酶联免疫吸附实验法

酶联免疫吸附实验法（精选九篇）

酶联免疫吸附实验法 篇1

1 样品采集、处理与保存

ELISA方法测定的样品种类十分广泛,包括血清、尿液、唾液、乳汁等体液及分泌物和排泄物。其中一些样品可直接应用ELISA进行测定,如血清、尿液等;还有一些需经预处理,如粪便、组织脏器等。兽医实验室用于ELISA测定的主要样品为血清,这类血清样品可按常规方法采集。禽类采取心脏或翅静脉采血,猪采取前臂静脉、耳缘静脉或前腔静脉采血,羊采取颈静脉采血,牛采取颈静脉或尾静脉采血。分离血清时,应尽量避免溶血。目前,商品化的ELISA试剂盒绝大多数以辣根过氧化物酶为标记,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,而以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中,样品发生溶血可能会增加非特异性显色,进而造成假阳性出现[2]。采集的血清样品应尽快进行检测,以保持样品的新鲜度和检测的时效性。如果血清样品在冰箱中保存过久,其中的免疫球蛋白成分可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来,5 d内可完成测定的血清样品可放置于4℃,超过1周则必须-20℃冻存。冻结血清样品融解后,蛋白质会局部浓缩而分布不均,应轻缓地上下颠倒使其充分混匀,不能在混匀器上强烈振荡。血清样品反复冻融会使抗体效价跌落,所以用于检测抗体的血清样品如需保存作多次检测,最好进行少量分装后-20℃冻存。如果血清样品混浊或有沉淀出现时,应先离心或过滤澄清后再进行检测。此外,在分离或分装时应避免污染,如血清样品被细菌污染,部分细菌中含有内源性辣根过氧化物酶,也会产生假阳性反应[3]。

2 试剂的准备

试验前首先仔细阅读ELISA试剂盒说明书,严格按试剂盒说明书的要求准备试验中需用的试剂及器材。严格讲,不同批次试剂盒中各成分不能混用。ELISA中用水包括用于洗涤过程的水,必须为蒸馏水或去离子水,且应保证其新鲜和高质。自配的缓冲液应用p H计测量其p H,需要时要较正至所需酸碱度。试验前,从冰箱中取出的试剂应待其温度恢复至室温后才能使用。稀释浓缩洗液前,要注意观察其内是否有结晶析出,如有结晶要升温待其完全溶解后才能使用。本次试验已经用完或不需要的试剂,应及时放回冰箱保存。

3 加样

加样准确是确保试验结果可靠的关键因素。首先,在移液器选择上,应尽量选用具有与加样量相近量程的移液器(特别是在稀释血清时);加相同或者相近体积的不同液体时,尽量使用同一把移液器,并保持相同的加样姿势。其次,在取样过程中,移液器枪头尽量与取液板(试管)垂直,才能确保所取的液体体积准确;在加样时,也要使枪头与ELISA板孔垂直,这样才能加在板孔的底部,避免将液体加在孔壁上。整个过程中,要慢吸快排,用力均匀不可溅出液体,尽量不产生气泡。最后,在加不同样品时,要更换枪头以免发生交叉污染。当加样量小时,应尽量采用倒退移液法。

4 温育

温育也称为孵育,是指将抗原与抗体混合后,在特定温度条件下进行的抗原抗体反应。实验室通常在4、37、43℃或室温(18~25℃)条件下,进行ELISA反应的温育操作[4]。ELISA反应动力学研究结果显示,多数抗原抗体结合反应的适宜温度是37℃,所以,实验室操作过程中常用的温育条件在37℃下,将抗原与抗体反应1~2 h,使其结合产物达到最大值。有时可通过提高反应温度的方式,加快反应速度。因此,有些ELISA方法在43℃的条件下进行抗原抗体反应,但不宜采用更高的温度[5]。研究表明,抗原与抗体在4℃条件下最趋近于完全结合,因此为了获得更多的抗原抗体结合物沉淀,放射免疫测定中常常让抗原抗体在4℃条件下进行过夜反应[3,6]。一般的ELISA方法为了提高检测效率,缩短反应时间,多采用37℃而非4℃作为温育条件。温育过程中,除了要保证反应温度和时间以外,还应注意为使所有反应样品都能在温育温度下尽快达到平衡,应尽量不要将多块反应板叠放在培养箱内。依据ELISA方法的要求,在室温进行温育反应时,要确保室温严格控制在操作方法规定的温度范围内,以保证试验结果的准确性[7]。总之,试验中温育的温度和时间应按要求力求准确,同时温育时为避免蒸发,可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔,也可将ELISA板应放在湿盒内[8]。

5 洗涤

在ELISA试验中,洗涤的作用包括清除吸附在反应板上的残留物质和去除非特异性结合的产物等,因此,洗涤效果对于ELISA试验结果的准确性起着重要作用[9]。操作过程中,试验人员应严格按照要求制备洗涤液,保证洗涤时间和次数。在间接ELISA试验中,可以通过延长浸泡时间以及加多洗涤次数等方法,有效地降低反应的本底读数[6]。

6 显色与比色

显色是指用酶催化无色的底物后,生成有色的产物的过程。在显色过程中,影响结果准确的关键因素是显色反应的温度和时间[10]。定性ELISA试验中,一般情况下显色可在室温进行,可以依据阴、阳性对照孔的显色情况适当调整反应时间的长短。然而,定量测定ELISA试验中,应严格按照说明书,要保证显色反应的温度和时间准确,才能获得有效的试验结果[11,12]。

酶标仪安放位置应注意避免阳光或强光照射,仪器工作温度在15~30℃。比色(读数)前应开启酶标仪预热15~30 min,以保证测读结果更加稳定。正式比色前应先测读底物对照孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替样品作全过程的孔),以记录本次试验的试剂状况。每次试验比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体。

7 结语

在监测工作中,筛选购置优质ELISA试剂盒;定期对移液器、温箱、酶标仪等设备进行检定和校准,控制实验室环境温湿度;试验人员搞清ELISA原理,清楚每个操作步骤的目的和意义,注重细节,加强练习,熟练操作。总之,优质的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。

摘要：酶联免疫吸附试验(ELISA)是兽医实验室常用检测方法,具有灵敏度高、特异性强以及操作简便等特点。为了刚好地使用ELISA方法进行疫情检测以及疫病诊断,本文总结了常见ELISA试验各个操作步骤的注意事项,为广大实验员提供获得更准确有效的实验结果提供参考。

酶联免疫吸附实验法 篇2

重金属残留的酶联免疫吸附检测技术研究进展

重金属残留是当前重点关注的难降解持久性污染物,建立重金属的现场速测方法是重金属残留含量分析中急需解决的研究内容.酶联免疫吸附法是将免疫学技术应用于重金属残留含量速测的新技术,其对于提升重金属残留含量检测的.技术水平具有重要意义.本文对检测重金属残留的酶联免疫吸附法进行了文献整理,对近期重金属残留酶联免疫吸附检测技术的研究进展进行了一定的阐述,以期为相关研究工作提供一定参考.

作 者：车晓青 郭明 Che Xiao-qing Guo Ming  作者单位：浙江林学院理学院化学系,浙江临安,311300 刊 名：福建分析测试 英文刊名：FUJIAN ANALYSIS & TESTING 年，卷(期)： 18(4) 分类号：Q55 关键词：重金属   酶联免疫吸附法   半抗原   抗体  

酶联免疫吸附实验法 篇3

(辽宁省鞍山市铁西区卫生防疫站辽宁鞍山114012)【摘要】艾滋病是当前严重威胁人类健康和生命的一种传染病,由早期的静脉吸毒者共用注射器传播,发展到当今性传播和母婴垂直传播,即向普通人群的传播, 艾滋病的流行给人类的健康、生命安全以及经济社会发展带来了严重影响。最常用的艾滋病诊断方式是进行抗体检测，要了解和掌握HIV的感染情况，关键就是实验室的检测技术，下文就关于在HIV抗体检测中酶联免疫吸附法和快速法的比较分析及其注意事项的总结。【关键词】酶联免疫吸附法;胶体金快速法;HIV抗体;检测【中图分类号】R446.6【文献标识码】B【文章编号】1004-5511（2012）04-0594-01 一、引言进入20世纪90年代，HIV在我国迅速传播，感染人数成倍增长，艾滋病的防治已经成为全世界面临的重要课题。HIV感染的诊断以HIV抗体的检测为金标准，为了达到早诊断、早治疗、早管理的目的，全国先后建立了大量的HIV抗体初筛实验室，对HIV抗体检测的准确性要求也越来越高。现简述关于我站用酶联免疫吸附法及胶体金快速法检测HIV抗体的思考。二、酶联免疫吸附法对HIV抗体的检测HIV抗体检测是发现HIV感染的有效途径，酶联免疫吸附法（ELISA）是一种敏感性高、特异性强、重复性好的试验诊断方法，由于其试剂具有稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适用于 规模筛查试验，又可以使用于少量标本的检测等优点，一直以来，成为艾滋病初筛试验室检测HIV抗体普遍使用的方法之一 1、试剂的选择:试剂盒的质量直接影响到结果的准确性，因此，要选择灵敏度和准确度较高，而且特异性较强的试剂盒。选择试剂盒的原则是，必须是经国家食品药品监督管理局注册批准，批检合格，临床评估质量优良，在有效期内的试剂，并经常了解同行对试剂盒使用的反馈情况一级卫生部临床检验中心对参加室间质评实验室试剂盒的综合评价。本站检测HIV抗体主要采用北京万泰生物药业有限公司试剂盒。另外，也应该注意试剂的保存，试剂从冰箱中取出后，应先平衡到室温后再使用，用多少取多少，防治反复冻融。2、仪器设备的校准与检定: 对实验结果起关键作者用的仪器，水浴箱、洗板机和酶标仪等均需按周期进行计量检定，并在检定周期内进行期间核查，同时，建立仪器设备的维护及操作规程，进行日常维护，保持仪器设备的最佳状态。3、样品样品的采集与保存: 样品采集时候应该尽量避免溶血和细菌污染、霉变，否则会导致假阳性。尽量不用抗凝血，保存时间不宜太长，一般2°C-8°C冰箱中保存一周内完成检验，长期保存最好在零下20oC度低温冰箱存放，并避免反复冻融，浑浊或有沉淀的样品要离心。作HIV抗体检测的血样不宜用塑料试管，应用玻璃试管装。4、检测中关键点的控制：（1）加样：微孔板条从冰箱中取出后应平衡至潮气干尽方可使用，用微量加样器按规定量加入孔底，避免加在孔壁上部，尽量慢慢快放，以免溅出或产生气泡，同时不要使吸头碰到酶标板孔上的包被抗原。（2）温育：调节水溶箱至合适的温度，不能过高也不能过低，放在水溶箱的隔板上或放在温箱的温盒里均可。（3）洗涤： 一定要用洗板机，防治污染。注意洗板机上的每一个放液和吸液纤孔都一致的插入孔底，将孔内液体吸干，严格按照要求设置一定的浸泡时间和洗涤次数，不要将各种试剂盒的洗涤液混用。（4）.显色： 严格按照说明书规定的时间温度恒定反应后终止，不可以随意更改。在加液和混均过程中避免产生气泡，洗涤后反应板用纸吸干后再置酶标液中比色。5、实验室内质量控制： 室内质控一般使用质控品和质控图。联合应用即刻法质控图法进行室内质控也是一种很使用的方法，可以借鉴。并积极参加室间质控活动，了解本实验室的实验误差情况。三、胶体金快速法对HIV抗体的检测与ELISA法相比，胶体金快速法具有快速，安全，操作简单等有点，但是在实际应用中要注意假阳性和假阴性结果。本站主要采用上海科华的胶体金快速检测法检测HIV抗体，其原理是采用HIV特異性抗原gp160和gp36等包被微孔反应板，用gp36、gp41标记辣根过氧化物酶。当待测标本中存在HIV抗体时，该抗体与固相化的抗原结合于反应板上，并进一步与酶结合物相结合，在TMB底物参与反应的情况。对于弱阳性样本的处理要慎重，不能轻易舍去，宜用正常血清稀释后与原液对照一起测定，往往可以收到很好的效果。四、结论ELISA法是实验室检测HIV抗体普遍使用的方法，但影响ELISA法测定结果的因素很多。与ELISA法相比，胶体金快速法具有快速，安全，操作简单等优点，但是在实际应用中要注意假阳性和假阴性结果。将胶体金快速法和ELISA法联合使用，并力求控制各个影响因素，可以大大降低假阳性和假阴性结果，提高检测的准备性，为艾滋病的防治工作提供更有效的依据。参考文献［1］中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范（2009年版）.北京：中国疾病预防控制中心，2009：6.［2］李秀华，宋爱京，王佑春.HIV抗体快速诊断试剂与酶联免疫诊断试剂灵敏度比较.中国生物制品学杂志，2004；17（3）：175-176.［3］胡静云，陈善昌.胶体金快速检测法与ELISA法检测HIV抗体效果观察.华夏医学，2009；22（3）：488.

酶联免疫吸附实验法 篇4

氯霉素是一种有旋光活性的酰胺醇类抗生素,具有优良的抗菌性,可大量生产,价格低廉,因此被广泛应用于畜禽疾病的预防治疗,但它对人体存在极大的毒副作用[1]。近年来,在畜禽产品中发现氯霉素的残留量很大,国际组织和世界上较多的国家和地区注意到氯霉素在动物体内残留的问题,并禁止在动物饲料中添加此类药品[2]。对氯霉素的检测方法有很多,酶联免疫吸附试验(ELISA)法是其中的一种[3,4]。试验旨在探究ELISA法在饲料中测定氯霉素的可行性。

1 材料

1.1 仪器设备

分析天平、离心机、微量振荡器、移液枪、酶标分析仪、氮吹仪、氯霉素试剂盒等,均由江西科技师范大学提供。

1.2 试验样品

豆粕、饲料样品,市购。

1.3 工作液的准备与试剂的配制

标准品:将各标准品从泡沫垫中取出,回温,备用。

酶标工作液:准确移取12 m L酶标物稀释液到酶标物浓缩液瓶内,混匀,使之充分溶解,并置于22~25℃条件下回温充分,备用。

样品稀释工作液:用去离子水按1∶10(1+9)的比例将10×样品稀释液稀释,备用。

清洗液:用去离子水按1∶20(1+19)的比例将20×清洗液稀释,备用。

显色剂:回温,备用。

终止液:回温,备用。

2 方法

2.1 样品的前处理

取20支大号的离心管编号(1~20号),分别称取0.5 g待检测的16份饲料样品以及4份做阳性添加试验的豆粕,在4支做阳性添加的试管中取1支作为空白对照,在其余的3支中分别加入0.2,0.4,0.6 m L的最高浓度(2.025 ng/m L)的氯霉素标准品。在20支试管中用移液枪分别加入5 m L的乙酸乙酯(在通风橱中进行添加试剂的操作),用微量振荡器振荡混匀10 min,将离心机调至5 000 r/min,室温条件下离心10 min。离心结束后用移液枪分别取500μL的上清液置于新编号(1~20号)的1.5 m L离心管中,用50℃氮吹仪吹干。在20支离心管中分别加入500μL的正己烷混匀30 s,使之充分溶解,再在20支离心管中用移液枪分别加入500μL的稀释工作液,充分混匀(此步骤防止乳化)。将含有正己烷和稀释液的离心管于室温条件下用离心机5 000 r/min离心10 min,离心后有明显的分层,用移液枪深入下层水相层取50μL用于检测。

2.2 检测过程

样品前处理完成后,试剂盒中的试剂以及酶标板均已回温充分,取试验所用微孔(双孔平行试验)移去多余的微孔,在微孔板上做好标注。用单道移液枪,在编号为A12~F12的各标准孔中加入50μL的氯霉素标准品,浓度分别为0、0.025 ng/m L、0.075 ng/m L、0.225ng/m L、0.675ng/m L、2.025 ng/m L,C34-H34中加入50μL的饲料样品提取液,在G12-B34中加入50μL阳性添加试验的豆粕提取液。用新的吸头配合8道移液枪和试剂槽,在所有孔中快速加入100μL酶标物工作液,注意要正确操作确保将吸头中的液体排空。22~25℃孵育10 min,在孵育过程中适度摇晃酶标板,以减少双孔试验误差,提高试验的准确度。孵育时准备好吸水纸巾以及清洗液,准确孵育10 min后去除微孔中的液体,在所有微孔中加入清洗液,轻敲反应板,然后倒掉微孔中的液体,重复此操作3次,共洗板4次,洗板完成后立即用吸水纸将微孔板拍干,彻底除去微孔中残留液体并对着光用洗耳球将气泡去除,立即用新的吸头配合8道移液枪和试剂槽,于每个微孔中加100μL显色剂,轻晃反应板,使之混匀(显色剂有刺激性,在加入显色剂时戴手套操作)。22~25℃显色10 min,显色完成,于每个微孔中加100μL终止液,微孔中的颜色由蓝色变成黄色,将酶标仪调至450 nm检测吸光度,结果要在10 min内读取才有效。

3 结果与分析

3.1 标准曲线

测得6个标准品的吸光度值,结果见表1。使用赛群分析软件绘制ELISA标准曲线,结果见图1。通过计算得出,标准曲线相关系数(R)为0.995,高于规定的0.98,同时标准品的离散系数(CV值)除了阴性标准外,均低于3.6%。说明本次试验标准曲线完全符合规范,试剂盒的试验操作正确。

3.2 样品中氯霉素含量

根据标准曲线计算样品中的氯霉素的含量,结果见表2。

参照农业部所指定的方法GB/T 8381.9—2005《饲料中氯霉素的测定》中规定的最低检测限为0.005 mg/kg,即测定结果小于5 ng/g时判定为阴性,检测结果均按未检出计。由表2可知,经计算,6个样品中氯霉素的含量均低于氯霉素的最低检测限,说明6个样品中氯霉素指标均为阴性。试验中共检测了16个饲料样品(其余10个样品的结果未列出),16个样品中的氯霉素均属阴性。说明所检测的饲料产品中没有添加氯霉素,饲料质量安全可靠。

3.3 回收率试验

结果见表3。

由表3可知,饲料在前处理过程中被稀释10倍,表中数值为提取液的测定浓度。通过提取液的测定浓度和加标的真实浓度进行计算,得到样品的回收率。空白试验的豆粕提取液中检测出氯霉素的含量为0.012 ng/m L,低于检测限表明未检出,其余加标样品的回收率均在90%以上,符合试剂盒中所规定的75%~95%,表明回收率达到要求,此次检测数据准确、可靠。

4 讨论

目前,氯霉素的检测方法主要有三大类:1)微生物测定方法。主要有棉签法、杯碟法、纸片法、TTC法、戴尔沃检测法、蓝黄检测法(BY法)、发光细菌法等[5]。2)免疫分析法。主要有ELISA法、放射免疫分析(RIA)法、常用来检测小分子农兽药痕量残留的免疫荧光分析(FIA)法、胶体金免疫层析(GICA)法等[6]。3)仪器分析法。主要有高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱-质谱联用(GC-MS)法、液相色谱-质谱联用(LC/MS)法等[7]。每种方法都具有其自身的特性。微生物测定法的优点是:简单、快速、费用少;缺点是:易受干扰、检测限高且灵敏度不高。免疫分析法的优点是:操作简便、特异性强,可以成批检测,仪器化程度和成本低灵敏度高;缺点是:影响因素多,易出现假阳性。仪器分析法的优点是:结果准确,灵敏度高、特异性强,可操作重复性高;缺点是:仪器设备要求高,分析速度慢,样品处理过程复杂,成本较高。

ELISA法是一种较为成熟的检测方法,试验结果表明,采用ELISA法测定氯霉素回收率在95%左右,标准曲线相关系数为0.995,证明ELISA法测定饲料中氯霉素准确、可靠。但在具体操作中,需要注意相关事项,减少试验误差。1)在使用试剂盒前要注意查看保质期为12个月,应在有效期内使用,试剂盒未使用时应在2~8℃条件下储存,不得在室温以及0℃的冷冻室中保存;2)使用前在22~25℃条件下回温1 h以上,回温不充分会影响试验的准确性;3)试验操作过程中不要中断任何程序和改变试验操作步骤;4)孵育时间以及温度是试验操作的关键,要准确把握10 min的孵育时间和22~25℃的温度,添加试剂要迅速,尽量保证前后孔的孵育时间一致;5)试验中用到乙酸乙酯、正己烷以及显色剂和终止液时要在通风橱中进行并且要戴橡胶手套进行操作。

5 小结

氯霉素为一种较为常见的广谱抗生素,危害较为广泛,对氯霉素的检测任务较为重要,试验采用ELISA法不受荧光物质以及色素等干扰,并且一次可检测多个样品,且操作简便,表明采用ELISA法检测饲料中氯霉素含量的前景广阔。

参考文献

[1]胡顶飞,沈建忠.氯霉素类抗生素的残留分析[J].中国兽药杂志,2001,35(5):55-57.

[2]陈眷华,彭羽.氯霉素类抗生素药物对人类健康的威胁[J].贵州畜牧兽医,2006,30(4):17-18.

[3]于徊萍,卢利军,周晓,等.流动注射化学发光法测定鸡肉、鸡蛋和鸡饲料中氯霉素[J].饲料研究,2007(8):18-20.

[4]葛祥武,张桢,袁奎敬,等.胶体金免疫层析法快速测定金丝桃素中氯霉素的含量[J].饲料研究,2007(2):26-27.

[5]宋杰,宋燕青,王勇鑫,等.微生物法在检测牛奶中氯霉素残留的应用[J].河北师范大学学报(自然科学版),2005,29(1):85-87,91.

[6]谢恺舟.兽药残留分析方法[J].中国家禽,2001,23(17):5-7.

酶联免疫吸附实验法 篇5

1 材料与方法

1.1 仪器设备

酶标读数仪 (配备450nm滤光片) , 分析天平, 离心机, 微型振荡器, 涡漩振荡器, 微量移液器, 恒温箱37℃。

1.2 试剂与材料

以下所有试剂, 除特别注明外, 均为分析纯试剂;水为符合GB/T6682规定的一级水。

(1) 庆大霉素检测试剂盒 (2~8℃保存) , 由北京望尔生物技术有限公司生产。 (2) 洗涤工作液:用水将20×浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释 (1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水) 用于酶标板的洗涤, 洗涤工作液在4℃环境中保存。 (3) 复溶工作液:用去水将2×浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释 (1份2×浓缩复溶液+1份去离子水) , 用于提取样本的复溶, 复溶工作液在4℃环境中保存。

1.3 样品制备及检测

取鲜牛奶至聚苯乙烯离心管中3000g以上, 离心10min, 移取上清液, 加入780µl复溶工作液混匀, 取50µl用于试剂盒El ISA检测。用r-biopharm数据分析软件对数据进行分析, 得出试料中庆大霉素的含量。

2 结果与分析

2.1 灵敏度的确定

为测定试剂盒本身的检测限, 按照农业部规定的方法:测定20份牛奶样品, 取其平均值, 加上3倍标准差来确定试剂盒的最低检测限。

(ng/Kg)

2.2 方法的准确度

取空白牛奶1.0ml, 添加添加1mg/L标准工作液20µl, 作为20µg/L空白添加试料。按上述测定方法、步骤进行测定, 每个浓度测定3个批次, 每个批次做5份样品, 并计算结果。

按上述测定方法、步骤进行测定, 每个浓度点做3个批次, 每个批次5份样品, 此方法的回收率都在90%~110%之间, 变异系数均在20%以内, 检测限为4.0ng/Kg。

3 讨论

(1) 室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温 (20~25℃) 会导致所有标准的OD值偏低。

(2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况, 则会出现标准曲线不成线性, 重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

(3) 每加一种试剂前需要将其摇匀。

(4) 反应终止液为2M硫酸, 避免接触皮肤。

(5) 不要使用过了有效日期的试剂盒, 也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂, 掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低;不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

(6) 储存条件:保存试剂盒于2~8℃, 不要冷冻, 将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感, 因此要避免直接暴露在光线下。

(7) 试剂变质的迹象:发色试剂有任何颜色表明发色剂变质, 应当弃之。0标准的吸光度 (450/630nm) 值小于0.5 (A450nm<0.5) 时, 表示试剂可能变质。

(8) 在加入底物液A液和底物液B液后, 一般显色时间为10~15min即可。若颜色较浅, 可延长反应时间到20min (或更长) , 但不得超过30min。反之, 则减短反应时间。

(9) 该试剂盒最佳反应温度为37℃, 温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

参考文献

[1]中国兽医药品监察所.兽药残留检测标准操作规程[S].北京:中国农业科学技术出版社, 2009, 24.

[2]徐立松, 徐秋琴.药物学[M].杭州:浙江科学技术出版社, 2004.

[3]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二部[S].北京:化学工业出版社, 2000, 394.

酶联免疫吸附实验法 篇6

1 材料与方法

1.1 疫苗与免疫程序

1.1.1 免疫疫苗

猪O型口蹄疫灭活疫苗由政府统一采购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司, 由区县兽医主管部门统一下发。

1.1.2 免疫程序

规模养猪场采取仔猪28~35d首免, 免疫剂量为肌注1mL/头, 首免30d后加强免疫1次, 免疫剂量为肌注2mL/头;种公猪和母猪每4个月接种1次, 每次免疫剂量为肌注3mL/头;散养猪采用春秋两季集中免疫, 定期补免措施, 每次免疫剂量为2mL/头。

1.2 采样点选择

每季度随机选取市辖区规模养殖场15场 (次) , 屠宰场10场 (次) , 散养户30户 (次) 进行血液样品采集、分离血清。

1.3 采样要求

每季度, 每个规模养殖场随机采集血样20份, 每个散养户采集5~10份, 每个屠宰场采集20份, 并记录采集地点、猪场规模、免疫时间、免疫次数、疫苗品种、生产厂家、批号及猪群健康状况等资料, 每份样品采血量大于1.5mL。

1.4 样品采集数量

全年共采集猪血清3100份, 其中规模猪场商品猪血样1157份, 规模猪场种猪血样412份, 屠宰场血样723份, 散养户血样808份。

1.5 诊断试剂与方法

猪口蹄疫抗体监测ELISA试剂:购自深圳市真瑞生物有限公司, 诊断试剂在有效期内使用, 批号为2015101377;试验严格按照诊断试剂说明书的要求进行操作[4]。

1.6 结果判定

以空白对照调零用酶标仪于450nm (630nm作参比波长) 读取吸光度A值。PI (阻断率) >35%则判断为阳性;PI≤35%则判断为阴性。

2 试验结果

2.1 不同采集点抗体合格率

由表1可见, 全年平均免疫抗体合格率, 规模场商品猪合格率 (85.15%) >散养户 (74.71%) >屠宰场 (71.96) ;在规模场中, 种猪合格率 (92.08%) >商品猪 (85.15%) 。

2.2 四个季度抗体合格率状况

由表1、图1看出, 对不同季度采集的猪血清进行O型口蹄疫免疫抗体监测发现, 不同养殖类型的不同场点, 群体免疫抗体合格率均高于农业部规定的70%的要求。规模场商品猪及种猪各自所在群体四个季度的免疫抗体合格率差异不大, 并且抗体持续处于较高水平;散养户、屠宰场第二、四季度的抗体合格率均高于第一、三季度, 其中散养户第三季度抗体水平处于最低, 屠宰场相比规模场、散养户抗体水平较低, 且第一季度抗体水平处于最低;由表2得出, 规模场商品猪各养殖场在不同季度, 猪O型口蹄疫免疫抗体群体合格率均达到80%以上, 种猪多数场免疫抗体群体合格率达到了90%以上。

3 分析与讨论

(1) 我市要求猪口蹄疫应免群体免疫密度常年维持在100%, 从2015年监测的结果来看, 在抽取的3100份猪血清的猪O型口蹄疫免疫抗体合格率达80.98%, 超过了农业部规定的要求 (70%) , 说明我市始终坚持“规模养殖场按程序进行免疫, 散养畜禽实行春秋两季集中免疫、每月及时补免”的工作制度, 坚持“应免尽免, 不留空档”的工作标准, 把口蹄疫等重大动物疫病免疫放在防疫工作的突出位置, 成效显著。

(2) 全年监测数据来看规模场各季度猪O型口蹄疫免疫抗体群体合格率差异不大, 一直处于较高水平;散养户由于第一季度处于屠宰或出栏高峰期, 存栏数量、抽检数量均较少。第一季度在秋防结束后经过几个月, 抗体水平逐渐降低, 虽每月进行补免, 但屠宰季节多数散养户不进行疫苗免疫, 个别猪处于免疫空档期, 致使免疫抗体水平合格率相对较低。第三季度处于春、秋防过渡临界期, 抗体水平也相对处于较低水平。对部分散养户的调查了解, 畜主担心猪接种口蹄疫疫苗后导致猪过敏反应, 未按规定程序免疫猪口蹄疫疫苗[5]。调查发现, 个别养殖者认为口蹄疫是寒冷季节发病率较高的疫病, 所以仅注重第一、四季度的免疫预防, 导致口蹄疫抗体合格率在不同季节的差异较大。但总的合格率仍高于农业部规定的70%的要求。

(3) 由于国家拨付给村级防疫员的工资经费有限, 加之免疫注射工作量大, 有些村级动物防疫员只做春秋两季的集中免疫, 平时的月月补针不能及时到位, 存在应免未免、补栏不能及时补免等现象, 也是导致第一季度、第三季度散养户猪O型口蹄疫免疫抗体水平较低的原因之一。

(4) 农村散养户的猪舍通风不良, 卫生条件差, 猪群长期处于应激状态, 导致猪体免疫力下降。饲料变质发霉, 比如黄曲霉、褐曲霉等产生毒素抑制免疫应答。饲料中营养物质缺乏, 影响免疫抗体生成速度和数量[6]。

(5) 个别屠宰场的免疫抗体合格率低下, 存在免疫情况不清等问题, 可能与免疫期超过6个月、漏免或免疫未产生应答等原因有关[7]。

摘要：为切实了解、掌握遂宁市生猪口蹄疫免疫效果, 以科学有效预防该病, 2015年, 随机抽取全市部分规模场、散养户以及屠宰场猪血清3100份, 用酶联免疫吸附试验监测O型口蹄疫免疫抗体。结果表明, 猪O型口蹄疫免疫抗体整体合格率为80.98%, 其中抗体最好的是规模场, 四个季度的免疫抗体合格率差异不大, 各规模场商品猪在不同季度, 猪O型口蹄疫免疫抗体群体合格率均达到80%以上, 种猪多数场免疫抗体群体合格率达到了90%以上;散养户及屠宰场免疫抗体合格率分别为74.71%、71.96%。说明我市始终坚持“规模养殖场按程序进行免疫, 散养畜禽实行春秋两季集中免疫、每月及时补免”的工作制度, 坚持“应免尽免, 不留空档”的工作标准, 把口蹄疫等重大动物疫病免疫放在防疫工作的突出位置, 成效显著。

关键词：酶联免疫吸附试验,O型口蹄疫,抗体监测

参考文献

[1]王世若, 王兴龙, 韩文瑜.现代动物免疫学[M].吉林:吉林科学技术出版社, 1996:320-321.

[2]吴志明, 刘莲芝, 李桂喜.动物疫病防控知识宝典[M].北京:中国农业出版社, 2006:114-118.

[3]刘桂清, 侯喜林.几种猪口蹄疫疫苗免疫效果观察[J].中国兽医科技, 1999, 29 (12) :38-39.

[4]猪口蹄疫抗体 (IgG) 诊断试剂盒 (酶联免疫法) 说明书[Z].2010年.深圳市真瑞生物有限公司.

[5]朱玉华, 陈亮.生猪注射口蹄疫灭活苗引起免疫应激的防治[J].安徽农学通报, 2007, 13 (18) :223.

[6]谢翠松, 罗平, 龙清孟, 等.仔猪O型口蹄疫疫苗首免与二免抗体水平比较[J].中国畜牧兽医, 2009, 36 (5) :144-146.

酶联免疫吸附实验法 篇7

1 材料与方法

1.1 试剂

购自珠海丽珠试剂有限公司, 产品批号20080528, 有效期20090527。

1.2 质控血清

由上海市CDC性病艾滋病科HIV确认中心实验室统一制备发放于各区CDC, 按2周实验用量分装, 封口, 标记, -20℃冻存。血清不可反复冻融, 融化后应于2～8℃保存, 2周内使用。

1.3 仪器设备

美国宝特ELX-800酶标仪、ELX-50洗板机, 仪器操作按“使用手册”使用保养。所有移液器每年强检1次。1.4方法采用双抗原夹心法, 严格按说明书要求执行。设空白1孔, 阴性 (Nc) 对照3孔, 阳性 (Pc) 2孔, 外部质控 (K) 1孔, CUTOFF-Nc+0.15, 采用单波长450nm, 空白孔调零。 (本试剂盒要求阴性值低于0.08时, 按0.08计算) 。

2 结果

先计算前3次S/CO值、均值 (x) 、标准差 (s) , 然后再计算SI上、下限, 从第3次开始用“即刻法”对结果进行质控。当SI上下限

x=9.21, s=0.81;x±2s=10.74～7.50, x±3s=11.55～6.69;CV=8.87%。

3 讨论

室内质控是实验室内部对检测质量的各个环节进行系统控制。S/CO图法是目前国内采用的室内质量控制方法。建议由专人负责建立质控图, 长期、稳定地使用一种质量好的试剂盒。本实验综合了2种方法的优点, 克服了传统单一应用质控图法必须连续对同一质控血清进行20次测定后才能进入质控的缺陷, 在测定3次后即可进入质控, 21次后又可运用质控图的方法进行质控, 对基层实验室来说, 笔者认为此方法较切实可行, 具有较好的可操作性。

HIV抗体检测具有特殊性, 涉及到个人隐私, 关系到个人、家庭及社会的稳定。因此, 必须建立一套HIV抗体检测的质量保证体系, 加强实验室自身质量管理, 保证每次检测结果的准确可靠。

以S/CO为评判指标, 可增加结果间的可比性。该方法同样适用于其他ELISA检测, 如抗-HCV、HBsAg等的室内质控, 具有普遍的推广应用价值[1]。

关键词：即刻法—质控图法,抗-HIV,酶联免疫吸附测定,室内质控

参考文献

酶联免疫吸附实验法 篇8

1 酶联免疫吸附法的原理与应用

酶联免疫吸附法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, ELISA) 1971年由瑞典学者Engvall和Perlman首次报道后, 由于具有快速、敏感、简便、易于标准化、对环境无害等优点, 而得到迅速的发展和广泛应用。

ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合, 滴加底物溶液后, 底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型, 通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应, 显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定, 这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来, 使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

目前ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面, ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。NY/T 1460—2007 (饲料中盐酸克仑特罗的测定酶联免疫吸附法) 标准中规定了适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中盐酸克仑特罗的测定。

2“瘦肉精”的危害

“瘦肉精”是肾上腺类神经兴奋剂, 属β-兴奋剂类激素。既不是兽药, 也不是饲料添加剂, 它是一类药物, 而不是一种特定的物质, 目前, 被称为“瘦肉精”的主要有莱克多巴胺、盐酸克仑特罗、沙丁胺醇等。“瘦肉精”能够改变动物养分的代谢途径, 促进动物肌肉特别是骨骼肌中蛋白质的合成, 抑制脂肪的合成和积累, 从而改善胴体品质, 使生长速率加快, 瘦肉相对增加。

“瘦肉精”进入动物体内会在组织中形成残留, 尤其是在肝脏等内脏器官残留较高, 人吃了这种肉后, 易出现心跳加速、呼吸困难等症状, 严重的会有恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状, 特别对心脏病、高血压、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大。

3 ELISA在饲料“瘦肉精”检测中的应用

“瘦肉精”药物常被非法添加到饲料中饲喂猪、牛和羊等动物, 用于提高动物的胴体瘦肉率。而“瘦肉精”药物造成动物体内的药物残留, 可对消费者的健康造成伤害。因此, 对饲料中“瘦肉精”药物的测定非常必要。

国内有关动物源性饲料中“瘦肉精”的检测方法有高效液相色谱法 (HPLC) 、气相色谱质谱法 (GC—MS) 、液相色谱质谱联用法 (LC—MS) 、酶联免疫吸附法 (ELISA) 和胶体金免疫层析法等。由于HPLC、GC—MS、LC—MS对仪器设备、场地等的要求比较高, 因此ELISA和胶体金免疫层析法应用比较广泛。

酶联免疫吸附法利用免疫学抗原抗体特异性结合和酶的高效催化作用, 利用酶联免疫吸附法中的竞争法检测抗体。ELISA测定的基础是抗原抗体反应。单克隆抗体既能与CLB等结合, 也能与酶标记物结合。当样品中含有CLB等时, 它与酶标记物竞争性的结合单抗上的结合位点, 经过洗涤步骤后, 没有与单抗结合的酶标记物被洗去。加入基质和发色剂后, 结合的酶标记物把无色的发色剂转化为蓝色的产物, 颜色的深浅和样品中盐酸克伦特罗的浓度有关。加入终止液后, 蓝色转变为黄色, 然后用酶标仪进行吸光度的测定, 最佳波长为450 nm。ELISA操作简单, 对仪器设备的要求不高, 可为“瘦肉精”检测卡检测的假阳性进行初步筛选。

“瘦肉精”药品是国家明令禁止在畜禽饲料和饲养过程中使用的药品。使用“瘦肉精”不仅危害人民群众身体健康, 对养殖业的持续健康发展和社会安定也是很不利的。因此要完善饲料和畜产品质量监测体系, 严把生产、经营、使用三道关口, 对于“瘦肉精”的检测而言, 发展一种可靠、灵敏、快速、实现批量检测的检测方法尤为必要也更具现实意义。

参考文献

[1]李德安, 王世琴, 李宇晴, 等.动物源饲料中“瘦肉精”类药物的分析及检测方法.畜牧与饲料科学, 2013 (07) :55-56.

[2]文美英, 朱志盈.瘦肉精的危害、检测方法及控制.肉类工业, 2013 (02) :49-51.

[3]陆平.“瘦肉精”的危害及检测方法.畜牧与饲料科学, 2012 (03) :54-55.

酶联免疫吸附实验法 篇9

孔雀石绿(malachite green,MG)是人工合成的碱性三苯甲烷类染料,在水产养殖过程中,常作为杀菌剂和抗寄生虫药,用于防治各种鱼病。孔雀石绿在鱼体内代谢为隐色孔雀石绿(LMG),能够长期残留于生物体内,其化学官能团三苯甲烷具有致突变、致畸和致癌作用。欧美、中国和日本等宣布严禁在水产养殖中使用孔雀石绿,并规定孔雀石绿(含隐色孔雀石绿)不得检出。

测定食品及环境中孔雀石绿及其代谢物常用高效液相色谱法或液相色谱-串联质谱法。虽然这些方法的定性、定量准确度较高,但仪器昂贵、样品前处理复杂、检测周期长、检测成本高。为了确保水产品质量安全,避免孔雀石绿对人体健康的危害,有必要建立对水产品中孔雀石绿药物残留检测的快速、灵敏的分析方法。本试验采用的酶联免疫吸附检测方法快速灵敏、准确可靠、成本低,能够用于水产中孔雀石绿药物残留的快速检测和筛选。

材料与方法

仪器设备

微孔板酶标仪(450 nm/630 nm)、电脑洗板机、涡旋仪、离心机、振荡器、氮吹仪、分析天平(感量0.01g)、聚苯乙烯离心管(2 mL、50 mL)、微量移液器(单道20～200 mL、100～1000 mL,多道250 mL)。试剂

试剂

除特别注明外,本法所用试剂均为分析纯,水为去离子水,符合《分析实验室用水规格和试验方法》(GB/T6682-2008)二级水的规定。

乙腈、中性氧化铝(100-200目)、提供的酶联免疫试剂盒、孔酶标板1块(包被有偶联抗原)、孔雀石绿校准品(1.5 mL/瓶×6瓶,浓度分别为:0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05μg/L)、孔雀石绿酶标记浓缩物(30X,25mL)、酶标记物稀释液(25 mL)、孔雀石绿样品稀释液(100 mL)、底物(14mL)、终止液(14 mL,注意1N盐酸,勿接触皮肤)、试剂a (4倍浓缩物,20 mL)、试剂b (10 g)。

实验步骤

1实验处理

称取5 g均质样品,除去多余水分,于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈,充分混合10分钟。3 000 g室温离心5分钟,加入3 g中性氧化铝(100-200目),3 000g离心5分钟。移取上清液于2 mL干净离心管中,氮气吹干。加入0.5 mL稀释好的试剂a溶液,混合3秒后静置30分钟。称取0.1 g试剂b并入到小离心管中,混合3秒后静置10分钟。取50μL上清液加入0.95mL样品稀释液1:20稀释并混匀。移取100μL进行分析。

2样品检测

测定在室温25～28℃条件下操作,测定之前将试剂盒以及所有试剂在室温(25～28℃)下放置30 min以上。将标准品和样品所需的孔条插入微孔架,标准品和样品做两组平行试实验,记录标准品和样品孔所在的位置。加100μL标准品溶液或样品溶液,然后加酶标记物100μL/孔,用封板膜封板,轻轻摇匀,25-28℃下反应30min。甩出孔内液体,加250μL/孔蒸馏水洗板4次,每次浸泡30 s,在吸水纸上拍打,彻底清除微孔中的残留液和气泡。加底物100孔,用封板膜封板,轻轻摇匀,25-28℃下反应30 min。加100μL/孔终止液,轻轻摇匀,5 min内在450 nm下检测吸光度。

结果判定

结果定量判定用以下方法。注意样本吸光值与其所含孔雀石绿的量成负相关。

1定量分析

按下式计算百分吸光度值:百分吸光度值(%)=

式中:

B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值;

B0为0 ug/L标准溶液的平均吸光度值。

2标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标,以孔雀石绿校准品浓度的半对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中孔雀石绿实际浓度。本方法采用的样品稀释倍数为10倍。

结果与讨论

实验条件的优化

为了得到高灵敏度的酶联免疫吸附方法,对实验条件如温育条件和显色条件进行了优化,经过筛选,得到最佳实验条件,即温育条件:室温,50min～60 min。显色时间为30 min。

标准曲线和方法的灵敏度

在最佳实验条件下,测定孔雀石绿的标准曲线,其标准溶液的浓度范围为0.1～100μg/。选择浓度范围在0-4.05 ug/L的6个浓度的孔雀石绿标准溶液作标准曲线,其线性相关系数达到0.998以上。试验中孔雀石绿和结晶紫的最低检出限以S/N=3计算,结果孔雀石绿的最低检出限为0.5μg/kg。对为确定酶联免疫吸附检测方法的重现性和灵敏度,对孔雀石绿两个不同添加浓度下分别作3个平行的回收率计算结果见表1,样品加标回收率在88.6%-106.6%之间,样品和样品加标平行测定结果的相对标准偏差(RSD)小于10%。结果表明所建立的酶联免疫吸附方法不仅灵敏度高,重现性也较好。

结论