猪瘟病毒双重PCR（精选六篇）
猪瘟病毒双重PCR 篇1
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病毒
CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 、猪流感病毒 (SIV) 、猪圆环病毒2型 (PCV-2) 、猪伪狂犬病病毒 (PRV) 和猪细小病毒 (PPV) 细胞毒, 西北农林科技大学预防兽医实验室保存。
1.1.2 组织病料
采集咸阳市泾阳县不同猪场的疑似CSF病猪的脾脏、肝脏、肾脏、扁桃体和淋巴结等组织病料, 用灭菌PBS稀释, 研磨后离心, 取上清液-70 ℃保存, 备用。
1.1.3 主要试剂
Trizol LS Reagent、DNAzol Reagent, Invitrogen公司产品;AMV反转录酶 (5 U/μL) 、HPR I RNA酶抑制剂 (40 U/μL) 、DEPC处理水、rTaq DNA聚合酶 (5 U/μL) 、dNTP (各成分均为2.5 mmol/L) , TaKaRa公司产品。
1.1.4 引物的设计与合成
根据GenBank上发表的CSFV Shimen株基因序列 (GenBank登录号AF092448) 设计了2对引物P1/P2和PED1/PED2 (由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) , 预计扩增片段长度为272 bp (见表1) 。
1.2 方法
1.2.1 CSFV RNA的提取和第一链cDNA的合成
取CSFV细胞毒250 μL, 按照Trizol LS Reagent试剂说明提取总RNA, 在空气中自然干燥后用10 μL无RNA酶的DEPC处理水溶解, 加入下游引物P2 (25 μmol/L) 1 μL, 65 ℃水浴5 min后立即冰浴, 再加入dNTP 4 μL、5×AMV Buffer 4 μL、AMV 0.5 μL、HPR I 0.5 μL, 42 ℃水浴反转录90 min, 取出后沸水浴5 min, 在核酸测定仪上测定cDNA的含量。
1.2.2 CSFV套式PCR方法灵敏性试验
将已知含量的cDNA溶液做1×10-1～1×10-11梯度稀释, PCR第1次扩增按照以下反应体系进行:取各梯度cDNA 2 μL作为模板, 加入超纯水17 μL, 10×PCR Buffer (Mg2+ plus) 2.5 μL, dNTP 2 μL, P1、P2各0.5 μL, rTaq DNA聚合酶0.5 μL, 总体积为25 μL。反应条件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s, 54 ℃ 90 s, 72 ℃ 90 s, 共35个循环;72 ℃ 10 min。将第1次扩增产物10倍稀释, 取2.0 μL作为模板进行第2次扩增, 体系同第1次扩增, 引物为PED1/PED2。反应条件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 共35个循环;72 ℃ 10 min。取5 μL第2次扩增产物, 在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 凝胶成像系统中照像观察。
1.2.3 CSFV套式PCR方法特异性试验
提取CSFV、PRRSV、SIV等RNA病毒的PK-15阳性细胞毒核酸并反转录获得cDNA, 按照DNAzol Reagent试剂说明提取PCV-2、PRV和PPV等病毒PK-15阳性细胞毒DNA模板, 用P1/P2 、PED1/PED2引物分别进行第1次和第2次扩增, 同时用健康猪脾脏、肝脏和阴性PK-15细胞作阴性对照。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 病料中CSFV的检测
用以上建立的检测方法对咸阳市送检的133份组织病料进行检测, 同时用灭菌水和疫苗毒作为阴性和阳性对照。
2 结果与分析
2.1 CSFV套式PCR检测方法灵敏性试验
CSFV RNA反转录第一链cDNA含量为100 ng/mL, 将其按照10倍梯度稀释。从图1可见所建立的方法能够扩增出可见目的条带的最大稀释度为1×10-9, 即检测的cDNA含量最低为1×10-7 ng/mL。表明此方法灵敏度高, 可以作为检测CSFV的方法。
M.DL-2 000 Marker;1～11.cDNA的稀释度依次为1×10-1～1×10-11。
2.2 CSFV套式PCR检测方法特异性试验
用所建立的方法对CSFV、PRRSV、SIV、PCV-2、PRV和PPV阳性毒进行扩增, 结果只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带, 与预期条带大小一致, 其他5种病毒和健康猪脾脏、肝脏组织及阴性PK-15细胞未扩增出条带, 阴性和阳性对照均成立, 说明所建立的方法是特异的, 结果见图2。
M.DL-2 000 Marker;1～6.PRRSV, SIV, PCV-2, PRV, PPV, CSFV;7.健康猪脾脏、肝脏;8.阴性PK-15细胞。
2.3 病料中CSFV的检测
用优化的套式PCR方法检测了咸阳市133份疑似感染CSFV的淋巴结、脾脏和扁桃体, 结果有60份为阳性, 阳性率为45.1%, 所设阳性、阴性对照均成立 (见图3) 。
M.DL-2 000 Marker;P.阳性对照;N.阴性对照;1～14.部分病料。
3 讨论
目前对CSFV进行诊断和分子流行病学的研究主要集中在5′-UTR约150 bp区域和E2基因内的约190 bp区域, 本试验第2次扩增采用的引物即在E2基因内, 并被广泛用来进行CSF流行病学研究和调查。Sand-Vik T等[1]和Goldrick M A等[2]分别利用套式PCR对CSFV进行检测, 结果证实扩增灵敏性较普通RT-PCR可提高1 000倍, 具有检出率高、特异性强的优点。本试验中, CSFV检测方法经过灵敏度和特异性试验也充分证明了这一点, 检测的cDNA浓度最大稀释度为1×10-9, 能检出cDNA含量最低为1×10-7ng/mL。对咸阳市泾阳县送检的120份疑似CSF病料进行检测, 阳性率为41.7%, 验证了这一方法的可行性。这一结果也表明咸阳市养猪场CSFV感染比较普遍, 提示这些猪场要加强CSFV的预防控制工作。
参考文献
[1]SAND-VIK T, PATON D J, LOWINGS P J.Detection and identifi-cation of ruminal and porcine pestiviruses by nested amplification 5′untranslated coding regions[J].J Vir Methods, 1997, 64:43-56.
猪瘟病毒双重PCR 篇2
1 材料和方法
1.1 病料
来自山东某规模化猪场送检的3头疑似CSF的发病仔猪, 采集其扁桃体、脾、肾等组织作为病料。
1.2 试剂
TRIzol试剂购自Invitrogen公司;AMV reverse transcriptase (10 U/μL) 、RNA酶抑制剂、d NTP (40 U/μL) 购自Promega公司;Taq DNA polymerase (5U/m L) 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;DEPC水购自上海生工生物技术公司;异丙醇、氯仿、氯化钠为天津市化学试剂三厂产品。
1.3 主要仪器
高速微量离心机 (Sigma, USA) ;PCR仪Gene Amp System 2400 (PE公司) ;紫外凝胶成像系统 (UVP公司) ;稳压稳流电泳仪DYY-31A型为北京六一厂产品。
1.4 引物的设计与合成
参照Alfort株、Brescia株和C-株 (SK-6) 核苷酸序列, 利用primer5.0软件设计4条引物, 其中正负链各1条, 由宝生物工程 (大连) 有限公司合成, 其引物代号、位置见表1。
1.5 组织中总RNA的提取
参照Invitrogen公司的TRIZOL!LSReagent的Total RNAisolation system进行, 方法如下:
剪取50~100 mg的组织, 用生理盐水冲洗后加1 000μLTRIZOL!LS Reagent在匀浆器中匀浆 (样品量不应超过用于匀浆的TRIZOL!LS Reagent的10%) , 将液相转移到1.5m LEppendorf管内。在15~30℃ (一般室温) 孵育5 min, 使核酸蛋白完全降解, 加入0.2 m L氯仿, 颠倒混匀 (轻轻) , 置于15~30℃孵育2~15 min。在2~8℃ (4℃) 以11 500 r/min离心15min, 取上层水相于一新Eppendorf管中。每1 m LTRIZOL!LS Reagent处理样品加0.2 m L异丙醇沉淀RNA。先在15~30℃孵育2~15 min, 在2~8℃ (4℃) 以11 500 r/min离心10 min。弃上清, 用750 m L/L乙醇 (1g/L DEPC水配制) 洗涤沉淀, 每1 m LTRIZOL!LS Reagent处理样品加至少1 m L750m L/L乙醇, 在2~8℃ (4℃) 以7 400 r/min离心5 min, 混匀样品。弃上清, 室温干燥沉淀5~10 min。用无RNase酶水 (30μL) 溶解沉淀, 加1μL (40 U/μL) RNA酶抑制剂 (Ribonu-clease inhibitor, 冰上操作) , 置-20℃备用。
1.6 目的片段的RT-PCR和RT-n PCR扩增
反转录合成c DNA:在一新Eppendorf管中加入:总RNA提取液8μL, CSFV-E2-p1a B (20 pmol/μL) 1μL, 5×AMV buffer 4μL, d NTP (25 mmol/μL) 6μL, RNasin (20 U/μL) 0.5μL, AMV (10 U/μL) 0.5μL。42℃水浴1.5~2 h, 置-20℃备用。
目的片段扩增 (一扩) :在一新Eppendorf n PCR管中加入:灭菌双蒸水13.25μL, 反转录c DNA液5μL, 10×PCR缓冲液2.5μL, d NTP (25 mmol/μl) 2μL, CSFV-E2-p1a (20pmol/μl) 1μL, CSFV-E2-p1a B (20pmol/μL) 1μL, Taq DNA polymerase (5 U/m L) 0.25μL。反应条件为:95℃变性4 min;然后94℃30 s, 56℃30 s, 72℃45 s, 35个循环;最后在72℃下延伸10 min。
扩增 (二扩) :将上步 (一扩) 的PCR产物作为模板, 用CSFV-E2-p2a和CSFV-E2-p2B做为配对引物完成的PCR (二扩) 。灭菌双蒸水16.25μL, 一扩PCR产物2μL, 10×PCR缓冲液2.5μL, d NTP (25 mmol/μL) 2μL, CSFV-E2-p2a (20 pmol/μL) 1μL, CSFV-E2-p2B (20 pmol/μL) 1μL, Taq DNA polymerase (5 U/m L) 0.25μL。反应条件为:95℃变性4 min;然后94℃30 s, 56℃30 s, 72℃45 s, 35个循环;最后在72℃下延伸10 min。
1.7 琼脂糖凝胶电泳PCR产物鉴定
取上述PCR (一扩产物, 预计305 bp;二扩产物, 预计172 bp) 产物5μL在10g/L TAE琼脂糖凝胶中电泳, 凝胶中含0.5μg/m L溴化乙锭, 电泳缓冲液为1×TAE, 90~100V, 25 min电泳完毕后, 于紫外凝胶成像系统观察。
2 结果与讨论
Marker左侧2、3、4为一扩引物扩增结果, 如图1。Marker右侧2、3、4为二扩引物扩增结果, 如图2。表明用引物p1a/p1a B进行扩增产物电泳后, 在预计的305 bp处有阳性条带;再用p2a/p2B做为配对引物完成的PCR二扩电泳, 在预计的172 bp处有更加明显的阳性条带。说明被检病猪存在CSFV感染。
巢式PCR的原理就是使用2对PCR引物扩增完整的片段, 第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似, 第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部, 使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增, 巢式PCR的好处在于, 如果第一次扩增产生了错误片断, 则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低, 因此, 巢式PCR的扩增非常特异[9]。Liu等[11]提取CSFV感染组织中总RNA进行RT-PCR反应, 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测表明, 其灵敏性可检测到104TCID50的病毒。Sand-Vik等[12]和Goldrick等[13]分别利用巢式PCR对CSFV进行检测, 结果证实扩增灵敏性较普通RT-PCR可提高1 000倍。
猪瘟病毒双重PCR 篇3
猪瘟病毒不仅能通过水平和接触传播, 还能通过母猪胎盘和公猪精液垂直传播[1]。目前, 规模猪场普遍采取人工授精技术, 如果公猪健康带毒或精液中存在带毒的情况, 则很容易通过精液直接传播, 造成疫病的扩散与流行, 这可能是造成规模猪场猪瘟难以控制的重要原因。为了了解猪瘟病毒在精液中分布情况, 试验利用RT-PCR方法, 对种公猪精液中的精子和精液离心上清液进行了PCR快速诊断, 结果成功在精子及精液离心上清液中扩增出预期的特异性片段, 现将结果报道如下。
1 材料
1.1 主要试剂
Trizol RNA提取试剂盒、AMV反转录酶, 均购自Promega公司;PCR Master Mix、100 bp DNA Ladder Marker, 购自天根生化科技 (北京) 有限公司。引物根据基因库中现有的猪瘟病毒的E2基因序列设计, 预期产物大小1 081 bp, 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为上游引物5′-CGGGATCCATGGTAACTGGGGCACAAGG-3′, 下游引物5′-CGGAATTCTCACACCACCAAGACAACAAAT-3′。
1.2 病料
1～7号7份精液来自江西省某种猪场7头种猪, 其血样经ELISA检测为猪瘟病毒抗原阳性。
2 方法
2.1 精子中病毒RNA的提取
将提取的精液倒入1支1.5 mL的离心管中, 5 000 r/min离心10 min;沉淀即为精子, 上清液为精液, 离心上清液, 将带有精子的离心管迅速置于液氮之中冷冻5 min;然后取出立即置于沸水中5 min, 反复3次;加入Trizol 1 000 μL, 充分匀浆、研磨后移入另一支离心管中, 并在其中加入氯仿200 μL, 旋涡振荡混匀, 4 ℃、13 000 r/min离心6 min;取上清液400 μL, 加入另一支已做好标记的离心管内, 再加入异丙醇1 000 μL, 4 ℃、13 000 r/min离心6 min;弃去上清液, 留底部白色物质, 再加入75%乙醇 (DEPC水配制) , 4 ℃、13 000 r/min离心2 min;弃去75%乙醇, 留下白色物质, 吹干;将病毒mRNA最后溶于15 μL经过DEPC处理的无RNase的水中, 取5 μL用于RT-PCR反应。
2.2 精液离心上清液中病毒RNA的提取
将上述2.1离心获得的精液离心上清液置液氮冷冻5 min, 然后取出立即置于沸水中5 min, 反复3次。提取RNA方法同2.1。
2.3 反转录cDNA
RT反应体系 (20 μL) :5×Reverse Transcriptase Buffer 4 μL;2.5 mmol/L dNTP 4 μL;RNase Inhibitor 0.5 μL;Oligo (dT) 18 1 μL;RNA溶液5 μL;高压双蒸水4.5 μL;AMV Reverse Transcriptase 1 μL。RT反应设置的参数均为42 ℃ 50 min, 70 ℃ 15 min。所得反应液用于PCR反应。
2.4 PCR反应
PCR反应总体积为25 μL, 组成如下:2×Taq PCR Master mixed 12.5 μL, RT产物2 μL, 上游引物 (P1) 、下游引物 (P2) 各1 μL, 无菌双蒸水8.5 μL, 各组分混匀95 ℃变性5 min后进入PCR循环。扩增猪瘟病毒基因片段的参数设置为95 ℃ 1 min, 51 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 共35个循环;72 ℃再延伸10 min。取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 观察扩增片段大小[2,3]。
2.5 临床样品的检测
应用所建立的RT-PCR方法对1～7号7份精液样品进行处理, 离心后进行检测, 同时选择了其中1, 3, 5号3份精液离心上清液进行检测。
3 结果
3.1 精子中猪瘟病毒基因检测结果
用此RT-PCR方法对7份种公猪精液中精子进行猪瘟病毒的RT-PCR检测, 结果7份送检样品中6份精子扩增出了猪瘟病毒1 081 bp的特异条带 (见图1) 。重复试验结果相同。
1～7.分别为1～7号精子猪瘟病毒基因扩增结果;M.100 bp DNA Ladder Marker。
3.2 精液离心上清液中猪瘟病毒基因检测结果
用此RT-PCR方法对3份种公猪精液离心上清液进行猪瘟病毒的RT-PCR检测, 结果3份精液上清液中均扩增出了猪瘟病毒1 081 bp的特异条带 (见图2) 。重复试验结果相同。
1.100 bp DNA Ladder Marker;2～4.分别为1, 3, 5号3份精液离心上清液猪瘟病毒基因扩增结果。
4 小结与讨论
1) 利用本试验建立的RT-PCR方法对7份经ELISA猪瘟抗原检测阳性公猪精液样品, 经过离心获得精子, 再进行扩增, 结果6份阳性, 检出率较高, 并且重复性较好。为了解猪瘟病毒在精液中的具体分布, 笔者随机选择了其中3份精液离心上清液进行基因检测, 结果3份均为阳性, 与精子检测结果一致。说明在精液中, 猪瘟病毒不仅存在于精子中, 也存在于精子外的溶液中。
2) 猪瘟在世界各地广泛流行, 近十年来它的流行和发病特点发生了很大变化, 其流行病学和临床症状已缺乏规律, 出现隐性感染或温和型猪瘟、流产、死胎等不易诊断的现象。目前, RT-PCR是应用广泛的方法, 本试验利用该方法成功地扩增出猪瘟病毒预期大小gE基因片段, 敏感度高, 速度快, 检测临床精液样品一般只需要6 h左右, 可满足对猪瘟病毒临床病料的快速检测和流行病学调查的要求。
3) 俗话说“母猪好好一窝, 公猪好好一坡”, 可见配种公猪在规模化养猪场的重要性。带毒公猪可通过精液将病毒传染给母猪。带毒母猪妊娠后病毒通过胎盘屏障感染胎儿造成垂直传播, 产下的带毒仔猪或僵猪不断产毒、排毒, 污染环境, 感染其他健康猪[4]。在荷兰, 1997—1998年间, 由于精液污染了猪瘟病毒而引起猪瘟的爆发流行, 经济损失达20亿美元。有研究表明, 种公猪在感染猪瘟病毒后第5天便可在精液中检测到病毒颗粒, 但种公猪不表现出任何临床症状。因此, 规模化猪场在引种时必须进行检疫, 并对种群采取监测-淘汰-隔离-选种的净化措施, 从根本上杜绝疾病的再次发生。
摘要：为了研究猪瘟病毒在种公猪精液、精子中的分布情况, 试验对7份种公猪精液中的精子和3份精液上清液进行了猪瘟病毒特异基因片段的RT-PCR扩增。结果表明:在种公猪的精子及精液上清液中均存在猪瘟病毒。说明猪瘟病毒可以通过精液和精子传播。
关键词：种公猪,猪瘟病毒,RT-PCR
参考文献
[1]周斌, 吴增坚, 贾赟, 等.种公猪精液中猪瘟和蓝耳病病毒混合感染的快速检测[J].畜牧与兽医, 2005, 37 (5) :1-3.
[2]赵丽, 崔保安, 陈红英, 等.Taq Man实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用[J].中国预防兽医学报, 2009, 31 (2) :136-140.
[3]成丹, 赵建军, 李娜, 等.同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立[J].畜牧兽医学报, 2009, 40 (1) :72-77.
猪瘟病毒双重PCR 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源。
来自江西进贤县城范围内各猪场送检的疑似感染猪瘟病毒的病猪肾脏、脾脏、淋巴结等脏器,共104份组织病料,-20℃保存备用。(CSFV阳性对照为市售猪瘟兔化弱毒疫苗)
1.1.2 酶和其它试剂。
Ta Ka Ra RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0,DNA Marker DL2,000购自大连宝生物公司,DEPC、TRIZOL购至上海生工,异戊醇、异丙醇、氯仿等其它试剂均为分析纯试剂。
1.1.3 引物设计及合成。
根据Genbank数据库猪瘟经典毒株基因组序列,进行多序列比对,从而找出高度保守区,以这些高度保守区作为模板设计引物。(引物由上海生工生物工程公司合成)上游引物:5'-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3'(上游引物120~138nt,Alfort187);下游引物:5'-GATTCAACTCCAT-GTGCCATG-3'(下游引物366~386nt,Alfort187)[5],扩增产物长255bp。
1.1.4 主要仪器设备。
无菌操作台,全自动数码成像及分析系统,PCR仪,冷冻超速离心机,微量移液器,电泳仪,自动双蒸水蒸馏器。
1.2 方法
1.2.1 病料的处理和RNA的提取。
将病猪的肺、脾、淋巴结等组织剪碎放入玻璃匀浆器,加入500μL Trizol混合充分研磨,倒入1.5m LEP管中,加入500μL氯仿-异戊醇的混合物,震荡混匀,4℃12000r/min离心15min,取上清液;重复前操作一次,取上清液,加入冷的异丙醇700μL,轻轻震荡,摇匀,4℃12 000r/min离心5min,弃上清液;用70%的冷乙醇洗涤700μL2次,倒掉乙醇,吹干,用40μL DEPC处理灭菌双蒸水溶解,同法制备PRRSV阳性对照株和CSFV阳性对照株的RNA模板。立即使用或-20℃保存备用[6]。
1.2.2 一步法RT-PCR扩增。
在0.2m L Eppendorf管中依次加入以下组分:一步法RNA PCR缓冲液(10×)5μL,Mg Cl2(25m M)10μL,d NTP Mixture(10m M)5μL,RNase Inhibitor(40 U/μL)1μL,AMV RTase XL(5U/μL)1μL,AMV-Optimized Taq(5U/μL)1μL,上游特性引物(25μM)1μL,下游特异性引物(25μM)1μL,模板1μL,DEPC水24μL,总体积为50μL。混匀后,按以下程序进行扩增:50℃逆转录30min,95℃预变性3min,然后进入95℃30s、56℃40s,72℃1min循环,共30个循环,最后72℃延伸10min。反应在基因扩增仪(PE9600)上进行。
1.2.3 PCR产物鉴定。
配制1%琼脂糖凝胶,加入终浓度为0.5μg/m L的溴化乙锭(EB)。取8μLPCR产物与上样缓冲液混合后加入加样孔,以1×TAE为缓冲液,紫外检测仪下观察结果。以PCR产物中出现266bp条带的样品为阳性。在凝胶成像系统下拍照。
2 结果与分析
3 讨论与小结
通过对进贤县城25个猪场的146份病料检测,其中113份为阳性,阳性率较高达77.4%,说明在进贤县猪瘟的发病率仍然很高,流行情况严重。虽然各个猪场进行了猪瘟免疫,但仍然出现免疫失败的情况。经调查分析,主要原因是:猪瘟免疫程序不合理;疫苗质量太差或者在进行操作时未按规定和说明进行操作;猪场内免疫抑制性疾病的存在;疫苗使用量过大造成免疫麻痹;技术人员的文化素质较低或者根本没有专业的兽医人员等[7]。因此,猪瘟发病率高的猪场,应该适时科学的进行免疫监测,了解猪群抗体水平,及时进行防疫,确保猪场安全。要尽快淘汰带毒猪,因为带毒猪污染环境,会感染其它健康猪。
参考文献
[1]高华峰,宋建领.猪瘟的诊断与新出现的诊断技术[J].动物科学与动物医学,2003,20(8):56～57.
[2]臧金灿,樊国燕,乔宏兴.RT-PCR技术检测河南省猪瘟病毒的研究[J].安徽农业科学.2006,34(24):6398～6399.
[3]萨姆布卢克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].第3版.北京:科学出版社,2002:636～643.
[4]罗廷荣,莫扬,昊文德,等.RT-PCR技术检测猪瘟病毒的应用研究[J].中国预防兽医学报,2004,26(4):307～309.
[5]焦莉,崔玉东,王春明,等.一步法RT-PCR快速检测猪瘟病毒[J].黑龙江八一农垦大学学报,2006,18(1):57～60.
[6]张维铭.现代分子生物学实验手册[C].北京:科学出版社.2003.80～87.
猪瘟病毒双重PCR 篇5
关键词：牛病毒性黏膜/腹泻病毒 (BVDV) ,牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV) ,双重PCR,特异性试验,灵敏度试验
牛病毒性黏膜/腹泻病 (BVD) 和牛传染性鼻气管炎病 (IBR) 是危害养牛业的两种重要的病毒性传染病, 在临床上常呈混合感染[1,2,3,4]。近年来, 随着养殖规模的不断扩大, 两种病原混合感染较为严重, 国内外虽已有针对牛病毒性黏膜/腹泻病毒 (BVDV) 和牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV) 检测的单项PCR方法[5,6,7,8,9,10,11], 但为了更好地对这两种疫病进行鉴别诊断和疫情防控, 建立一种可同时快速、特异、灵敏检测BVDV和IBRV的分子生物学检测方法具有重要意义。本试验针对BVDV和IBRV这2种病原进行了双重PCR检测技术的研究, 以满足同步快速检测的需要。
1 材料
1.1 病毒
BVDV和牛轮状病毒 (BRV) , 购自中国兽医药品监察所;IBRV、猪瘟病毒 (CSFV) , 由宁夏农林科学院草畜工程中心分子生物学实验室保存。
1.2 主要试剂
TRIzol Regeng RNA提取试剂、Quant Revers Transcriptase、Taq Master Mix、MarkerⅠ、DEPC水, 均购自北京天根生化科技有限公司;其他化学试剂如氯仿、异丙醇、乙醇均为国产分析纯。
1.3 主要仪器
PCR仪 (型号为T-100) 、凝胶成像仪 (型号为Gel DocTMXR+) , 均购自美国Bio-Rad公司。
2 方法
2.1 引物的设计与合成
参照参考文献[7]中检测BVDV的引物序列, 引物序列为BVD-F 5'-AGGCTAGCCATGCCCTTAG T-3', BVD-R 5'-TCTGCAGCACCCTATCAGG-3', 基因片段大小为244 bp;参照参考文献[10]中检测IBRV的引物序列, 引物序列为IBR-F 5'-GGCTC-TACCGCACGGGCACCTCT-3', IBR-R 5'-GCG-GCTCTCGTCTCGCAGCATTT-3', 基因片段大小为362 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2.2 病毒RNA的抽提和反转录
取BVDV冻干物约100 mg, 加入TRIzol 1 m L, 按照TRIzol Regeng RNA提取试剂使用说明书提取BVDV的RNA, -70℃保存, 备用。提取的RNA按照Quant Reverse Transcriptase试剂盒说明书进行反转录, 反转录产物作为PCR模板备用。
2.3 双重PCR反应条件的建立
2.3.1 最适退火温度的确定
选取55~62℃的退火温度进行梯度PCR反应, 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 确立最佳退火温度。
2.3.2 最适引物体积的确立
在PCR反应体系 (25μL) 中分别加入各对引物 (10μmol/μL) 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.2μL, 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 确定最佳引物体积。
2.4 双重PCR的特异性试验
用已建立的双重PCR对BVDV、IBRV、CSFV、BRV这4种病原进行扩增, 设双蒸水为阴性对照, 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
2.5 双重PCR的灵敏度试验
用紫外分光光度计测定BVDV总RNA反转录后的c DNA、IBRV总DNA含量, 并分别进行10倍梯度稀释, 每个稀释度取0.3μL进行双重PCR扩增, 反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
2.6 临床样本的检测
对宁夏银川市、吴忠市、石嘴山市奶牛养殖厂采集的25份疑似病料进行双重PCR检测。
3 结果与分析
3.1 双重PCR反应条件的优化结果
通过对BVDV和IBRV的退火温度及引物体积进行优化, 最后确定双重PCR的最佳反应条件为:94℃5 min;94℃30 s, 60.3℃40 s, 72℃1 min, 共35个循环;72℃5 min。双重PCR的最佳反应体系为:25μL反应体系, 其中包括2×Taq Master Mix12.5μL, 模板各0.3μL, 引物各0.3μL, dd H2O10.7μL。扩增产物的电泳结果见图1。
M.DNA分子质量标准;1.BVDV+IBRV;2.阴性对照。
3.2 双重PCR的特异性试验结果
利用双重PCR方法对BVDV、IBRV、CSFV、BRV在相同条件下进行扩增, 结果显示, BVDV和IBRV的PCR产物大小与预期结果一致, 而CSFV、BRV均未扩增出条带, 结果见图2。
3.3 双重PCR的灵敏度试验结果
用紫外分光光度计测定的BVDV和IBRV模板浓度均为10μg/m L, 将该模板10倍梯度稀释, 每个稀释度取0.3μL作为模板, 结果显示最低可扩增出10 pg的BVDV和IBRV, 结果见图3。
M.DNA分子质量标准;1.BVDV+IBRV;2.IBRV;3.BVDV;4.CSFV;5.BRV。
M.DNA分子质量标准;1.10 ng;2.1 ng;3.100 pg;4.10 pg;5.1 pg;6.阴性对照。
3.4 临床样本的检测
分别用试验建立的双重PCR和单项PCR对在宁夏不同地区采集的25份疑似病料进行检测, 结果两者的符合率达100%, 说明本试验建立的双重PCR检测体系的特异性和敏感性较好。
4 讨论
双重PCR反应在同一体系内进行, 复合扩增物中的引物之间、模板之间、引物与模板之间可能存在抑制, 在试验过程中必须对各种条件进行优化。在本试验中, 曾先后试过对BVDV和IBRV的各4套引物进行扩增, 结果发现, 单项PCR反应良好, 而在双重PCR反应中常出现扩增效率不高、非特异性扩增、扩增不出条带等问题, 经反复摸索及优化反应体系和条件后, 成功摸索出适合同时检测BVDV和IBRV的双重PCR反应用的引物和反应条件。
本研究通过对25份临床病料进行检测, 单项PCR和双重PCR检测的符合率均为100%, 说明可以在一份样品中同时检测出2种病原体, 达到了对多种疾病的同步诊断, 为BVDV和IBRV的检测提供了新的技术, 对这两种疫病的防制具有较好的应用价值。
参考文献
[1]康晓冬, 谢秀兰, 吴韶儒, 等.宁夏奶牛病毒性腹泻-黏膜病血清学调查[J].黑龙江畜牧兽医, 2013 (02下) :90-91.
[2]范晴, 谢芝勋, 刘加波, 等.牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展, 2010, 31 (10) :10-14.
[3]邹世颖, 何倩妮, 刘蕾, 等.中国北方六省市牛传染性鼻气管炎病流行病学分析[J].中国兽医杂志, 2012, 48 (2) :47-48.
[4]殷震, 刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社, 1997.
[5]郭春娟, 吴星星, 王璐, 等.牛病毒性腹泻病毒通用型RT-PCR检测方法的建立[J].新疆农业大学学报, 2012, 35 (3) :217-221.
[6]任敏, 焦海宏, 蒋颖, 等.基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立和初步应用[J].中国预防兽医学报, 2008, 30 (9) :665-668.
[7]王伟利, 肖成蕊, 孟日增, 等.牛病毒性腹泻病毒一步法RTPCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报, 2007, 29 (10) :806-809.
[8]孔繁德, 徐淑菲, 周斌华, 等.进口奶牛牛传染性鼻气管炎病毒的分离与鉴定[J].中国动物检测, 2006, 23 (4) :29-30.
[9]王冰.针对gG基因的牛传染性鼻气管炎病毒新型检测方法建立和应用[D].武汉:华中农业大学, 2011.
[10]周斌华.牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及在进境牛检疫中的应用[D].扬州:扬州大学, 2006.
猪瘟病毒双重PCR 篇6
绵羊肺炎支原体 (Mycoplasma ovipneumoniae, Mo) 是引起绵羊和山羊间质性肺炎的主要病原体之一, 主要表现为咳嗽、气喘、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎症等[6,7,8]。由于病羊的主要症状为慢性非进行性肺炎, 故控制和消灭本病比较困难。
近年来, 我国新疆、辽宁、河北、四川、重庆、广西、贵州、湖南等不同地区都流行绵羊肺炎支原体[9]。为了更好地对绵羊肺腺瘤病毒和绵羊肺炎支原体进行鉴别诊断和疫情防控, 建立一种针对JSRV和Mo的快速、敏感、特异的分子生物学检测方法具有重要意义。本研究建立一种可用于JSRV和Mo 2种病原的双重PCR诊断方法, 以期为快速鉴别诊断绵羊肺脏疾病奠定基础。
1 材料与方法
1.1 参考毒株
绵羊肺炎支原体 (Mo, Y98株) 、丝状支原体山羊亚种 (Mmc) LC型 (Y-goat株) 、绵羊肺腺瘤病毒 (JSRV) 、山羊关节炎脑炎病毒 (CEAV) 、伪狂犬病病毒 (PRV) 、绵羊痘病毒 (SV) 、禽白血病病毒 (ALV) , 均购自中国兽医药品质量监察所, 辽宁省铁岭市动物疾病中心实验室保存。
1.2 主要试剂
Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL-2 000 Marker等, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;改良的Hayfliek培养基、胶回收试剂盒, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司;其他化学试剂如氯仿、异丙醇、乙醇等, 均为国产分析纯。
1.3 引物的设计与合成
根据GenBank中登录的JSRV、Mo参考毒株基因序列, 利用Primer Premier 6.0软件设计了2对特异性引物 (引物序列见表1) , 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 用DEPC水溶解并配成20 pmol/mL溶液, 备用。
1.4 病毒基因组DNA的提取
取JSRV和Y98株, 反复冻融3次, 13 000 r/min离心10 min;取上清液采用酚-氯仿法提取各病毒DNA。
1.5 双重PCR反应条件的优化
最适退火温度的确立:分别以49, 51, 53, 55, 57 ℃进行梯度PCR反应, 取扩增产物用琼脂糖凝胶电泳, 根据不同退火温度下目的条带的亮度确定最适退火温度。
最适模板浓度的确立:分别以1, 2, 3, 5, 8 μL DNA为模板, 保持其他试剂浓度及反应条件不变, 取扩增产物用琼脂糖凝胶电泳, 确定最适模板浓度。
最适引物浓度的确立: 向50 μL PCR反应体系中分别加入上、下游引物 (20 μmol/μL) 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0 μL, 取扩增产物用琼脂糖凝胶电泳, 确定最适引物浓度。
1.6 双重PCR的特异性试验
分别在二级生物安全实验室 (P2) 的生物安全柜内提取实验室保存的Mmc LC型 (Y-goat株) 、CEAV、PRV、SV、ALV的总RNA或DNA, 以其为模板, 用建立的双重PCR扩增, 同时设双蒸水阴性对照, 扩增反应结束后进行凝胶电泳检测, 以检验双重PCR的特异性。
1.7 双重PCR的敏感性试验
取实验室保存的JSRV和MoY98株提取病毒总DNA, 用紫外分光光度计测定其含量, 并依次做10倍梯度稀释, 每个稀释度取1 μL为模板, 采用已优化的双重PCR反应条件分别对上述不同稀释度的DNA 进行双重PCR扩增, 反应结束后进行凝胶电泳检测, 以检测建立的双重PCR的敏感性。
1.8 双重PCR的重复性试验
用建立的双重PCR检测方法分别对JSRV感染的7份阳性样品、Mo感染的4份阳性样品及5份阴性样品重复检测3次, 以验证本试验所建立的双重PCR方法的重复性和稳定性。
1.9 临床样品的检测
用所建立的双重PCR检测方法对提取的新疆、内蒙古、青海等省 (区) 送检的17份疑似病料进行扩增, 用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测, 观察结果。
2 结果
2.1 双重PCR反应条件的优化结果
通过对JSRV和Mo 2对特异性引物浓度的测定及双重PCR扩增温度、时间和循环次数等的优化, 最后确定双重PCR中最佳引物浓度分别为JSRV 120 ng、Mo 100 ng。双重PCR的最佳反应条件为94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 共30个循环;最后 72 ℃ 延伸8 min。
2.2 双重PCR扩增产物的检测结果
将JSRV和Mo的核酸分别进行双重PCR扩增, 扩增结果与试验设计相符, JSRV扩增的目的条带为695 bp, Mo扩增的特异性片段为485 bp, 而对照却扩增不出任何条带, 扩增产物的电泳结果见图1。
1.DL-2 000 Marker;1.Mo PCR产物;2.JSRV PCR产物;3, 4.空白对照。
2.3 双重PCR的特异性试验结果
利用建立的双重PCR方法对JSRV、Mo及Mmc LC型 (Y-goat株) 、CEAV、PRV、SV、ALV在相同的条件进行扩增。结果表明, JSRV和Mo的PCR产物的片段长度分别为695 bp和485 bp, 与预期大小一致, 而Mmc LC型、CEAV、PRV、SV、ALV均未扩增出片段, 见图2, 说明本研究建立的双重PCR方法特异性强。
M.DL-2 000 Marker;1.JSRV;2.Mo;3.JSRV+Mo;4.Mmc LC型;5.CEAV; 6.PRV;7.SV;7.ALV;9.空白对照。
2.4 双重PCR敏感性试验结果
用紫外分光光度计测定的模板DNA浓度为10 μg/mL。将提取的DNA依次做10倍梯度稀释, 每个稀释度取1 μL作为模板, 结果表明, 用10 pg的JSRV和10 pg的Mo可以扩增出特异性条带, 见图3, 表明建立的双重PCR方法敏感性强。
M.DL-2 000 Marker; 1～7.DNA含量分别为100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、10 fg; 8.空白对照。
2.5 双重PCR重复性试验结果
经过3次重复操作, 结果一致, 表明本研究建立的双重PCR方法是稳定可靠的。
2.6 临床样品的检测结果
对17份在不同地区采集的疑似病料, 用建立的双重PCR和单项PCR进行检测, 两者符合率达到100%, 见表2, 表明该双重PCR反应体系的特异性和敏感性较好。
3 讨论
很多研究表明, 健康绵羊基因组中含有至少15～20拷贝与外源性绵羊肺腺瘤反转录病毒 (exJSRV) 相似的内源性逆转录病毒序列, 并且exJSRV和外源性绵羊肺腺瘤逆转录病毒 (enJSRV) 有很高的同源性[10,11], 在绝大多数区域同源性高达98%以上, 但有3个高可变区, 分别位于U3、env、gag区[12,13]。由于患该病后在血液中检测不到循环抗体, 因此不能用常规的血清学方法对其进行诊断[3]。本试验根据JSRV高可变区env基因设计引物, 对引起绵羊肺腺瘤病的病原进行进一步确诊, 为建立特异性诊断该病的方法提供理论依据。Mo 16S rRNA相对保守, 大小适中, 已被选定为公认的分类指标。在本研究中, 针对Mo 16S rRNA设计了特异性引物, 通过试验证实了所设计的引物具有较高的特异性, 建立了Mo的PCR诊断方法。
PCR是一种非常有效的检测病原微生物的方法, 尤其适用于像支原体等培养困难和抗原性复杂的病原体的检测与鉴定, 具有快速、特异、敏感的特点。双重PCR技术是近年来发展起来的一种可用于检测2种病原体的PCR技术, 可以在同一反应体系中同时对2个目的基因进行扩增, 不论是用于检测单一感染病原的不同基因型, 还是用于检测2种混合感染的病原, 其快速性和敏感性都优于传统的鉴别诊断方法, 具有较高的实用价值, 可直接用于临床检测, 服务于生产 [14]。