MBTH分光光度法

MBTH分光光度法（精选六篇）

MBTH分光光度法 篇1

1 仪器及药品

1.1 仪器

UV1801;采样装置(自制);10 m L具塞比色管。

1.2 药品

1%硫酸铁铵溶液:称量1.0 g硫酸铁铵[NH4Fe(SO4)2·12H2O]用0.1 mol/L盐酸溶解,并稀释至100 m L;

1 g/L酚试剂溶液:准确称量0.10 g MBTH(酚试剂)加至100 m L容量瓶中定容做为显色剂,放冰箱中保存。采样时,精密量取吸收原夜5 m L,稀释至100 m L,即为吸收夜,采样时现配现用。

甲醛标准贮备液:量取10 m L甲醛溶液(A.R.含量36%～38%),放入500 m L容量瓶中加蒸馏水稀释至刻度,其准确浓度用碘量法标定。

样品溶液制备:采用自制气体采样装置,在装修时间分别为一年、半年、三个月的室内5个不同采样点用酚试剂吸收液采集气体500 m L,放置30 min,配成5 m L待测样品1、样品2和样品3。

2 条件优化

2.1 显色剂稳定性

用蒸馏水及乙醇作为溶剂配制酚试剂显色剂,在相同条件下显色,在633 nm波长处测定5天内的吸光度,结果如图1所示。

从图1可以看出,用乙醇作溶剂配制的吸收液,在5天测定的吸光度没有明显的降低,灵敏度高于蒸馏水作溶剂配制的吸收液。因此,用乙醇配制的吸收液稳定性高于用水配制的吸收液的稳定性。

2.2 最大吸收波长

在现配的酚试剂吸收液中加入甲醛溶液合并体积25 m L(1 m L溶液中含有6 ng甲醛),立即混合均匀,静置30 min后,加入2 m L 1%硫酸铁铵溶液,用蒸馏水定容至50 m L,混合均匀,室温下静置25 min显色,以蒸馏水做空白扫描吸收图谱,结果如图2所示。

从图2得出,在波长633 nm下,吸光度最大。

2.3 硫酸铁铵的用量

在现配的酚试剂吸收液中加入甲醛溶液合并体积25 m L(1 m L溶液中含有6 ng甲醛),放入50 m L容量瓶中,立即混合均匀,静置30 min后,加入1、2、3、4、5 m L 1%硫酸铁铵溶液,用水定容至50 m L,混合均匀,静置25 min显色,以蒸馏水做空白在633 nm测定其吸光度,结果如图3所示。

从图3可以看出,硫酸铁铵的用量对吸光度有影响,随着用量的增加吸光度随之增加,当用量达到2 m L后,吸光度增加不明显,因此用量2.0～2.5 m L吸光度均较好。

2.4 显色温度

在现配的酚试剂吸收液中加入甲醛溶液合并体积25 m L(1 m L溶液中含有6 ng甲醛),放入50 m L容量瓶中,立即混合均匀,静置30 min后,加入2 m L 1%硫酸铁铵溶液,用水定容至50 m L,混合均匀,分别在10、15、20、25、30℃下静置25 min显色,以蒸馏水做空白测定其吸光度,结果如图4所示。显色温度对测定结果有影响,20～25℃吸光度增加不明显,因此在温度范围内测定结果即可。

2.5 显色时间

在现配的酚试剂吸收液中加入甲醛溶液合并体积25 m L(1 m L溶液中含有6 ng甲醛),放入50 m L容量瓶中,立即混合均匀,静置30 min后,加入2 m L 1%硫酸铁铵溶液,用水定容至50 m L,混合均匀,室温下静置10、15、20、25、30 min显色,以蒸馏水做空白测定其吸光度,结果如图5所示。显色时间太短时,酚试剂与甲醛反应生成的嗪与硫酸铁铵发生氧化还原反应不完全,时间过长颜色稍褪,本实验的显色时间选择25 min。

3 样品结果

3.1 绘制标准曲线

在现配的酚试剂吸收液中加入甲醛溶液合并体积25 m L(1 m L溶液中含有6 ng甲醛),放入50 m L容量瓶中,立即混合均匀,静置30 min后,制成1 m L含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ng甲醛,加入1%硫酸铁铵溶液2 m L,用水定容至50 m L,混合均匀,静置25 min显色,以蒸馏水做空白测定吸光度,绘制标准曲线,如图6。根据标准溶液显色后对应的颜色及浓度制作比色卡。标准曲线方程为y=0.0826x+0.1143,相关线性系数R2=0.9992,线性关系较好。

3.2 加标回收率

取新制的吸收液加入甲醛标准溶液,立即混合均匀,静置30 min后,加入2 m L 1%硫酸铁铵溶液,用水定容至50 m L,混合均匀,静置显色,测定吸光度,计算回收率,结果如表1所示。从表1中可以看出,随着加入标样浓度的逐渐增大,回收率相应增大,此方法适用于稍高的甲醛浓度测。

3.3 样品结果

取制成的待测样品,加入1%硫酸铁铵溶液2 m L,用水定容至50 m L,混合均匀,静置25 min显色,以水为空白测定吸光度,平行测定三次,结果如表2所示。从表可以发现装修时间越长,室内的甲醛含量越低,装修时间三个月及半年的室内甲醛含量超标。用此方法测定的甲醛含量值稍偏高于国标方法测定值,相对平均偏差不超过3%,甲醛含量越高相对平均偏差越小,适用于甲醛含量稍高的室内测定。

4 结论

本试验采用改进的酚试剂分光光度法测定室内空气中的甲醛,改进吸收液的溶剂,优化测定条件,样品测定结果与国标测定结果相对平均偏差不超过3%,适用于室内空气中甲醛含量的测定。制作浓度对应的比色卡,测定甲醛时可直接用比色卡进行简单的定性测定,利于方法的推广。

摘要：改进了MBTH(酚试剂)测定室内空气中甲醛的方法。用乙醇做溶剂制备酚试剂吸收液,稳定性和灵敏度增强,优化了测定条件,最大吸收波长633 nm,显色温度20～25℃,显色时间25 min,显色剂用量2～2.5 mL,加标回收率达到96%以上,样品测定结果与国标偏差不超过3%,适用于甲醛含量测定;根据颜色对应的浓度制作比色卡。该方法精密度高、准确性好,简单、快速,可用于空气中甲醛含量的测定。

关键词：MBTH分光光度法,改进,室内空气,甲醛

参考文献

[1]邱湘龙,张育胜,贾毅,等.酚试剂-分光光度法检测PVP K30和PVP VA64中的醛[J].药物鉴定,2010(11):26-27.

[2]国家技术监督局.GB/T16127-1995,居室空气中甲醛的卫生标准[S].

[3]国家技术监督局.GB/T18204.26-2000,公共场所空气中甲醛的测定方法[S].

紫外—可见分光光度法教案 篇2

紫外—可见分光光度法

一．教学内容

1． 紫外－可见吸收光谱的产生（分子的能级及光谱、有机物及无机物电子能级跃迁的类型和特点）2． 吸收定律及其发射偏差的原因

3． 仪器类型、各部件的结构、性能以及仪器的校正 4． 分析条件的选择

5． 应用（定性及结构分析、定量分析的各种方法、物理化学常数的测定及其它方面的应用

二．重点与难点

1． 比较有机化合物和无机化合物各种电子跃迁类型所产生吸收带的特点及应用价值

2． 进行化合物的定性分析、结构判断

3． 定量分析的新技术（双波长法、导数光谱法、动力学分析法）4． 物理化学常数的测定

三．教学要求

1． 较为系统、深入地掌握各种电子跃迁所产生的吸收带及其特征、应用 2． 熟练掌握吸收定律的应用及测量条件的选择 3． 较为熟练仪器的类型、各组件的工作原理 4． 运用各种类型光谱及的经验规则，判断不同的化合物

5． 掌握定量分析及测定物理化学常数的常见基本方法 6． 一般掌握某些新的分析技术

四．学时安排

5学时

研究物质在 紫外、可见光区 的分子吸收光谱 的分析方法称为紫外-可见分光光度法。紫外—可见分光光度法是利用某些物质的 1 分子吸收200 ~ 800 nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子 在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定。

第一节

紫外—可见吸收光谱

一、分子吸收光谱的产生

在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转动。这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级。在每一电子能级上有许多间距较小的振动能级，在每一振动能级上又有许多更小的转动能级。

若用△E电子、△ E振动、△ E转动分别表示电子能级、振动能级转动能级差，即有△ E电子 △ E振动 △ E转动。处在同一电子能级的分子，可能因其振动能量不同，而处在不同的振动能级上。当分子处在同一电子能级和同一振动能级时，它的能量还会因转动能量不同，而处在不同的转动能级上。所以分子的总能量可以认为是这三种能量的总和：

E分子 = E电子

+ E振动

+ E转动

当用频率为的电磁波照射分子，而该分子的较高能级与较低能级之差△ E恰好等于该电磁波的能量 h时，即有

△ E

= h

（h为普朗克常数）

此时，在微观上出现分子由较低的能级跃迁到较高的能级；在宏观上则透射光的强度变小。若用一连续辐射的电磁波照射分子，将照射前后光强度的变化转变为电信号，并记录下来，然后以波长为横坐标，以电信号（吸光度 A）为纵坐标，就可以得到一张光强度变化对波长的关系曲线图——分子吸收光谱图。

二、分子吸收光谱类型

根据吸收电磁波的范围不同，可将分子吸收光谱分为远红外光谱、红外光谱及紫外、可见光谱三类。

分子的转动能级差一般在0.005 ~ 0.05eV。产生此能级的跃迁，需吸收波长约为250 ~ 25m的远红外光，因此，形成的光谱称为转动光谱或远红外光谱。

分子的振动能级差一般在0.05 ~ 1 eV，需吸收波长约为25 ~ 1.25m的红外光才能产生跃迁。在分子振动时同时有分子的转动运动。这样，分子振动产生的吸收光谱中，包括转动光谱，故常称为振-转光谱。由于它吸收的能量处于红外光区，故又称红外光谱。电子的跃迁能差约为1 ~ 20 eV，比分子振动能级差要大几十倍，所吸收光的波长约为12.5 ~ 0.06m，主要在真空紫外到可见光区，对应形成的光谱，称为电子光谱或紫外、可见吸收光谱。

通常，分子是处在基态振动能级上。当用紫外、可见光照射分子时，电子可以从基态激发到激发态的任一振动（或不同的转动）能级上。因此，电子能级跃迁产生的吸收光谱，包括了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带，这就是为什么分子的紫外、可见光谱不是线状光谱，而是带状光谱的原因。又因为绝 大多数的分子光谱分析，都是用液体样品，加之仪器的分辨率有限，因而使记录所得电子光谱的谱带变宽。

由于氧、氮、二氧化碳、水等在真空紫外区（60 ~ 200 nm）均有吸收，因此在测定这一范围的光谱时，必须将光学系统抽成真空，然后充以一些惰性气体，如氦、氖、氩等。鉴于真空紫外吸收光谱的研究需要昂贵的真空紫外分光光度计，故在实际应用中受到一定的限制。我们通常所说的紫外—可见分光光度法，实际上是指近紫外、可见分光光度法。

第二节

化合物紫外—可见光谱的产生

在紫外和可见光谱区范围内，有机化合物的吸收带主要由*、*、n*、n*及电荷迁移跃迁产生。无机化合物的 3 吸收带主要由电荷迁移和配位场跃迁（即d—d跃迁和f—f跃迁）产生.由于电子跃迁的类型不同，实现跃迁需要的能量不同，因此吸收光的波长范围也不相同。其中*跃迁所需能量最大，n*及配位场跃迁所需能量最小，因此，它们的吸收带分别落在远紫外和可见光区。从图中 可知，*（电荷迁移）跃迁产生的谱带强度最大，*、n*、n*跃迁产生的谱带强度次之，（配位跃迁的谱带强度最小）。

一、有机化合物的紫外—可见吸收光谱

（一）、跃迁类型

基态有机化合物的价电子包括成键电子、成键电子和非键电子（以 n表示）。分子的空轨道包括反键 *轨道和反键*轨道，因此，可能的跃迁为*、*、n* n*等。

1，*跃迁

它需要的能量较高，一般发生在真空紫外光区。饱和烃中的—c—c—键属于这类跃迁，例如乙烷的最大吸收波长max为135nm。

2，n*跃迁

实现这类跃迁所需要的能量较高，其吸收光谱落于远紫外光区和近紫外光区，如CH3OH和CH3NH2的n*跃迁光谱分别为183nm和213nm。

3，*跃迁

它需要的能量低于*跃迁，吸收峰一般 处于近紫外光区，在200 nm左右，其特征是摩尔吸光系数大，一般max104，为强吸收带。如乙烯（蒸气）的最大吸收波长max为162 nm。

4，n*跃迁

这类跃迁发生在近紫外光区。它是简单的生色团如羰基、硝基等中的孤对电子向反键轨道跃迁。其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100，属于禁阻跃迁。

5，电荷迁移跃迁

所谓电荷迁移跃迁是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向与接受体相联系的轨道上跃迁。因此，电荷迁移跃迁实质是一个内氧化—还原的过程，而相应的吸收光谱称为电荷迁移吸收光谱。例如某些取代芳烃可产生这种分子内电荷迁移跃迁吸收带。

电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度较大，最大波长处的摩尔吸光系数max可大于104。

（二）、常用术语 1，生色团

从广义来说，所谓生色团，是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。但是，人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。

2，助色团

助色团是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸光度。

3，红移与蓝移（紫移）

某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团（-OH、-OR、-NH2、-SH、-Cl、-Br、-SR、-NR2）之后，吸收峰的波长将向长波方向移动，这种效应称为红移效应。这种会 使某化合物的最大吸收波长向长波方向移动的基团称为向红基团。

在某些生色团如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波长会向短波方向移动，这种效应称为蓝移（紫移）效应。这些会使某化合物的最大吸收波长向短波方向移动的基团（如-CH2、-CH2CH3、-OCOCH3）称为向蓝（紫）基团。(三)有机化合物紫外-可见吸收光谱 1，饱和烃及其取代衍生物

饱和烃类分子中只含有键，因此只能产生*跃迁，即电子从成键轨道（）跃迁到反键轨道（ *）。饱和烃的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可见分光光度计的测量范围。

饱和烃的取代衍生物如卤代烃，其卤素原子上存在n电子，可产生n* 的跃迁。n* 的能量低于*。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n* 跃迁分别出现在173、204和258nm处。这些数据不仅说明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相应的吸收波长发生了红移，显示了助色团的助色作用。直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不大。但是它们是测定紫外和（或）可见吸收光谱的良好溶剂。2，不饱和烃及共轭烯烃

在不饱和烃类分子中，除含有键外，还含有键，它们可以产生*和*两种跃迁。*跃迁的能量小于 *跃迁。例如，在乙烯分子中，*跃迁最大吸收波长为180nm

在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键共轭时，随着共轭系统的延长，*跃迁的吸收带 将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强。在共轭体系中，*跃迁产生的吸收带又称为K带。

3，羰基化合物

羰基化合物含有C=O基团。C=O基团主要可产生*、n*、n*三个吸收带，n*吸收带又称R带，落于近紫外或紫外光区。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有 羰基。由于醛酮这类物质与羧酸及羧酸的衍生物在结构上的差异，因此它们n*吸收带的光区稍有不同。

羧酸及羧酸的衍生物虽然也有n*吸收带，但是，羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接连结含有未共用电子对的助色团，如-OH、-Cl、-OR等，由于这些助色团上的n电子与羰基双键的电子产生n共轭，导致*轨道的能级有所提高，但这种共轭作用并不能改变n轨道的能级，因此实现n* 跃迁所需的能量变大，使n*吸收带蓝移至210nm左右。4，苯及其衍生物

苯有三个吸收带，它们都是由*跃迁引起的。E1带出现在180nm（MAX = 60，000）； E2带出现在204nm（MAX = 8，000）；B带出现在255nm（MAX = 200）。在气态或非极性溶剂中，苯及其许多同系物的B谱带有许多的精细结构，这是由于振动跃迁在基态电子上的跃迁上的叠加而引起的。在极性溶剂中，这些精细结构消失。当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B谱带。5，稠环芳烃及杂环化合物

稠环芳烃，如奈、蒽、芘等，均显示苯的三个吸收带，但是与苯本身相比较，这三个吸收带均发生红移，且强度增加。随着苯环数目的增多，吸收波长红移越多，吸收强度也相应增加。

当芳环上的-CH基团被氮原子取代后，则相应的氮杂环化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光谱，与相应的碳化合物极为相似，即吡啶与苯相似，喹啉与奈相似。此外，由于引入含有n电子的N原子的，这类杂环化合物还可能产生n*吸收带。

二、无机化合物的紫外-可见吸收光谱

产生无机化合物紫外、可见吸收光谱的电子跃迁形式，一般分为两大类：电荷迁移跃迁和配位场跃迁。

（一）电荷迁移跃迁

无机配合物有电荷迁移跃迁产生的电荷迁移吸收光谱。

在配合物的中心离子和配位体中，当一个电子由配体的轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上时，可产生电荷迁移吸收光谱。

不少过度金属离子与含生色团的试剂反应所生成的配合物以及许多水合无机离子，均可产生电荷迁移跃迁。

此外，一些具有d10电子结构的过度元素形成的卤化物及硫化物，如AgBr、HgS等，也是由于这类跃迁而产生颜色。

电荷迁移吸收光谱出现的波长位置，取决于电子给予体和电子接受体相应电子轨道的能量差。

（二）配位场跃迁

配位场跃迁包括df

跃迁。元素周期表中第四、五周期的过度金属元素分别含有3d和4d轨道，镧系和锕系元素分别含有4f和5f轨道。在配体的存在下，过度元素五 个能量相等的d轨道和镧系元素七个能量相等的f轨道分别分裂成几组能量不等的d轨道和f轨道。当它们的离子吸收光能后，低能态的d电子或f电子可以分别跃迁至高能态的d或f轨道，这两类跃迁分别称为df

跃迁。由于这两类跃迁必须在配体的配位场作用下才可能发生，因此又称为配位场跃迁。

三、溶剂对紫外、可见吸收光谱的影响

溶剂对紫外—可见光谱的影响较为复杂。改变溶剂的极性，会引起吸收带形状的变化。例如，当溶剂的极性由非极性改变到极性时，精细结构消失，吸收带变向平滑。

改变溶剂的极性，还会使吸收带的最大吸收波长发生变化。下表为溶剂对亚异丙酮紫外吸收光谱的影响。

正己烷

CHClCH3OH

H2O * max/nm

230

238

237

243

n *max/nm

329

315

309

305

由上表可以看出，当溶剂的极性增大时，由n * 跃迁产生的吸收带发生蓝移，而由* 跃迁产生的吸收带发生红移。因此，在测定紫外、可见吸收光谱时，应注明在何种溶剂中测定。

由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或数据表中必须注明所用的溶剂。与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相同。在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。选择溶剂时注意下列几点：

（1）溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质应该是惰性的。即所成溶液应具有良好的化学和光化学稳定性。

（2）在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小的溶剂。（3）溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收。

第三节

紫外-可见分光光度计

一、组成部件

紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统。

（一）光源

对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小。

分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。

热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。钨灯和碘钨灯可使用的范围在340 ~ 2500nm。这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关，在可见光 9 区，辐射的能量与工作电压4次方成正比。光电流与灯丝电压的n次方（n1）成正比。因此必须严格控制灯丝电压，仪器必须配有稳压装置。

在近紫外区测定时常用氢灯和氘灯。它们可在160 ~ 375 nm范围内产生连续光源。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大3~5倍。

（二）单色器

单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。

单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色散元件，起分光的作用。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度度、选择性及校准曲线的线性关系等。

能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。

棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350 ~ 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域内。石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 ~ 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三 个光域。

光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。入射、出射狭缝，透镜及准光镜等光学元件中狭缝在决定单色器性能上起重要作用。狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭缝又会减弱 光强。

（三）吸收池

吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料两种。石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。

（四）检测器

检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。

常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。

硒光电池对光的敏感范围为300~800nm，其中又以500 ~ 600nm最为灵敏。这种光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中。

光电管在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。

光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。

（五）信号指示系统

它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。

二、紫外-可见分光光度计的类型

紫外-可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三种类型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。1，单光束分光光度计

经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。2，双光束分光光度计

经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。

双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。

3，双波长分光光度计

由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光；利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA（ΔA=A1-A2）。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。

通过光学系统转换，使双波长分光光度计能很方便地转化为单波长工作方式。如果能在1和2处分别记录吸光度随时间变化的曲线，还能进行化学反应动力学研究。

三、分光光度计的校正

通常在实验室工作中，验收新仪器或实验室使用过一段时间后都要进行波长校正和吸光度校正。

建议采用下述的较为简便和实用的方法来进行校正：镨铷玻 璃或钬玻璃都有若干特征的吸收峰，可用来校正分光光度计的波长标尺，前者用于可见光区，后者则对紫外和可见光区都适用。也可用K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度。

定性分析

紫外－可见分光光度法是一种广泛应用的定量分析方法，也是 对物质进行定性分析和结构分析的一种手段，同时还可以测定某些 化合物的物理化学参数，例如摩尔质量、配合物的配合比和稳定常 数、以及酸、碱的离解常数等。

紫外－可见分光光度法在无机元素的定性分析应用方面 是比较少的，无机元素的定性分析主要用原子发射光谱法或化学分 析法。在有机化合物的定性分析鉴定及结构分析方面，由于紫外－ 可见光谱较为简单，光谱信息少，特征性不强，而且不少简单官能 团在近紫外及可见光区没有吸收或吸收很弱，因此，这种方法的应 用有较大的局限性。但是它适用于不饱和有机化合物，尤其是共轭体系的鉴定，以此推断未知物的骨架结构。此外，它可配合红 外光谱法、核磁共振波谱法和质谱法等常用的结构分析法进行定量 鉴定和结构分析，是不失为一种有用的辅助方法。一般定性分析方 法有如下两种：

1.比较吸收光谱曲线法

吸收光谱的形状、吸收峰的数目和位置及相应的摩尔吸 光系数，是定性分析的光谱依据，而最大吸收波长

及相应的是定性分析的最主要参数。比较法有标准物质比较法和标准谱图比 较法两种。

利用标准物质比较，在相同的测量条件下，测定和比较未知物 13 与已知标准物的吸收光谱曲线，如果两者的光谱完全一致，则可以初步认为它们是同一化合物。为了能使分析更准确可靠，要注意如下几点：

一、是尽量保持光谱的精细结构。为此，应采用与吸收物质作用力小的非极性溶剂，且采用窄的光谱通带；

二、是吸收光谱采用不同，则曲线只是沿

对

作图。这样如果未知物与标准物的浓度

曲线那样以的比

轴平移，而不是象例移动，更便于比较分析。

三、是往往还需要用其它方法进行证实，如红外光谱等。利用标准谱图或光谱数据比较。常用的标准谱图有以下表中的四种：

[1] Sadtler Standard Spectra(Ultraviolet),Heyden,London,1978.萨特勒标准图谱共收集了46000种化合物的紫外光谱。

[2] R.A.Friedel and M.Orchin,“Ultraviolet and Visible Absorption Spectra of Aromatic Compounds”,Wiley,New York, 1951.本书收集了597种芳香化合物的紫外光谱。

[3] Kenzo Hirayama：“Handbook of Ultraviolet and Visible Absorption Spectra a of Organic Compounds.”,New York,Plenum,1967。

[4] “Organic Electronic Spectral Data”。

2.计算不饱和有机化合物最大吸收波长的经验规则

有伍德沃德（Woodward）规则和斯科特（Scott）规则。

当采用其它物理或化学方法推测未知化合物有几种可能结构后，可用经验规则计算它们最大吸收波长，然后再与实测值进行比较，以确认物质的结构。

伍德沃德规则

它是计算共轭二烯、多烯烃及共轭烯酮类化合物π—π*跃迁最大吸收波长的经验规则，如表13.7和表13.9所示。计算时，先从未知物的母体对照表得到一个最大吸收的基数，然后对连接在母体中π电子体系(即共轭体系)上的各种取代基以及其他结构因素按上所列的数值加以修正，得到该化合物的最大吸收波长

。

结构分析

紫外－可见分光光度法可以进行化合物某些基因的判别、共轭体系及构型、构象的判断。

1.某些特征集团的判别

有机物的不少基团(生色团)，如羰基、苯环、硝基、共轭体系等，都有其特征的

紫外或可见吸收带，紫外－可见分光光度法在判别这些基团时，有时是十分有用的。如在270～300nm处有弱的吸收带，且随溶剂极性增大而发生蓝移，就是羰基n－π*跃迁所产生R吸收带的有力证据。在184nm附近有强吸收带(E1带)，在204nm附近有中强吸收带(E2带)，在260nm附近有弱吸收带且有精细结构(B带)，是苯环的特征吸收，等等。可以从有关资料中查找某些基团的特征吸收带。

2.共轭体系的判断

共轭体系会产生很强的K吸收带，通过绘制吸收光谱，可以判断化合物是否存在共轭体系或共轭的程度。如果一化合物在210nm以上无强吸收带，可以认为该化合物不存在共轭体系；若在215～250nm区域有强吸收带，则该化合物可能有两至三个双键的共轭体系，如1－3丁二烯，为217nm，为21,000；若260～350nm 15 区域有很强的吸收带，则可能有三至五个双键的共轭体系，如癸五烯有五个共轭双键，3.异构体的判断

包括顺反异构及互变异构两种情况的判断。

顺反异构体的判断

生色团和助色团处在同一平面上时，才产生最大的共轭效应。由于反式异构体的空间位阻效应小，分子的平面性能较好，共轭效应强。因此，及都大于顺式异构体。例如，肉桂酸的顺、反式的吸收如下：

为335nm，为118,000。

＝280nm

295nm =27000

=13500

＝

同一化学式的多环二烯，可能有两种异构体：一种是顺式异构体；另一种是异环二烯，是反式异构体。一般来说，异环二烯的吸收带强度总是比同环二烯来的大。

互变异构体的判断

某些有机化合物在溶液中可能有两种以上的互变异构体处于动态平衡中，这种异构体的互变过程常伴随有双键的移动及共轭体系的变化，因此也产生吸收光谱的变化。最常见的是某些含氧化合物的酮式与烯醇式异构体之间的互变。例如乙酰乙酸乙酯就是和烯醇式两种互变异构体：

它们的吸收特性不同：酮式异构体在近紫外光区的272nm（为为16)，是n－π*跃迁所产生R吸收带。烯醇式异构体的为243nm(为16000)，是π－π*跃迁出共轭体系的K吸收带。两种异构体的互变平衡与溶剂有密切关系。在象水这样的极性溶剂中，由于 可能与H2O形成氢键而降低能量以达到稳定状态，所以酮式异构体占优势:

而象乙烷这样的非极性溶剂中，由于形成分子内的氢键，且形成共轭体系，使能量降低以达到稳定状态，所以烯醇式异构体比率上升:

此外，紫外－可见分光光度法还可以判断某些化合物的构象(如取代基是平伏键还是直平键)及旋光异构体等。

定量分析

紫外－可见分光光度法定量分析的方法常见到的有如下几 种 ：

1.单组分的定量分析

如果在一个试样中只要测定一种组分，且在选定的测量波长下，试样中其它组分对该组分不干扰，这种单组分的定量分析较简单。一般有标准对照法和标准曲线法两种。标准对照法

在相同条件下，平行测定试样溶液和某一浓度Cs（应与试液浓度接近）的标准溶液的吸光度Ax和As则由Cs可计算试样溶液中被测物质的浓度Cx

标准对照法因知使用单个标准，引起误差的偶然因素较多，故往往较不可靠。标准曲线法

这是实际分析工作中最常用的一种方法。配制一系列不同浓度的标准溶液，以不含被测组分的空白溶液作参比，测定标准系列溶液的吸光度，绘制吸光度－浓度曲线，称为校正曲线（也叫标准曲线或工作曲线）。在相同条件下测定试样溶液的吸光度，从校正曲线上找出与之对应的未知组分的浓度。

此外，有时还可以采用标准加入法。2.多组分的定量分析

根据吸光度具有加和性的特点，在同一试样中可以同时测定两个或两个以上组分。假设要测定试样中的两个组分A、B，如果分别绘制A、B两纯物资的吸收光谱，绘出三种情况，如图13.20所示。

（a）情况表明两组分互不干扰，可以用测定单组分的方法分

别在λ

1、λ2测定A、B两组分；

（b）情况表明A组分对B组分的测定有干扰，而B组分对A组分的测定无干扰，则可以在λ1处单独测量A组分，求得A组分的浓 18 度CA。然后在λ2处测量溶液的吸光度值，根据吸光度的加和性，即得

及A、B纯物质的和

则可以求出CB；

（c）情况表明两组分彼此互相干扰，此时，在λ

1、λ2处分别测定溶液的吸光度

及，而且同时测定A、B纯物质的、及、。然后列出联立方程

解得CA、CB。显然，如果有n个组分的光谱互相干扰，就必须在n个波长处分别测定吸光度的加和值，然后解n元一次方程以求出各组分的浓度。应该指出，这将是繁琐的数学处理，且n越多，结果的准确性越差。用计算机处理测定结果将使运算大为方便。3.双波长分光光度法

当试样中两组分的吸收光谱较为严重时，用解联立方程的方法测定两组分的含量可能误差较大，这时可以用双波长分光光度法测定。它可以进行一组分在其它组分干扰下，测定该组分的含量，也可以同时测定两组分的含量。双波长分光光度法定量测定两混合物组分的主要方法有等吸收波长法和系数倍率法两种。等吸收波长法

试样中含有A、B两组分，若要测定B组分，A组分有干扰，采用双波长法进行B组分测量时方法如下：为了要能消除A组分的吸收干扰，一般首先选择待测组分B的最大吸收波长λ2为测量波长，然后用作图法选择参比波长λ1，作法如图所示。

在λ2处作一波长轴的垂直线，交于组分B吸收曲线的另某一点，再从这点作一条平行于波长轴的直线，交于组分B吸收曲线的另一点，该点所对应的波成为参比波长λ1。可见组分A在λ2和λ1处是等吸收点，由吸光度的加和性可见，混合试样在λ2和λ1处的吸光度可表示为

双波长分光光度计的输出信号为ΔA，可见仪器的输出讯号ΔA与干扰组分A无关，它只正比于待测组分B的浓度，即消除了B的干扰。系数倍率法

当干扰组分A的吸收光谱曲线不呈峰状，仅是陡坡状时，不存在两个波长处的等吸收点时，如图所示。在这种

情况下，可采用系数倍率法测定B组分，并采用双波长分光光度计来完成。选择两个波长λ

1、λ2，分别测量A、B混合液的吸光度，利用双波长分光光度计中差分函数放大器，把大k1、k2倍，获得、两波长处测得的差示信号S：

调节放大器，选取和，使之满足、、分别放得到系数倍率K为

差示信号S与待测组分B的浓度CB成正比，与干扰组分A无关，即消除了A的干扰。4.导数分光光度计法

采用不同的实验方法可以获得各种导数光谱曲线。不同的实验方法包括双波长法、电子微分法和数值微分法。

将对波长λ求导:

在整个波长范围内可控制在恒定值，则

上式表明，第一，导数分光光度法的一阶导数信号与浓度成正比例，不需要通过对数转换为吸光度；第二，测定灵敏度决定于摩尔吸光系数在特定波长处的变化率，在吸收曲线的拐点波长处大，灵敏度最高。如图 所示。

对于二阶导数光谱：

最

只有当一阶导数

时，二阶导数信号才与浓度成正比例。测定波长选择在吸收峰处，其曲率

三阶导数光谱：

最大，灵敏度就高。

当一阶导数

时，三阶导数信号与浓度成比例，测定波长在曲率半径小的肩峰处

最大，可获得高的灵敏度。

在一定条件下，导数信号与被测组分的浓度成比例。测量导数光谱曲线的峰值方法有基线法、峰谷法，如图13.24所示。

基线法又称切线法在相邻两峰的极大或极小处画一公切线，在由峰谷引一条平行于纵坐标的直线相交于a点，然后测量距离他t的大小的。

峰谷法测量相邻两峰的极大和极小之间的距离p，这是较常用的方法。

峰零法测量峰至基线的垂直距离z。该法只适用与导数光谱曲 23 线对称于横坐标的高阶导数光谱。

导数分光光度法对吸收强度随波长的变化非常敏感，灵敏度高。对重叠谱带及平坦谱带的分辩率高，噪声低。导数分光光度法对痕量分析、稀土元素、药物、氨基酸、蛋白质的测定，以及废气或空气中污染气体的测定非常有用。

6.其它分析方法：简单介绍动力学分光光度法及胶束分光光度法 动力学分光光度法

一般的分光光度法是在溶液中发生的化学反应达到平衡后测量吸光度，然后根据吸收定律算出待测物资的含量。而动力学分光光度法则是利用反应速率与反应物、产物或催化剂的浓度之间的定量关系，通过测量与反应速率成正比例关系的吸光度，从而计算待测物质的浓度。根据催化剂的存在与否，动力学分光光度法可分为非催化和催化分光光度法。当利用酶这种特殊的催化剂时，则称为酶催化分光光度法。由反应速度方程式及吸收定律方程式可以推导出动力学分光光度法的基本关系为

A=KCc

式中K为常数，Cc为催化剂的浓度。测定Cc的方法常有固定时间法、固定浓度法和斜率法三种。

优点：灵敏度高，选择性好(有时是特效的)、应用范围广(快速、慢速反应，有副反应，高、低浓度均可)。

缺点：影响因素较多，测量条件不易控制，误差经常较大。胶束增容分光光度法

胶束强度分光光度法是利用表面活性剂的增强、增敏、增稳、褪色、析向等作用，以提高显色反应的灵敏度、对比度或选择性，改善显色反应条件，并在水向中直接进行光度测量的分光光度法。

MBTH分光光度法 篇3

【关键词】微波消解；重铬酸钾分光光度法；COD

化学需氧量（COD）是评价水体有机污染程度的综合指标，是我国《重点工业污染源监测暂行技术要求》中大多数工矿企业的必测项目之一。COD的测定随着测定水样中还原性物质以及测定方法的不同，其测定值也不同。目前应用最为普遍的是重铬酸钾氧化法（GB/T19914—1989）和紫外分光光度法。重铬酸钾氧化法对样品氧化完全、操作简单、测定结果准确度、重现性较好，被众多环境监测部门作为常用的监测方法。但测定过程中整个反应体系在浓硫酸介质中进行，需要回流2小时以上，耗水耗电，消耗大量的浓硫酸和昂贵的硫酸银，特别是当废水中Cl-浓度较高时，还需要加入毒性很大的硫酸汞最为掩蔽剂，极易对环境造成汞二次污染。因此，中华人民共和国环境保护部又颁布了HJ/T399—2007《水质化学需氧量的测定-快速消解分光光度法》，此方法只需要少量样品、试剂用量较少，样品消化能耗少，批量处理样品分析速度较快，具有操作简便、能耗下、实验装置空间小等优点。实验从消解方式、方法标准曲线、精密度、准确度等方面进行对比研究。

1、实验部分

1.1仪器设备

全玻璃回流装置，滴定管50ml；分光光度计，分析天平，TL-LA型恒温消化装置，专用反应管，磨口具塞刻度比色管。

1.2主要试剂

重铬酸钾标准溶液（1/6K2Cr2O7）=0.2500mol/L。

试亚铁灵指示剂。

硫酸亚铁铵标准溶液：0.1mol/L。

邻苯二甲酸氢钾标准溶液：COD值为500mg/L。

硫酸银-硫酸试剂：向2.5L硫酸中加入25g硫酸银放置1～2天使之溶解，并在混匀前小心摇匀。

催化剂使用液：将专用催化剂用浓硫酸稀释10倍后使用。

邻苯二甲酸氢钾标准溶液：COD值为1000mg/L。

掩蔽剂：称取7.0g硫酸汞，用新配制的1+4硫酸100ml溶解。

1.3测定原理

1.3.1重铬酸钾法

在强酸性溶液中，准确的加入过量的重铬酸钾标准溶液和作为催化剂的硫酸银，加热回流一定时间，将水样中还原性物质（主要是有机物）氧化，过量的重铬酸钾溶液以试亚铁灵指示液作指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液回滴，根据所消耗的重铬酸钾标准溶液量计算水样化学需氧量。

1.3.2重铬酸钾分光光度法

采用与标准方法同样的H2SO4-K2Cr2O7消解体系，在专用复合催化剂存在下，于165℃恒温加热消化水样10min，重铬酸钾被水中还原性物质（主要是有机物）还原为三价铬，根据三价铬的量换算成消耗氧的质量浓度，在消化水样前加入硫酸汞，使其与氯形成络合物以消除干扰。

1.4测定步骤

1.4.1重铬酸钾法

取20.00ml混合均匀的水样置250ml磨口的回流锥形瓶中，加入10.00ml重铬酸钾标准溶液及数粒玻璃珠，连接磨口冷凝管，从冷凝管上口慢慢地加入30ml硫酸—硫酸银溶液，轻轻摇动混合，加热回流2h，冷却后，用90ml蒸馏水冲洗冷凝管壁，取下锥形瓶，溶液总体积不得小于140ml，溶液再度冷却后，加3滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量。测定水样的同时，以20.00ml蒸馏水，按同样步骤作空白试验，记录滴定空白消耗硫酸亚铁铵标准溶液的量。

1.4.2重铬酸钾分光光度法

吸取3ml混合均匀的水样置于专用反应管中，加入少许掩蔽剂（1ml）摇匀；再加入1ml专用氧化剂，摇匀；然后垂直快速加入5ml催化剂使用液，将反应管依次置于恒温加热装置的孔穴内（严禁加盖消化），当温度上升到165℃开始时，消化水样10min，取出反应管，室温下冷却，再用水冷数分钟，用水定容至12ml刻度线，加盖摇匀、冷却待测定，于610nm波长处，用3cm的比色皿以水作参比液测定吸光度并做空白校正，做出标准曲线，从而计算出CODCr值。

2、结果与讨论

2.1消解条件的选择

根据GB-11914-1989重铬酸钾滴定法测定化学需氧量中规定低质量浓度样品（10mg/L～50mg/L）与高质量浓度样品（50mg/L～700mg/L）所使用试剂的质量浓度不同，所以本实验分别使用25mg/L和250mg/L的样品在不同消解温度、消解时间下测定样品的回收率。在不同消解温度下的回收率测定结果如图1所示，在不同消解时间下样品的回收率如图2所示。

由图1可以看出在消解温度低于160℃時，随着消解温度的提高回收率增加，而在消解温度高度160℃后，回收率增加不明显，而且回收率均达到了99%以上，故本实验的消解温度选择165℃。

由图2可以看出，在消解时间低于9分钟时，回收率随着消解时间的增加而增加，说明消解时间过短，消解不完全；而消解时间大于9分钟后，随着消解时间的增长，回收率不再增加，且均达到99%以上，说明试样消解完全，故本实验选择消解时间为9分钟，较至国家标准方法——重铬酸钾滴定法的回流2小时，时间明显缩短。

2.2测定条件的选择

2.2.1特征波长的选择

按照1.4.2的步骤消解水样，待水样冷却后定容、摇匀，在400-760nm可见光范围内测定其吸光度，绘制出吸收曲线如图3所示。故本实验选择特征吸收波长为610nm。

2.2.2测量范围的选择

为了保證分光光度法在测定的准确度，就必须保证标准工作曲线不偏离朗伯比尔定律，因浓度是偏离朗伯比尔定律的一个重点因素，故本实验分别用1000mg/L的COD标准储备液按照表1配制出标准系列，在610nm处测定其吸光度，作出工作曲线。

由表1可知，分光光度法在0-1000mg/L之间线性关系良好。

2.3微波消解分光光度法与国家标准方法比较

取四个水样，分别用微波消解-分光光度法和国家标准方法（重铬酸钾氧化法）测定，用t检验法分别计算，结果如表2所示。

由表2可知，当α=0.05时，t计算

2.4方法准确度

准确度的测定用假表回收率进行测定，本实验用上述实验测定的水样1、水样2、水样3、水样4，，分别加入200mg/L的标准溶液。测定结果如表3所示。

实验表明，加标回收率在95%～105%之间，方法准确度可以接受。

2.5方法精密度

根据微波消解-分光光度法的测定范围，用COD为1000mg/L的标准储备液分别配制COD为100、250、500、750的标准溶液，对4组浓度的溶液进行测定，结果如表4所示。

通过对上述四种标准样品进行的平行测定，计算相对标准偏差Si，四种标准样品的相对标准偏差Si均小于2%，满足实验室质量控制的要求。结果表明：该方法稳定性、重现性比较好，精密度能到满足定量分析的要求。

3、结论

微波消解-重铬酸钾分光光度法测定COD在610nm处有最大吸收，在0～1000mg/L范围内符合朗伯比尔定律，相关系数为0.9996，与国家标准方法无显著性差异，方法精密度和准确度高，且实验时间短，有毒试剂重铬酸钾加入量少。因此用分光光度法代替常规的重铬酸钾滴定法是切实可行的。

参考文献

[1]国家环保总局.水和废水监测分析方法（第四版）[M].北京：中国环境科学出版社，2002.

[2]GB/T 11914-89 水质化学需氧量的测定重铬酸钾法[S].

[3]HJ/T 399-2007 水质 化学需氧量的测定 快速消解分光光度法[S].

[4]李涛，伏圣菊，徐进等.快速消解分光光度法测定COD的应用研究[J].能源与环境.2014（1）：87-89.

分光光度法快速测定化学需氧量 篇4

分光光度法快速测定化学需氧量

摘要：研究开发一种快速的分光光度测定化学需氧量的方法,实验结果表明:该方法节省时问,节约用水,可同时测试多组样品,其准确度和精密度能满足实际工作中的要求.作 者：封丽红 霍振平 蔡海霞 作者单位：河北省邯郸市污水公司排水监测站,河北邯郸,056004期 刊：科技与生活 Journal：TECHNOLOGY AND LIFE年，卷(期)：,“”(6)分类号：X832关键词：化学需氧量 助催化剂 电热恒温干燥箱 分光光度法

铁氰化钾分光光度法测定茶叶中的铁 篇5

关键词：普鲁士蓝；分光光度法；茶叶；铁

中图分类号： O657.32文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0344-02

茶叶具有止渴、清神、利尿、治咳、祛痰、明目、益思、除烦去腻、驱困轻身、消炎解毒等功效。茶叶中含有茶单宁、蛋白质、生物碱、果胶、氨基酸、钾、钙、镁、锰、铁等。其中铁元素在人体中具有造血功能，参与血蛋白、细胞色素及各种酶的合成，促进生长，铁还在血液中起运输氧和营养物质的作用。人体缺铁可导致缺铁性贫血、免疫功能下降和新陈代谢紊乱。测定茶叶中的铁含量对茶叶营养价值的评估具有重要的意义。已报道的茶叶中铁的测定方法有：光化学伏安法[1]、分光光度法[2-4]、原子吸收光谱法[5-8]、荧光熄灭法[9]等。利用生成普鲁士蓝的可见光分光光度法测定茶叶中的铁含量还未见报道。本试验首先把茶叶消化，加入NH2OH·HCl，使茶叶中的Fe3+还原为Fe2+，然后加入K3[Fe（CN）6]，Fe2+与 K3[Fe（CN）6] 生成可溶性普鲁士蓝，通过测定普鲁士蓝在712 nm 处的吸光度来测定茶叶中总铁的含量。本法所用仪器简单，操作容易，干扰少，所用试剂无毒且价格便宜，测定灵敏度高、线性范围较宽，应用于茶叶中铁含量的测定，结果令人满意。

1材料与方法

1.1试剂与材料

铁标准溶液（10 μg/mL）：用十二水硫酸铁铵（AR，天津市光复精细化工研究所）配制，准确称取0.431 7 g十二水硫酸铁铵，加入6 mol/L硫酸10 mL及适量蒸馏水溶解，转移至500 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，配制成含铁100 μg/mL的溶液。准确移取含铁100 μg/mL的溶液20.00 mL，转移至200 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。盐酸羟胺（10%）：称取盐酸羟胺（AR，国药集团化学试剂有限公司）4.0 g，放入小烧杯中，加入36 mL蒸馏水，搅拌溶解，转移入棕色试剂瓶中（临用时配制）。铁氰化钾（1.500 mmol/L）：称取K3[Fe（CN）6]（AR，天津市德恩化学试剂有限公司）0.246 9 g，放入小烧杯，加入适量蒸馏水溶解，转移至500 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

市售茶叶3种：信阳毛尖、安溪铁观音、祁门红茶，均购自洛阳市茶叶市场。

1.2仪器

TU-1900双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；PHS-3C型精密酸度计（上海大普仪器有限公司）。

1.3试验方法

1.3.1样品处理样品按照王功平等[10]、陈祥海等[11]的方法进行处理，首先把样品放入烘箱中，90 ℃烘干至恒质量。把样品研碎，称取茶叶样品2.000 0 g，放入200 mL三角瓶中，加入30 mL浓硝酸和3 mL浓硫酸，放置过夜，将三角瓶放在电炉上加热至沸腾20～30 min，溶液呈棕黄色，冷却，再加入2 mL浓硝酸，煮沸，重复以上操作，当加浓硝酸不再显示棕色时，说明茶叶已消化完全，这时溶液呈澄清状态，继续加热煮沸至冒白烟。冷却，转移至离心管中，用离心机4 000 r/min离心30 min。弃去沉淀，把上清液转移入50 mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液调节溶液pH值为1.0，加水至刻度。

1.3.2测定方法准确移取2.00 mL茶叶提取液，放入12.50 mL比色管中，加入1.00 mL 10%的盐酸羟胺，再加入1.80 mL 1.500 mmol/L的K3[Fe（CN）6]溶液，用蒸馏水稀释至刻度，室温放置10 min，以试剂空白为参比，用分光光度计测定溶液在712 nm处的吸光度。

2结果与分析

2.1反应机理

通过消化反应使茶叶中的铁游离，然后加入盐酸羟胺使Fe3+还原为Fe2+，再加入K3[Fe（CN）6]，Fe2+与 K3[Fe（CN）6] 生成可溶性普鲁士蓝。通过测定普鲁士蓝在712 nm处的吸光度可间接测定茶叶中总铁的含量。

2.2最大吸收波长的选择

按照“1.3”节的试验方法，以试剂空白为参比，用 TU-1900 双光束紫外可见分光光度计扫描生成可溶性普鲁士蓝在 500～900 nm的吸收光谱。图1表示生成可溶性普鲁士蓝的光吸收曲线，最大吸收波长为712 nm，故本试验选择测定波长为712 nm。

2.3K3[Fe（CN）6]的用量

考察了K3[Fe（CN）6]用量对吸光度的影响。图2表示K3[Fe（CN）6]用量为0.4～3.0 mL时，溶液的吸光度变化。当K3[Fe（CN）6]用量为1.80 mL时，吸光度达到最大，继续增加K3[Fe（CN）6]的用量，溶液吸光度基本保持不变，说明K3[Fe（CN）6]已与还原生成的Fe2+完全反应，故选择1.500 mmol/L K3[Fe（CN）6]溶液用量为1.80 mL。

2.4pH值及显色时间的选择

考察了pH值对吸光度的影响，当pH值在0.5～4.0范围内，考察了不同pH值溶液吸光度的变化情况，图3表示了溶液pH值对吸光度的影响。 当溶液的pH为1.0时，溶液的吸光度最大，随着溶液pH值的增大，溶液的吸光度逐渐减小。故本试验选择pH值为1.0。

K3[Fe（CN）6]与Fe2+生成可溶性普鲁士蓝的反应在室温下就能进行，考察了显色时间对吸光度的影响，从放置时间1 min到30 min，每5 min测定1次吸光度，观察溶液吸光度的变化情况。溶液的吸光度从5 min到30 min几乎保持不变。故本试验选择放置时间为10 min。

2.5干扰物质的影响

在最佳试验条件下，配制Fe3+含量为2.0 μg/mL的溶液进行测定，控制相对误差在±5%之内，对一些茶叶中常见的有机成分 （咖啡碱、茶单宁、叶绿素、叶黄素、维生素C）和一些常见离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+）进行了干扰影响的测定。研究表明：100倍的咖啡因、150倍的茶多酚和维生素C、300倍的叶绿素和叶黄素不影响测定，300倍的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+不影响测定。

2.6工作曲线与检出限

配制 Fe3+含量（C）分别为0、0.16、0.40、0.80、1.60、2.40、3.20、4.00、4.80、5.60、6.40、7.20、8.00、8.80、9.60 μg/mL的标准溶液，根据试验方法测其吸光度D并进行线性回归。Fe3+含量在0.02～9.60 μg/mL均具有良好的线性关系，线性回归方程D=0.184 2C+0.028 8，相关系数r=0.999。摩尔吸光系数ε=1.03×104 L/（mol·cm）。对11份Fe3+含量为0.32 μg/mL的溶液进行了平行试验，标准偏差 σ=1.23×10-3，检测限（3σ/k）为0.020 μg/mL。

2.7样品测定和回收率试验

2.7.1样品测定准确称取每份待测样品2.000 0 g，按照“1.2”节的试验方法进行样品处理和测定。通过标准曲线法测定样品中的铁含量，结果见表1。

2.7.2加标回收率试验准确称取信阳毛尖、安溪铁观音、祁门红茶各2.000 0 g，分别加入铁0.200 0 mg，按“1.3”节的方法进行回收率试验，结果见表1：回收率为96.6%～98.6%。

3结论

为了测定茶叶中总铁的含量，首先通过消化，使茶叶中的铁游离出来，加入盐酸羟胺使Fe3+还原为Fe2+，然后加入 K3[Fe（CN）6]，Fe2+与K3[Fe（CN）6]生成可溶性普鲁士蓝。确定了普鲁士蓝分光光度法测定茶叶中铁的最佳试验条件。建立了吸光度与铁含量的关系，铁含量在0.02～9.60 μg/mL均具有良好的线性关系，平均回收率达到97.47%。 成功分析了市售3种茶叶中铁的含量，结果令人满意。

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MBTH分光光度法 篇6

关键词：达氏鲟；精子；密度；分光光度法

中图分类号： S965.215.12+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0184-03

收稿日期：2013-05-23

基金项目：四川省财政基因工程青年基金（编号：2012QNJJ-016）。

作者简介：陈春娜（1981—），女，四川自贡人，硕士，助理研究员，从事水产名特优繁育和鱼类生理生化研究。E-mail：hc_1981_2001@sina.com。精子密度是评价精子质量的一个重要指标，不仅可以用来判断精液品质的优劣，还直接关系到人工授精中精子用量的有效精子数。在受精过程中，精子浓度过低会降低受精率，过高会造成受精卵后期发育脱膜畸变。通过测定精子密度，可以在人工授精中建立最佳精卵比例，避免多精入卵[1-2]。同时，精子密度也是反应鱼类繁殖潜力的重要指标，是优化个体遗传潜力的主要考虑因素。此外，精子密度能显著影响精子冷冻保存效果，正确测定精子密度有助于将精子稀释至冷冻保存所需浓度范围[3]，有利于精子冷冻保存。

测定精子密度最常见的方法有目测法、血球计数法和库尔特颗粒计数法[4]。目测法虽然简单，但十分不精确，计数法虽然精确，但费时、费力，在处理大量样品时很难做到快速及时。用分光光度計测定精子密度，具有操作方法简便、快速及结果准确等特点，在很多领域上都有应用，尤其是在家畜精子密度研究中应用较多[5-8]。有关测定水产动物精子密度的研究较少。国外应用分光光度法已建立了虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、白鰕虎鱼（Leucopsarion petersi）、金鲈（Perca flavescens）、银大麻哈鱼（Oncorhynchus kisutch）、硬头鳟（Salmo gairdneri、Oncorhynchus mykiss）、塞巴各湖鳟（Salmo salar m. sebago Girard）、花鲈（Lateolabrax japonicus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、西伯利亚鲟（Acipenser baerii）、小体鲟（Acipenser ruthenus）、牡蛎（Crassostorea gigas、Crassostrea virginica）和紫贻贝（Mytilus edulis）等水产动物精液密度和光密度的相关关系[9-17]，国内利用该方法建立了俄罗斯鲟（Acipenser gueldenstaedtii）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）和中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）精子密度的标准曲线[4，18]。

达氏鲟（Acipenser dabryanus Dumeril）英文名Dabrys turgeon、Yangtze sturgeon，别称长江鲟和沙腊子，是我国特有的淡水定居性鲟科鲟属鱼类[19]，分布于长江上游和金沙江下游，为国家一级重点保护动物、国际自然保护联盟（IUCN）极危级（CR）物种、国际濒危动植物种贸易公约（CITES）附录Ⅱ保护物种、长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区的主要保护对象之一，具有很高的学术价值和生态价值。目前，国内外尚未见利用分光光度法测定达氏鲟精子密度的相关报道。本研究探讨了不同波长和密度下吸光度与精子密度之间的关系，旨在建立分光光度法测定达氏鲟精子密度的标准化方法，以便于快速检测精子密度。

1材料与方法

1.1材料

性成熟雄性达氏鲟亲鱼为四川省农业科学院水产研究所养殖，2012年4月经注射催产，采取腹部挤压法收集精液，确保精液不含尿液等杂质。收集得到的精液保存在干燥的离心管中，于4 ℃下保存。

1.2方法

以0.65% NaCl为稀释液，将鲜精液分别稀释成10份浓度梯度不同的样品，利用紫外可见分光光度计（岛津 UVmini-1240 ）分别在波长380、530、780 nm处测吸光度，每一样品在同一波长下测定3次，取平均值作为该样品的吸光度（D），以0.65% NaCl溶液做空白，用血球计数板分别计数每个浓度梯度的样品浓度（C）。

1.3数据分析

试验数据采用Excel及SPSS统计软件进行分析处理，并进行回归差异检验和比较。

2结果与分析

由图1可见，在3种不同波长下，随着精子密度增加，精子的吸光度也不断增大；当精子密度小于1×106个/mL时，吸光度变化不大，因此确定1×106个/mL为检测下限。通过对精子密度与吸光度关系的回归分析发现，精子密度与吸光度呈良好的对数关系，其回归方程为D=a+blnC，将对数函数进行线性变换：Y=a+bX，其中Y=D，X=lnC。3种波长下精子密度与吸光度的相关系数都较高，其回归方程分别为D380 nm=-7.212+0513lnC（r2=0.975）；D530 nm=-6.969+0.492lnC（r2=0968）；D780 nm=-6.504+0.454lnC（r2=0953）。

波长为380 nm时，达氏鲟精子密度与吸光度回归方程的判定系数r2=0. 975，高于波长530 nm和780 nm时回归方程的判定系数，这表明380 nm为最适检测波长。对回归方程回归系数和常数项的显著性检验结果表明，精子密度对数与吸光度间存在着显著的正线性关系。

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3小结与讨论

3.1不同回归模型及不同波长下精子密度与吸光度的回归关系

研究发现，精子密度与吸光度随着种类的不同而呈现不同的函数关系：猪呈三次函数回归关系、牛呈二项式回归关系、羊呈线形回归关系、太平洋牡蛎呈对数回归关系、紫贻贝呈线形回归关系、俄罗斯鲟呈对数回归关系[4，6-8，15，17]。本研究中达氏鲟精子密度与吸光度的分布趋势以对数函数曲线拟合时相关性最为显著，通过变换能将对数函数转换为线性函数，利用该曲线方程能通过吸光度快速准确地推算精子密度。

测定时选择合适的波长尤为重要。精液由多种成分组成，在任一波长下的吸光度是全部组分之和，通常吸光度在最适波长时有1个比较宽的波峰，得到的回归方程相关系数也比较高[20]，已报道测定精子浓度的波长范围大多选用375～630 nm[21]，如太平洋牡蛎最适波长为581 nm、紫贻贝为 320 nm、大菱鲆为420 nm、俄罗斯鲟为530 nm、三疣梭子蟹和中华绒螯蟹为520 nm[4，13，15，17-18，21]。本研究采用了3种可见光波长380、530、780 nm，发现在380 nm波长下得到的回归方程相关系数较高，380 nm为最佳检测波长。

3.2影响分光光度计测定精子密度精确度的因素

分光光度法测定精子密度可以广泛应用于水产动物精子质量评估、人工繁殖、精子冷冻保存和遗传育种等方面，但是在使用分光光度计检测精子密度的过程中，会受到一些因素的影响。

在测定时，需要将精液稀释成不同浓度的精子悬液，研究发现，当加入不同浓度的稀释液时，精子会呈现出不同的运动水平，运动水平的快慢会直接影响精子悬液形成的时间，从而会影响到吸光度的读数[22]，因此在选择稀释液浓度时，应尽可能选择抑制精子运动的最低浓度。精液稀释的比例是影响光度计测定精子密度精确度的另一因素[21]，由于受光度计示值范围因素的影响，精液浓度过高会超出检测仪器的最大量程，浓度过低会使吸光度变化不大，浓度过高或过低均会造成较大的测定误差，因此应根据光度计的示值范围确定稀释倍数。由于受稀释方式、量器精度等因素的影响，用于稀释的精液量也会造成不同程度的测量误差，从而影响分析结果的准确性，因此，用于稀释的精液体积一定要精确[9]。另外，在测量开始时，精子由于重力作用，可能在样品中分布不均，因此，在测定浓度和吸光度之前，精子悬液是否充分摇匀也会影响读数。在收集精液的过程中还要注意防止尿液等物质污染精液，这些污染物也会影响到精确度。

因此，为使分光光度计测定精子密度更精确，在精液样本的准备阶段和测量过程中都应严格按标准程序进行。

3.3测定精子密度在达氏鲟研究中的重要性

达氏鲟是一类较大型的鱼类，性成熟年龄长，种群中存在着“生殖间期”的现象，即当年产卵的亲鱼第2年可能不会产卵。如何利用好当年性成熟的个体，在人工繁殖中提高卵的受精率与孵化率，精子用量及精卵比例在人工授精过程中就显得十分重要。精子浓度过低受精率会偏低，过高则部分受精卵会出现脱膜畸变[2]。因为同一尾鲟鱼不同时间段采集到的精液浓度不一致[4]，在自然产卵季节，在实际生产中不能以精液体积作为精液用量的依据，对于采集到的精液，可以运用分光光度计法对其质量进行评估，快速、准确测定达氏鲟精子密度，确定最适精卵比例，为人工授精精子用量提供参考。

目前，达氏鲟的人工繁殖亲本仍取自自然繁殖种群。因环境因子等破坏，达氏鲟自然繁殖群体数量已处于濒危状态，且雌雄性比严重失调，雄性比例显著下降。为保护好达氏鲟的种质资源，开展精液的冷冻保存技术在达氏鲟研究中显得十分必要，而精子密度则是影响精子冷冻保存的关键因素之一。在水生动物精子的短期保存中，有研究发现，精子密度越高，活力保持越长，这是因为精子存活期间消耗的氧是固定的，浓度高的精液会降低体系溶解氧，有利于保存精子的能量物质[23-25]。在水生动物精子超低温冷冻保存研究中发现，由于缺乏统一的精子浓度标准，即使是在相同的试验条件下，同一物种中成功冷冻保存的方案也很难重复[3]。因此，可以利用分光光度计快速、精确测定精液浓度，为今后达氏鲟精子超低温冷冻保存中精液用量提供统一的量化范围，为该种群资源保护起到指导性作用。

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