精子质量检测系统

2024-05-25

精子质量检测系统（精选八篇）

精子质量检测系统篇1

计算机辅助精液分析( computer - aided semen analysis,简称CASA) 系统,是将精液样本通过显微镜进行放大,图像经电子摄像系统送入计算机,运用先进的计算机技术对精子密度、活力、活率、运动轨迹特征等进行自动化定量检测的分析装置[2]。已有试验运用精子质量分析仪对鸡精液进行分析,在精子活力、活率等相关指标的测定上验证均可以代替人工测定方法,但对精子密度的测定都未获得理想的结果[3,4]。试验采用WLJY—9 000伟力彩色精子质量检测系统对鸡精子密度进行检测,逐步矫正检测系统参数,并与传统的计数板法比较,探讨WL - CASA系统在鸡精子密度测定中的适用性,现报道如下。

1 材料与方法

1. 1 试验动物及仪器、试剂

黑丝羽乌骨鸡及其杂交公鸡,湖南省畜牧兽医研究所养殖基地提供。

WL - CASA系统,北京伟力新世纪科技发展有限公司制造。血细胞计数板等常规试验器具与试剂,湖南光大牧业科技有限公司种公牛站提供。

1. 2 试验设计

1. 2. 1精液的采集与处理采用背部按摩法采集公鸡精液,用2 m L离心管作为集精管,在采集过程中要求精液无污染。采集后的精液放置于含冰块的疫苗冷藏箱,带回实验室。所有精液检测操作均由同一人使用相同仪器进行。将采回的10只公鸡精液标注为1 ~ 10组,分别用稀释液1∶1稀释。

1. 2. 2密度的测定计数板法: 先将血细胞计数板及盖玻片用纯化水冲洗,自然干燥。再将1∶1稀释后的精液用3% Na Cl稀释200倍( 最终稀释倍数为400倍) ,取20 μL样品于计数板上,每个样品观察上下2个计数室,取平均值,若2个计数室计数结果误差超过5% 则重新检测。

精子检测系统测定法: 同一精液样本分别在100倍和200倍显微镜下连续测定6次,确定该系统的可重复性,并比较2种不同放大倍数检测结果的一致性。从1 ~ 10号样品中取适量稀释后的精液用3%Na Cl稀释200倍( 最终稀释倍数为400倍) ,取5 μL样品于系统提供的专用计数板上进行检测,记录数据并存档。

1. 3 数据的统计分析

采用SAS软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 精子检测系统检测的可重复性和一致性( 结果见表 1、表 2)

注: P > 0. 05 表示差异不显著。

由表1、表2可以看出,同一样本连续检测6次,精子密度的变化均很小,不同放大倍数下各检测参数亦无显著差异( P > 0. 05) ,表明该检测系统具有较好的可重复性。同时通过对比也发现,使用200倍比使用100倍检测得到的结果更稳定,变异系数更小,可能与100倍下鸡精子偏小、颜色偏浅、头尾无明显区别,系统容易漏抓有关。不同放大倍数下的密度测定结果对比分析也表明,结果之间差异性较小 ( P >0. 05) ,表明该检测系统的一致性较好。

2. 2 精子检测系统与计数板法的比较( 结果见表 3)

注: P > 0. 05 表示差异不显著。

通过对比分析发现,精子检测系统与计数板法检测结果之间具有直线回归关系,回归方程为y =8. 454 + 0. 449x,回归关系极显著( P < 0. 01) ( 式中: y为实际密度,x为系统检测密度) 。

由表3可以看出,精子检测系统换算后的结果与计数板法对鸡精子密度检测的结果无显著差异( P >0. 05 ) ,相关性好,说明精子检测系统测定鸡精液质量有较好的准确性,可以代替计数板法。

使用精子检测系统检测鸡精液,样品制备比较重要,需要使用系统提供的专用计数板和盖玻片,才能保证系统计算的准确性,而且计数板和盖玻片要洁净,如果有污渍,将会影响系统对精子的抓取。同时,滴加在计数板上的精液量不能超过5 μL,滴加过多会导致最终密度比实际值偏大,这是由于计数池容量是固定的,滴加过多虽然多余的部分会溢出到计数池之外,但是精子会大量留在计数池内,造成密度偏大;样品滴加太少则不能完全铺满计数池,同样不能得到准确结果。在检测中为了将所有精子都捕捉到,调焦时稍微模糊一点有利于捕捉精子,这可能是因为稍微模糊一些会让细长的精子显得更粗,方便仪器识别。

利用WL - CASA系统检测鸡精液的结果需要换算的原因是该系统设定的程序是检测牛精子密度的,需要矫正; 而测得的密度值偏大可能是由于该试验进行时间较长,采集的精液先进行冷藏,离心管盖子敞开,从而导致部分水分蒸发,最终密度偏大。但由于试验目的只是评价伟力精子检测系统在鸡精子密度检测上的使用效果,且主要是进行计数板法、精子质量检测系统两种方法的对比,因此样本密度的一致改变对试验结果也无影响; 但实际应用中,如精子稀释后离检测的时间较长,最好将样品密封,盖紧盖子。

3 讨论与结论

计数板法检测精子密度的缺点就是容易受到检测者主观因素的影响,不同技术人员判断标准不同,导致分析结果有很大变异,而且操作过程比较繁琐,重复性较差[5]。

精子质量检测技术不仅可对精子密度进行测定,也可以动态、定量地对精子活力、运动轨迹等参数进行检测,结果具有客观性和真实性[6],为精子质量检测提供了先进手段[7],使得各检测单位间的检测结果具有可比性和通用性,易于将检测过程与结果标准化[8]。据报道,精子质量检测系统在人类精子质量检测领域可以代替其他精液分析方法,且具有良好的重复性和准确性[9,10],在猪和牛精液检测领域也显示出巨大的优势[11,12]。但该系统在家禽领域的检测效果不理想,特别是鸡精液密度的测定结果与用传统方法所测密度之间差异极显著[3,4],可能的原因包括以下两方面: 1) 目前CSAS - 9000伟力彩色精子质量检测系统的软件设计依据是形如蝌蚪的哺乳动物精子,而对形如头发丝的鸡精子则缺乏考虑,因此使用本系统时调整仪器抓取精子要更加细致。鸡精液有不同于哺乳动物精子的特殊结构,精子密度远高于家畜,尾较长,头部偏细,更容易发生粘连、缠绕,造成在检测鸡精液密度时难度大,特别是利用CASA -9000伟力彩色精子质量检测系统检测更是困难。有研究表明,精子密度在( 20 ~ 100) × 106个/m L时,计算机辅助精液分析对精子密度的检测才比较准确[13]。因此,本试验在使用CASA - 9000伟力彩色精子质量检测系统检测精子密度前先对精液样品进行稀释,得到的结果比较理想。

2) CASA - 9000伟力彩色精子质量检测系统对视野的清洁程度要求较高,在识别精子时需将灰度和阈值调整到将精子全部采集而不采集细胞碎片、脂肪小体或杂质等非精子成分[14]。

目前,临床实验室分析精子质量的人工方法和计算机系统几乎各占一半[15],但由于计算机系统在分析精子质量方面比手工法有明显优势,计算机系统的应用有逐步上升的趋势。

摘要：为了明确精子质量检测系统在鸡精子密度测定中的适用性,试验采用精子质量检测系统与计数板法测定黑丝羽乌骨鸡及其杂交鸡公鸡精液精子密度,比较了精子质量检测系统在鸡精子密度测定中的重复性和准确性。结果表明:该系统的重复性和一致性较好,10倍与20倍物镜检测结果无显著差异(P>0.05);该检测系统准确性较好,与计数板法测得的结果比较无显著差异(P>0.05),可以在实际研究与生产中应用。

精子检测盒篇2

最近，一家北京公司发明了“精子浓度测定试剂盒”，同女性的早孕试纸有着异曲同工之处，让男子在家里便可测试难以“启齿”之事。据发明人介绍，这种试剂盒是公司的拳头产品，该产品包括精液收集盒、细胞染色液和试验板，其精液收集盒由塑料收集盒和精液液化剂组成。测试者在家里按照说明书的提示，就可以测出自己是否有问题，节省了时间。现在精子自测试剂盒受到消费者的青睐，与现代社会生存压力大、周边辐射多不无关系。心理承受的巨大压力导致了男性情绪波动，进而影响精子的生成、成熟和存活率。这些成为现代社会，渴望拥有下一代的夫妻的隐忧。因此，便捷的检测更受到大众的推崇。

不过，北医三院生殖医学中心副主任刘平表示，仅凭一只试剂盒判断使用者自身是否具备生育能力并不权威。并且如果只通过精子浓度测定或其他单纯的标准判断测试者是否可育，也不太准确。“在医院检查时，精子浓度水平是医生在显微镜下数出来的。”刘平说，“而且医院检查的不仅是精子浓度，还有质量、形态等。”

如果患者不具备一定的医学知识，无法辨别自己是否有问题时，那么自我测试可能会导致信息被误读：在医院，测试者遇到这些问题的几率则小得多。

“因此，希望更多的人不要怕麻烦，还是到医院进行更专业的检测，这样对家人对自己更负责。”刘平说。

“北京旅游”随《非诚勿扰2》上演

以“非常北京非常旅游”为主题的《非诚勿扰2》首映礼12月16日晚在北京举行。首映礼上，北京市旅游局局长张慧光和华谊兄弟总裁王中磊宣布双方达成战略合作关系。

据悉，此次携手华谊兄弟通过电影《非诚勿扰2》宣传北京旅游，只是北京市旅游局与华谊兄弟开展系列合作的第一步，明年，双方将进一步加强合作。

网络主持人全国选拔大赛在京启动

12月14日，由北京人民广播电台外语广播和中国公益网共同举办的首届“E声有你”网络节目主持人全国选拔大赛在京启动。本次大赛除设北京赛区外，还设立了东北赛区、华北赛区以及华南赛区。各省市参赛选手可通过登录大赛官方网站www.am774.com报名。

腾讯公益发起励志演讲巡回行

他和世界不一样，爱心网民却给了他最热情的回响。2010年12月8日至12日，由宋庆龄基金会、腾讯公益慈善基金会、思尔豪国际教育基金会在北京、上海和深圳三地，共同举办了主题为“用感恩的心回馈社会”的尼克·胡哲励志演讲公益行活动，此举正式拉开了“腾讯公益行”系列活动的序幕。腾讯公司主要创始人之一、腾讯公益慈善基金会执行理事长陈一丹出席了演讲现场并特别致辞，感谢尼克用这样特别的方式，与中国公益网友进行了精彩的互动，为网络时代的公益事业带来了一次最好的支持。

遗失声明

北京市海淀区八里庄街道工会工作委员会的银行名称：中国农业银行北京市玉渊潭支行，开户许可证核准号：J1000039693301作废。

小手共绘美丽世界500幅儿童画进世园

近日，“小手绘世园——2011西安世界园艺博览会儿童绘画作品征集活动”最终评审会在西安浐灞生态区商务中心举行。由西安世园会执委会副主任，西安市委常委、宣传部长，西安浐灞生态区党工委书记王军，零点研究咨询集团董事长袁岳，著名雕塑家任军，中央美术学院视觉传达系主任王子源，西安欧亚学院艺术设计学院客座教授党晟等组成的评委团，经过多轮遴选和反复讨论，评选出50名优胜奖和500名入围奖。

“小手绘世园——2011西安世界园艺博览会儿童绘画作品征集活动”今年10月4日正式启动，向全球儿童发出盛情邀请，鼓励中国大陆、港、澳、台地区及国外的儿童以“绿未来·我的花样生活”为主题，充分发挥想象力，描绘人们与大自然和谐相处美好的图景。

活动在全球范围内引起了强烈反响，共征集到来自海内外共37个城市的12977幅儿童作品，其中最小的参赛者仅3岁。从经过初审、复审后的500幅入围画作中，评委们最终选了50幅优胜奖作品。

本次活动的国际绿色大使，著名美籍演员KerryBerryBrogan欣赏完优胜奖作品后，对其中一幅名为《绿妞妞》的画印象颇深，“都说小朋友的想象力是无穷的，这幅画完美地印证了这一点。作品真的是表现了这个孩子想象当中的‘人和大自然的和谐’，这个‘绿色’的妞妞头发长出来的都是各种植物和花！非常有想法！”

精子质量检测系统篇3

1 故障一

1.1 故障现象

显示屏不显示, 图像黑屏。

1.2 故障分析

活动显示区出现黑窗口, 检查显微镜、计算机屏幕分辨率、颜色进行参数调整。

1.3 故障排除

将显微镜拉杆往外, 将屏幕分辨率改为“1 024×768”, 颜色质量改为“中16位”。

2 故障二

2.1 故障现象

图像显示蓝屏带雪花或黑波纹, 无法显示正常精子。

2.2 故障分析

打开计算机主机, 重新插拔内存条、采集卡和显卡并固定。

2.3 故障排除

色彩模式更改为“RGB565”, 打开DEMO程序, 选择“VIEW”菜单下的“CRYOSC TYPE”设置为35M。

3 故障三

3.1 故障现象

提示“目标个数多”, 但稀释后仍无法分析。计算机分析时, 精子不能被圈上或圈上的精子比视野实际精子个数少。

3.2 故障分析

因CASA系统识别精子是根据人为而设定的大小和灰度来判断, 准确性受到精液细胞成分和非细胞颗粒的影响。

3.3 故障排除

调节中心阈值, 可在分割中剔除比精子小的杂质。将显微镜物镜的倍数和软件上的倍数调为相同的倍数, 将新域值的数值增大, 使精子圈上为止。

由于本系统是以精密光学仪器和电子计算机等先进电子仪器为主的设备, 检测标本又有其特殊性 (要求在一定时间内完成) [2], 因此, 只有在日常工作中加强实验室质量改进, 掌握计算机系统维护及故障排除, 才可以确保医疗设备安全有效的运行, 确保实验结果的准确性, 提高本系统使用寿命, 为临床提供可靠依据。

参考文献

[1]黄宇烽, 许瑞吉.男科诊断学[M].上海:第二军医院大学出版社, 1999.

氧化应激对精子质量的影响及预防篇4

1 精液中活性氧的来源

精液中活性氧主要由白细胞和未成熟的精子产生。在生产人工授精用的精液时, 对精液反复离心、冷冻解冻, 尤其是生产猪冷冻精液时需要离心处理, 使活性氧大量产生。

精液中的白细胞主要来自前列腺和精囊腺。白细胞, 尤其是中性粒细胞和巨噬细胞, 与ROS的过量产生有直接的关系。产生活性氧是白细胞破坏病原的主要机制, 活性氧在杀死病原的同时也导致了精子功能异常。

2 氧化应激对精子的影响

精液中含有少量的ROS是正常的生理现象, 生理水平的活性氧在精子生理学方面发挥重要作用, 激活精子的获能、顶体反应和精子的超激活, 有利于精子穿过卵丘和透明带, 增加精子膜与透明带ZP3蛋白的结合, 最终引发精卵融合。当ROS大量存在, 超过了抗氧化系统的清除能力和精核独特紧密结构的防御能力时, 就发生了氧化应激, 而且精子缺乏对氧化应激损伤的修补机制, 对精子造成不可逆的损伤。活性氧直接破坏精子的细胞膜和DNA, 降低精子的活力、穿透卵子的能力以及父系遗传物质在胚胎发育过程中的作用。

精子结构特殊, 细胞质含量较低、膜含有高浓度的不饱和脂肪酸并且尾部含有丰富的线粒体, 极易受活性氧的攻击。不饱和脂肪酸含有较多的双键, 在过量活性氧的攻击下发生脂类过氧化反应, 脂肪酸失去双键, 导致精子膜失去流动性, 膜的流动性是精子运动、顶体反应和精卵融合等受精过程所必需具备的条件。脂质过氧化产物, 特别是醛式产物, 如丙二醛 (MDA) 对细胞具有毒性作用, 破坏膜结构的完整性, 可使膜通透性增加。精子膜结构和功能的改变, 使其失去了对参与精子运动调控的有关胞内离子浓度的调节能力。采用低渗膨胀试验检查精子膜结构和功能完整性时, 低膨胀率与氧化应激引起的膜损伤有直接的关系。ROS可使与精子运动相关的酶, 如酪氨酸、色氨酸、鸟氨酸等硝基化或羟化以及巯基氧化, 使这些与精子运动有关的重要的酶的活性部位被破坏甚至酶活性被抑制、灭活, 从而影响精子的运动。ROS还可以破坏精子产生能量的场所——线粒体, 导致ATP耗竭, 失去运动所需能量的供应。氧化应激破坏了精子膜以及能量供应, 精子的运动能力下降甚至消失, 降低了受精率。

ROS在影响精子运动能力的同时, 也破坏了精子内的遗传物质。精子是一种结构特化的细胞, 含有大量的父系遗传物质——DNA, 当精液中ROS的量超过生理水平时, ROS直接破坏DNA的嘌呤、嘧啶碱基和脱氧核糖骨架, 导致碱基变异、缺失、DNA交联和染色体重组或者DNA链的断裂。精子DNA破坏后, 父系基因在胚胎发育中的作用受到影响, 直接影响胚胎的发育, 受精卵异常卵裂、胚胎不能着床、早期死亡或者产下畸形胎儿。实践中人工授精后家畜出现返情, 尤其是返情时间拖后, 并不是卵子没有受精, 而是各种原因引起的胚胎早期死亡, 即隐形流产, 其中父系基因缺失引起的胚胎异常是一个主要原因。

3 如何降低氧化应激对精子的影响

精液中有许多抗氧化机制防止氧化应激的发生, 允许发生正常的氧化代谢和细胞内信号传导。精浆中含有酶类抗氧化剂和非酶类抗氧化剂两种保护机制防止氧化应激的发生。酶类抗氧化剂如超氧化物岐化酶 (SOD) 、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶, 灭活超氧阴离子和过氧化氢, 均是防止脂质过氧化发生的物质。非酶类的抗氧化物质如抗坏血酸 (VC) 、α-生育酚 (维生素E) 、谷胱甘肽、氨基酸 (牛磺酸、亚牛磺酸) 、白蛋白、肉毒碱、胡萝卜素等直接中和自由基;转铁蛋白、乳铁蛋白、血浆铜蓝蛋白保护精子膜的免受脂质过氧化的危害。

在生产人工授精用的精液时, 需要对精液进行前期处理, 这些处理过程不可避免的增加了活性氧的产生, 冷冻解冻过程破坏了精液中的抗氧化酶的活性, 造成了活性氧清除效率的下降。尤其是猪的精液, 离心去除精清的操作造成活性氧大量生成, 目前在实验室操作中采用玻璃棉过滤或上游处理技术浓缩精液, 可以大量降低活性氧的产生。

精液稀释液在发挥各种保护作用的同时也起到了抗氧化应激的作用。海藻糖在发挥抗冻剂作用的同时明显降低了精液中活性氧的含量。在稀释液中添加B族维生素 (叶酸、维生素B6、维生素B12) 是一种即经济又实用的方法;在稀释液中添加过氧化物酶、SOD、维素素C、维生素E、EDTA、肉桂酸、谷胱甘肽、次牛磺酸等抗氧化剂, 可以降低氧化应激对精子的损伤。亚油酸和维生素E可以保护抗氧化酶的活性, 有效抑制精子膜不饱和脂肪酸的过氧化反应。甲基黄嘌呤类物质如咖啡因可以提高鲜精和冻精的精子活力、刺激精子获能和顶体反应, 其保护作用与抵抗活性氧和减少精子质膜中脂类物质过氧化有关。丁羟基甲苯 (butylated hydroxytoluene, BHT) 有效抑制精子质膜过氧化反应。谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 是一种广泛存在于活细胞内的三肽, 在细胞内抗氧化应激反应中发挥着重要作用。但是目前商业化的稀释液中除了添加白蛋白和氨基酸还没有其他抗氧化剂的添加。

辅助生殖技术中精子质量低下的对策篇5

1 ART技术对精子质量的要求

卵母细胞要取得满意的受精机会, 一定数量的活性精子是基本条件。这对于人工授精和常规体外受精-胚胎移植 (in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET) 十分重要, 否则会严重影响治疗的效率。在ART过程中对精子的质量判断常常是基于光镜下的无创伤观察, 如精子的密度、活力或大致形态。而对于其内在的遗传特性、其他生物学特性和详尽的形态学特性难以进行判断。

1.1 人工授精对精子的要求

在宫颈内人工授精 (intra cervical insemination, ICI) 中, 对精子的质量要求与正常精液一致, 就是说在精液 (或精子悬液) 中活性精子的密度不少于8×106/ml, 且体积可以浸沐宫颈外口;有效的宫腔内人工授精 (intra uterine insemination, IUI) 要求注入宫腔的精子不少于0.5×106个 (0.3~0.5 ml) , 为保障临床有效, 一般要求1×106~3×106个精子为宜。过多的精子注入不能改善结局, 还可能存在潜在的风险。

1.2 IVF-ET对精子的要求

在常规IVF-ET方案中, 不同的授精方法对精子质量要求不同。在大体积受精培养 (1 ml体积的授精池) 中, 活性精子的密度不少于30×103/ml, 而临床实际方案中活性精子密度常在0.1×106/ml~0.3×106/ml;在微体积受精培养 (0.05~0.1 ml受精液滴) 中, 要求液滴内活性精子不少于3×103个, 而临床实际方案中活性精子为5×103个。授精时一般将精子悬液制备成10倍于工作密度, 按1∶9的体积比加入授精池内。授精池中的精子密度过高不利于优化受精池内的化学环境。

2 精子质量低下的可能因素

精子质量低下可能是源于精液质量的一般状态较差或在治疗时偶然取出的精液差, 或精子分离效率低。临床上以精液偶然差为多见。精液质量差是否影响到技术实施, 还受到精子分离方法的影响。由于在离心过程中过大的离心力可能对精子构成损伤, 精子分离中须控制离心转速, 故精液中精子的回收率约在25%~40%。相比较于上游法, 梯度离心的精子分离效率略高, 标本间的分离效率差异低。在IVF中, 正常精子形态率低于1%时, 可能伴有受精功能障碍, 在ART中应当给予关注。精子正常形态率过低常常是精液本身因素形成的。精子分离后获得的悬液其形态学有一定改善, 但作用有限。

3 治疗前的精子评估

在技术实施前和精子分离前对精液实施评估是避免和有效处置ART中精子质量低下的前提条件。包括以下措施。

3.1 充分评估精液质量

避免ART中精子质量低下, 首先要对精液进行准确评估, 正确掌握适应证。没有规律的多变性是精液变化的规律, 对精液判断要采取多次检查综合进行。检查的次数越多, 对精液的判断越准确。一般对精液的检查不少于2次, 变化较大者, 应3次以上的观察。精液质量波动大, 发生偶发精子质量低下的概率高。对于这类病例, 可以采取相应的技术准备和预防, 如精液冷冻储备。

精液检查的主观性较大, 严格精液检查方法与标准有利于对精液的准确判断和避免因治疗前误判导致技术实施时精子质量低下。实施ART的人员与精液分析人员时常共同讨论, 统一标准, 有利于正确的精液评估。

3.2 预精子分离

对于精液处于边缘状态的精液, 在ART启动之前, 按技术的标准程序对精液进行处理, 以判断精液是否可以达到技术的要求, 预先选择恰当的精子分离方式, 避免技术实施中精子质量低下情况发生。尽管各个实验室精子回收效率有区别, 一般而言当精液内活性精子小于2×106时, 应当注意精子质量低下问题, 有必要预精子分离, 以正确掌握指征和制定个体化的精液处理方法。

3.3 精子分离前的精液预检

在精子分离前, 对精液进行简单分析, 初步估计精液中精子的密度、活力等, 有利于选择恰当的精子分离方法, 对于避免精子质量低下有较大的帮助。

4 ART技术中精子质量低下时的处理

4.1 精子质量低下时的人工授精

人工授精中, 在排卵期实施人工受精时取出的精液质量差, 难以满足治疗的质量要求的情况在临床上时有遇到。这时在临床上要经过恰当处置, 保障注入的活性精子达到技术有效性的要求。

4.1.1 ICI

ICI多用于性功能障碍, 所用的精子一般处于精液原液状态。当取出的治疗精液为少、弱精子状态时, 或精液量过少、不能浸沐宫颈外口时, 应改为宫腔内人工授精。

4.1.2 IUI

取得的精子悬液质量与精液质量密切相关。不能达到IUI精子质量要求的病例, 宜采取其它的治疗方案。临床上常常遇到这种情况, 在实施IUI时取得的精液质量差, 不能通过常规精子分离技术得到合格的精子, 这时需要进行以下处置以改善受孕。

4.1.2.1多单元精子分离

通常精子分离时只应用了0.5~1 ml的精液。当治疗用的精液质量较差时, 可以将全部精液用于精子分离。将精液分为0.5~1 ml进行多单元初次分离后再集中洗涤, 有利于提高分离的精子悬液质量。

4.1.2. 2 增加分离液与精液的接触面积、延长上游时间

如果采用上游法分离精子, 增加分离液与精液的接触面积、延长上游时间有利于提高精子回收率, 改善精子质量。通常情况下, 通过上游法分离精子时将试管倾斜45°, 上游时间为45分钟。当精液质量差时, 可将倾斜度提高到60°, 上游时间延长到90分钟。

4.1.2. 3 加大离心力

通常精子分离中采用150~200 g、10~15分钟离心进行精子洗涤。虽然这个离心力不足以沉淀全部的精子, 但可避免离心力过大可造成精子离心损伤。但当精液质量差, 不能得到质量合格的精子的情况下, 保障精子悬液中活性精子的数量对保障技术质量更为重要。当估计分离出的活性精子数量不足的情况下, 通过适当增加离心力提高精子回收率有利于改善技术结局。必要时可采用300~500 g洗涤精子, 但离心时间要略为缩短。

4.1.2. 4 全精液洗涤

对于精液质量明显低下, 估计以上措施仍然不能达到精子基本要求的情况下, 可不经精子优选, 直接将全部精液洗涤后行IUI。当然, 大量非有效成分进入女性宫腔有可能导致感染和其他的潜在风险增加。

4.1.2. 5 保留弃去液

精子分离过程中暂时保留弃去液, 等待分离完成、检查满足使用要求后在弃去。如果精子质量低下, 可再补救回收精子。

4.2 IVF-ET

IVF-ET程序复杂, 费用昂贵, 在技术实施中, 精子质量低下不但对患者产生较大的心理负担, 而且带来较大的经济损失。当遇到精子质量低下时, 可以采取一定的措施改善结果。

4.2.1 调整精液处理方法

上述人工授精精液处理中提高精子回收率的方法都可以用于IVF-ET中的精液分离, 提高精子质量。

4.2.2 集中短时授精

得到的精子悬液质量低下、卵母细胞难以按常规方法受精时, 可将卵母细胞集中授精。做法是在精子分离的最后步骤, 所分离的精子放入0.5~1 ml受精液内 (密度不少于30×103) 。然后将所得到的卵母细胞全部放入精子悬液中, 1~2小时取出卵母细胞, 再按常规IVF-ET培养。将卵母细胞集中受精时细胞密度较大, 难以维持理想的生化环境, 不利于卵母细胞, 受精培养时间不宜长。

4.2.3 卵胞浆内单精子注射 (ICSI)

在IVF-ET中, 当精子悬液的质量不能满足技术要求时, 经患者同意后可改为ICSI。

4.2.4 受精失败的预防和补救措施

精子质量低下容易导致受精失败。因此, 进行受精失败的预防和补救较为必要。通常采用的方法有half ICSI、晚补救IC-SI和早去颗粒细胞-早补救ICSI。

Half ICSI是预防受精失败的常用方法。但在精子质量低下、患者同意ICSI的情况下采用half ICSI是否合理值得思考。如患者对ICSI顾虑较大、全部卵子受精失败的可能性大时, 采用half ICSI也是一个有效的选项。

晚补救ICSI是对受精失败的卵母细胞进行ICSI, 以期望进行补救, 达到卵母细胞受精的目的。由于补救ICSI常常在取卵后20小时或以后进行, 这时卵母细胞的功能已经减退, 虽然可以达到一定的受精率 (约40%~70%) , 但胚胎质量差, 再加上胚胎与子宫内膜同步性的问题, 效果很不理想, 得到临床妊娠的机会很低, 一些研究者不主张实施晚补救ICSI。

在国内, 近年来早去颗粒细胞-早补救ICSI在患者中常有实施。方法是在IVF-ET授精4~6小时 (此时如受精, 卵母细胞排除第二极体, 但原核尚未形成) 后去除卵母细胞外围颗粒细胞, 观察是否出现第二极体, 对没有出现第二极体的卵母细胞实施ICSI, 避免卵母细胞受精失败。由于发现卵母细胞受精失败的时间和实施补救ICSI的时间大为提前, 临床结局明显优于晚补救ICSI。尽管早去颗粒细胞-早补救ICSI具有一定潜在的风险, 多数学者认为不应成为常规的临床方案, 但在精子质量低下的情况下避免受精障碍无疑具有较大的优势。

精子质量检测系统篇6

关键词：硒,亚急性中毒,小鼠,精子质量,微量元素

硒是人体和动物必需的微量元素, 缺硒会引发多种疾病[1,2]。在饲料中添加硒能够增加动物的抗病能力, 但如果添加剂量稍大或摄入时间过长就会引发急性或慢性硒中毒[1,3,4]。为了进一步了解硒的雄性生殖毒性, 试验研究了在亚急性染毒条件下, 硒对小鼠精子密度、精子活率和精子畸形率的影响, 评价硒对精子质量的毒性。

1 材料

1.1 试验动物

清洁级健康昆明小鼠120只, 雄性, 5~6周龄, 体重为12~16 g, 由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。购回适应饲养1周后用于试验, 适应期及试验期均进行常规饲养管理。

1.2 药品

亚硒酸钠 (Sodium Selenite) :白色粉末, 分析纯, 含量为98%以上, 由上海三浦化工有限公司提供。

2 方法

2.1 亚急性硒中毒模型的构建

将试验小鼠分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组, 每组30只, 进行30 d的亚急性毒性试验, 试验小鼠均以灌胃的方式染硒。灌胃前, 各组小鼠禁食4 h, 灌胃液放至室温, 灌胃时以小鼠体重计, 并严格遵照每只小鼠灌胃量为0.01 m L/g的原则。3个染硒组分别按照0.135 mg/kg、0.540 mg/kg、2.160 mg/kg剂量浓度灌胃[5], 对照组灌胃纯化水, 灌胃后放回笼中, 自由饮水, 并于灌胃后3 h自由采食。

连续攻毒30 d, 每隔10 d采样1次, 各组随机选取10只, 小鼠停食4 h处死, 解剖、采样。

2.2 检测项目与方法

2.2.1 睾丸脏器系数的检查

处死前用电子天平称取小鼠体重 (g) , 处死后用酒精棉球消毒腹部开口部位被毛及皮肤, 剪开腹壁, 雄性鼠称取睾丸重。睾丸脏器系数=睾丸重量 (mg) /体重 (g) 。

2.2.2 精子密度、精子活率、精子畸形率的检查

采用剥离的方法采集输精管精子, 采精时每只公鼠所用稀释液体积相同, 可以计算每毫升精液中精子的相对密度, 即将每只公鼠的精液均按照0.05 m L计算, 用1.0 m L液体以稀释20倍计算, 计数前先将保存的精液二次稀释10倍, 即总稀释倍数为200倍。

精子的计数采用改良纽巴 (Neubauer) 氏血细胞计数板。用吸管吸取二次稀释的精液, 放于计数室与盖玻片接触处, 使精液自然流入计数室中。计数中间5个中方格 (对角5个或四角及中间) 内80个小方格的精子数, 计数值为X, 按照简化公式X×10 000 000即可计算出每毫升输精管精液中精子的密度。

计算精子活率时, 先计数死精子的X1值, 将计数器置于50℃水浴锅中的搪瓷盘中, 在50℃条件下10 min杀死精子, 计数总精子数X2值。精子活率= (X2-X1) /X2, X2×107为精子相对密度。计数时每份精子用3个计数板重复计数3次, 取平均值。

精液中形态不正常的精子称为畸形精子。精子畸形率是指精液中畸形精子数占总精子数的百分比。检查畸形精子时, 取1小滴保存精液滴在载玻片上, 将样品滴以拉的形式制成抹片。用1%伊红染色5 min, 自然干燥, 水洗后镜检。检查不同视野的500个精子, 计算其中所含的畸形精子数, 求畸形精子百分率。当数到最后一个视野时, 即使已有500个精子, 也应将视野内所有精子计数完成。

3 结果与分析

3.1 睾丸脏器系数 (结果见表1)

注:规定各剂量组代号对照组为a (A) , 低剂量组为b (B) , 中剂量组为c (C) , 高剂量组为d (D) ;规定各时间组代号10 d为e (E) , 20 d为f (F) , 30 d为g (G) 。数据肩标表示某组与本组之间有差异, 即小写字母表示差异显著 (P<0.05) , 大写字母表示差异极显著 (P<0.01) , 未标记表示该组与其他组之间差异不显著 (P>0.05) 。

由表1可知, 各时间点对照组睾丸脏器系数逐渐增加, 但差异不显著 (P>0.05) , 低、中剂量组睾丸脏器系数随染硒时间的延长而逐渐减小, 但差异不显著 (P>0.05) , 高剂量组睾丸脏器系数随染硒时间的延长明显减小, 其中染毒10 d与30 d相比差异极显著 (P<0.01) 。染毒10 d中、高剂量组睾丸脏器系数有所减小, 中剂量组与对照组相比差异显著 (P<0.05) , 与低剂量组相比差异极显著 (P<0.01) , 高剂量组与低剂量组相比差异显著 (P<0.05) ;染毒20 d中、高剂量组睾丸脏器系数与对照组相比极显著减小 (P<0.01) , 低剂量组与高剂量组相比差异显著 (P<0.05) ;染毒30 d各组睾丸脏器系数与对照组相比均明显减小, 低剂量与对照组相比差异显著 (P<0.05) , 中、高剂量组与对照组相比差异极显著 (P<0.01) 。

3.2 精子密度、精子活率、精子畸形率

3.2.1 精子密度与精子活率的检查结果见表2。

由表2可知:精子密度随染硒剂量的增加逐渐减小, 从对照组到高剂量组, 各组间存在极显著差异 (P<0.01) ;精子活率随染硒剂量的增加而降低, 低、中、高剂量组与对照组相比差异极显著 (P<0.01) , 低剂量组与高剂量组相比差异极显著 (P<0.01) 。

3.2.2 精子畸形率的检查结果见表3。

由表3可知, 各染硒组精子畸形率明显升高, 对照组与染硒各剂量组相比差异极显著 (P<0.01) , 低剂量组精子畸形率极显著高于对照组 (P<0.01) , 中、高剂量组的精子畸形率极显著高于对照组和低剂量组 (P<0.01) , 但中、高剂量组间差异不显著 (P>0.05) 。

各染硒组小鼠的精子畸形率均有所增加, 出现的精子畸形主要有胖头、双头, 颈部膨大, 尾部弯曲、不全、回旋、双尾等 (见161页彩图1) 。

4 讨论

亚硒酸钠作为饲料添加剂可以提高动物的抗病能力和繁殖性能, 预防多种硒缺乏症的出现, 但目前尚无统一的用药标准, 如果添加剂量过大, 即可导致毒性反应的发生。在国内外, 为了补硒而出现大量的富硒饲料、富硒食品以及人为添加硒的背景下, 硒中毒的病例逐年增加, 针对硒中毒的研究主要集中在硒的急性和蓄积性毒性试验, 对免疫器官的影响和胚胎致畸的影响方面[6,7,8]和其他金属或非金属元素相比, 有关硒的雄性生殖毒性研究很少。

脏器系数的变化在排除体重变化的影响下, 可以较好地反映化学毒物对该脏器的毒性综合情况, 也可以证明化学毒物对该脏器的病理学改变的可能性。试验结果表明, 对照组睾丸脏器系数随时间的延长而逐渐增加, 但各时间点无显著性差异, 可能是小鼠体重增长速度快导致的。随染硒剂量的增加和时间的延长, 各染硒剂量组睾丸脏器系数呈下降趋势, 呈现明显的时间-剂量-效应关系, 与其他学者的研究结果相似[9,10]。周景明[9]指出, 中毒公兔畸形精子数明显增多, 与对照组相比差异显著, 精子负染后电镜观察结果表明, 许多精子表现为顶体膨胀或脱落, 颈部肿胀, 轴丝外露, 尾部卷曲, 末稍松散。李贤相等[11]报道, 大鼠硒中毒后出现精子计数、精子活力降低, 精子畸形率升高, 畸变类型以折叠为主。这些结果均提示雄性动物硒中毒后性欲减退, 精子形成不良, 精液品质下降。单旭东[12]研究发现, 当饲料中添加的硒含量大于1 mg/kg时对小鼠的精液质量, 包括活力、畸形率和顶体完整率等造成不良影响, 过量添加铬和硒对雄性小鼠的繁殖性能将造成不良影响。

本试验结果与其他学者的研究结果相近, 硒中毒后小鼠精子密度随染硒剂量的增加逐渐减小, 从对照组到高剂量组, 各组间存在极显著差异 (P<0.01) , 高剂量组降至对照组的1/3左右, 各组间呈现剂量-效应关系;精子活率随染硒剂量的增加而降低, 低、中、高剂量组与对照组相比差异极显著 (P<0.01) , 各组间呈现剂量-效应关系;各染硒组小鼠的精子畸形率均增加, 与对照组相比差异极显著 (P<0.01) , 随染硒剂量的增加精子畸形率有所升高。

5 结论

硒中毒可影响雄性小鼠生长发育, 阻碍睾丸的发育甚至引起睾丸萎缩, 影响精子的生成和发育, 降低雄性小鼠的生殖机能。

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哺乳动物冻融精子质膜检测方法研究篇7

关键词：哺乳动物,精子,质膜,检测方法

行客观、准确的评价极为重要。根据精子的特性, 利用光学显微镜、荧光显微镜、流式细胞计数仪等仪器, 结合常规染色技术或荧光探针技术, 通过检测精子染色质的状态、运动能力、质膜完整性、顶体的状态、线粒体的活性、获能、顶体反应以及与卵子的结合能力等指标来评价精子的功能状态, 可准确预测精子的受精能力。

由于普通光学显微镜检测精液存在主观性、可变性以及与受精能力相关性差等缺点, 近年来, 出现一些新的技术用于精子检测, 可以更加细致地评价精子的特性。荧光染色技术可用于评价精子的特殊性质和功能, 包括质膜完整性、获能状态和顶体状态;联合使用荧光染料, 可以同时检测精子多种功能特点;流式细胞仪可以在短时间内分析大量的经荧光标记的精子;计算机辅助精子分析系统可以提供精子活力和形态学上客观的、详细的信息。有研究表明, 由于冷冻造成的精子结构和功能的变化是导致受精能力降低的根本原因[1], 因此采用快速、准确的方法对精子质膜完整性进行检测以确定精子的受精能力。试验就哺乳动物冻融精子质膜完整性的检测方法进行综述, 以期为哺乳动物冻融精子在生产中的推广应用提供参考。

1 精子膜的生物学特性

精子膜是一种起限制、保护作用的半通透性生物膜。质膜是精子最外层的细胞结构, 对细胞内、外起生理屏障的作用, 其完整性与精子正常的生理功能、新陈代谢、获能、顶体反应、雄配子和雌配子的结合、精子与卵细胞的融合过程有直接联系。有研究认为, 精子质膜是最易损伤的部位[2,3], 其完整性是精子存亡的间接指标[4]。精子质膜完整性主要包括头膜完整性和尾膜完整性, 只有头膜与尾膜结构都完整的精子受精能力最强[5]。但精液经冷冻保存后, 由于冷冻-解冻过程的物理和化学效应直接作用于精子膜, 精子的头膜与尾膜完整性不可避免地受到损伤, 且损伤后的精子受精能力有所下降。因此, 阐明冷冻精子质膜完整性状态对了解精液品质和精子受精能力极为重要。目前, 随着冷冻保存技术的发展, 对哺乳动物冻融精子质膜完整性检测的方法也不断改进。

2 哺乳动物冻融精子质膜完整性检测方法

以往报道的精子质量检测方法大多在形态学观察水平上, 随着冷冻保存技术和检测方法的改进, 研究者们不断完善精子质量的检测方法, 尤其是对质膜完整性的检测方法。目前, 检测精子质膜完整性的方法主要包括低渗肿胀试验 (HOS) 、低渗肿胀-伊红拒染结合试验 (HOS-EY) 、双荧光探针法和流式细胞术 (FCM) 等方法。

2.1 低渗肿胀试验

HOS是利用正常精子尾部细胞膜在低渗溶液中的膨胀形态, 作为判断精子受精能力的一种间接试验手段。基本原理:精子质膜能够有效地运输分子, 质膜完整的精子在低渗溶液中时, 膜内渗透压高于膜外渗透压, 水由膜外进入膜内, 最终达到膜内外渗透压趋于平衡, 内流的水会使精子的体积增大, 导致精子尾部呈不同程度肿胀, 出现弯曲, 这样的精子结构完整, 功能良好, 具有良好的受精能力。如果精子质膜结构受损或不完整, 则精子质膜内、外渗透压相同, 水不能由膜外进入膜内, 从而出现精子尾部不肿胀或肿胀不完全现象, 这样的精子功能欠佳, 受精能力差, 因而统计精子尾部的弯曲率可作为评价精子质膜完整性的标志[6]。

常用的操作方法:吸取精液0.1 m L加入装有1 m L低渗溶液的试管中混匀, 37℃水浴30 min, 取出后, 室温静置1 min, 吸取滴片10μL, 用高倍镜 (400×) 镜检, 检出膨胀精子数, 计算百分率。

1966年, Drevius和Eriksson首先发现了将牛精子置于低渗溶液中时精子尾部出现肿胀的现象[7], 而且随着溶液渗透压的进一步降低, 精子最终会溶于其中。1984年, Jeyendran P S[8]发现处于低渗溶液中人的精子尾部也可发生不同程度的膨胀, 说明精子尾部低渗肿胀试验可以较直接地反映精子整体的功能, 也可间接判断精子的受精能力。1999年, 张保平等[9]用HOS对人精子进行检测, 发现经低渗处理后, 质膜结构完整的精子尾部呈不同程度肿胀, 肿胀程度最好的精子呈“g”型, 提示这种精子具有潜在的受精能力, 而质膜结构受损或不完整的精子尾部不肿胀或肿胀不完全, 这样的精子功能欠佳, 受精能力差。证明HOS可作为体外精子质膜功能及完整性检测的有效手段。

精子尾部的功能是运动, 其功能状态直接影响精子活率。张秀成[10]研究发现, 精子低渗肿胀率与金黄地鼠卵子穿透试验、精子活率、正常形态精子百分率具有很好的正相关性。由于HOS在衡量质膜完整性上具有简便、快速、廉价等优点, 目前已经用于牛、猪、羊、狗、小鼠等动物和人精子的质膜功能完整性检测[11]。但是, 为了更好地标志精子膜的整体功能, 即同时检测精子头膜和尾膜的功能, 还需对此方法进行改进。

2.2 低渗肿胀-伊红拒染结合试验

曾有报道评价精子经冷冻保存后质膜完整性的改变, 但检测多局限在精子的1个部位, 未能同时揭示单个精子头膜与尾膜损伤的状态, 即使用荧光显微镜或透射电镜的方法也很难在基层实验室普遍应用。近年世界卫生组织推荐Jeyendran P S的HOS和Elias S R的EY应用于对人类精子的评价。HOS检测精子尾膜完整性, EY反映精子头膜完整性, 其原理是在HOS的基础上, 加入伊红液制成HOS-EY低渗染液。将精子置于伊红染液, 若头膜完整, 伊红分子不能进入膜内, 精子核不被染色;若头膜损伤, 其拒染性丧失, 精子核着色。因此, 结合这两种方法形成单一试验 (HOS-EY) 可以避免HOS或EY只显示精子1个部位膜状态的局限性, 而且试验简便、结果直观。

基本操作方法:取新鲜或冷冻精液0.1 m L加入1 m L低渗液中, 混匀。37℃水浴后, 再加入伊红低渗液0.1 m L, 混匀。2 min后取样置于光镜下观察精子头部着色和尾部肿胀情况, 按以下4种精子类型进行统计, 计算百分率。Ⅰ型为头红染 (EY+) -尾不肿胀 (HOS-) ;Ⅱ型为头红染 (EY+) -尾肿胀 (HOS+) ;Ⅲ型为头未染 (EY-) -尾不肿胀 (HOS-) ;Ⅳ型为头未染 (EY-) -尾肿胀 (HOS+) 。基于精子头部和尾部的形态学变化, 4种精子类型分别提示, Ⅰ型是头膜和尾膜同时发生损伤的精子, Ⅱ型和Ⅲ型是膜损伤分别发生在头部或尾部的过渡型, Ⅳ型是头膜和尾膜都完整的活精子。

王立强等应用伊红低渗溶液对犬、猪、牛、鸡活精子的代谢能力进行评定, 同时用常规精子评定法进行评定, 发现经伊红低渗溶液处理后, 生理代谢正常的精子表现为头部不着色, 膨胀, 尾部弯曲;生理代谢不正常的精子表现为头部着色, 但不膨胀, 尾部也不弯曲。精子活率与头部膨胀率之间存在正相关关系;精子活率与头部染色率之间存在负相关关系。采用常规方法测得的精子活率与HOS测得的精子尾部膨胀率结果一致, 研究表明在牛、猪、鸡、犬精子活率与质膜完整性评定上HOS-EY是一种行之有效的方法。

吴裕伦等用HOS-EY对人精子头膜和尾膜完整性进行检测, 发现精子尾部肿胀率与精子活率呈现显著的正相关, 与精子死亡率呈现显著的负相关。研究表明, 当精子活率越高、死亡率越低时, 精子尾部低渗肿胀率越高, 提示精子尾膜的完整性越好。经低渗液处理的精子用伊红染色后, 低渗溶液中活精子尾部低渗肿胀率均在90%以上, 且随着低渗溶液浓度的不断下降, 精子头膜的完整性不断受到损害。随着低渗溶液稀释倍数不断增加, 尾部肿胀精子中的伊红着色率不断下降, 证明精子头膜与尾膜对低渗溶液的顺应性并不一致, 同时也证明不同浓度低渗肿胀试验结合伊红染色可正确评价精子质膜的整体功能。

朱伟杰等建立HOS-EY对人冻融精子质膜完整性进行检测, 按照精子尾部是否肿胀和头部是否着色分为4种类型进行统计, 发现4种类型精子发生率与冷冻前相比均有显著性差异, 表现在经冷冻保存后, 头膜-尾膜均完整的Ⅳ型精子发生率和头膜-尾膜均损伤的Ⅰ型精子发生率分别显著减少和增多。研究表明:冷冻-解冻过程对精子质膜完整性有严重影响;头膜损伤-尾膜完整的Ⅱ型精子发生率在冷冻组显著增多, 提示精子头部或尾部的冷冻损伤是独立发生的, 且头膜较尾膜易损伤;冷冻精子Ⅳ型精子发生率与冷冻精子活率呈显著正相关, 但与冷冻精子穿卵率不相关。

研究表明, HOS-EY可作为哺乳动物精子受精能力的评定方法, 也可作为冷冻对精子质膜造成损伤的有效检测手段, 且此方法简便、直观及具有实用性, 易于在基层推广应用。

2.3 双荧光探针法

随着生物技术的不断发展, 荧光探针技术以其具有灵敏度高、选择性好、样本用量小的特点在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要作用。荧光探针技术的发展, 为评价精子的功能状态提供了新工具, 而复合的荧光探针要比单一的荧光探针在评价精子质膜完整性方面更具优越性。双重荧光标记探针的结合使用不仅可以直接测出精子活力的2个参数 (精子内的酶活性和质膜完整性) , 还可以测定精子的存亡。双荧光探针法现已被用来评价多种动物的精子活率, 基本原理:碘化丙锭 (PI) 是不透性膜还是对死亡精子特异的荧光染料, 当PI遇到质膜破损的精子时, 染料可进入细胞与DNA结合;羟化荧光素 (CMFDA) 是通透性膜还是对活精子特异的荧光染料, 当CMFDA遇到精子细胞时, 能进入细胞膜完整的精子细胞, 并在活的细胞内被非特异性酯酶水解, 形成一种很强的荧光染料, 发绿色荧光。双荧光探针法是联合使用这2类染料, 使精子表现3种不同的染色类型:被CMFDA染成绿色的活精子;被PI染成红色的死亡精子;同时染上并发出2种荧光的双阳性精子, 正处于由活到亡的过渡状态。

操作方法:将精液稀释后放入1 m L的PBS中, 加现配的染色液40μL (1.7 mol/L甲醛, 20μmol/L CMFDA, 7.3 mol/L PI) , 33℃孵育10 min, 取10μL滴片, 立即置荧光显微镜 (400×) 下观察, 分类并计数, 计算百分率。

张旭刚等利用PI结合CMFDA双荧光探针标记, 检测和比较冷冻对山羊精子质膜完整性的影响, 发现山羊精液经冷冻-解冻处理后, 精子的活率和质膜完整率明显降低, 证明冷冻过程对山羊精子质膜造成了严重损伤。与传统精子检测方法相同的是, 双荧光探针法也可用来检测精子质膜的完整性, 但是荧光显微镜只能检测少部分冻融精子的质量, 指标单一, 易受操作者的主观影响, 这对预测精子整体受精潜能有局限性。因此, 为了更加快速、准确地反映精子的生育力, 还需寻找可以同时检测多个指标, 检测出具备多种特性、功能完整的精子的方法。

2.4 流式细胞术

近年来, 随着生殖生物学的发展和人类对辅助生殖技术的迫切需求, 以精子形态学观察为主的传统检测方法已不能满足人们的需要, FCM正是作为精子功能研究的一种快速、客观、多指标的检测手段而出现的, 基本原理:用特异荧光探针标记的单细胞悬液在管道中稳定地流动, 当精子细胞依次经过喷嘴时, 经恒定功率的激光束激发后产生散射光和激发荧光。这2种信号同时被前向的光电二极管和侧向的光电倍增管接收, 经计算机处理, 细胞的一系列特性就被快速、准确地测定。在此基础上, 可根据有关参数把所需的细胞亚群从整个样品中分选出来。

操作方法:将新鲜精子和冻融精子样品直接收集到10 m L的离心管中, 800 g离心5 min;弃上清液, 用缓冲液 (Annexin V-PI检测试剂盒) 稀释, 加入胰蛋白酶2μL消化5 min;然后用缓冲液洗涤2次, 800 g离心5 min;再用缓冲液重新悬浮精子, 使精子细胞浓度为 (1~2) ×105个/m L。取精子悬液195μL, 加入Ann-FITC (Annexin V-PI检测试剂盒) 5μL, 在室温下孵化10 min。然后加入PI染液10μL, 室温下避光孵育10~15 min, 利用FACS-Calibur型流式细胞仪检测。流式细胞仪氩离子激发光波长为488 nm, 光源为200 m W, 检测每个精子的前向角散光和侧向角散光, 用波长为520 nm的通带滤器检测FITC荧光, 用另一波长大于610 nm的滤器检测PI。

李新红等用3种不同的防冻液稀释精液且经程序冷冻制成细管冻精后, 用荧光显微镜及流式细胞仪对冷冻复苏后的猪精子质膜完整率和凋亡状况进行测定, 比较不同检测方法评估猪冻融精子活率的差异性, 发现正常活精子Annexin V、PI均低染, 凋亡精子Annexin V高染、PI低染及坏死精子Annexin-V、PI均高染。研究表明:冷冻保存会造成猪精子质膜膨胀断裂或损伤, 而导致精子凋亡比例增加;利用SYBR-14/PI染色荧光显微镜法往往高估冻融精子的死亡率, 而采用Annexin-V/PI染色流式细胞术能准确测出猪冻融精子质膜完整率及处于凋亡状态的数量, 这对选择活率高且早期凋亡率小的冻精样品用于实际生产具有重要意义。

目前, FCM应用于精液质量的检测主要是在人, 家畜 (牛、羊、马、猪、狗、兔) 及实验动物 (大鼠、小鼠) 中进行, 在野生动物方面还未见报道。虽然FCM具有快速、客观、多指标检测、大通量等优点, 可以有效避免其他检测方法的主观性, 但FCM的应用仍处于实验室阶段, 且流式细胞计数仪价格昂贵, 很难在基层生产中广泛使用。

3 小结

动物精子在冷冻-解冻过程中, 其质膜是易损伤的部位, 而精子必须保持一定活力及结构完整性才能完成其生殖功能, 因此质膜结构的完整性可以作为检测冷冻成功与否的重要指标之一。在检测冻融精子成活率时, 常以质膜完整率来估计精子的成活率。研究者发现冷冻对精子的顶体完整性, 精子畸形率及精子活率等的影响较为明显。冷冻使精子质膜破损, 致使冻融精子无论是在质膜完整性还是在顶体完整率上都与新鲜精子存在较大差异, 说明冷冻过程对精子膜结构造成了严重损伤。

对冻融精子进行质膜完整性检测, 可预测精子的受精能力, 但是精子冻融后的活率和质量与物种、个体、冷冻保护液成分、降温和升温速度、精液冻前处理等因素密切相关。目前, 许多动物精液冷冻技术的研究还处于经验性试验研究阶段, 对精液冷冻过程中精子的损伤机理, 试验过程中外部环境变化对精子的影响, 不同个体的冷冻敏感性及遗传因素对冷冻敏感性差异的机制等诸多方面尚不完全清楚。对于目前精液冷冻技术存在的问题, 还需对冷冻机制方面进一步研究。通过对影响精液冷冻的相关因素进行更加深入的研究, 进一步探索冷冻损伤的机理, 了解不同个体间精子膜的分子组成结构, 不断优化冷冻程序和对精子的冷冻损伤质量评估的方法, 精液冷冻技术就会得到实质性的改进, 进而推动精液冷冻技术的发展。

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精子质量检测系统篇8

精液常规分析法在猪精液检查和人工授精中具有重要作用。以往精液常规检测分析的方法是, 测活力是用显微镜进行目测, 或用活体染色法计数所得;测密度是用专用的精子密度仪, 或染色后用血球计数板计数, 再依公式计算所得;测定畸形率则用姬姆萨抹片染色检查。上述项目的检测结果会因操作者的技术水平和经验而造成较大误差, 且速度较慢, 无法在短时期内测定大量的样本, 工作效率较低。

精子质量分析仪 (SQA) 是测定精液的活力、密度、畸形率的一体机, 能准确快速地直接读出所测结果。因此, 在这次大量猪精液检查样本中, 全部用精子质量分析仪 (SQA) 读出结果与常规分析方法的结论进行了系统的比较, 发现完全可以用精子质量分析仪 (SQA) 来取代精液常规分析方法。

在此次承担的精液检查项目中, 虽没有要求精子畸形率的检测, 但是为了研究精子质量分析仪 (SQA) 与常规检测分析在这个方面是否存在差异, 于是作了对精子畸形率的检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源。

2009年9~11月份江西省部分良种猪场采集精液样本350份, 其中大约克公猪精液100份、长白公猪精液50份、杜洛克公猪精液200份。所有公猪均为正在使用的青壮年公猪 (2~5岁) 。1.1.2仪器。精子质量分析仪 (SQA) :从北京伟力公司购得;精子密度仪:由法国卡苏公司购买;显微镜:奥林巴斯型普通光学镜;血球计数板, 医用 (上海) 。

1.2 检测方法

1.2.1 检测项目。精子的活力, 密度, 畸形率。

1.2.2 方法。

精液常规检测依《中华人民共和国国家标准种猪常温精液》 (GB23238-2009) 的方法进行;SQA按仪器说明进行, 精子密度仪先将原精按0.3m L样本加入0.9%生理盐水2.7 m L混匀;每个样本均分为3份, 一一对应用3种方法检测。

1.3 统计分析

各组间均数差异显著性用t检验。

2 结果

2.1 猪精子的活力测定

应用SQA、目测和伊红-苯胺黑活体染色3种方法测定精子活力的结果见表1。

统计分析表明目测法与其他2种方法有显著差异 (P<0.05) , 可能是由于目测法存在一定的主观性。SQA和伊红-苯胺黑活体染色差异不显著 (P>0.05)

2.2 精子密度的测定

应用SQA、精子密度仪和血球计数板3种方法测定密度的结果见表2。