组织蛋白酶K抑制剂

组织蛋白酶K抑制剂（精选五篇）

组织蛋白酶K抑制剂 篇1

1 Materials and methods

1.1 Specimen collection

Surgical specimens of human ovarian tissue were obtained from January 2002 to June 2004 in the Department of Gynecology and Obstetrics of Shengjing Hospital affiliated China Medical University.A total of 69 epithelial ovarian tumors were studied,including38 EOC,16 borderline epithelial ovarian tumors,and15 benign epithelial ovarian tumors.In addition,11normal ovarian tissues were studied for comparison.All the patients with EOC did not receive preoperative radiotherapy or chemotherapy.Among the patients with EOC(6 StageⅠ,10 stageⅡ,9 stageⅢ,13stageⅣ;24 positive lymphatic metastasis,14 negative lymphatic metastasis;26 with ascites,12 without ascites).The median age of the patients was 52.1 years(ranging 18～74).All the cases were surgically staged according to FIGO criteria(2000).All the specimens were divided into two portions,for one portion pathological examination was performed after HE staining,and the other was preserved in-70℃refrigerator for further use after quick freezing in liquid nitrogen.

1.2 Major reagents

Trizol agent was bought from American Promega Company,RT-PCR kit and Taq DNA polymerase were bought from Dalian BAO Bioengineering Limited Company,MMP-9 and TIMP-1 primers were synthesized in Beijing Aoke Bioengineering Limited Company.

1.3 Methods

1.3.1 Extraction of total RNA

100 mg were taken from each freezing sample and cut into trivial portions,then 1 mL Trizol solution was added to split,total RNA was extracted using one step method according to Trizol reagent instruction,concentration and purity of RNA were determined by DNA/RNA radiometer.1.3.2 Synthesis of cDNA 2μL total RNA was taken,the followings were added in turns:10×buffer 10μL,25 mmol/L MgCl22.4μL,10 mmol/L dNTP 1μL,RNase inhibitor 0.5μL,22 U/μL AMV Reverse Transcriptase 1μL,0.5 g/L Oligonucleotide(dTMP)1μL,ddH2O 2.5μL,cDNA synthesis was accomplished according to the instruction.

1.3.3 PCR amplification

The primer sequences for MMP-9 were as follows:sense:5′-GGCCCTTC-TACGGCCACTA-3′,anti-sense:5′-CAGA-GAATCGCCAGTACTT-3′.The primer sequences for TIMP-1 were:sense:5′-CTTCCACAGGTCCCA-CAACC-3′,anti-sense:5′-CAGCCCTGGCTCCC-GAGGC-3′.Reaction conditions for MMP-9 were94℃30 seconds,60.5℃60 seconds,72℃90 seconds,and reaction conditions for TIMP-1 were 94℃30 seconds,63℃60 seconds,72℃90 seconds.Both were extended at 72℃for 7 minutes after 30 circles.β-actin was used as an internal comparison to detect transcription efficiency.2%agarose gel electrophoresis and EB coloration were carried out for RT-PCR productions.The fragment lengths of MMP-9,TIMP-1andβ-actin PCR production were 138 bp,285 bp and 592 bp,respectively.The positive strips of agarose gel electrophoresis were confirmed by DL-2000 DNA relative molecular mass marker.The appearance of amplification strip presented positive expression,and automatic running gel image analyzer Chemi Imager 5500 software was used to analyze the content of each amplification product,the ratios of MMP-9 or TIMP-1/β-actin content were used to indicate the relative expression levels of MMP-9 or TIMP-1 mRNA.

1.3.4 Statistical analysis

All the statistical analyses were performed using SPSS 11.5 software.χ2 test and Fisher precise probability calculation were used to determine the rate comparisons;T and F tests were employed for the comparisons of MMP-9 and TIMP-1mRNA expression levels between each group.

2 Results

2.1 Expression of MMP-9 and TIMP-1 mRNA in different ovarian tissues

Both positive expression rates and expression levels of MMP-9 or TIMP-1m RNA in EOC and bor-derline tumors were higher than those of benign tumors and normal ovarian tissues(P<0.05).Moreover,there was an extremely significant difference between the first two groups(P<0.01).No significant difference was found between the benign epithelial ovarian tumors and normal ovarian tissues(P>0.05).See Figure 1,2and Table 1.

M:marker,1-4:epithelial ovarian cancers,5-7:epithelial ovarian borderline tumors,8&9:benign epithelial ovarian tumors,10&11:normal ovarian tissues

M:marker,1-4:epithelial ovarian cancers,5-7:epithelial ovarian borderline tumors,8&9:benign epithelial ovarian tumors,10&11:normal ovarian tissue

Note:1)Comparisons of EOC or borderline tumor with benign ovarian epithelial tumor2)Comparison of benign ovarian epithelial tumor with normal ovarian tissue

2.2 Expression of MMP-9 and TIMP-1 mRNA inEOC with different clinicopathologic characteristics

Both positive expression rates and expression levels of MMP-9 mRNA in advanced stage EOC(Ⅲ～Ⅳ)were obviously higher than those of the early stage EOC(Ⅰ～Ⅱ,P<0.05),but no associations were found with age,lymphatic metastasis and ascites(P>0.05).Positive expression rates and expression levels of TIMP-1 mRNA did not correlate with clinicopathological variables of EOC(P>0.05).See Table 2.

2.3 Ratios of MMP-9/TIMP-1 mRNA in differ-ent ovarian tissues

The ratios of MMP-9 toTIMP-1 mRNA in normal ovarian tissues,benign,borderline,and malignant ovarian epithelial tumors were 0.89,0.99,1.06 and1.22,respectively.The ratio of MMP-9/TIMP-1 was the lowest in normal tissues,and the ratios increased from benign to borderline further to malignant epithelial ovarian tumors.Moreover,the ratios were>1 in both borderline and malignant ovarian epithelial tumors.If the ratio of MMP-9/TIMP-1 in normal ovarian tissues is standard,the imbalance between MMP-9and TIMP-1 in EOC was the most obvious.

3 Discussion

Invasion and metastasis of malignant tumors are thought to be a multi-step process,involving proteolytic degradation of extracellular matrix(ECM),altered cell adhesion and immigration of tumor cells.In addition,the formation of new blood vessels is essential both for tumor growth and for successful tumor invasion and metastasis.MMPs play a central role in all these processes[1].ECM consists of basement membranes(BM)and matrix.Normal BM is a kind of uniform and undivided extra cellular structure,composed of type IV collagen,laminin,fibronectin and so on.All the components of ECM are substrates because almost all of them can be degraded by MMPs[1].Gelatinase-B(MMP-9)is of particular importance in tumor cell invasion because it can specifically degrade gelatin and type IV collagen that are major components of the basement membrane,which constitutes an important barrier to tumor cell invasion[9].CAPO-CHICHI et al.[10]reported,loss of collagen IV and laminin may be an initial event in ovarian tumorigenicity,and that restoration of collagen IV and laminin expression may promote metastasis of ovarian tumors.

MMP-9(gelatinase B)localizes to chromosome20 q11.2-q13.1,which can degrade major components of ECM--type 1,4,5,7,11 collagens and gelatin.It exists both in active(82-kDa)and pro forms(92-kDa)in tumor tissues.After pro-MMP-9(92-kDa)is secreted from the cells,it turns into an active form(82-kDa)by protease hydrolysis.MMP-9 may make important contributions to metastasis process such as regulating cell migration,promoting tumor growth and angiogenesis[11].TIMP-1 is a 28-kDa glycoprotein,which acts to inhibit MMP-9 activity by forming a 1∶1complex with active MMP-9.The major expression sites of TIMP-1 are ovary and bone[11].

Our results indicated that MMP-9 mRNA was over-expressed in epithelial ovarian tumors.Moreover,the expression levels of MMP-9 mRNA increased from benign,borderline,further to malignant epithelial ovarian tumors.The expression level of MMP-9 mR-NA in EOC was associated with surgical-pathologic stage,and MMP-9 mRNA expression level in advanced stage EOC was significantly higher than that of early stage EOC.The results were in line with the report of HU XIAO-XIA et al[6],demonstrating MMP-9is correlated with epithelial ovarian tumorigenesis,invasion and metastasis.Another study reported[5]that increased MMP activity was an etiological factor for ovarian cancer risk.SYMOWICZ et al[12]suggested MMP-9 induced E-cadherin function initiated by cell-matrix contact to promote EOC metastatic dissemination.In addition,since surgical stage of EOC is a major prognostic factor,we concluded higher expression of MMP-9 may have a prognostic significance in EOC.The report of DAVIDSON et al[13].also indicated,MMP-9 was avalid marker of poor survival in advanced-stage ovarian carcinoma.SILLANP魧魧S et al[4].Reported,MMP-9 had a dual prognostic significance in EOC,acting against tumor advancement when it was in tumor epithelium and promoting tumor progression while it was in the stroma.KAMAT et al[14].also reported,high stromal expression of MMP-9 was an independent predictor of poor prognosis in EOC.The importance of MMPs in the processes of tumor invasion and metastasis is now widely acknowledged[1],but almost all the clinical trials of matrix metalloproteinase inhibitors(MMPIs)used in anticancer treatment have been disappointing[15,16].Therefore,it may be helpful by choosing MMPIs that specifically control the activity of MMPs in tumor stroma to improve MMPIs therapeutic efficacy.Further clarification of the mechanisms of MMPs functional role in tumorigenesis and progression will be important in the development of novel therapeutic strategies against metastases.

This research demonstrated the levels of TIMP-1mRNA expression increased from benign to borderline,and further to malignant ovarian neoplasm,and no correlations were found with clinicopathologic variables in EOC.The results were consistent with the report of HUANG et al[9].The study of RAUVALA et al[5].indicated an elevated preoperative serum TIMP-1 concentration correlated to the aggressive behavior of ovarian cancer.The role of TIMP-1 in tumor progression is complicate.On one hand it can inhibit the activity of MMP-9,on the other hand it also has the activity to promote cell growth,which may be one of the reasons for overexpression of TIMP-1 in some invasive tumors[3].In present study,we found the ratio of MMP-9/TIMP-1 enhanced from benign to borderline,and further to malignant epithelial ovarian neoplasm;moreover,the ratio of MMP-9/TIMP-1 was over 1 in both malignant and borderline epithelial ovarian tumors.And it suggested the expression levels of both MMP9 and TIMP-1 mRNA enhanced in epithelial ovarian tumors,since the increase amount of TIMP-1was far below that of MMP-9,the dynamic balance between MMP-9 and TIMP-1 was destroyed.We concluded that imbalance between MMP-9 and TIMP-1may play a role in ovarian tumorigenesis,invasion and metastasis.It was reported the molar ratio of MMP-9to its inhibitor(TIMP)is the critical determinant of whether activation of MMP-9 will occur.MMP-9 activation is observed to proceed at MMP-9/TIMP ratios greater than 1∶1[11].

In conclusion,MMP-9 and TIMP-1mRNA expressed both in normal ovarian tissue and epithelial ovarian tumors,overexpression of MMP-9 mRNA and imbalance regulation between MMP-9 and TIMP-1may lead to tumorigenesis,invasion and metastasis in epithelial ovarian tumors.In addition,overexpression of MMP-9 mRNA may have a prognostic significance in advanced stage EOC.

摘要：目的探讨基质金属蛋白酶(MMP-9)及其组织抑制物(TIMP-1)mRNA与卵巢上皮性癌的发生、发展的关系。方法采用RT-PCR技术检测69例卵巢上皮性肿瘤(38例恶性、15例交界性、16例良性)及11例正常卵巢组织中MMP-9及TIMP-1mRNA的表达,并分析其与各临床病理特征的关系。结果MMP-9mRNA在卵巢上皮性癌及交界性肿瘤组织中的阳性表达率(分别为76%、44%)及表达水平[分别为(154.14±4.42)、(96.87±3.04)]均显著高于良性肿瘤及正常卵巢组织[分别为13%、9%和(8.26±2.67)、(2.34±1.02);P<0.05];且MMP-9mRNA在晚期卵巢上皮性癌组织中的阳性表达率和表达水平明显高于早期癌组织(P<0.05)。TIMP-1mRNA在卵巢上皮性癌及交界性肿瘤组织中的阳性表达率(分别为68%、38%)及表达水平[分别为(126.35±3.81)、(90.62±5.54)]均显著高于良性肿瘤及正常卵巢组织[分别为13%、9%和(8.32±2.02)、(2.63±1.35);P<0.05];TIMP-1mRNA在卵巢上皮性癌组织中的阳性表达率和表达水平与各临床病理特征均无相关性(P>0.05)。结论MMP-9mRNA的高表达及MMP-9/TIMP-1平衡的调节失衡导致卵巢上皮性肿瘤的发生、侵袭和转移;MMP-9mRNA的高表达对卵巢上皮性癌有预后意义。

组织蛋白酶K抑制剂 篇2

关键词：过敏性紫癜性肾炎,金属蛋白酶组织抑制物-1,ELISA 双抗体夹心法,肾损害

过敏性紫癜性肾炎 (Henoch-Schonlein purpura nephritis, HSPN) 是继发于过敏性紫癜的肾脏损害, 是造成儿童慢性肾损害的常见原因之一。病理改变以全身性小血管损害及肾小球系膜病变为主, 国际儿科肾脏病学会 (ISKDC) 推荐的诊断标准因更适用于临床而被广泛应用, 临床常见急进性肾炎及肾病综合症, 以血尿、蛋白尿为主要表现, 可伴高血压和肾衰竭。目前国内外临床深入研究紫癜性肾炎的发病机理, 预防慢性肾功能衰竭的发生, 已取得一定成果, 前瞻性看好。研究发现:HSPN患者肾小球细胞外基质 (extracelluar matrix, ECM) 的质和量的变化, 在肾脏纤维化过程中起了非常重要的作用。而金属蛋白酶组织抑制物 (tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs) 是其特异的抑制剂;其中广泛存在于组织和体液中的TIMP-1, 在肾脏纤维化中, 对细胞外基质及肾脏细胞凋亡有控制作用[1]。目前肾小球疾病临床多采用抗凝、促纤溶、免疫等方法治疗, 疗效并不十分满意。多项研究表明通过阻断TIMP-1的表达或抑制其活性, 抑制系膜细胞增殖和ECM合成, 防止肾小球纤维化, 可能为防止或减缓肾功能减退提供一个新手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取符合HSPN诊断标准的患者42例为试验组, 其中男25例, 女17例;年龄6~55岁, 平均 (24.50±13.59) 岁;病程6个月~10年。经肾穿刺活组织病理检查, 其中:Ⅰ级7例, 男5例, 女2例, 年龄6~16岁, 平均10.4岁;Ⅱ级11例, 男7例, 女4例, 年龄16~32岁, 平均21.3岁;Ⅲ级5例, 男2例, 女3例, 年龄19~39岁, 平均24.6岁;Ⅳ级6例, 男4例, 女2例, 年龄24~42岁, 平均32.1岁;Ⅴ级5例, 男2例, 女3例, 年龄28~46岁, 平均34.3岁;Ⅵ级8例, 男5例, 女3例, 年龄32~55岁, 平均38.5岁。健康对照组14例, 男8例, 女6例, 年龄16~38岁, 平均32.5岁, 均为健康志愿者。各组研究对象的年龄、性别比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2诊断标准

有过敏性紫癜病史, 或有典型的紫癜, 双下肢外侧及臀部对称分布的出血性皮疹伴荨麻疹, 伴或不伴有关节疼痛;病程在6个月内, 有轻重不等的血尿或蛋白尿;排除Ig A肾病和其他继发性肾脏疾病。

1.3 肾脏病理诊断

在超声科协助下超声引导定位, 采用经皮肾穿刺活检术, 应用16 G活检针经皮穿刺获得肾组织, 送病理检查。病理分类按ISKDC推荐的诊断标准[2]。Ⅰ级:无异常;Ⅱ级:单纯性系膜增生, a:局限性, b:弥漫性;Ⅲ级:系膜增生伴新月体形成<50%, a:局限性, b:弥漫性;Ⅳ级:系膜增生伴新月体形成50%~75%;Ⅴ级:系膜增生伴新月体形成>75%, a:局限性, b:弥漫性;Ⅵ级:系膜毛细血管性肾炎。

1.4 检测方法

(1) 实验方法采用ELISA双抗体夹心法 (检验室采用试剂由英国Biotra公司提供的TIMP-1、human、ELISA系统;试剂缓冲液选用磷酸盐缓冲液浓缩物) 。实验室人员采取患者和健康自愿者空腹血 (外周血5 m L) 置于实验试管内, 室温自然凝固10~20 min后, 离心20 min, 收集上清液, 按要求分别放置在-20℃冰箱中备用。然后将已溶解的各组血清, 严格参照有关文献[3-4]及试剂说明书执行有关操作。 (2) 采用ELISA双抗体夹心法反应, 获取在标准曲线对照范围内的OD值, 并由OD值和标准曲线应用计算机计算出相应的TIMP-1值。健康人TIMP-1含量正常值按平均1206 ng/m L参考。

1.5 统计学处理

应用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用单因素方差分析和q检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

试验组Ⅱ~Ⅵ级血清中TIMP-1水平较对照组显著增高 (P<0.05) , Ⅲ~Ⅵ级血清中TIMP-1水平较Ⅱ级组显著增高 (P<0.01) , 而Ⅰ级血清中TIMP-1水平与对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

3 讨论

本文旨在探讨HSPN患者血清中TIMP-1水平变化与肾小球细胞间质纤维化严重程度的关联, 意在提醒临床医生在治疗HSPN患者时应注意到相关因素, 采取相应治疗新措施, 以减少终末肾病的发生几率。研究表明TIMP-1广泛分布于组织和体液中, 它是一种多功能的细胞因子, 不仅能通过抑制MMP而ECM的降解, 其活性的变化在一定程度上决定着ECM的积聚[5]。而且对细胞生长、增殖及多种细胞的凋亡有重要作用。另外, TIMP-1还是一种能刺激各种细胞生长的因子, 许多肾外疾病的研究发现, 它还与肿瘤细胞的生长密切相关[6,7,8]。TIMP-1的生成与活性发挥亦受多种细胞因子的调节, 在原发和继发性肾脏疾病中TIMP-1表达明显增加, 提示TIMP-1在肾脏纤维化发展进程中发挥了重要的刺激作用。

研究证明, 正常的ECM主要位于肾小球毛细血管袢基膜和系膜区, 肾小球毛细血管袢基膜区含有丰富的IV型胶原, 基质金属蛋白酶系统 (MMPs) 表达异常致IV型胶原合成和降解失衡, 肾小球基膜损伤, 致使ECM大量堆积[9]。而ECM的大量积聚引起的肾小球硬化与间质纤维化是多种肾病发展至终末期肾功能衰竭的共同病理表现, 这一致病过程的生理变化尚在研究之中。研究发现肾间质纤维化对肾功能的影响较肾小球病变更为重要, 因而被用做衡量慢性肾脏疾病进展的重要指标之一。而肾间质成纤维细胞的增殖活化是肾间质纤维化发生和维持的主要因素之一[10,11]。以往对ECM堆积的原因研究主要集中于ECM如何合成增加方面, 而忽视了ECM降解酶系统异常在此生理过程中有同样重要的作用。近年来研究ECM降解在肾脏硬化中的作用及其调控机制已成为重点课题。

MMPs是参与肾脏细胞外基质降解的主要酶类, TIMP-1是其抑制剂。正常状态下, TIMP-1与MMP-9在血清或组织液中的比例是平衡的, 笔者用ELISA双抗体夹心法发现TIMP-1在Ⅲ~Ⅵ级HSPN患者血清中水平显著增高, 提示随着系膜细胞、系膜基质的增加及纤维化的加重, 肾脏固有细胞分泌MMP-9和TIMP-1水平失衡, 导致ECM异常堆积, 基底膜Ⅳ型胶原降解减少, 基底膜网络状结构破坏重塑, 肾小球结构重叠, 蛋白尿形成等病理变化, 直至肾功能损害。

本文初步探讨TIMP-1在HSPN中的水平变化及其与肾功能损害的关联。通过对HSPN不同病理分级中TIMP-1的表达与活性变化的检测, 笔者发现HSPNⅡ~Ⅵ级患者血清中TIMP-1水平较对照组显著增高, Ⅲ~Ⅵ级较Ⅱ级组显著增高, Ⅰ级与对照组比较无明显差异。目前已经认识到治疗肾小球疾病除常规治疗外, 抑制系膜细胞ECM合成和阻断TIMP-1的表达或抑制其活性, 是将来治疗肾脏纤维化的一个新手段。有研究者发现某些西药与中药具有一定的调节细胞外基质降解酶系统的作用, 如鳖甲煎丸及缬沙坦药物血清具有抑制正常培养条件及脂多糖刺激条件下TIMP-1表达的作用, 这可能是其延缓肾小球硬化的部分作用机制[12]。更多研究发现肽类或核酸药物对干预细胞外基质降解酶的活性和表达有其特异性, 可能为今后治疗肾脏疾病减轻肾脏纤维化开辟一条新的途径。

组织蛋白酶K抑制剂 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

Wistar大鼠,体重180~200 g(哈尔滨医科大学附属第二医院动物中心提供)。兔抗大鼠平滑肌α-肌动蛋白抗体、兔抗大鼠TIMP-3抗体、MMP-2抗体(武汉博士德生物工程有限公司),逆转录PCR试剂盒(Invitrogen公司,美国),疫组化染色试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs的分离、培养、鉴定

(1)VSMCs的分离和培养:参照NAKAMURA等[6]的方法取18只大鼠,腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,切取胸主动脉。用含10%胎牛血清的DMEM采用组织块贴壁法培养VSMCs,细胞生长至80%融合时传代。(2)VSMCs的鉴定:取第3代VSMCs接种于6孔板。一抗为兔抗大鼠平滑肌α肌动蛋白抗体,二抗为生物素标记山羊抗兔IgG,采用SP法进行染色。以PBS代一抗作为阴性对照。

1.2.2 TIMP-3-pcDNA

3.0重组质粒转染大鼠VSMCs及鉴定(1)转染:取标记后的第3代VSM-Cs,按Lipofectamine 2000转染试剂盒提供的方法,将TIMP-3-pcDNA 3.0重组质粒瞬时转染至VSM-Cs,72 h后完成转染,转染后细胞立即应用。(2)RT-PCR鉴定:取转染前后VSMCs,分别提取总RNA,进行TIMP-3基因RT-PCR扩增。TIMP-3基因引物序列为:上游引物:5'-GCCGTTTATGGAGTTGAT-3',下游引物:5'-AGCATTGAGCAGGGTAGA-3'。

1.2.3 动物模型制备

参照尹倪等[7]方法,复制AMI模型。取54只大鼠戊巴比妥钠麻醉后,第4肋间进胸,显露心脏,丝线结扎左冠状动脉远端,制备AMI模型。随机分三组,TIMP-3组(TIMP-3基因转染VSMC移植组)将BrdU标记的细胞悬液0.5 m L,含1×106个TIMP-3基因转染VSMCs,分5点注射到梗死心肌的边缘区;VSMC移植组同样方法注射BrdU标记的细胞悬液0.5 m L,含1×106个VSMCs;DMEM移植组注射等量无细胞的DMEM液0.5m L。

1.2.4 检测指标

(1)心脏功能检测:每组取9只A-MI 3 d进行移植的大鼠于AMI,4周后进进行心动超声检查,观察大鼠心脏功能的变化。

大鼠在胸骨旁心脏左室长轴切面获取M型超声心动图像3个。大鼠左室舒张末内径(left ventricular internal diameter at end-diastole,LVIDd)和左室收缩末内径(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)通过M型超声图像获得(每个图像选用3个心动周期,取平均值),应用Teichholtz公式计算舒张末容积(end-diastolic volume,EDV)、收缩末容积(end-systolic volume,ESV)。(2)MMP-2、TIPM-3蛋白表达的检测取注射部位心肌组织,10%福尔马林固定,酒精脱水,石蜡包埋,组织切片。按照免疫组化试剂盒操作:一抗为兔抗大鼠MMP-2、TIMP-3抗体,二抗采用生物素标记山羊抗兔IgG,DAB显色。(3)MMP-2、TIMP-3 m RNA表达的检测:心肌组织低温研磨后,用Trizol试剂抽提总RNA[8],进行PCR扩增。MMP-2基因上游引物:5'-CACACCAGGTGAAGGATGTG-3,下游引物:5'-GCC CTCCTAAGCCAGTCTCT-3'。β-actin的上游引物:5'-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3',下游引物:5'-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3'。

1.2.5 统计学方法

采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。数据以均数±标准差表示,两组间比较采用非配对t检验,P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 VSMCs体外培养、鉴定和基因转染

VSMCs呈梭形,束状排列,呈峰谷长势。第3代VSMCs抗平滑肌α肌动蛋白免疫组化染色,光镜下见胞浆中大量平行条状棕黄染色,即为肌动蛋白(图1)。TIMP-3基因瞬时转染后的VSMCs组在464 bp处扩增出目的条带。(图2)

抗SMA免疫组化染色组(×400)

M.DNA Marker DL2,000 1.转染前VSMCs组,2.转染后VSMCs组

2.2 心功能变化

心动超声检查发现DMEM组、VSMC组和TIMP-3基因转染VSMC移植组的LVIDd、LVIDs、EDV和ESV值均较正常鼠升高;VSMC组较DMEM组有所改善,TIMP-3基因转染VSMC移植组较DMEM组有明显改善,且TIMP-3基因转染VSMC组较单纯VSMC组心脏功能好转(表1,图3)。

注:各组与Normal组比较,P<0.05;1)与DMEM组比较,P<0.05,2)与DMEM组比较,P<0.01;3)TIMP-3组与VSMC组比较,P<0.05,4)TIMP-3组与VSMC组比较P<0.01

2.3 MMP-2、TIPM-3蛋白表达的变化

2.3.1 MMP-2

DMEM组、VSMC组和TIMP-3组均可见棕黄色颗粒,镜下观察与对照组相比,DMEM组MMP-2蛋白的表达最多,VSMC组MMP-2蛋白的表达较少,TIMP-3组MMP-2蛋白的表达最少(图4)。

2.3.2 TIMP-3

抗TIMP-3蛋白染色发现DMEM组、VSMC组、TIMP-3组均见棕黄色颗粒。TIMP-3组TIM P-3蛋白的表达多,VSMC组表达较少,DMEM组仅有极少TIMP-3蛋白的表达;TIMP-3蛋白主要位于梗死区边缘和梗死区(图5)。

2.4 MMP-2、TIMP-3 mRNA表达的变化

2.4.1 MMP-2 m RNA

RT-PCR扩增显示:在286 bp处出现特异条带。各组m RNA含量均较对照组明显升高(P<0.01),TIMP-3组较DMEM组和VSMC组明显降低(P<0.01),VSMC组较DMEM组明显降低(P<0.01)。(图6)

A:Normal;B:DMEM组;C:VSMC组;D:TIMP-3组

a.Normal b.DMEM组可见大量棕黄色颗粒c.VSMC组可见较少棕黄色颗粒d.TIMP-3组可见少量棕黄色颗粒

A:Normal;B:DMEM组可见很少棕黄色颗粒;C:VSMC组可见较多棕黄色颗粒;D:TIMP-3组可见大量棕黄色颗粒

M:DNA Marker DL2,000;1:正常对照组;2:DMEM组;3:VSMC组4.TIMP-3组

2.4.2 TIMP-3

RT-PCR结果示:在464 bp处出现特异条带。各组均较对照组明显升高(P<0.01),TIMP-3组较VSMC组和DMEM组明显增高(P<0.01),VSMC组较DMEM组明显增高(P<0.01)(图7)。

M:DNA Marker DL2,000;1:正常对照组;2:DMEM组;3:VSMC组;4:TIMP-3组

3 讨论

心肌梗死(AMI)后发生的左心室的进行性扩张和外形改变被称为梗死后心室重塑。近年来随着对心肌梗死后心室重塑分子生物学机制研究的深入,人们认识到心肌梗死后心室重塑是一系列复杂的分子和细胞机制导致心肌结构、功能和表型的变化[1]。这种变化不仅表现为心肌细胞的凋亡、坏死和心肌肥厚,还表现为心肌间质纤维胶原合成和降解之间动态平衡的破坏。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一类含Zn2+的内源性蛋白水解酶,能降解除多糖以外的所有细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)成分,在组织重塑中起重要作用[9]。基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metallopro teinases,TIMPs)是基质金属蛋白酶的内源性特异性抑制剂,主要功能是抑制MMPs,通过对MMPs活性的抑制减轻组织重塑[10],MMPs、TIMPs及其调节因子间的相互作用决定了心肌间质重塑过程的进展。

ROMANIC等[5]在兔心肌梗死模型中发现,MMP-2在心肌梗死后表达上调。WILSON等[11]在羊的心肌梗死模型中检测了心肌MMPs与TIMPs的区域分布,发现MMP-2于过渡区和心肌梗死区升高。TIMP-3是TIMPs家族中的重要成员,它只存在于细胞外基质中,是一种结合于细胞外基质的非可溶性蛋白,APET等[12]研究表明TIMP-3能抑制多种MMPs的活性,对MMP-2、MMP-9、胶原酶-1及基质溶素均有抑制作用。BRAUER等[13]研究证实AMI后TIMP-3蛋白表达量减少。FEDAK等[14]报道AMI后心肌组织中TIMP-3含量的下降可促进左心室的扩大,降低心脏功能。

实验人员在建立稳定的大鼠AMI模型的基础上,将转染了TIMP-3基因的VSMCs以心肌内注射的方法移植到心肌缺血区,将细胞移植和基因治疗相结合,探讨AMI后早期增加缺血心肌中肌细胞的数量和TIMP-3基因转染对调节心肌间质重塑的作用。

本研究显示,TIMP-3基因成功转入VSMCs,移植到心肌缺血区后,移植细胞可在缺血心肌内存活,并且表达TIMP-3。心脏功能检测发现TIMP-3基因转染VSMCs移植大鼠的心功能明显提高,TIMP-3基因转染VSMC移植组的LVIDd、LVIDs、EDV和ESV值均较其他组升高。同时,MMP-2基因m RNA和蛋白的表达较其他组明显减少。上述心功能的改变可能与MMP-2基因表达的抑制有关,MMP-2表达抑制可减少间质的降解,抑制心室重塑。采用TIMP-3基因修饰VSMCs后进行移植,可克服单纯VSMCs移植仅增加细胞数量而不能改善内环境的缺点,两种治疗相互促进,可以减缓心肌梗死区域室壁变薄和心腔扩大,改善心室结构,维持心脏功能。

摘要：目的 观察基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP-3)基因转染血管平滑肌细胞(VSMCs)移植,对大鼠心肌梗死(AMI)的治疗效果,并探讨其可能的机制。方法 取Wistar大鼠胸主动脉,采用组织块法培养VSMCs。左冠状动脉远端结扎方法复制AMI模型。随机分三组:冠状动脉结扎后3 d向缺血心室壁内分别注射含有1×106个TIMP-3基因转染的VSMC(sTIMP-3组)、1×106个VSMC(sVSMC组)、不含细胞的DMEM液(DMEM组)各0.5 mL。术后第4周,观察大鼠心脏功能变化,免疫组化染色检测TIMP-3和基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达,RT-PCR法检测缺血心肌组织中TIMP-3和MMP-2 mRNA含量。结果 TIMP-3基因成功转入VSMCs中。术后4周,TIMP-3组的LVIDd、LVIDs、EDV和ESV值较正常鼠升高(P<0.05),但小于VSMC(P<0.01)组和DMEM组(P<0.01)。RT-PCR结果显示:各移植组TIMP-3 mRNA含量均较对照组显著升高(P<0.01),TIMP-3组较VSMC组、DMEM组明显增高(P<0.01);TIMP-3组MMP-2 mRNA含量较VSMC组、DMEM组明显降低(P<0.01)。结论 将TIMP-3基因转染的VSMCs移植入心肌缺血区可明显抑制MMP-2的表达,进而抑制AMI后早期心肌重塑,改善心功能。

组织蛋白酶K抑制剂 篇4

关键词：脊柱炎,强直性/针灸疗法,基质金属蛋白酶3/针灸效应,基质金属蛋白酶组织抑制因子/针灸效应,长蛇灸,人类

强直性脊柱炎(AS)是一种以骶髂关节和中轴关节慢性炎症为主的、原因不明的自身免疫性疾病,以侵犯脊柱为主,早期表现为滑膜炎和韧带附着点的病变。滑膜炎典型表现为滑膜细胞肥大和滑膜增生,有明显的淋巴细胞和浆细胞浸润,附着点的病变过程是以关节囊、肌腱、韧带的骨附着点为中心的慢性炎症。这两种病理过程都是间质成分被水解蛋白酶消化的过程,在此过程中,基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)两个酶系统的作用尤为重要。近几年,笔者采用长蛇灸治疗强直性脊柱炎取得了较好的疗效,为了探讨其可能作用机理,观察了长蛇灸对AS患者血清MMP-3和TIMP-1水平的影响,现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

60例患者均来源于2008-05～2010-03本院门诊和住院病人,符合强直性脊柱炎诊断标准。按就诊顺序,查随机数字表,分为2组。治疗组30例,其中男26例,女4例;平均年龄(29.7±13.5)岁;平均病程(7.3±5.8)年。对照组30例,其中男27例,女3例;平均年龄(31.2±12.8)岁;平均病程(7.1±6.3)年。两组患者性别、年龄、病程、病情基本一致,经统计学处理,无显著差异(P>0.05),具有可比性。

1.2 诊断标准

参照1984年修订的纽约标准[1]。(1)临床标准:①下腰痛至少三个月,活动后可减轻,休息无缓解。②腰椎前屈、后伸、侧弯活动受限。③胸廓活动度较同年龄、同性别的正常人减少。(2)放射学标准:单侧骶髂关节炎≥3级或双侧骶髂关节炎≥2级。符合放射学标准和一项以上临床标准即可诊断。

1.3 纳入标准

(1)符合上述强直性脊柱炎诊断标准;(2)年龄在12岁以上的患者;(3)非妊娠或哺乳期妇女;(4)保证配合治疗,完成全部疗程的患者。

1.4 排除标准

(1)年龄在12岁以下的患者;(2)晚期脊柱强直或驼背固定,X线显示骶髂关节融合,脊柱呈竹节样改变的患者;(3)凡伴有发热,四肢关节红肿热痛,目赤肿痛或眩晕耳鸣,盗汗,手足心热的患者(即中医辨证分型为湿热痹阻证或肝肾不足证)不纳入治疗组;(4)精神病患者;(5)恶性肿瘤患者;(6)有结核或其他传染性疾病患者;(7)皮肤有严重破损或有皮肤过敏者或有严重皮肤病患者;(8)妊娠期或哺乳期女性患者;(9)未能按照实验计划完成治疗过程者。

2 方法

2.1 治疗用药

治疗组:采用长蛇灸治疗。操作方法:取大蒜(约500g)捣烂成泥及艾绒适量备用。患者俯卧,裸露背部,将脊柱及两侧皮肤(督脉及膀胱经)常规消毒后,在督脉大椎穴至腰俞穴涂上蒜汁,铺敷7cm宽、1.25cm厚的蒜泥,再将斑蝥粉3g、白芍粉10g、川乌粉10g、细辛粉10g沿督脉铺于蒜泥之上,然后铺长蛇形艾绒1条(约1cm宽、1cm厚),点燃头、身、尾3点,让其自行燃烧。燃烧过程中以患者有烧灼感为度,根据燃尽情况中间可适当添加艾绒。每次铺灸30分钟;灸毕,移去蒜泥与艾绒,用湿纱布轻轻将皮肤揩干;灸后局部皮肤出现微红灼热,属正常现象,无需处理;如局部出现水泡,可用消毒针刺破水泡放出渗液,并用药棉揩干,再涂以烫伤油,并以纱布包敷。隔日换药1次,直到结痂脱落;每周治疗1次,6次为1疗程,连续治疗两个疗程。对照组:采用西药口服治疗。口服柳氮磺胺吡啶(武汉同兴科技有限公司),1g/次,每日2次,严重者,配合非甾体抗炎药口服,连续用药3个月。

2.2 观测指标与检测方法

分别于治疗前和治疗后取空腹静脉血4ml,分离血清,置于-75℃保存待测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行MMP-3与TIMP1的检测。

2.3 统计学处理

实验检测数据用undefined表示,采用SPSS 17.0进行t检验。

3 结果 见表1。

与治疗前比较*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较△P<0.05,△△P<0.01

4 讨论

MMPs是一组可降解细胞外基质的锌依赖性内肽酶,根据底物的不同,MMPs主要分胶原酶、基质溶解酶、明胶酶和膜型基质金属蛋白酶。MMP-3属于基质溶解酶,是对基质起广泛作用的一种蛋白酶,MMP-3由成纤维细胞、滑膜细胞和软骨细胞分泌,被认为是导致软骨降解的最重要的蛋白酶[2]。有资料表明[3],AS患者血清中MMP-3水平与其自身疾病活动性存在一定程度的相关性,可作为评估AS病情活动的另一个客观指标。金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是组织中MMP活性的抑制分子,分为两个功能区,其N端功能区的半胱氨酸残基与MMP的锌离子活性中心结合,其C端功能区与MMP的其他部位结合,形成MMP-TIMP复合体,从而阻断MMP与底物结合,抑制MMP的活性。TIMP-1由巨噬细胞和结缔组织细胞产生,广泛存在于组织和体液中,能被多种细胞因子诱导产生,TIMP-1主要结合抑制活化的MMP-9和MMP-3。

长蛇灸是在督脉的脊柱段上施以艾灸的一种传统的中医外治法,集督脉、艾灸、中药、蒜泥的治疗作用于一体,发挥温肾壮骨、补精益髓、温通经络、活血化瘀等功效,其对缓解AS有显著疗效[4,5]。斑蝥粉药性温热,芳香走窜,通过热力能使药物直达病所,并有破血消癥、攻毒蚀疮、引赤发泡之功;白芍可以养血敛阴、柔肝止痛、平抑肝阳;川乌祛风除湿、温经止痛;细辛解表散寒、祛风止痛;艾灸温经通络、行气活血、补虚壮阳。现代药理研究表明[6],白芍、细辛、艾灸有调节免疫作用,且白芍、细辛、川乌还有抗炎作用。

本研究结果表明,长蛇灸能降低AS患者血清MMP-3水平,升高TIMP-1水平,调节MMP/TIMP平衡,减少致炎因子的释放,调整异常的基质降解和减少血管形成等炎症的病理因素,缓解AS炎症、减少软骨和骨质破坏,降低致残率,提高患者的生活质量。

参考文献

[1]张乃峥.临床风湿病学.上海:上海科学技术出版社,1999:165.

[2]Xie DL,Hui F,Meyers R.Cartilage chondrolysis by fibronectin fragments is associated with several proteinases;stromelysin plays a major role in chondrolysis.Arch Biochem Biophys,1994,311:205.

[3]申明.基质金属蛋白酶与强直性脊柱炎.临床医药实践杂志,2006,15(11):805.

[4]曾庆利,陈春明,李胜利.华佗夹脊辅以督脉敷灸治疗强直性脊柱炎32例疗效观察.四川中医,2006,24(12):98.

[5]吴建军,戚玲娟.走罐加针灸治疗强直性脊柱炎18例.中国中医药科技,2009,16(3):219.

组织蛋白酶K抑制剂 篇5

1资料与方法

1.1一般资料

选取2013年3月 -2014年4月在天津医科大学第二医院泌尿外科行手术治疗的84例膀胱尿路上皮癌患者的癌组织,病理结果均为尿路上皮癌;同时收集同期住院的20例良性前列腺增生患者的正常膀胱黏膜组织,病理结果均为正常膀胱黏膜。84例膀胱尿路上皮癌患者中,男性58例,女性26例; 年龄48~82岁,中位数年龄66岁,其中年龄≤65岁33例,>65岁51例;单发肿瘤34例,多发肿瘤50例; 肿瘤直径≤3 cm 49例,>3 cm 35例;复发性肿瘤49例,原发性肿瘤35例;病理分级低级别57例,高级别27例;肿瘤分期Ta、Tis及T150例,T2~T434例。所有标本均于术后0.5 h内获得,液氮速冻后置入 -80℃冰箱保存备用。

1.2主要试剂

DNA提取试剂盒、DNA修饰试剂盒购自Omega公司,甲基化转移酶购自Solarbio公司,引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,组织蛋白提取试剂盒购自博士德生物,鼠抗人TSLC1单克隆抗体购自Abnova公司,二抗羊抗鼠单克隆抗体、GAPDH内参抗体及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自康为世纪。

1.3实验方法

1.3.1 TSLC1基因启动子Cp G岛甲基化检测采用E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit试剂盒提取基因组DNA,每个样本取30 mg左右的组织至加有200μl Buffer TL的离心管中,剪碎后匀浆处理,加入25μl OB蛋白酶,混匀,55℃水浴至组织完全消化,室温10 000×g离心5 min去除杂质,将上清液转移至另一离心管,加入220μl Buffer BL涡旋混匀,70℃水浴10 min,加入220μl的无水乙醇,高速涡旋15 s混匀,转移混合液至套有收集管的Hi Bind DNA柱子中,室温下8 000×g离心1 min,弃去滤液,把柱子装在新收集管中,加入500μl HB Buffer,室温8 000×g离心1 min,弃去滤液,把柱子装在新收集管,加入700μl DNA Wash Buffer,室温8 000×g离心1 min,弃去滤液,把柱子重新装回收集管, 12 000×g离心空柱2 min以甩干柱子基质,把柱子装在干净的1.5 ml离心管上,加入200μl 70℃预热的Elution Buffer到柱子基质上,室温下静置3 min后室温10 000×g离心1 min以洗脱DNA,保留含DNA的洗脱液。在UV3000紫外分光光度仪上测定吸光度值鉴定DNA纯度,OD260/OD280比值在1.8~ 2.0。甲基化特异性PCR(MSP):用修饰试剂盒EZ DNA Methylation-Gold KitTM取1μg DNA进行修饰, 在PCR管中添加130μl CT Conversion Reagent到每20μl DNA样品中(如果DNA样品的体积 <20μl, 则用水来弥补差量),98℃放置10 min,64℃放置2.5 h,添加600μl M-Binding Buffer到Zymo-Spin ICTM Column中,并将柱放入Collection Tube中,装填样品到含有M-Binding Buffer的Zymo-Spin ICTM Column中,混匀,全速(≥10 000×g)离心30 s,弃去滤液,添加200μl M-Wash Buffer到柱中,全速离心30 s,添加200μl M-Desulphonation Buffer到柱中并且室温下放置20 min,全速离心30 s,添加200μl M-Wash Buffer到柱中,全速离心30 s,添加10μl的M-Elution Buffer到柱基质中,将柱放置在1.5 ml的管中,全速离心来洗脱DNA。取修饰好的DNA 4μl进行MSP反应。TSLC1基因甲基化引物M,正向引物:5'-TTTTAATTATTATTTTCGAGTTTATC G-3',反向引物:5'-TCTTTAAAAACGAAAACTATAC G-3';非甲基化引物U,正向引物:5'-TTTTTTAATTA TTTTTGAGTTTATTG-3',反向引物:5'-AAATCTTTA AAAACAAAAACTATAC-3'。反应体系参照PCR试剂盒推荐量50μl:PCR混合液25μl,上下游引物各2μl,模板4μl,无核酶水17μl。MSP循环条件:95℃ 预变性10 min,94℃变性30 s,57℃(甲基化引物)或55℃(非甲基化引物)退火30 s,72℃延伸60 s,共35个循环,72℃继续延伸5 min。为保证检测结果的可靠性,以经甲基转移酶(M Sss I)和未经M Sss I处理的正常人外周血淋巴细胞DNA分别作阳性和阴性对照组。取PCR产物10μl行2%琼脂糖凝胶电泳, 110 V电泳40 min,凝胶成像系统下照相。结果判定标准:只要应用甲基化引物扩增出特异性条带即可认为存在甲基化(M),只有应用非甲基化引物扩增出特异性条带方可认为不存在甲基化(U)。

1.3.2 Western blot检测膀胱癌组织和膀胱正常黏膜组织中TSLC1蛋白的表达水平按照组织净重 (mg)∶裂解液(μl)=1∶10的比例,加入相应体积的裂解液进行匀浆,冰上孵育2 h,直至充分裂解、离心后取少量上清液,根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书绘制标准曲线并检测样本蛋白浓度,制备SDS-PAGE凝胶,计算取出20μg蛋白经沸水煮5 min后上样,设置电压为80 V,电泳1.5 h;把电泳分离的样品从凝胶转移到固相载体PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,一抗鼠抗人TSLC1单克隆抗体(1∶ 1 000)4℃孵育过夜、二抗羊抗鼠单克隆抗体(1∶ 5 000)孵育2 h,以鼠抗人GAPDH作为内参。ECL化学发光试剂加在PCDF膜上反应5 min,凝胶成像分析系统下显影、定影。利用Image-Pro Plus 5.0软件对蛋白表达的灰度值进行分析,蛋白相对表达为目的基因与内参基因的比值。

1.4统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,膀胱癌患者组及其对照组中TSLC1基因启动子区Cp G岛甲基化状态的比较用Fisher’s确切概率法,膀胱癌患者中TSLC1基因启动子甲基化与临床病理特征的关系用四格表 χ2检验,膀胱癌组和正常组TSLC1蛋白表达的比较用两独立样本t检验,P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1TSLC1基因启动子区CpG岛甲基化状态及其与临床病理特征的关系

Normal:正常 ;Positive control:阳 对 ;Negative control:阴性对照组

例(%)

MSP结果显示,20例正常膀胱黏膜组织中未检测到TSLC1基因启动子甲基化;84例膀胱尿路上皮癌组织中43例检测到TSLC1启动子区Cp G岛甲基化(见图1),甲基化率为51.2%(43/84),表明膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1基因启动子甲基化率明显高于正常膀胱黏膜组织,TSLC1基因启动子甲基化与膀胱癌的发生有关。膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1基因启动子甲基化与患者的性别、年龄、肿瘤数目无关(P >0.05),而与肿瘤是否复发、肿瘤直径病理分级和临床分期有关,差异有统计学意义(P < 0.05)。见附表。

2.2TSLC1蛋白表达及TSLC1基因启动子甲基化与蛋白表达的关系

1~3:膀胱癌组织发生 TSLC1 基因甲基化标本;4~6:膀胱癌组 TSLC1 基因甲基化标本;7~8:正常膀胱黏膜

Western blot检测结果表明,84例膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1蛋白的表达水平为(0.2613±0.1405), 明显低于20例膀胱正常黏膜组织[(0.695 7±0.092 4) (t =7.457,P <0.01)](见图2)。43例发生TSLC1基因启动子甲基化的膀胱癌组织TSLC1蛋白表达水平为(0.114 3±0.044 3),明显低于41例未发生TSLC1基因启动子甲基化[(0.375 6±0.043 9)](t =11.763,P < 0.01)。

3讨论

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,其发生、发展是一个多因素相互作用的复杂过程,既有内在遗传因素,又有外在环境因素。虽然近年来膀胱癌的诊治取得一些进展,但仍未能十分有效地阻止疾病的进展和改善患者的预后,因此有必要对其发生、 发展的相关因素进行深入研究。DNA甲基化是一种表观遗传修饰,该修饰影响着DNA和其他分子的相互作用,并且通过细胞分裂和增殖遗传,在胚胎的早期发育、干细胞的分化和特定的基因表达中起重要作用[12]。近年来,DNA甲基化研究成为肿瘤学研究的一个热点。

TSLC1是一种在NSCLC中发现的肿瘤抑制基因,TSLC1可通过抑制增殖和促进凋亡来抑制肿瘤的生长,并可介导同种或异种细胞间的相互黏附,在抑制上皮组织来源的恶性肿瘤中起重要作用[13], TSLC1功能丧失可导致癌细胞浸润及转移[14],一系列人类肿瘤组织和细胞系中TSLC1呈低表达或缺失,且其低表达与启动子区Cp G岛甲基化相关[2,3,4,5,6,7,8,9,15,16]。 TSLC1基因启动子甲基化可以作为一种肿瘤诊断、 检测和预后判断的分子标记物。同时有研究发现,去甲基化药物天花粉蛋白处理宫颈癌He La细胞后可逆转TSLC1基因甲基化状态,从而诱导其重新表达发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用[17]。本实验应用MSP同时检测20例膀胱正常黏膜组织和84例膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1基因启动子甲基化状态,发现51.2%(43/84)的膀胱尿路上皮癌组织中存在TSLC1基因甲基化,而在20例正常膀胱黏膜组织中未检测到TSLC1基因甲基化,提示TSLC1基因启动子甲基化有肿瘤特异性,有望作为膀胱尿路上皮癌的诊断标记物。

本实验将TSLC1基因启动子甲基化状态与患者的临床资料进行分析后发现,原发性肿瘤中TSLC1基因甲基化率为37.1%,复发性肿瘤中甲基化率为67.3%; 直径≤3 cm的肿瘤中甲基化率为42.9%,直径 >3 cm的肿瘤中甲基化率为68.6%;低级别肿瘤中甲基化率为43.9%,高级别肿瘤中甲基化率为74.1%;非肌层浸润性膀胱癌中甲基化率为44.0%,肌层浸润性膀胱癌中甲基化率为76.5%,差异有统计学意义(P < 0.05)。该结果提示TSLC1基因启动子甲基化与膀胱尿路上皮癌的大小、是否复发、分化程度和浸润深度等肿瘤的生物学行为有关。

本研究发现在84例膀胱尿路上皮癌组织和20例膀胱正常黏膜组织中,膀胱癌组织中TSLC1蛋白的表达水平明显低于正常组织;43例发生TSLC1基因启动子甲基化的膀胱癌组织TSLC1蛋白表达水平明显低于41例未发生TSLC1基因启动子甲基化的膀胱癌组织,差异有统计学意义(P <0.05),研究结果与前期研究发现膀胱尿路上皮癌组织中TSLC1蛋白表达降低相符[11]。结果提示TSLC1基因启动子Cp G岛甲基化可能是导致其蛋白表达下调的主要原因之一。

本研究结果表明,在膀胱尿路上皮癌组织中, TSLC1基因具有较高的甲基化率,并且与膀胱癌的发生、发展密切相关。因此有必要进一步研究TSLC1在膀胱癌中的功能及其可能机制,为膀胱癌早期诊断、判断预后及基因治疗提供新的理想靶点奠定研究基础。

摘要：目的 探讨膀胱尿路上皮癌组织中肺癌肿瘤抑制物1(TSLC1)基因启动子区Cp G岛甲基化状态和蛋白的表达,及其与临床病理参数的关系。方法 分别采用甲基化特异性PCR(MSP)和Western blot检测84例膀胱尿路上皮癌组织和20例正常膀胱黏膜组织中TSLC1基因启动子Cp G岛甲基化状态和蛋白表达。结果20例正常膀胱黏膜组织中均未检测到TSLC1基因甲基化,84例膀胱尿路上皮癌组织中43例检测到TSLC1启动子区甲基化,甲基化率为51.2%,两组比较差异有统计学意义(P<0.01);膀胱癌组织中TSLC1基因启动子区Cp G岛甲基化状态与患者的年龄、性别、肿瘤数目无关(P>0.05),而与肿瘤直径、肿瘤是否复发、病理分级和临床分期有关,差异有统计学意义(P<0.05)。膀胱癌组织中TSLC1蛋白表达[(0.261 3±0.140 5)]较正常组织[(0.695 7±0.092 4)]显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。膀胱癌组织中发生TSLC1基因启动子Cp G岛甲基化的TSLC1蛋白表达[(0.114 3±0.044 3)]明显低于未发生TSLC1基因启动子Cp G岛甲基化[(0.375 6±0.043 9)],差异有统计学意义(P<0.01)。结论 TSLC1基因启动子Cp G岛甲基化与膀胱癌的发生、发展相关,TSLC1基因启动子Cp G岛甲基化可能是导致其蛋白表达下调的主要原因之一。