，确保养殖环境的净化和安全，获得有效地防疫效果。

3.2制定合理的免疫程序和科学的免疫剂量 根据猪场（户）的不同，制定适时的免疫时间和适当的免疫程序。通常，春季免疫应在2月末至3月初进行。秋季免疫应在10月底前。仔猪断奶首免日龄应该是20日龄，二免加强免疫在55日龄以内完成。免疫剂量必须保证400个以上的RID（即至少5倍）。

3.3做好外引猪的免疫工作 加大对个体养殖户的猪瘟综合防治的宣传指导工作，注意加强外引猪的检疫工作，预防外源性带毒猪。近年来，外引猪数量明显增多，特别是每年的春季，大量仔猪刚刚断奶，不明免疫状态的猪从不同地区、不同渠道运往各养殖场所，市场交易无任何防控措施，很容易将猪瘟疫病带进猪场，养殖户引进猪源后无隔离观察概念。带毒猪混群后即感染发病。这样的饲养群体遍布各地，也是发病率最高，控制猪瘟难度较大的群体。要使这样的养殖场（户）能较好地控制猪瘟，必须在这一部分下大力气做深入细致的工作。建议应制定断奶猪先免疫后交易的制度，避免因路途运输等应激因素造成猪免疫下降，以保证饲养占有量很大的中、小型饲养场（户）免受外引猪带毒现象，并能减少补针数量，提高猪群的免疫密度。

3.4加强种猪的猪瘟免疫监测工作 加强大型猪场的管理，检查淘汰猪瘟及带毒母猪是大型猪场控制和消灭猪瘟的重要手段之一。对流产胎儿和哺乳期疑似猪瘟的带毒母猪进行淘汰处理，强化免疫力度，并加强综合防治措施，坚持自繁自养，净化种群。总结推广大型场防治经验，有计划、分批次地向中型场推广。以点带面，渐进性进行猪瘟净化和控制工作，逐步规范落实猪场管理方案和防疫规程。

3.5结合治疗进行全群预防 强化春秋两季社会散养猪的猪瘟免疫密度，增强防疫意识，适时补针。发现疫情及时处理，严格隔离，及时采用应急措施，本着“免疫与治疗同时进行”的原则，对于发病猪群和亚健康猪群使用科丰清瘟败毒散（或青蓝黄明散）进行全群的预防和治疗。对于病重者，可采用科丰转疫肽（或科丰黄芪毒清、科丰抗感解毒等）进行注射治疗，当基本上控制了全群的疾病的发展势头后适时的进行一次加强免疫，以便彻底控制该病。

4.猪瘟发病场的紧急控制措施

猪瘟检测方法研究进展 篇3

1病毒分离

病毒分离是体外检测感染性猪瘟病毒最特异的方法, 被认为是确诊猪瘟的“金标准”。病毒可以从组织、全血中分离, 但是对于猪瘟的早期诊断, 全血或血浆比白细胞更为敏感。最常用于猪瘟病毒分离的细胞为猪肾细胞系 (PK15或SK6) 或猪睾丸细胞 (ST) 。虽然病毒分离和鉴定周期长、操作繁琐、对操作者技术要求较高, 但在猪瘟爆发时它仍然是对猪瘟进行确诊的必不可少的检测方法。

2血清学诊断

目前最常用的检测猪瘟病毒的血清学方法有病毒中和试验、琼脂扩散试验、补体结合反应试验、间接血凝试验、ELISA、免疫荧光试验, 其中酶联免疫吸附试验 (ELISA) 以其敏感、准确、快速、简单等优点已经成为国内外动物疫病常规的诊断技术, 是进行大规模样品检测的优选方法, 结合单克隆抗体应用使其具有更大的优势。

1990年Leforban等建立了一种ELISA方法, 能够区分BVDV、BDV以及CSFV抗体。这个方法对于BVDV/BDV高流行地区CSFV的检测非常有意义。

2006年刘建文等用纯化的3株CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6直接包被酶标板, 然后用纯化兔抗CSFV Ig G作为第二抗体建立了AC-ELISA方法, 保证了方法的特异性和敏感性, 而且操作便捷、省时, 易于推广。

3分子生物学诊断

近年来, 分子生物学检测技术中PCR技术发展迅速, 该技术应用于猪瘟病毒的检测, 使猪瘟的检测变得快速、准确, 其中有反转录-聚合酶链式反应 (reverse transcrip-tion-polymerase chain reaction, RT-PCR) 、巢式PCR (nest-PCR) 、荧光定量PCR (FQ-PCR) 、多重PCR (Multiplex-PCR) 、环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 。PCR技术越来越多的应用于CSFV间以及CSFV与其它瘟病毒的检测与鉴别诊断。

2001年Barlic-Maganja等建立了检测并鉴别BVDV和CSFV的单管单酶RT-PCR诊断方法, 缩短了检测时间, 提高了病毒的检出率。

2006年李艳等人利用猪瘟病毒基因组5′端相对保守, 但包含强毒与弱毒的差异性位点, 可以作为强毒与弱毒分子鉴别诊断的靶区域, 建立了一种能快速区分猪瘟强毒和弱毒的特异而敏感的RT-复合套式PCR (RT-n PCR) 分子鉴别诊断方法, 可对猪瘟病毒感染进行早期快速准确诊断, 从而防止猪瘟感染的蔓延, 并及时发现新的猪瘟病毒流行毒株, 为制定猪瘟防制策略提供了依据。

2007年朱小甫等根据Shimen株 (AF092448) 基因序列设计了2对引物, 优化了猪瘟病毒 (CSFV) 的RT-nested PCR检测方法, 并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。经实验检验优化的检测方法灵敏度高, 特异性强。

环介导等温扩增方法是日本学者Notomi等在2000年发明的一项恒温核酸扩增新技术, 该技术特异性强、灵敏度高、成本低廉、不需要PCR仪, 仅需要一个恒温水浴锅即可完成核酸的扩增, 特别适合基层部门应用。2009年Chen等利用RT-LAMP、RT-PCR和常规病毒分离方法检测猪瘟疑似病例血液、扁桃体样本中的CSFV, 结果CSFV的阳性率分别为89%、78%及71%, 与RT-PCR和常规病毒分离方法比较表明RT-LAMP方法具有高度敏感性。

2007年史子学等建立了一种CSFV两步法荧光定量RT-PCR检测方法, 参考涵盖CSFV三个基因型的25株CS-FV基因组5′NTR序列设计了一对简并引物和一条TaqMan探针, 引物、探针序列和参考的25株CSFV毒株的相应序列完全匹配。并且所检测的54份阳性CSF临床样品中所含病毒株属于CSFV基因1.1、2.1、2.2、2.3亚型, 表明建立的荧光定量RT-PCR方法可以特异的检测较广的CSFV基因。现在荧光定量PCR还没有成为OIE认可的CSFV检测标准方法, 但是随着荧光定量RT-PCR方法在CSF临床病料检测方面的不断应用, 荧光定量RT-PCR方法将会成为在CSF流行病学调查上使用的可靠方法。

综上所述, 病毒分离存在诊断周期长、操作繁琐、检出率低等缺点;常规的血清学试验又都存在一定的血清学交叉反应;抗原抗体反应的检测技术敏感性不够高、检出时间晚, 有一定的局限性, 荧光定量PCR, 敏感性超过病毒分离, 特异性略低于病毒分离, 经研究人员比较RT-n PCR的检出率最高, 表明RT-n PCR是CSFV感染早期诊断的最好方法。可以看出分子生物学技术手段将越来越多的被应用于猪瘟病毒的诊断中。

摘要：猪瘟是一类具有高度危害性的传染病, 主要流行于亚洲、欧洲、南美洲, 是世界养猪业最重要的疫病之一。随着检测技术的发展, 猪瘟检测的手段也越来越多, 作者就目前猪瘟检测手段加以综述。

关键词：猪瘟,诊断

参考文献

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猪瘟疫苗免疫程序与方法研究剪辑 篇4

目前国内还没有统一的CSF免疫程序。目前多数猪场采用仔猪、育肥猪20~28日龄首免和60~70日龄二免, 种猪每年2次免疫的免疫程序 (母猪的免疫应避开配种和妊娠期, 以免引起胎盘感染) 。林毅等采用Dot ELISA检测猪瘟母源抗体消长规律和4种猪瘟免疫程序 (超前免疫组:新生仔猪在吃初乳前接种2头份猪瘟单价疫苗, 注苗后1h让其吃初乳;超前并加强免疫组:按超前一次免疫后, 45日龄用2头份三联苗加强免疫;20日龄首免2头份猪瘟单价苗, 60日龄二免2头份三联苗组。28日龄首免猪瘟单价苗, 70日龄二免三联苗, 又分为1头份和2头份免疫组的免疫效果。结果, 在7、14、21、28和35日龄时猪瘟母源抗体阳性串分别为80.0%、60.0%、33.3%、13.4%和6.7%, 其抗体效价几何平均值 (CMT) 分别为1∶88、1∶69、1∶59、1∶40和1∶35。4种免疫程序的猪瘟抗体检测结果为, 超前免疫和超前井加强免疫2倍量猪瘟单价苗, 在6月龄时, 其抗体阳性率分别为85%和80%, GMT分别为1∶105和1∶85。20日龄首免2倍量猪瘟单价苗后, 60日龄二免2倍量猪瘟-猪肺疫-猪丹毒三联苗, 在60日龄和6月龄时, 抗体阳性率分别为90.0%和87.0%, GMT分别为1∶135和1∶103。28日龄首免猪瘟单价苗, 70日龄加免三联苗, 免疫1头份和2头份组在65日龄时, 阳性率分别为78.0%和92.0%, 6月龄时分别为73.0%和86.0%。结果表明, 免疫2头份比1头份的效果好, 4种免疫程序的效果都较理想。吴楚泓 (2000) 在广东广三保养猪公司的试验结果表明, 在无猪瘟流行的地区, 仔猪在65日龄时进行一次性大剂量 (5头份) 免疫, 抗体有效效价高于2次免疫猪 (35日龄首免3头份, 65日龄二免5头份) , 与2次免疫相比, 既节省免疫费用, 又可获得较好的免疫保护力。蔡葵蒸等 (2002) 试验指出, 在猪瘟威胁区, 免疫母猪所产仔猪以28日龄首免4头份疫苗, 55口龄二免2头份疫苗的免疫程序效果较为可靠。

2 乳前免疫

乳前免疫也称零时免疫、超前免疫 (简称“超免”) , 即仔猪出生后去除体表黏液, 颈侧消毒后肌肉注射猪瘟兔化弱毒苗, 与母猪隔离一段时间后再吃初乳的免疫方法。乳前免疫的一般做法是仔猪出生后肌肉注射猪瘟疫苗1头份, 2~4 h后吃初乳。关于乳前免疫的主要争论在于注射疫苗后吃初乳的时间问题。衣翠玲 (2002) 试验结果表明, 初生仔猪接种疫苗后间隔60~120 min吸吮初乳的免疫效果最好。罗才文等将仔猪出生后立即与母猪隔开, 肌肉注射猪瘟疫苗1头份, 注苗后2小时哺初乳;对照组注射1ml生理盐水。超前免疫组仔猪猪瘟的发病率为6.48%, 死亡率为4.20%;对照组仔猪猪瘟发病率为78.37%, 死亡率为62.16%。超前免疫组仔猪育成率为95.80%, 对照组仔猪育成率为37.84%, 仔猪断乳平均体重免疫组比对照组高出1.4 kg。张银河等认为新生仔猪进行猪瘟超前免疫时, 应选择在接种后60 min吃初乳为最佳时间。顾春海等认为仔猪超免猪瘟疫苗1头份, 30 min之后吃初乳的效果好。于泰 (1989) 等进行的超免研究发现:仔猪注射猪瘟兔化弱毒苗1头份, 3 h后吃初乳的免疫方法, 对仔猪猪瘟的保护长达1年。早期的超免研究多认为一次超免即可提供对猪瘟的终生保护。林毅等在超前免疫后180 d, 检测猪瘟抗体的阳性率为85%, 据此认为一次超免可保证绝大多数猪出栏。但许多学者认为这种做法是危险的。因为一旦猪群中存在猪瘟强毒, 将会迅速增殖蔓延, 造成恶果。近年来的实践越来越支持加大超免剂量和进行加强免疫的免疫方法。何存利 (1998) 等进行了仔猪猪疽免疫程序的研究。他们建立的乳前免疫方法是:初生仔猪注苗2头份, 2 h后放回母猪身边吃乳。试验表明, 150日龄时超免仔猪血清阳性率仅73.68%, 已不能对猪群提供全程保护。在猪瘟疫区和受威胁区, 采取乳前免疫和常规免疫相结合的方式, 才能确保猪群免遭猪瘟侵袭。他们还发现, 通过加大免疫剂量来中和残余母抗的方法, 常规免疫就能起到很好的效果;张曹民电认为只要解决好母源抗体干扰的问题, 不必在所有的猪场都施行超前免疫。朱建国等的试验支持超前免疫后进行加强免疫的做法, 他们认为首免为超免、二免在30~35日龄的猪瘟免疫程序在猪瘟流行区切实可行;王红宁等在四川南充、内江和成都等地规模化猪场的试验表明, 超前免疫预防猪瘟的效果良好, 他们推荐的免疫程序为:超前免疫2头份, 6月份加强免疫1次。此外, 胡薛英、郭金海、王世权等均有超前免疫后需做2次免疫的报道。

3 大剂量免疫

除了免疫时间以外, 免疫剂量也是影响免疫效果的一个重要因素。近年来, 按照常规剂量免疫, 抗体效价低, 维持时间短, 有些地方和猪场采用2头份、4头份, 甚至6头份剂量免疫, 则可以达到较好的免疫效果。采用大剂量猪瘟疫苗接种可以在最短的时间内激发机体的免疫防御系统, 从而对抗病原的进一步侵入。丁国华等在室内、室外分别对猪接种不同剂量的猪瘟兔化弱毒疫苗和牛睾丸细胞苗, 免疫期106~130 d攻击石门系猪瘟强毒, 室内接种组攻毒结果:猪瘟弱毒苗头剂量0.5 m L 150个免疫量, 保护率100% (5/5) ;头剂量1.0 m L 150个免疫量, 保护率100% (5/5) ;头剂量1.0m L 300个免疫量, 保护率100% (4/4) ;牛睾丸细胞苗头剂量0.5 m L 300个免疫量, 保护率100% (4/4) ;室外接种组攻毒结果:猪瘟弱毒苗头剂量0.5m L 50个免疫量, 保护率25% (1/5) ;头剂量1.0 m L 150个免疫量, 保护率80% (4/5) ;攻毒对照猪发病4/4, 死亡3/4。试验证明室外接种0.5 m L 150个免疫量, 保护率极低。张须庄等 (2000) 通过不同剂量猪瘟疫苗抗体检测试验研究认为强化母猪猪瘟免疫, 于配种前7~15 d肌注4~5头份猪瘟细胞苗, 才能保护仔猪在哺乳期的安全。仔猪应在20~25日龄防疫注射3~4头份猪瘟细胞苗, 必要时两个月后再加强免疫一次。蒋冬福等建议各地根据猪群母源抗体的水平, 适当加大免疫剂量, 母源抗体高的猪群可用到每猪4头份, 反之则用2头份。张苏强 (2001) 报道, 采用母猪免疫宜在哺乳后期和断乳时, 避开配种和怀孕期, 免疫剂量为4头份/头。种公猪, 每年3、9月份各接种一次, 4头份/头。新生仔猪未吃初乳时, 首免:2头份/头 (注苗2 h后吃初乳) , 70日龄二免, 4头份/头, 发现疫情后实行超剂量免疫, 立即对全场所有猪实行猪瘟兔化弱毒疫苗超剂量接种8头份/头。谭海等 (2003) 使用猪瘟弱毒疫苗, 每头猪在初乳前接种1头份、25日龄接种2头份、60日龄接种3头份, 以后每年的3月、9月各接种4头份, 如果全群种猪进行紧急免疫, 每头接种4头份, 可以有效控制猪瘟的发生和流行, 黄鉴明 (1995) 在母猪配种前2~3周接种4头份猪瘟疫苗有效防止了繁殖障碍型猪瘟的发生。隆先觉按体重计算用苗头份, 10~30 kg体重的猪瘟发病组首次接种5~15头份、次日再接种5~15头份可以有效治疗猪瘟, 初发病病猪康复率高达86.1%, 对假定健康猪接种5头份, 保护率达100。

但也有试验证明无须增加疫苗剂量, 金柏新等试验证明仔猪30日龄每头注射猪瘟疫苗1头份剂量, 30日龄第二次加强免疫注射1头份剂量的情况下, 至180日龄时仍具有保护力。在30和60日龄同样进行二次免疫, 而每次增加疫苗头份量, 未见有增加抗体效价的作用, 1头份与2头份、4头份间无显著性差异, 因而认为在猪瘟免疫中, 没有必要增加剂量。

4 免疫增强剂辅助免疫

由于种种原因, 在生产中采取乳前免疫或加大免疫剂量的免疫方法, 仍然有抗体水平未达到最低保护线 (1∶32, IHA法) 的猪只存在。为此通过使用免疫增强剂的途径来提高动物免疫力, 提高猪瘟的免疫效果的研究成为猪瘟防制的热点之一。

猪瘟诊断方法研究 篇5

目前国内外检测猪瘟的方法较多, 但大多不是国际兽疫局 (Office International des Epizooties, OIE) 推荐的国际贸易动物疾病诊断方法[3]。病毒分离是最具敏感性和特异性的检测方法。猪瘟常规试验室诊断方法有冰冻组织的直接荧光抗体试验、抗原捕获酶联免疫吸附实验 (ELISAs) , 以及各种以PCR为基础的检测猪瘟方法等。本实验室通过猪瘟ELISA试剂盒测定其抗体的水平, 并对抗体水平进行分析, 制定相应的猪场猪瘟防控措施, 并将猪瘟抗体检测结果表现为不合格的猪进行再次加强免疫并及时检测, 淘汰免疫耐受猪, 通过对当前猪瘟流行病学, 免疫机理, 免疫程序, 制定出科学、适用的综合防控措施, 以促进猪瘟的控制和扑灭, 从而达到猪瘟净化的计划。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 血清样品

釆集吉林省规模猪场的各阶段的猪群的血样 (均在免疫后21 d采集) , 对采集好的样品血清做好标记, 并进行登记, 然后按照常规的方法分离血清并置于-20℃的冰箱中保存, 等待检测。

1.1.2 诊断试剂

猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒 (北京爱德士元亨生物科技有限公司) 。

1.2 方法

1.2.1 操作步骤

使用前所有试剂应恢复至室温 (25℃) , 试剂应轻轻旋转或振荡混匀。

1取出抗原反应板 (根据样品多少, 可拆开分次使用) , 在记录表上记录阳性对照、阴性对照和样品的位置;

2分别在相应孔中加入阳性对照 (2孔) 和阴性对照 (2孔) 原液 (不用稀释) 、稀释好的待检猪血清各100μL。充分混匀后, 贴上封板膜, 置37℃孵育1 h;

3小心揭掉封板膜, 弃去各孔中液体、拍净。每孔加满洗涤液, 静置约30 s, 重复洗涤5次, 最后在吸水纸上拍净;

4每孔加入酶结合物液100μL, 贴上封板膜, 置37℃孵育30 min;

5重复步骤3;

6每孔加入底物液A50μL, 再加入底物液B50μL, 轻轻振荡混匀, 置37℃避光显色10 min;

7每孔加入终止液50μL, 轻轻振荡混匀, 置酶标仪450 nm波长处测定各孔OD450值。

1.2.2 判定标准

按照产品说明书操作进行结果判定:

试验结果同时符合下列条件, 方为有效:

1两孔阴性对照OD450平均值应≤0.25;

2 每孔阳性对照OD450平均值均≥0.75;

按以下计算方法的判定结果:

1阳性:样品OD450值>阳性对照OD450平均值×0.3, 即CSFV抗体阳性。

2 可疑:

阳性对照OD450平均值×0.25≤样品OD450值≤阳性对照OD450平均值×0.3, 应再进行双孔复试, 若任意一孔或两孔均为阳性, 则视为CSFV抗体阳性;若两孔均为阴性则视为CSFV抗体阴性。

3阴性:样品OD450值<阳性对照OD450平均值×0.25, 即CSFV抗体阴性。

2结果与分析

2.1 规模猪场的猪群猪瘟抗体检测结果 (见下表)

2.2 规模猪场的猪群猪瘟抗体检测结果分析

规模化猪场采用国家统一标准提出的猪瘟免疫程序对不同阶段猪群进行了免疫, 课题组随机检测共计300份样品, 疑似样品8份, 阴性样品9份, 阳性率为94.3%, 远远高出了国家要求的70%以上的标准。对检测为阴性样品和疑似样品的猪进行二次免疫并进行检测, 如仍为疑似或阳性, 猪场为达到彻底净化猪瘟的目的, 毫不犹豫的进行淘汰。

3 讨论

北京爱德士元亨生物科技有限公司生产的“猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒”采用基因工程表达的猪瘟病毒抗原包被微量反应板, 利用间接ELISA原理进行检测。如果待测样品中含有猪瘟病毒抗体, 则与包被抗原结合, 加入辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体后, 形成抗原-抗体-酶标抗体复合物, 再加入TMB底物液作用显色, 在酶标仪450nm波长测定各孔吸光度值, 判定结果。该检测试剂盒能做到准确定量测定猪瘟抗体水平。

针对国内目前养殖的现状, 课题组认为, 猪瘟的抗原净化工作存在较大的难度, 在现有的养殖环境条件下, 猪群能否产生足够的抗体显得更为重要, 因此, 通过检测并发现猪群中的免疫耐受猪同时进行逐渐淘汰是本方法的基本出发点, 结合对后备猪群的长期监测, 严格把关, 使所有种猪群均能够对猪瘟疫苗产生良好的抗体, 以保护自身和小猪, 成为本方法的核心。本方法具有淘汰率低、操作简便、易于被猪场接受同时不影响猪场正常生产等特点, 是适合在大部分猪场推广的新的猪瘟控制方案。

影响猪场猪瘟免疫失败的原因很多, 经过调查、了解, 归纳主要有以下几个方面:免疫抑制性疾病影响、免疫耐受导致猪群带毒、霉菌毒素的影响、母源抗体的干扰及其他因素影响 (疫苗保存不当;运输不当;担心注射引起负反应, 使用疫苗的剂量不足;免疫期间使用抑制免疫的抗生素如庆大霉素、地塞米松等) 。

参考文献

[1]Barbara E.Straw, Jeffery J.Zimmerman, Sylvie D’Allaire, David J.Taylor.赵德明, 张仲秋等译.猪病学 (第9版) [M].北京;中国农业大学出版社, 2008.

[2]殷震, 刘景华.动物病毒学 (第2版) [M].北京:科学出版社, 1997, 652~664.

猪瘟的防治方法 篇6

!从猪的乳头的出血情况, 结合体温可诊断猪瘟病, 该法简易准确, 优点在于早期诊断猪瘟, 并能确定感染时间, 以便及早预防。将猪侧卧保定, 从后向前依次挤乳头, 并观察乳头出血情况。如果从乳头!周围挤出黑色血水, 体温在40.5~41.5℃之间, 并见排干粪球, 即可断定该猪已经患了猪瘟。大多数猪!的乳头有6~7对, 根据乳头从后向前出血情况, 来判断患病的时间.从后向前挤, 若第1对乳头出血, !!表明已感染猪瘟病毒1~2 h, 第2对乳头出血, 则已感染2~4 h, 如此由后向前递增的方法来确定患!病的时间, 最前一对乳头出血, 这时已感染12~14 h, 患病猪半月后开始出现喜喝脏水、钻草堆等症!状, 表明病情加重。最适宜的治愈时间是1~10 h内。

来源:中国养猪网

一起猪瘟病例调查诊断处置 篇7

2010年7月20日, 接弥渡县某基层站报称, 该镇某养殖户饲养的生猪从7月中旬出现以发热、不食, 并有猪只死亡等情况, 随即笔者与相关技术人员前往该镇进行实地调查诊断及处置。现报告如下:

1 发病情况

弥渡县某养殖户饲养生猪51头, 其中公猪2头, 母猪3头, 仔猪26头, 乳猪10头, 肥猪10头。从2010年7月16日开始, 除肥猪外, 其余猪只相继发病, 截止7月20日, 已发病41头, 发病率80.3%;已死亡15头, 病死率36.5%。曾用过青、链霉素等抗菌类药物治疗, 至笔者诊断时病情仍未得到控制。

2 临床症状

病猪精神沉郁, 体温40.5～41℃, 稽留不退。肌肉震颤, 常挤卧一堆, 呈怕冷状, 叫声嘶哑, 食欲减少或废绝, 给予退热针药后, 仅能吃少量的精料或青绿草料。多数病猪腹下, 嘴唇, 下颌, 四肢及外阴部出现紫绀或连片红斑, 指压不褪色。粪便干结呈球状, 后期腹泻, 有的便秘与腹泻交替发生, 并带有粘膜或血液, 触诊腹股沟淋巴结肿大。挤压公猪包皮时, 流出浑浊发臭少量尿液。乳猪及仔猪眼结膜苍白, 眼睑有很多分泌物, 且极度消瘦。

3 免疫情况

该户所饲养的生猪除公猪, 母猪于两年前从外地购入, 其余猪只均自繁自养。肥猪及种猪已用猪瘟脾淋苗免疫过。其中肥猪免疫过2次;种猪在10月前免疫过一次, 其它仔猪和乳猪未经免疫。

4 剖检病理变化

通过对发病仔猪解剖观察, 主要的病理变化为:腹股沟淋结肿大, 呈周边出血, 胆囊有出血点, 肾脏色较淡, 皮质有零星出血点。肠炎明显, 在回肠末端、盲肠和结肠上都有同心轮层状有钮状溃疡。

5 实验室检测

无菌取心、肺、脾、肾、肺门淋巴结组织制成涂片, 经瑞氏染色镜检, 未见典型致病菌。采集病猪静脉血清用深圳市康百得生物科技有限公司生产的猪瘟快速诊断试剂盒进行猪瘟病毒检测结果为阳性。

6 诊断

根据发病情况, 临床症状, 免疫情况, 剖检变化, 实验室检测结果, 诊断该病例为猪瘟。

7 处置

对发病乳猪和仔猪采取扑杀措施, 并作深埋处理。

对发病公猪, 母猪采用大剂量免疫方法进行猪瘟疫苗免疫接种, 每头剂量为4头份或采用猪瘟高免血清进行治疗。同时给予清洁饮水和易消化的饲料, 提高猪体抵抗力。

猪瘟的诊断与防制 篇8

1猪瘟的诊断

1.1 临床诊断

急性型患猪表现为发病突然, 症状急剧, 体温升高到41~42℃, 口渴, 废食, 嗜液, 皮肤和黏膜紫绀出血, 多数病猪有明显的脓性结膜炎, 有的出现便秘, 随后出现下痢, 粪便恶臭, 怀孕母猪可出现流产, 仔猪出现神经症状, 如磨牙, 痉挛, 转圈等。特急性病例甚至症状尚不明显即因败血而死亡, 一般在出现症状后几小时或几天后死亡。 慢性型, 多发于老疫区, 也有的因急性不死转为慢性, 患猪症状不规则, 体温时高时低, 猪体消瘦贫血, 喜卧, 行动迟缓, 食欲不振, 喜饮水, 便秘与腹泻交替, 有的病猪皮肤出现紫斑或坏死痂, 病程多在4 周以上。 非典型猪症为近年来国内外发生较普遍的一种猪瘟病型, 感染猪潜伏期长, 症状轻缓而且病变不典型, 群众称无名高热, 死亡率30%~50%, 有的自愈后出现干耳和干尾, 甚至皮肤出现感性坏疽并脱落。 这种类型的猪瘟病程上1~2 月不等, 有的猪有肺炎感染和神经症状, 新生猪引起大量死亡, 自愈猪变为侏儒猪或僵猪。

笔者在2015 年3 月接诊了许多非典型性猪瘟的病例, 其中一例情况报告如下。

一养殖户从外地购进30 头45 日龄仔猪。 据畜主描述仔猪在购1 周后发病14 头, 死亡11 头。 病猪体重下降, 体温在40~41.5℃, 少动, 精神萎顿, 少食厌食。 呼吸次数增加, 有腹式呼吸表现, 眼角有少量脓性分泌物, 皮肤有少量出血点, 先便秘, 粪便带黏液呈球状, 后腹泻, 拉灰黄色粪便。 病程稍长的病猪消瘦、拱腰, 毛粗乱无光泽曾用安乃近等药物治疗但效果不明显。 通过观察畜主带来的4 头病猪发现病猪有腹式呼吸表现, 眼角有少量脓性分泌物, 皮肤有少量出血点, 与畜主描述相一致。 随后又进行了剖检和实验室诊断。

1.2 剖检变化

典型猪瘟, 全身淋巴结肿大, 尤其是肠膜淋巴结, 外边呈暗红色, 中间有出血条纹, 切面呈红白相间的大理石外观, 扁桃体出血或坏死, 胃和小肠里呈出血性炎症, 在大肠的回盲瓣段黏膜上形成特征性的纽扣状溃疡, 肾呈土黄色, 表面和切面有针尖大的出血点, 膀胱黏膜层布满出血点, 脾的边缘有时见到红黑色的坏死斑状, 似米粒大小, 质地较硬, 突出被膜表面, 妊娠母猪感染病毒后, 可见流产的胎儿水肿, 表皮出血和小脑发育不全。 非典型猪温病理变化轻微, 如淋巴结呈现水肿状态, 轻度出血, 脾稍水肿, 膀胱粘膜仅有少数出血点, 回盲瓣可能有溃疡, 坏死, 但很少有纽扣装溃疡等典型病变。 上述病例剖检后发现腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结肿大并伴有月边样出血。 脾肿大, 肾皮质点状出血, 肾外观颜色不一, 出血点大小、 密度不一。 膀胱黏膜出血, 肠黏膜潮红, 有少量出血点, 个别病猪出现结肠溃疡。

1.3 实验室诊断

根据临床症状、特征性病理变化, 对猪瘟仅能做出初步诊断, 但确诊非典型猪瘟, 特别是仔猪表现的复杂症状, 十分困难, 必须借助实验室诊断进行确诊。 常用的实验室诊断法有血清中和试验法、酶联免疫吸附试验法﹑间接血凝试验法等, 其中间接血凝试验法操作简单, 易制定, 既可检测抗原, 也可检测抗体, 主要是监测猪瘟免疫抗体水平。 目前此种方法在我国应用较多, 仅用于检测猪瘟抗体水平高低, 帮助免疫程序的制定和修正, 但不能作为是否感染的依据。

2猪瘟的防制

目前针对猪瘟并没有十分有效的治疗药物, 一旦发病将给养猪业带来巨大的经济损失, 因此制定严密的防制措施是防止猪瘟暴发的关键。 猪瘟是传染病, 它的传播扩散, 必须具备传染源, 传播途径和易感猪群三个基本环节, 如果切断这三个环节中的任何一个环节, 这些传播就会停止流行, 因此在猪瘟的防制措施中应做到以下几点。

2.1 搞好环境卫生与消毒工作

根据猪瘟病毒的病原学特点我们可以了解到猪瘟病毒对环境的抵抗力不强, 因此平时搞好栏舍, 环境饲具的清洁卫生工作, 定期清理栏舍内外, 在猪瘟发病时发病猪舍运动场及有关器械用2%的Na OH或其它强力消毒剂进行彻底消毒。粪便及垫草, 剩料等污物堆积或销毁, 从消灭传染源这个方面防止猪瘟病毒的传播扩散。

2.2 加强饲养管理

加强饲养管理, 是搞好猪病防制的基础, 是增强猪抵抗能力的根本措施。 首先, 选择优质的仔猪。 应从无疫地区或无病猪群购进种猪或仔猪, 确保无病猪进入猪场, 并建立健全隔离制度, 保证必要的隔离条件。 其次, 供给全价饲料。 营养水平不仅影响猪群的生产能力, 而且缺乏某些成分可发生相应的缺乏症, 所以要从正规的饲料厂购买饲料, 贮存时注意时间不能过长, 并防止霉变和结块, 在配饲料时要注意原料的质量, 避免饲粮的配方与实际应用相脱节。另外, 还要保证适宜的温度, 这有利于提高猪群的生产能力。如果温度过高或过低, 都会影响猪群的健康, 冷热不定容易导致猪体感冒及其他疾病。

2.3 完善免疫程序

猪瘟的发病率和带来的损失在猪病中占有很高的比例, 不仅会造成猪群的大批死亡和畜产品的损失, 而且直接影响人民的生活健康和外贸, 预防猪瘟最有效的方法之一就是预防注射疫苗及特定的抗原, 按照猪瘟的发病规律, 合理制定免疫接种程序, 减少猪群发病。

在生产中, 一般情况下, 中小型猪场可参考下列免疫程序。种公猪:每年春、秋用猪瘟兔化弱毒疫苗接种1 次;种母猪:配种前30 d免疫接种1 次或春、 秋两季各接种1 次; 仔猪:20 日龄, 70 日龄, 各免疫接种1 次, 或在猪出生后未吃初乳前立即用猪瘟兔化弱毒疫苗免疫接种1 次, 接种2 h后可哺乳;后备猪:产前一个月免疫接种1次, 选留做种时应立即接种1 次。