组织抑制因子（精选八篇）
组织抑制因子 篇1
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
仪器:高速低温离心机 (Sigma) , 酶标仪 (Anto) , ZK-82A电热真空干燥箱 (上海实验仪器总厂) , 血细胞分析仪 (sysmex XT-1800I) , 凝血分析仪 (STA compact CT) 。试剂:Mouse TF 96 test ELISA Kit (美国R&D公司) , Mouse TFPI 96 test ELISA Kit (美国R&D公司) 。
1.2 动物分组及造模
健康雌性昆明小鼠72只, 购自广东省医学实验动物中
心, 体重 (22±4) g, 适应性喂养1周, 术前禁食禁水12 h, 随机分为正常组、假手术组、造模组, 每组各24只;各组按术后时间点又分为2、4、8、12 h四个亚组, 每亚组各6只。正常组不做任何处理。造模组采用经典CLP模型:用10%水合氯醛 (0.03 m L/10 g) 经腹腔注射麻醉小鼠, 沿腹正中线作1 cm切口, 找到盲肠, 结扎盲肠根部, 用大号针头在盲肠远端刺一孔, 挤出少量肠内容物, 还纳腹腔, 逐层缝合腹壁。假手术组开腹找到盲肠后, 随即关腹。造模组和假手术组给予注射生理盐水 (约0.2 m L/6 h) 。
1.3 实验方法
1.3.1 TF、TFPI浓度测定
采用ELISA法。各组按时间点经眼眶采血, 收集血液标本至无菌无致热源1.5 m L EP管中, 4℃静置过夜, 将血样高速离心2 000 g 15 min后取上清, 分装后-70℃保存。实验前, 室温下溶解标本, 按照ELISA试剂盒说明书进行操作, 绘制标准曲线, 计算样本TF、TFPI浓度。
1.3.2 血小板与凝血四项检查
取各组术后12 h亚组的血样0.5 m L置于0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝试管中, 检测血小板计数 (PLT) 。同法取血样0.5 m L高速离心2 000 g 10 min, 取上清液, 以磁珠法进行凝血四项分析, 检测凝血酶原时间 (PT) 、凝血酶时间 (TT) 、活化部分凝血酶时间 (APTT) , 纤维蛋白原 (Fbg) , 以酶联免疫荧光定量法测定D-二聚体 (DD) 。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差表示, 组间比较采用单因素方差分析, 两两比较采用LSD-t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组术后12 h亚组的凝血指标比较
与正常组和假手术组相比, 造模组术后12 h凝血指标中的PT、TT、APTT和DD显著升高;而Fbg和PLT计数显著降低, 组间差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
2.2 各组术后不同时间TF浓度比较
绘制TF浓度标准曲线:Y=114.5X-2.936 (R2=0.994) 。造模组各时间TF浓度均显著高于正常组和假手术组, 且随着时间的增加呈现显著的上升趋势;与正常组相比, 假手术组TF浓度也显著升高;各组间比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
2.3 各组术后不同时间TFPI浓度比较
对标准品进行梯度稀释得出TFPI标准曲线为Y=9.73X-0.014 (R2=0.994) , 样品以1∶3稀释, 故样本TFPI的实际浓度为测得数据的4倍。与正常组及假手术组相比, 造模组各时间点TFPI浓度均明显上升, 假手术组与正常组相比TFPI浓度亦显著升高, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 但术后4 h之后造模组TFPI浓度并没有随时间的延长而呈现上升趋势。见表3。
3 讨论
各种原因导致的腹膜炎是脓毒症常见病因之一, CLP模型有效地模拟了腹腔空腔脏器穿孔与感染, 并产生脓毒症甚至MODS, 而凝血功能相关指标的异常与脓毒症进展程度显著相关[6]。本实验结果显示, 造模组术后12 h的PLT和Fbg均明显下降, 同时, PT、TT、APTT和DD升高 (P<0.05) 。说明脓毒症发生的早期, 凝血因子大量消耗, 同时, 被激活的纤溶激酶降解, 凝血亢进与纤溶失衡是脓毒症发生发展至DIC的主要病理生理过程。在炎症刺激后, 血小板被激活, 在血小板表面大量促凝物质表达, 膜表面为各种凝血蛋白酶级联反应的成分提供了凝集的必要条件, 特别是磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine, PS) , 是重要的凝血级联反应的细胞催化剂。血小板的凋亡与消耗增加, 导致血小板减少。在脓毒症过程中, 血小板减少症频繁发生, 成为脓毒症患者死亡的独立危险因素, 血小板也成为重要的标志物[7,8]。
注:与正常组比较, ★P<0.05;与假手术组比较, ☆P<0.05
注:与正常组比较, ★P<0.05;与假手术组比较, ☆P<0.05
注:与正常组比较, ★P<0.05;与假手术组比较, ☆P<0.05
脓毒症时凝血异常与炎症反应之间相互影响, 形成恶性循环, 在连结凝血和炎症过程中, TF最为关键, 是启动外源性凝血途径的关键凝血因子[9]。本实验测得游离TF水平, 造模组各时间点均高于正常组、假手术组, 并随时间延长而升高。TF通常不存在与脉管系统, 但在炎症状态下, 通过炎症因子的激活, 诱导了单核细胞和巨噬细胞表达TF, 并启动凝血过程[10,11]。目前认为, 循环中的TF已经被看作血细胞的成份之一, 尤其是血细胞微粒相关的TF, 以可溶解的形式在血液中流通, 并完成促凝血活动, 进一步扩大了循环TF的概念。内皮细胞在促炎细胞因子的刺激下释放TF, 循环TF的血浆浓度可作为炎症诱导凝血激活的临床标志物之一[4]。
在生理条件下, 抗凝系统是持续活动的, 以防止血液在内皮细胞表面形成凝块。在维护这个抗凝环境中, 内皮组织起了关键作用, 通过3个主要的抗凝蛋白来控制血凝块:TFPI、AT和APC[12]。TFPI是目前所知的唯一能抑制Ⅶa/TF复合物活性的生理性抗凝物质, 其能够抑制构建在磷脂小体上的Ⅶa/TF复合物的活性。TFPI表达影响凝血功能及其病理状态下的DIC发生[13]。TF一旦启动凝血途径, 血管内皮细胞 (VEC) 上的TFPI将迅速改变构型, 与TF介导的凝血因子复合物结合形成失活的FⅩa-TFPI-FVⅡa-TF而发挥其抗凝功能[14]。游离的TFPI可能反映VEC的持续损伤, 导致锚着于其上的高活性TFPI脱落。因此, 同时检测游离的TF和TFPI水平, 既可反映各自表达的动态变化, 也能反映凝血功能的异常[15]。本实验结果显示:造模组术后2 h, TF浓度和TFPI浓度显著升高, 其后, TF的表达呈进行性上升, 而TFPI并没有进一步升高。说明脓毒症早期各种效应细胞表达并产生了大量的游离TF, 启动并激活凝血系统, 而后TF与TFPI的不同步升高, 表明了脓毒症时存在凝血激活持续亢进状态, 而抗凝的物质在质和量上出现了相对的不足。TFPI是正常附属于内皮渠道的蛋白聚糖 (PGs) , PGs是黏多糖GAGs绑定的一个核心蛋白, 在脓毒症中, 促炎细胞因子减少在内皮表面的GAGs合成体, 可以因此影响TFPI的功能, 这也影响了凝血激活和抗凝过程的平衡, 导致了凝血的激活与亢进[16]。
综上所述, 脓毒症时存在血小板减少和凝血异常, 在凝血激活与亢进的同时, TF、TFPI表达出现不同步增加。由此推测, TF、TFPI表达增加的失衡可能是诱发凝血异常进而参与MODS发生的关键因素。
摘要：目的 探讨脓毒症时组织因子 (tissue factor, TF) 与组织因子途径抑制剂 (tissue factor pathway inhibitor, TFPI) 的表达及其平衡对凝血异常的影响。方法 昆明小鼠72只采用盲肠结扎穿孔模型 (cecal ligation and puncture, CLP) , 分为正常组、假手术组和造模组, 每组根据不同时间点 (2、4、8、12 h) 分4个亚组, 每个亚组各6只, 检测血小板计数和凝血指标, 采用ELISA法检测血浆TF和TFPI浓度。结果 盲肠结扎穿孔后, 造模12 h组PT、TT、APTT和DD显著升高, Fbg和PLT计数显著降低, 与正常组及假手术组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。造模2 h组TF与TFPI均显著升高, 各组间比较差异有统计学意义 (P<0.05) ;且TF浓度随时间呈进行性升高, 而TFPI未见进一步升高。结论 脓毒症时, 血小板减少及TF、TFPI表达增加的失衡可能是诱发凝血异常进而参与MODS发生的关键因素。
组织抑制因子 篇2
肾小球疾病是临床常见的自身免疫病，其临床发病与免疫相关的炎性反应存在密切联系。本文对免疫抑制性致炎、抗炎细胞因子与肾小球疾病的研究进展作一简单叙述。
白细胞介素-1受体拮抗剂
白细胞介素-1受体拮抗剂是一种22kD分子量、能与白细胞介素-1受体特异性结合的蛋白，具有阻断白细胞介素-1生物学活性的作用。人体内多种细胞，如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞以及系膜细胞可分泌产生白细胞介素-1受体拮抗剂。多种肾脏疾病，如狼疮性肾炎、免疫复合物肾炎、IgA肾病等的发病与白细胞介素-1有关。白细胞介素-1可以引起肾小球发生炎性反应、导致凝血或纤维化的发生。由于白细胞介素-1受体拮抗剂能与白细胞介素-1受体结合，因此，可以有效降低白细胞介素-1对系膜细胞的刺激作用。国外学者采用白细胞介素-1受体拮抗剂处理系膜细胞后，观察白细胞介素-1对白细胞介素8及巨噬细胞趋化蛋白-1的诱导表达作用，发现白细胞介素-1受体拮抗剂可以显著降低白细胞介素-1对白细胞介素8及巨噬细胞趋化蛋白-1的诱导表达。此外，白细胞介素-1受体拮抗剂具有降低尿蛋白与抑制白细胞积聚的作用[1]。部分科学家通过实验证实白细胞介素-1受体拮抗剂能降低肾小球与肾间质内白细胞黏附分子-1的表达，进而显著降低伴肾小球与肾间质内的白细胞浸润。动物实验显示，用白细胞介素-1受体拮抗剂处理的新月体肾炎小鼠肾功能较对照组小鼠稳定，血尿与蛋白尿发生率显著降低，核抗原表达明显减少。
转化生长因子-β
转化生长因子-β大小为25kD，存在于血小板A颗粒中，而内皮细胞、巨噬细胞以及肾小球细胞也可合成转化生长因子-β。转化生长因子-β的主要生物学活性为抑制T、B淋巴细胞的增殖，对系膜细胞的生长具有促进与抑制双重作用，即低剂量时促进系膜细胞生长，而高剂量时抑制系膜细胞生长。此外，还能抑制LPS的生物活性，诱导白细胞介素-1受体拮抗剂表达，进而抑制白细胞介素-1的作用。
体外实验显示，转化生长因子-β对小鼠肾小球系膜细胞具有刺激作用，可以使细胞外基质增加，具有促细胞外基质沉积的作用[2]。因此，对于肾小球疾病患者而言，不可采用转化生长因子-β进行治疗，否则可导致肾小球硬化的发生。
白细胞介素-10、13、4
白细胞介素-10是一种39kD分子量的二聚体。T淋巴细胞、成纤维细胞、单核/巨噬细胞在免疫活化状态下可产生白细胞介素-10。白细胞介素-10的生物学活性有抑制Th1细胞功能，抑制单核/巨噬细胞产生炎性介质及递呈抗原的作用。白细胞介素-13是Th2细胞因子，具有抑制单核/巨噬细胞产生炎性介质的作用。白细胞介素-4的生物学作用为抑制Th1细胞的形成，同时抑Th1细胞、单核/巨噬细胞产生炎性细胞因子。
国外研究学者通过RT-PCR技术以及特异性ELISA法对白细胞介素-10对LPS的反应进行研究，结果显示，小鼠的系膜细胞可以通过LPS增加白细胞介素-10的分泌，相反，无LPS刺激的小鼠系膜细胞则无白细胞介素-10表达。此外，在肾小球患者体内发现，T淋巴细胞可以自发生成白细胞介素-13，而B淋巴细胞则形成白细胞介素-13受体，患者IgE、IgG4高表达与白细胞介素-13存在密切聯系。另外，研究学者们发现，对于复发期的肾小球疾病患者，其外周血粒细胞在体外经过外界因素刺激后可以产生大量白细胞介素-4，与缓解期肾小球疾病患者或对照组患者相比，差异具有统计学意义。由此可见白细胞介素-10、13、4在肾小球疾病患者肾小球炎症发生过程中存在显著的调节作用。
由此可见，免疫抑制细胞因子白细胞介素-1受体拮抗剂、转化生长因子-β、白细胞介素-10、13、4在肾小球疾病患者的肾小球炎症发生过程中发挥了显著的调节作用。目前，白细胞介素-1受体拮抗剂对肾小球疾病患者的抗炎作用已经明确，具有广泛的应用前景。而转化生长因子-β、白细胞介素-10、13、4对肾小球的抗炎作用目前仍处于理论研究阶段。对免疫抑制细胞因子进行有针对性、有效的抗肾小球炎症研究，对临床治疗肾小球疾病将具有重要的临床意义。
参考文献
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组织抑制因子 篇3
1 材料和方法
1.1 细胞培养
HGF来自于健康阻生牙拔除时患者的牙龈,HPDLC取自拔除健康正畸牙的根中1/3,志愿者无系统性疾病。人牙周膜细胞或人牙龈成纤维细胞用含有100 U/ml青霉素和100 μg/ml 链霉素的DMEM培养液(Dulbecco's modified Eagle medium's,flow laboratories, Mclean, VA, USA)液清洗3 遍,将分离的组织块贴在培养皿底部,尽量保留组织量(面积越大越易成活),用盖玻片覆盖在组织面上,放置于加有10% FBS的DMEM 培养液中, 37 ℃、 5% CO2 孵箱中培养。
1.2 细胞处理
HGF和HPDLC分别种在6孔板中,每孔浓度为1×105 个细胞, 3 d后细胞单层融合,用人工合成的IL- 1β浓度为25 ng/ml (Genzyme Co. Boston, MA) 和PGE2 浓度为10-6 mol/L(Sigma chemical Co.St Louis, MO)分别在 1、 3、 6、 12、 24、 48 h加入。根据实验结果, HPDLC在IL- 1β浓度分别为 0.25、 2.5、25、 250 ng/ml下培养6 h,HGF培养12 h,观察不同浓度的IL- 1β对细胞的影响。
1.3 RT- PCR
用1 ml TRIzol (Gibco)处理离心后收集的细胞,沉淀出总RNA并冲洗重新溶在DEPC处理后的水中, 总 RNA 用浓度测量仪(MicroAmp, PE Co, Foster City, CA)在光波长为 260 nm处测量并计算浓度。每个反应试管中加入2 μg 总RNA和 RT反应混合物(总量 25 μl), 包括转录酶superscriptTMII(Gibco BRI) 和随机引物(Takara Shuzo CO., LTD)。 cDNA合成条件为 25 ℃,10 min, 42 ℃ 50 min, 70 ℃ 10 min。
PCR的扩增反应物为20 μl含Taq polymerase(EX TaqTM Takara Shuzo CO., LTD)。 ODF, OCIF和GAPDH引物分别如下: ODF- F (TAA TCA GGA TGG CTT TTA TTA CCT G, nucleotides 583～608), ODF- R (TGT AAATAC GCG TGT TCT CTA CAA G, nucleotides 1081～1106), OCIF- F (TTG CCC TGA CCA CTA CTA CAC A, nucleotides 192～214), OCIF- R(GCC GTT TTA TCC TCT CTA CAC T, nucleotides 728～750), GAPDH- F (TCA TCT CTG CCC CCT CTG CTG, nucleotides 418～439), GAPDH- R(GCC TGC TTC ACC ACC TTC TTG, nucleotides 833～854). ODF PCR 反应条件为94 ℃ 1 min, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s,共27 个循环。 OCIF PCR反应条件为 94 ℃ 1 min, 62 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s,25 个循环,GAPDH PCR反应条件为94 ℃ 1 min,58 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s,共22 个循环。
1.4 Southern blots 及RT- PCR的半定量分析
5 μl PCR 产物在2%琼脂中电泳并转移到尼龙膜上(Amersham Pharmacia Biotech Limited, England)。用常规Southern- blot来检测PCR产物,并用software BAS 2000来做定量分析,用GAPDH基因来标准化。特异性探针为:cDNA: ODF, (GGT CTG GAG AGG AAA TCA GCA TCG AGG TCT CCA ACC CCT CCT TAC TGG ATC CGG ATC AGG nucleotides 810～870); OCIF, (CAG TAC GTC AAG CAG GAG TGC AAT CGC ACC CAC AAC CGC GTG TGC GAA TGC AAG GAA GGG nucleotides 471～531); GAPDH, (CCC TCC GGG AAA CTG TGG CGT GAT GGC CGC GGG GCT CTC CAG AAC ATC ATC CCT GCC TCT nucleotides 631～691)。
2 结 果
25 ng/ml IL- 1β加入HPDLCs 和HGFs 1、 3、 6、 12、 24、 48 h后,HPDLC中ODF mRNA的表达在6 h时达到峰值,是空白对照组的989%(均用GAPDH基因标准化后)(图 1B)。HGFs在12 h时ODF mRNA的表达达到峰值,为对照组的1267%(图 2B)。 24 h后2 种细胞中ODF mRNA均回到基础水平。 25 ng/ml IL- 1β刺激下,1、 3、 6、 12、 24、 48 h后,OCIF mRNA在HPDLCs 和 HGFs的表达随着时间的延长而升高,呈明显梯度增高趋势(图 1C, 2C)。
在浓度梯度实验中,根据以上实验结果,HPDLC取IL- 1β刺激6 h后ODF mRNA 和 OCIF mRNA的表达值, HGFs采用12 h ODF mRNA 和 OCIF mRNA的表达值。 HPDLCs 和 HGFs在IL- 1β作用下OCIF表达较ODF敏感, 当IL- 1β在低浓度2.5 ng/ml 时OCIF mRNA 明显升高,HPDLCs中OCIF的表达为对照组的177%; HGFs中OCIF的表达为对照组的168%, 而这时 ODF mRNA 没有变化(图 3C,4C),IL- 1β浓度为250 ng/ml时HGFs和HPDLCs中的ODF才开始发生变化,其浓度为250 ng/ml时ODF合成明显升高(图 3B, 4B)。
浓度为10-6 mol/L PGE2 12 h后使HPDLCs中ODF mRNA的表达达到峰值,为对照组的1381%,HGF细胞对PGE2的反应似乎比HPDLCs敏感,在3 h后就达到峰值,为对照组的454%。 在2 种细胞中ODF mRNA 的表达都是短暂的。 在HPDLC中24 h后ODF mRNA开始下降,在HGFs中6 h后下降,PGE2 对 OCIF mRNA在这2 种细胞中的表达没有影响(图 5、6)。
3 讨 论
以往的研究表明ODF不仅在松质骨和骨髓中查到,在胸腺、肺、脾甚至淋巴结中都可以测到。本研究中在HPDLC 和 HGF中也检测到ODF mRNA和 OCIF mRNA。 牙周炎时,骨的吸收和形成的平衡遭到破坏,在致炎因素如细菌、细胞因子、激素等作用下,促进了破骨细胞的形成,最终导致骨吸收。尽管对细胞因子,如IL- 1β、 IL- 6、 TNF- α 及促进骨成熟因子如 PTH、 1,25(OH)2D3和 PGE2在牙周炎中的作用都得到深入的研究[9],但很少有报道ODF 和OCIF在牙周组织中与这些因子的关系。由于在体外,ODF 是破骨细胞形成的必须因子, 这就提示促进破骨细胞成熟的激素和细胞因子是通过调节细胞的ODF和 OCIF来调节骨吸收的[8]。 ODF不仅可以促进骨分化还作用于免疫系统,如它可以诱导炎症前因子IL- 6和 IL- 1的产生,促进T细胞生长等[10]。 我们的研究提示,牙周组织中,ODF 在PGE2 和 IL- 1β介导下可引起骨吸收和参与炎症反应。
以往研究表明, 1,25(OH)2D3、 PGE2、 PTH、 IL- 1、 IL- 11、 IL- 17、 TNF- α等均可促进成骨干细胞中ODF的表达[5]。 我们的研究中在PGE2 和 IL- 1β作用下,HPDLC和 HGF也能体外表达ODF mRNA。虽然表达的时间和延续的时间有所不同,但数据表明,PGE2和IL- 1β可通过刺激牙周组织中ODF的表达来提高破骨细胞的形成和活性。
尽管IL- 1β促进骨吸收,但它也促进HPDLCs 和 HGFs 产生 OCIF。 文献报道, IL- 1β能促进人成骨细胞产生OCIF mRNA[11]。 这说明IL- 1β在炎症时也可激活OCIF来对抗 ODF的作用从而保护组织, 在成骨干细胞中PGE2 通过抑制OCIF的表达来介导炎症和提高破骨细胞的活性[6]。 我们的研究表明,HPDLC 和 HGF在PGE2 作用下不产生OCIF mRNA。显示PGE2 和 IL- 1β在骨吸收过程中作用有所不同。
本研究提示,HPDL 和 HGF 在IL- 1β和PGE2 作用下,可产生调节骨代谢的ODF 和OCIF,这两种因子的变化对局部牙槽骨的吸收有重要影响。阻断ODF或用OCIF 来阻断骨吸收或可抑制牙周炎时牙槽骨的吸收。通过抑制IL- 1β和PGE2的分泌,特别是PGE2能有效地减少ODF的合成,从而降低ODF在局部炎症中的比例,减少骨吸收。
摘要：目的:检测炎症前细胞因子IL-1β和骨成熟因子PGE2对人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞破骨细胞分化因子(osteoclastdifferentiation factor,ODF)和破骨细胞生长抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF)表达的影响。方法:用RT-PCR和Southern-blot对该2种细胞在IL-1β或PGE2作用下细胞中ODF和OCIF mRNA的表达进行半定量。结果:上述2种细胞在IL-1β或PGE2作用下,ODF和OCIF的合成均有升高,各细胞合成ODF和OCIF的峰值随IL-1β或PGE2作用时间和浓度的不同而发生变化。结论:牙周组织中ODF和OCIF可能同时参与炎症反应,并受致炎因子IL-1β和骨代谢因子PGE2调节。
关键词：牙周膜细胞,牙龈细胞,破骨细胞分化因子,破骨细胞生长抑制因子
参考文献
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组织抑制因子 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2013年1月—2015年12月本院诊治的宫颈癌患者45例、宫颈上皮内瘤变(CIN)患者45例以及正常宫颈组织45例的病理标本。宫颈癌患者取材前未行手术或放化疗;健康对照组排除妊娠以及哺乳期妇女。3组患者的年龄、孕产等一般资料相比,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 检测方法
取宫颈组织,甲醛固定、脱水、浸蜡、包埋,,连续切片厚度4μm。切片给予常规脱蜡、水化处理,即:二甲苯3次,20min/次;100%酒精3次,100min/次;之后98%酒精、80%酒精、70%酒精各10min。蒸馏水、PBS液冲洗3次,5min/次;将切片置入枸橼酸缓冲液中进行加热,沸腾后停止加热,5min之后重复加热,之后在室温下进行冷却;用PBS溶液冲洗3次,5min/次;在37℃的温度下,使用3%的H2O2孵育20min,阻断内源性酶的活性;再次用PBS溶液冲洗3次,5min/次;滴加山羊血清封闭15mim,除去多余液体后加入浓度为1:160的TFPI-2抗体,在4℃的温度下孵育过夜;复温并在PBS冲洗后加入生物素标记的二抗Ig G工作液,在37℃下孵育15min;用PBS溶液冲洗3次,5min/次;加入辣根标记的链霉卵白素工作液,在37℃下孵育15min;用PBS溶液冲洗3次,5min/次;DAB(联苯胺)显色,在室温条件下显色,显微镜下控制标本的染色程度;在苏木素进行复染约20~30s后使用清水进行冲洗、返蓝;使用梯度酒精进行脱水,即:70%酒精、80%酒精、98%酒精、100%酒精脱水三次,每次5min;二甲苯进行透明,3次,5min/次。结束后使用中性树胶进行封片处理,放于显微镜下进行观察。
1.3 结果判读
病理科医生在200倍镜下,随机选择5个视野观察,阳性结果为胞质被染为棕黄色。其中不表达是阴性,弱阳性为小于10%、阳性为10%~50%、次强阳性为50%~70%、强阳性为75%~100%。
1.4 统计学分析
使用SPSS 17.0,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验,计数资料采用率表示,采用χ2检验,等级资料采用秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 3组患者宫颈组织中TFPI-2的表达情况
免疫组化结果显示:正常宫颈患者、宫颈上皮内瘤变(CIN)患者、宫颈癌患者组织病理标本中TFPI-2的表达逐渐下降,3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。具体结果见表1。
注:3组间秩和检验比较,χ2=10.208,P=0.000
2.2 宫颈癌样本TFPI-2的表达与病理类型、分化程度、分期以及淋巴结转移的关系
宫颈癌中TFPI-2的表达与其FIGO分期和淋巴结转移有关,肿瘤越晚期,TFPI-2的表达越低,差异有统计学意义(P<0.05);但是与其病理分类和分化程度无关,差异无统计学意义(P>0.05)。具体结果见表2。
3 讨论
3.1 TFPI-2概述
TFPI-2是一种丝氨酸蛋白酶家族抑制剂,基因位于染色体7q22,全长7Kb,其编码产物的相对分子质量为32000,广泛分布于人体细胞内[6]。TFPI-2可在内皮细胞、表皮细胞中分泌合成,在胎盘组织、骨骼肌、肝脏、血管内皮细胞中高度表达[7]。研究发现,恶性肿瘤患者发生了蛋白质的水解失调。Chand等[8]进行体外实验发现TFPI-2可抑制纤溶酶、基质金属蛋白酶等多种蛋白酶。TFPI-2可以显著的抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶的作用,从而参与到机体的组织发生、纤溶、胚胎发育及肿瘤侵袭等过程中[9]。在许多肿瘤中都能够发现TFPI-2基因的缺失。
3.2 TFPI-2的作用机制及与宫颈癌的关系
宫颈癌导致患者死亡的一个主要原因就是癌细胞的侵袭以及远处转移,在宫颈癌发生侵袭或者远处转移时,需要将基底膜、ECM进行降解[10]。在整个过程中,肿瘤细胞分泌的丝氨酸蛋白酶起着重要的作用。作为丝氨酸蛋白酶抑制剂,TFPI-2可以通过以下方面抑制宫颈癌的侵袭和转移:1)抑制、降解MMP(基质金属蛋白酶),肿瘤细胞可以分泌MMP并与ECM中的生长因子结合,改变基质的微环境,不仅促进肿瘤的增生,还会使MMP的表达、分泌上调。而TFPI-2可以与MMP及其前体结合,竞争性的抑制MMP和ECM的结合,从而保证ECM结构的完整性,发挥抑制肿瘤的侵袭、转移作用[11,12]。2)抑制肿瘤新生血管的形成,一方面可以抑制MMP的表达和纤溶物质,增加其抑制物的功能活性起作用;另一方面可以使IL-8的表达水平和血管生成因子的表达下调,发挥抑制血管生成的作用[13]。3)促进癌细胞的凋亡,TFPI-2可以通过降解丝氨酸蛋白产物,与凋亡受体结合,导致肿瘤细胞的死亡[14]。
组织抑制因子 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
Wistar大鼠,体重180~200 g(哈尔滨医科大学附属第二医院动物中心提供)。兔抗大鼠平滑肌α-肌动蛋白抗体、兔抗大鼠TIMP-3抗体、MMP-2抗体(武汉博士德生物工程有限公司),逆转录PCR试剂盒(Invitrogen公司,美国),疫组化染色试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 VSMCs的分离、培养、鉴定
(1)VSMCs的分离和培养:参照NAKAMURA等[6]的方法取18只大鼠,腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,切取胸主动脉。用含10%胎牛血清的DMEM采用组织块贴壁法培养VSMCs,细胞生长至80%融合时传代。(2)VSMCs的鉴定:取第3代VSMCs接种于6孔板。一抗为兔抗大鼠平滑肌α肌动蛋白抗体,二抗为生物素标记山羊抗兔IgG,采用SP法进行染色。以PBS代一抗作为阴性对照。
1.2.2 TIMP-3-pcDNA
3.0重组质粒转染大鼠VSMCs及鉴定(1)转染:取标记后的第3代VSM-Cs,按Lipofectamine 2000转染试剂盒提供的方法,将TIMP-3-pcDNA 3.0重组质粒瞬时转染至VSM-Cs,72 h后完成转染,转染后细胞立即应用。(2)RT-PCR鉴定:取转染前后VSMCs,分别提取总RNA,进行TIMP-3基因RT-PCR扩增。TIMP-3基因引物序列为:上游引物:5'-GCCGTTTATGGAGTTGAT-3',下游引物:5'-AGCATTGAGCAGGGTAGA-3'。
1.2.3 动物模型制备
参照尹倪等[7]方法,复制AMI模型。取54只大鼠戊巴比妥钠麻醉后,第4肋间进胸,显露心脏,丝线结扎左冠状动脉远端,制备AMI模型。随机分三组,TIMP-3组(TIMP-3基因转染VSMC移植组)将BrdU标记的细胞悬液0.5 m L,含1×106个TIMP-3基因转染VSMCs,分5点注射到梗死心肌的边缘区;VSMC移植组同样方法注射BrdU标记的细胞悬液0.5 m L,含1×106个VSMCs;DMEM移植组注射等量无细胞的DMEM液0.5m L。
1.2.4 检测指标
(1)心脏功能检测:每组取9只A-MI 3 d进行移植的大鼠于AMI,4周后进进行心动超声检查,观察大鼠心脏功能的变化。
大鼠在胸骨旁心脏左室长轴切面获取M型超声心动图像3个。大鼠左室舒张末内径(left ventricular internal diameter at end-diastole,LVIDd)和左室收缩末内径(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)通过M型超声图像获得(每个图像选用3个心动周期,取平均值),应用Teichholtz公式计算舒张末容积(end-diastolic volume,EDV)、收缩末容积(end-systolic volume,ESV)。(2)MMP-2、TIPM-3蛋白表达的检测取注射部位心肌组织,10%福尔马林固定,酒精脱水,石蜡包埋,组织切片。按照免疫组化试剂盒操作:一抗为兔抗大鼠MMP-2、TIMP-3抗体,二抗采用生物素标记山羊抗兔IgG,DAB显色。(3)MMP-2、TIMP-3 m RNA表达的检测:心肌组织低温研磨后,用Trizol试剂抽提总RNA[8],进行PCR扩增。MMP-2基因上游引物:5'-CACACCAGGTGAAGGATGTG-3,下游引物:5'-GCC CTCCTAAGCCAGTCTCT-3'。β-actin的上游引物:5'-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3',下游引物:5'-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3'。
1.2.5 统计学方法
采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。数据以均数±标准差表示,两组间比较采用非配对t检验,P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 VSMCs体外培养、鉴定和基因转染
VSMCs呈梭形,束状排列,呈峰谷长势。第3代VSMCs抗平滑肌α肌动蛋白免疫组化染色,光镜下见胞浆中大量平行条状棕黄染色,即为肌动蛋白(图1)。TIMP-3基因瞬时转染后的VSMCs组在464 bp处扩增出目的条带。(图2)
抗SMA免疫组化染色组(×400)
M.DNA Marker DL2,000 1.转染前VSMCs组,2.转染后VSMCs组
2.2 心功能变化
心动超声检查发现DMEM组、VSMC组和TIMP-3基因转染VSMC移植组的LVIDd、LVIDs、EDV和ESV值均较正常鼠升高;VSMC组较DMEM组有所改善,TIMP-3基因转染VSMC移植组较DMEM组有明显改善,且TIMP-3基因转染VSMC组较单纯VSMC组心脏功能好转(表1,图3)。
注:各组与Normal组比较,P<0.05;1)与DMEM组比较,P<0.05,2)与DMEM组比较,P<0.01;3)TIMP-3组与VSMC组比较,P<0.05,4)TIMP-3组与VSMC组比较P<0.01
2.3 MMP-2、TIPM-3蛋白表达的变化
2.3.1 MMP-2
DMEM组、VSMC组和TIMP-3组均可见棕黄色颗粒,镜下观察与对照组相比,DMEM组MMP-2蛋白的表达最多,VSMC组MMP-2蛋白的表达较少,TIMP-3组MMP-2蛋白的表达最少(图4)。
2.3.2 TIMP-3
抗TIMP-3蛋白染色发现DMEM组、VSMC组、TIMP-3组均见棕黄色颗粒。TIMP-3组TIM P-3蛋白的表达多,VSMC组表达较少,DMEM组仅有极少TIMP-3蛋白的表达;TIMP-3蛋白主要位于梗死区边缘和梗死区(图5)。
2.4 MMP-2、TIMP-3 mRNA表达的变化
2.4.1 MMP-2 m RNA
RT-PCR扩增显示:在286 bp处出现特异条带。各组m RNA含量均较对照组明显升高(P<0.01),TIMP-3组较DMEM组和VSMC组明显降低(P<0.01),VSMC组较DMEM组明显降低(P<0.01)。(图6)
A:Normal;B:DMEM组;C:VSMC组;D:TIMP-3组
a.Normal b.DMEM组可见大量棕黄色颗粒c.VSMC组可见较少棕黄色颗粒d.TIMP-3组可见少量棕黄色颗粒
A:Normal;B:DMEM组可见很少棕黄色颗粒;C:VSMC组可见较多棕黄色颗粒;D:TIMP-3组可见大量棕黄色颗粒
M:DNA Marker DL2,000;1:正常对照组;2:DMEM组;3:VSMC组4.TIMP-3组
2.4.2 TIMP-3
RT-PCR结果示:在464 bp处出现特异条带。各组均较对照组明显升高(P<0.01),TIMP-3组较VSMC组和DMEM组明显增高(P<0.01),VSMC组较DMEM组明显增高(P<0.01)(图7)。
M:DNA Marker DL2,000;1:正常对照组;2:DMEM组;3:VSMC组;4:TIMP-3组
3 讨论
心肌梗死(AMI)后发生的左心室的进行性扩张和外形改变被称为梗死后心室重塑。近年来随着对心肌梗死后心室重塑分子生物学机制研究的深入,人们认识到心肌梗死后心室重塑是一系列复杂的分子和细胞机制导致心肌结构、功能和表型的变化[1]。这种变化不仅表现为心肌细胞的凋亡、坏死和心肌肥厚,还表现为心肌间质纤维胶原合成和降解之间动态平衡的破坏。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一类含Zn2+的内源性蛋白水解酶,能降解除多糖以外的所有细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)成分,在组织重塑中起重要作用[9]。基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metallopro teinases,TIMPs)是基质金属蛋白酶的内源性特异性抑制剂,主要功能是抑制MMPs,通过对MMPs活性的抑制减轻组织重塑[10],MMPs、TIMPs及其调节因子间的相互作用决定了心肌间质重塑过程的进展。
ROMANIC等[5]在兔心肌梗死模型中发现,MMP-2在心肌梗死后表达上调。WILSON等[11]在羊的心肌梗死模型中检测了心肌MMPs与TIMPs的区域分布,发现MMP-2于过渡区和心肌梗死区升高。TIMP-3是TIMPs家族中的重要成员,它只存在于细胞外基质中,是一种结合于细胞外基质的非可溶性蛋白,APET等[12]研究表明TIMP-3能抑制多种MMPs的活性,对MMP-2、MMP-9、胶原酶-1及基质溶素均有抑制作用。BRAUER等[13]研究证实AMI后TIMP-3蛋白表达量减少。FEDAK等[14]报道AMI后心肌组织中TIMP-3含量的下降可促进左心室的扩大,降低心脏功能。
实验人员在建立稳定的大鼠AMI模型的基础上,将转染了TIMP-3基因的VSMCs以心肌内注射的方法移植到心肌缺血区,将细胞移植和基因治疗相结合,探讨AMI后早期增加缺血心肌中肌细胞的数量和TIMP-3基因转染对调节心肌间质重塑的作用。
本研究显示,TIMP-3基因成功转入VSMCs,移植到心肌缺血区后,移植细胞可在缺血心肌内存活,并且表达TIMP-3。心脏功能检测发现TIMP-3基因转染VSMCs移植大鼠的心功能明显提高,TIMP-3基因转染VSMC移植组的LVIDd、LVIDs、EDV和ESV值均较其他组升高。同时,MMP-2基因m RNA和蛋白的表达较其他组明显减少。上述心功能的改变可能与MMP-2基因表达的抑制有关,MMP-2表达抑制可减少间质的降解,抑制心室重塑。采用TIMP-3基因修饰VSMCs后进行移植,可克服单纯VSMCs移植仅增加细胞数量而不能改善内环境的缺点,两种治疗相互促进,可以减缓心肌梗死区域室壁变薄和心腔扩大,改善心室结构,维持心脏功能。
摘要：目的 观察基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP-3)基因转染血管平滑肌细胞(VSMCs)移植,对大鼠心肌梗死(AMI)的治疗效果,并探讨其可能的机制。方法 取Wistar大鼠胸主动脉,采用组织块法培养VSMCs。左冠状动脉远端结扎方法复制AMI模型。随机分三组:冠状动脉结扎后3 d向缺血心室壁内分别注射含有1×106个TIMP-3基因转染的VSMC(sTIMP-3组)、1×106个VSMC(sVSMC组)、不含细胞的DMEM液(DMEM组)各0.5 mL。术后第4周,观察大鼠心脏功能变化,免疫组化染色检测TIMP-3和基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达,RT-PCR法检测缺血心肌组织中TIMP-3和MMP-2 mRNA含量。结果 TIMP-3基因成功转入VSMCs中。术后4周,TIMP-3组的LVIDd、LVIDs、EDV和ESV值较正常鼠升高(P<0.05),但小于VSMC(P<0.01)组和DMEM组(P<0.01)。RT-PCR结果显示:各移植组TIMP-3 mRNA含量均较对照组显著升高(P<0.01),TIMP-3组较VSMC组、DMEM组明显增高(P<0.01);TIMP-3组MMP-2 mRNA含量较VSMC组、DMEM组明显降低(P<0.01)。结论 将TIMP-3基因转染的VSMCs移植入心肌缺血区可明显抑制MMP-2的表达,进而抑制AMI后早期心肌重塑,改善心功能。
组织抑制因子 篇6
关键词：口腔鳞状细胞癌,细胞型FLICE样抑制蛋白,T-box转录因子,免疫组化,逆转录多聚酶链反应
口腔鳞状细胞癌 (oral squamous cell carcinoma, OSCC)是一种常见于口腔颌面部的恶性肿瘤 ,在口腔颌面部恶性肿瘤中占有相当高的比例,每年有几十万人患病,威胁着人们的生活质量及生命,是一种严重危害人类健康的重大疾病[1,2]。 而肿瘤的发生是内外界因素长期作用于人体细胞的结果,因此,学者认为口腔颌面部肿瘤是危害人们健康及生活质量的一种慢性病。 而在肿瘤的发生、发展及转移的过程中可能有多个因素及多种机制的参与,如不良生活习惯、理化因素、机械刺激因素、生物学因素以及基因突变[3,4]。 研究表明,细胞型FLICE样抑制蛋白(c FLIP)及Tbox转录因子 (TBX2)在多种肿瘤组织中表现为高表达,故深入探讨两者在肿瘤中的作用,有助于OSCC的防治。
1材料与方法
1.1病例选择及分组标准
标本来源:由吉林大学口腔医学院及郑州大学第一附属医院病理科提供。 选择病例标准:所有病例术前未行放疗、化疗等任何治疗。 术后均经病理组织学确诊。 其中男37例,女20例;年龄40~73岁,中位年龄66岁;伴淋巴结转移者48例,无淋巴结转移者9例; 临床分期分为Ⅰ期5例、Ⅱ期7例、Ⅲ期26例、Ⅳ期19例[国际抗癌联盟(UICC)2002年分期标准]。 另外部分取口腔黏膜上皮异常增生(DOM)组织(位于癌变组织与正常黏膜交界部位, 组织学表现为不典型增生)38例,男21例,女17例;取距离癌肿边缘5 cm处的正常口腔黏膜(NOM)30例,男15例,女15例。 本研究经医院伦理委员会通过,患者知情同意并签署知情同意书。
1.2主要试剂
鼠抗人单克隆抗体c-FLIP和TBX2。生物素化兔抗山羊二抗Ig G、SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、Trizol试剂;M.MLV逆转录酶,Oligo(d T)12-18引物,Tag DNA聚合酶, 硝酸纤维素膜, 羊抗兔 β-actin抗体,预染蛋白marker,BCATM蛋白定量试剂盒。
1.3实验方法
1.3.1免疫组织化学方法
1.3.1.1处理组织切片,固定,标本染色:加入1∶150的一抗c FLIP/TBX2的单抗,4℃过夜。 加入生物素化二抗工作液, 置室温下20 min,PBS漂洗后加入试剂SP,室温下20 min,PBS洗后经DAB显色 ,苏木精复染,脱水,透明,封片。
1.3.1.2结果判断。 采用显微镜进行观察,随机选5个高倍镜视野(每个视野可见细胞数目≥200个)。 镜下免疫组化阳性表达于细胞质,呈颗粒样、棕黄色。 结果判定:10分=细胞无染色;1分=细胞呈浅黄色;2分= 细胞呈棕黄色;3分=细胞呈棕褐色。21分=阳性细胞数所占百分比<30%;2分=阳性细胞数所占百分比为30%~70%;3分=阳性细胞数所占百分比>70%。 总积分=1、2两项评分的乘积;阴性结果(-):0~1分,阳性结果(+):≥2分。
1.3.2 RT-PCR 法
1.3.2.1引物的设计与合成。
1.3.2.2提取组织总RNA。 采用Trizo试剂进行提取 , 其优点是RNA不易降解, 且提取的RNA纯度较好。 步骤如下: 裂解组织,RNA抽提,RNA沉淀,RNA洗涤,RNA溶解。 测定总RNA浓度和纯度的:空白对照是DEPC-H2O。
1.3.2.3逆转录 (RT) 以m RNA为模板 , 合成单链c DNA。
1.3.2.4聚合酶链反应 (PCR)在相应的反应条件经过变形-退火-延伸下进行PCR,然后定量分析。
1.4统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件录入、处理实验数据。计量资料采用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验,计数资料采用 χ2检验。 相关性采用Spearman相关分析。 以P < 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 c FLIP和TBX2在三种组织中的表达情况
显微镜下:c FLIP和TBX2的阳性表达呈棕黄色, 定位于细 胞质 ;c FLIP的阳性表 达率 :OSCC为91.23% ,DOM为84.21% ,NOM为10.00% 。 c FLIP在OSCC、DOM两种组织 中的表达 较高 , 而c FLIP在NOM表达相对较低;OSCC、DOM与NOM的c FLIP表达差异有统计学意义 (P < 0.05),OSCC与DOM的c FLIP表达差异无统计学意义(P > 0.05)。 TBX2的阳性表达率:OSCC为87.72%,DOM为81.58%,NOM为26.67%。 TBX2在OSCC、DOM两种组织中的表达较高, 而TBX2在NOM相比较相对较低,OSCC、DOM与NOM的TBX2表达差异 均有统计 学意义 (P < 0.05), 而OSCC、DOM比较差异无统计学意义 (P > 0.05)。 见表1。
注 : 与 NOM 比 较 ,*P < 0.05;c FLIP: 细 胞 型 FLICE 样 抑 制 蛋 白 ; TBX2:T-box 转录因子 ;OSCC:口腔鳞状细胞癌 ;DOM:口腔黏膜上皮 异常增生;NOM:正常口腔黏膜
2.2 c FLIP和TBX2在三种组织中的表达情况与OSCC临床之间的关系
本研究表明,OSCC的临床分期及淋巴结转移与c FLIP和TBX2表达程度有关, 在这两个方面的表达差异有统计学意义(P < 0.05)。 见表2。
注:与Ⅰ+Ⅱ期比较,*P < 0.05;与无淋巴结转移比较,▲P < 0.05;c FLIP:细 胞型 FLICE 样抑制蛋白;TBX2:T-box 转录因子;OSCC:口腔鳞状细胞癌
2.3 OSCC、DOM和NOM三种组织中c FLIP m RNA、TBX2 m RNA的表达情况
OSCC、DOM两种组织中c FLIP m RNA的表达较高,而NOM的c FLIP m RNA较低,差异有统计学意义 (P < 0.05); 同时 ,OSCC、DOM之间的c FLIP m RNA表达差异有统计学意义 (P < 0.05)。 在OSCC、DOM和NOM三种组织中TBX2 m RNA的表达 :三种组织中 , TBX2的表达由高到低依次是OSCC、DOM和NOM, 其中OSCC与DOM、OSCC与NOM间的TBX2 m RNA的表达差异有统计学意义 (P < 0.05); 而DOM与NOM之间的TBX2 m RNA的表达差异无统计学意义 (P > 0.05)。 见表3。
注:与 NOM 比较,aP < 0.05; 与 DOM 比较 ,bP < 0.05;c FLIP: 细胞型 FLICE 样抑制蛋白 ;TBX2:T-box 转录因子 ;OSCC: 口腔鳞状细胞癌 ;DOM:口腔黏膜上皮异常增生 ;NOM:正常口腔黏膜
2.4 c FLIP m RNA和TBX2 m RNA的表达与OSCC临床特征的关系
结果表明OSCC的临床分 期及淋巴 结转移与c FLIP m RNA和TBX2 m RNA的表达情况有关, 差异有统计学意义(P < 0.05)。 见表4。
2.5 c FLIP、TBX2在OSCC中的相关性
经过Spearman相关性分析发现,c FLIP、TBX2的表达呈正相关(r = 0.768,P < 0.05)。
注:与Ⅰ+Ⅱ期比较,*P < 0.05;与无淋巴结转移比较,▲P < 0.05;c FLIP: 细胞型 FLICE 样抑制蛋白;TBX2:T-box 转录因子;OSCC:口腔鳞状细 胞癌
3讨论
世界卫生组织(WHO)明确定义恶性肿瘤是一种慢性病,而口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤———鳞状细胞癌的形成也是一个长期的生物学过程,其特点是多步骤、多病灶性。 因此我们可根据慢性病的特点,采取更合理、更有效的治疗措施。 目前国内外高度重视恶性肿瘤的基础和临床研究, 尤其是其发生发展、转化的研究;随着分子生物技术的飞速提高,大量的肿瘤标志物、癌基因被发现,应用于临床诊断、治疗之中,取得了较好的效果。 常见的癌基因:Ras基因,抑癌基因:p53基因、RB基因等。 研究表明:肿瘤发生时细胞的遗传物质———脱氧核糖核酸(DNA)产生突变, 细胞的生长和分裂失衡,导致细胞的异常增生,凋亡失衡。 在这个过程之中癌基因和抑癌基因发挥重要的作用。 1997年Irmler发现了c FLIP,它是一种凋亡调控蛋白[5],定位于人类染色体2q33-34,其蛋白的主要表达为c FLIPL和c FLIPS,前者的分子量较大,后者的较小;可以在人类等哺乳动物中存在,可以在正常组织中表达,例如肌肉、淋巴组织中等[6]。 组织在炎症状态下c FLIP的表达水平会有所增加,促进单核巨噬细胞的趋化功能,清除坏死细胞及组织[7];同时 ,炎症细胞能诱导c FLIP的表达水平增高, 影响细胞凋亡。 c FLIP可以抑制Fas及其他死亡受体介导的细胞凋亡 (如TNFR、DR3、DR6等),诱导肿瘤发生。 而Fas蛋白信号通 路在肿瘤 细胞的凋 亡中发挥 重要的作 用 。 c FLIP内含有死亡效应域 (death effect domain,DED); DED可以与死亡效应分子和Caspase-8结合,阻止了死亡信 号复合体 (death -induced signal complex, DISC)的形成 ,进而阻断了Fas蛋白所介导的细胞凋亡途径,抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞的增殖,形成肿瘤组织。 通过小鼠实验表明c FLIP转基因肿瘤细胞能够躲避机体的免疫监视,且与Fas蛋白信号通路有关。 研究表明,c FLIP在肠上皮癌[8]、膀胱上皮癌组织[9]、胃癌组织[10]及淋巴瘤组织[11,12,13]中表达显著增高,明显高于正常组织。 本研究发现c FLIP及c FLIP m RNA在鳞癌组织中表达较高,明显高于NOM;另外,其表达情况与OSCC的临床分期及是否有淋巴结转移有关,而与年龄、性别之间的差异无关。 有研究表明在Kaposi肉瘤中c FLIP的临床表达,提示了c FLIP在OSCC的发展中发挥一定的作用。 T-box基因是一个重要的转录因子,TBX2是其重要的一员,在胚胎的发育形成过程中发挥至关重要的作用,同时还参与许多器官的形态发生,如肺、肾脏、乳腺间质、心脏、原肠形成以及黑色素细胞等[14,15,16,17,18,19,20,21]。 研究表明TBX2在多种肿瘤中表达较高[22],本研究与之相符 。 其机制可能是抑制p19arf蛋白的表达,破坏细胞的正常凋亡,导致细胞的过度增殖。 也有人认为TBX2可以与Myc、Ras等癌基因发挥相互协同作用,促进肿瘤的发展;TBX2可能导致肿瘤细胞产生耐药性而维持肿瘤的生长。 在相关性分析中,c FLIP、TBX2的表达呈正相关,提示两者之间可能互相促进OSCC的发生发展,印证了肿瘤的发生发展是多个基因共同调控的结果;但是具体机制需要进行深入的研究。
组织抑制因子 篇7
关键词：脊柱炎,强直性/针灸疗法,基质金属蛋白酶3/针灸效应,基质金属蛋白酶组织抑制因子/针灸效应,长蛇灸,人类
强直性脊柱炎(AS)是一种以骶髂关节和中轴关节慢性炎症为主的、原因不明的自身免疫性疾病,以侵犯脊柱为主,早期表现为滑膜炎和韧带附着点的病变。滑膜炎典型表现为滑膜细胞肥大和滑膜增生,有明显的淋巴细胞和浆细胞浸润,附着点的病变过程是以关节囊、肌腱、韧带的骨附着点为中心的慢性炎症。这两种病理过程都是间质成分被水解蛋白酶消化的过程,在此过程中,基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)两个酶系统的作用尤为重要。近几年,笔者采用长蛇灸治疗强直性脊柱炎取得了较好的疗效,为了探讨其可能作用机理,观察了长蛇灸对AS患者血清MMP-3和TIMP-1水平的影响,现报道如下。
1 临床资料
1.1 一般资料
60例患者均来源于2008-05～2010-03本院门诊和住院病人,符合强直性脊柱炎诊断标准。按就诊顺序,查随机数字表,分为2组。治疗组30例,其中男26例,女4例;平均年龄(29.7±13.5)岁;平均病程(7.3±5.8)年。对照组30例,其中男27例,女3例;平均年龄(31.2±12.8)岁;平均病程(7.1±6.3)年。两组患者性别、年龄、病程、病情基本一致,经统计学处理,无显著差异(P>0.05),具有可比性。
1.2 诊断标准
参照1984年修订的纽约标准[1]。(1)临床标准:①下腰痛至少三个月,活动后可减轻,休息无缓解。②腰椎前屈、后伸、侧弯活动受限。③胸廓活动度较同年龄、同性别的正常人减少。(2)放射学标准:单侧骶髂关节炎≥3级或双侧骶髂关节炎≥2级。符合放射学标准和一项以上临床标准即可诊断。
1.3 纳入标准
(1)符合上述强直性脊柱炎诊断标准;(2)年龄在12岁以上的患者;(3)非妊娠或哺乳期妇女;(4)保证配合治疗,完成全部疗程的患者。
1.4 排除标准
(1)年龄在12岁以下的患者;(2)晚期脊柱强直或驼背固定,X线显示骶髂关节融合,脊柱呈竹节样改变的患者;(3)凡伴有发热,四肢关节红肿热痛,目赤肿痛或眩晕耳鸣,盗汗,手足心热的患者(即中医辨证分型为湿热痹阻证或肝肾不足证)不纳入治疗组;(4)精神病患者;(5)恶性肿瘤患者;(6)有结核或其他传染性疾病患者;(7)皮肤有严重破损或有皮肤过敏者或有严重皮肤病患者;(8)妊娠期或哺乳期女性患者;(9)未能按照实验计划完成治疗过程者。
2 方法
2.1 治疗用药
治疗组:采用长蛇灸治疗。操作方法:取大蒜(约500g)捣烂成泥及艾绒适量备用。患者俯卧,裸露背部,将脊柱及两侧皮肤(督脉及膀胱经)常规消毒后,在督脉大椎穴至腰俞穴涂上蒜汁,铺敷7cm宽、1.25cm厚的蒜泥,再将斑蝥粉3g、白芍粉10g、川乌粉10g、细辛粉10g沿督脉铺于蒜泥之上,然后铺长蛇形艾绒1条(约1cm宽、1cm厚),点燃头、身、尾3点,让其自行燃烧。燃烧过程中以患者有烧灼感为度,根据燃尽情况中间可适当添加艾绒。每次铺灸30分钟;灸毕,移去蒜泥与艾绒,用湿纱布轻轻将皮肤揩干;灸后局部皮肤出现微红灼热,属正常现象,无需处理;如局部出现水泡,可用消毒针刺破水泡放出渗液,并用药棉揩干,再涂以烫伤油,并以纱布包敷。隔日换药1次,直到结痂脱落;每周治疗1次,6次为1疗程,连续治疗两个疗程。对照组:采用西药口服治疗。口服柳氮磺胺吡啶(武汉同兴科技有限公司),1g/次,每日2次,严重者,配合非甾体抗炎药口服,连续用药3个月。
2.2 观测指标与检测方法
分别于治疗前和治疗后取空腹静脉血4ml,分离血清,置于-75℃保存待测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行MMP-3与TIMP1的检测。
2.3 统计学处理
实验检测数据用undefined表示,采用SPSS 17.0进行t检验。
3 结果 见表1。
与治疗前比较*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较△P<0.05,△△P<0.01
4 讨论
MMPs是一组可降解细胞外基质的锌依赖性内肽酶,根据底物的不同,MMPs主要分胶原酶、基质溶解酶、明胶酶和膜型基质金属蛋白酶。MMP-3属于基质溶解酶,是对基质起广泛作用的一种蛋白酶,MMP-3由成纤维细胞、滑膜细胞和软骨细胞分泌,被认为是导致软骨降解的最重要的蛋白酶[2]。有资料表明[3],AS患者血清中MMP-3水平与其自身疾病活动性存在一定程度的相关性,可作为评估AS病情活动的另一个客观指标。金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是组织中MMP活性的抑制分子,分为两个功能区,其N端功能区的半胱氨酸残基与MMP的锌离子活性中心结合,其C端功能区与MMP的其他部位结合,形成MMP-TIMP复合体,从而阻断MMP与底物结合,抑制MMP的活性。TIMP-1由巨噬细胞和结缔组织细胞产生,广泛存在于组织和体液中,能被多种细胞因子诱导产生,TIMP-1主要结合抑制活化的MMP-9和MMP-3。
长蛇灸是在督脉的脊柱段上施以艾灸的一种传统的中医外治法,集督脉、艾灸、中药、蒜泥的治疗作用于一体,发挥温肾壮骨、补精益髓、温通经络、活血化瘀等功效,其对缓解AS有显著疗效[4,5]。斑蝥粉药性温热,芳香走窜,通过热力能使药物直达病所,并有破血消癥、攻毒蚀疮、引赤发泡之功;白芍可以养血敛阴、柔肝止痛、平抑肝阳;川乌祛风除湿、温经止痛;细辛解表散寒、祛风止痛;艾灸温经通络、行气活血、补虚壮阳。现代药理研究表明[6],白芍、细辛、艾灸有调节免疫作用,且白芍、细辛、川乌还有抗炎作用。
本研究结果表明,长蛇灸能降低AS患者血清MMP-3水平,升高TIMP-1水平,调节MMP/TIMP平衡,减少致炎因子的释放,调整异常的基质降解和减少血管形成等炎症的病理因素,缓解AS炎症、减少软骨和骨质破坏,降低致残率,提高患者的生活质量。
参考文献
[1]张乃峥.临床风湿病学.上海:上海科学技术出版社,1999:165.
[2]Xie DL,Hui F,Meyers R.Cartilage chondrolysis by fibronectin fragments is associated with several proteinases;stromelysin plays a major role in chondrolysis.Arch Biochem Biophys,1994,311:205.
[3]申明.基质金属蛋白酶与强直性脊柱炎.临床医药实践杂志,2006,15(11):805.
[4]曾庆利,陈春明,李胜利.华佗夹脊辅以督脉敷灸治疗强直性脊柱炎32例疗效观察.四川中医,2006,24(12):98.
[5]吴建军,戚玲娟.走罐加针灸治疗强直性脊柱炎18例.中国中医药科技,2009,16(3):219.
组织抑制因子 篇8
关键词：p53凋亡刺激蛋白抑制因子,SW480,增殖,结直肠癌
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一类常见的消化道恶性肿瘤,2012年全世界新发结直肠癌病例约136万,死亡人数约69万人[1]。其发生由遗传和环境等诸多因素相互作用所致,涉及多基因、多阶段的复杂过程,而其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是发生的重要原因[2,3],癌基因与抑癌基因的相互调控也成为癌症研究的重要方向之一。
p53是人类肿瘤相关性很高的抑癌基因[4],在多种肿瘤已被证实与肿瘤发生相关。p53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of p53,ASPP)家族被发现参与p53的调节过程,包括ASPP1、ASPP2和i ASPP。p53凋亡刺激蛋白抑制因子(inhibitory member of the ASPP family,i ASPP)是ASPP家族的最新成员,且在进化上非常保守[5]。ASPP1和ASPP2能与p53结合并增强p53与促凋亡基因启动子的结合,促进凋亡的发生,是p53的激活子;而i ASPP是p53的抑制基因,能够和ASPP1或ASPP2竞争性地与p53蛋白结合,抑制p53的功能,从而导致肿瘤的发生[6]。p53作为抑癌基因,i ASPP作为p53的重要调节基因,在多种癌症中发挥原癌基因的功能,i ASPP的异常表达与肿瘤发生有着密切的关系。目前国内外对iASPP的研究主要见于乳腺癌、肺癌及白血病等,在结直肠癌中研究尚少。本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测i ASPP在结直肠癌中的表达情况,检测沉默i ASPP对SW480结直肠癌细胞系细胞增殖的影响,以期探讨i ASPP在结直肠癌中的重要意义。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂人结直肠癌细胞Lo Vo、SW620和SW480细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,正常人结肠上皮细胞(HCo Epi C)购自Scien Cell公司。DMEM、RPMI细胞1640培养液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均购自Gibco公司。鼠源抗i ASPP单克隆抗体以及β-actin内参抗体购自Abcam公司。i ASPP si RNA及Con-si RNA购自Bio Systems公司。细胞转染试剂Lipo-2000购自Life Technology公司。
1.1.2组织标本收集选取2013年1月‐2013年12月中南大学湘雅医院肿瘤科收治的结直肠癌患者标本24例,所有患者取标本前均未进行放疗及化疗。收取行手术切除术的新鲜结直肠癌组织及其配对的癌旁组织,于手术后0.5~1.0 h内迅速将组织冻存于液氮中。所有病例标本的获得均获医院伦理委员会批准。
1.1.3主要仪器实时荧光定量PCR(RT-q PCR)仪为美国Bio-Rad公司产品;电泳装置,标准湿式转膜装置为Bio-Rad公司产品。其他常用试剂均为国产分析纯。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养人结直肠癌细胞系Lo Vo、SW620和SW480在含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640细胞培养液中培养,正常人结肠上皮细胞(HCo Epi C)在含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM细胞培养液中培养。上述细胞均置于37℃、5%二氧化碳(CO2)、饱和湿度培养箱内常规传代培养。实验用细胞均为对数生长期细胞。
1.2.2 i ASPP基因si RNA转染人结肠癌细胞SW480以每孔2×105个细胞接种于细胞6孔板,待细胞长满至70%~80%时,更换无血清培养基,使用Lipo-2000将i ASPP-si RNA转染细胞。制备终浓度为80 nmol/L的si RNA-脂质体复合物,共分3组:空白对照组,SW480细胞加Lipo-2000;Con-si RNA组,SW480细胞转染si RNA无义序列;i ASPP-si RNA组,SW480细胞转染i ASPP-si RNA。转染12 h后换液,加入含抗生素(青霉素、链霉素)的完全培养基,转染48 h后收取细胞进行后续检测。
1.2.3 RT-q PCR检测研钵加入液氮预冷,取约50 mg的术后新鲜组织块置于研钵中研磨,直至成粉末状,加入1 ml Trizol试剂,按操作说明分别抽提组织总RNA,测定RNA浓度。转染后的细胞,收取一个6孔板的细胞,约1×106个细胞。取50μg总RNA进行反转录反应合成c DNA,然后以c DNA为模板、GAPDH作为内参对照,进行RT-PCR反应。扩增的反应条件为:94℃1 min预变性;94℃40 s,60℃20 s,40个循环,72℃6 min。i ASPP的上下游引物序列分别为:5'-ATCAGATCCCGTCCAAAGTG-3'和5'-C C C A G G A A T A T C C A G T G G T G-3';GAPDH的上下游引物序列分别为:5'-C C A T C A A T G A C C C C T T C A T T G-3'和5'-GACGGTGCCATGGAATTT-3',实验重复3次。反应结束后,使用BIO-RAD real-time PCR仪自带软件分析PCR过程中样本的Ct(threshold cycle)值,采用2-△△Ct计算目的基因相对反应起始拷贝数。
1.2.4 Western blot检测候选靶基因i ASPP蛋白表达水平提取各组全细胞蛋白质,Bradford法测定蛋白质含量。按每孔10μg上样,并向两个空白泳道中各加入10μL Marker,常规SDS-PAGE电泳。电泳完成后以半干式电泳转移法将蛋白条带转移到聚偏二乙烯膜(PVDF)上。电转完成后取出PVDF膜,5%牛血清蛋白(BSA)4℃封闭过夜。弃去BSA封闭液,在其上加入相应的一抗,β-actin作为内参与PVDF膜在室温共孵育2 h。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后再分别用结合辣根过氧化物酶的二抗孵育。增强化学发光法(ECL)进行显色,X光胶片上曝光,定影、显影后进行扫描。Image J图像分析系统对蛋白条带的光密度进行灰度分析。
1.2.5 MTT检测细胞生长曲线收集各组处于对数生长期的结直肠癌SW480细胞,把细胞悬液浓度调节为1×105个/ml。将100μl(含1×104个细胞)的细胞悬液种入每孔中,每组设5个复孔,种5块96孔板。置于37℃,5%CO2培养箱孵育,把种板时间作为起始时间点0 h,在0 h取出一块96孔细胞培养板,每孔加入10μl 0.5%MTT溶液,继续培养4 h。1 000 rpm/min离心10 min,小心吸掉孔内上清液,每孔均加入100μl二甲基亚砜(DMSO),将96孔板置摇床上,低速振荡10 min,充分溶解结晶物。在酶联免疫检测仪上波长490 nm处分别测量各孔的吸光度(A)。同时设置调零孔(MTT、培养基、二甲基亚砜),细胞活力共检测5 d。
1.2.6 Brd U检测细胞增殖能力细胞以2×103个/ml细胞数接种于96孔板中,培养1 d,用含0.4%FCS培养液同步化2 d,使绝大多数细胞处于G0期。终止细胞培养前,加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)(终浓度为10μmol/L),37℃,孵育24 h。去除培养基,细胞被固定30 min,过氧化物酶孵育耦合抗Brd U抗体(Sigma-Aldrich公司)孵育60 min,用PBS洗3次,加过氧化物酶底物(四甲基联苯胺)染色30 min,在450 nm处测定各组的OD值。
1.3统计学方法
2结果
2.1结直肠癌组织中i ASPP m RNA及蛋白表达差异
本研究分别在临床结直肠癌样本中和结直肠癌细胞系中检测了i ASPP m RNA水平和蛋白水平的表达差异。对24例结直肠癌组织及配对癌旁组织样本进行检测后发现,癌组织中i ASPP m RNA表达水平相对癌旁组织明显上调,癌组织m RNA相对表达量是正常组的1.848倍(P=0.009),差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。
与正常细胞HCo Epi C相比,3种结直肠癌细胞系Lo Vo、SW620和SW480中i ASPP m RNA水平和蛋白水平表达见表1,m RNA水平分别是正常细胞组的2.339倍(P=0.000)、1.945倍(P=0.003)和2.136倍(P=0.001),蛋白水平分别是正常细胞组的1.452倍(P=0.000)、1.837倍(P=0.003)、1.726倍(P=0.001),差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。
2.2转染i ASPP-si RNA对i ASPP表达水平的影响
为观察i ASPP-si RNA转染SW480细胞后对SW480细胞中i ASPP表达影响,本研究分别用RT-q PCR和Western blot法在m RNA和蛋白水平检测i ASPP表达变化。结果显示,转染i ASPP-si RNA后(i ASPP干扰组)i ASPP m RNA和蛋白表达降低,分别可下调76.7%和45.6%,转染无义si RNA(转染对照)相对于未转染组(未进行转染)i ASPP m RNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2和图3。
2.3沉默i ASPP抑制SW480细胞增殖
与上述同样的分组,MTT和Brd U法检测结果如下所示,转染i ASPP-si RNA后,从细胞生长曲线可以观察到,沉默i ASPP可明显抑制SW480细胞的生长。见表3和图4A。而Brd U结果显示,沉默i ASPP可显著抑制细胞DNA合成。见表4和图4B。说明干扰i ASPP可抑制结直肠癌SW480细胞的增殖。
3讨论
结直肠癌在全球近45%发生在亚洲,寻找有效的早期筛查和治疗靶点成为一项紧迫的任务[7]。其中,ASPP家族因为其具有调节p53及其家庭成员的功能而进了研究者的视线[8,9]。ASPP家族包括3个成员,ASPP1、ASPP2和i ASPP。。p53通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞可抑制肿瘤的生长,研究表明ASPP1和ASPP2激活p53;i ASPP是ASPP家族进化上最为保守的成员,可竞争性结合p53从而抑制p53的功能。近年来i ASPP被发现在肝癌[10]、子宫内膜癌[11]、非小细胞肺癌[12]、前列腺癌[13]及卵巢癌[14]等多种实体肿瘤中高表达,与肿瘤的发病过程密切相关。因此i ASPP对于确定细胞如何选择死亡是肿瘤治疗的潜在新靶点之一。
本研究中,笔者通过RT-q PCR对临床样本的i ASPP m RNA水平进行检测,发现其配对癌旁组织样本与癌组织样本中相比,表达明显提高,差异显著。此外,3种不同的结直肠癌细胞系和正常结肠上皮细胞(HCo Epi C)相比较,通过RT-q PCR和Western blot分别检测i ASPP m RNA水平和蛋白水平,结果显示i ASPP的表达呈现不同程度的升高。Lu等[10]研究发现,i ASPP在肝癌中表达上调,其表达增加与癌症患者的复发时间和存活周期显著相关。Liu等[11]通过免疫组化(Immunohistochemistry)的方法,检测子宫内膜腺癌标本中i ASPP表达水平,发现i ASPP的高表达与患者年龄、侵袭和淋巴结转移密切相关。在黑色素瘤中,HEDGEHOG调控GLI-E2F1直接结合到i ASPP的启动子来调节肿瘤细胞的增殖。这些都提示i ASPP在肿瘤发展中发挥着重要作用[12]。
本研究进一步通过运用si RNA的方法对SW480细胞中i ASPP进行干扰,干扰效率用RT-q PCR和Western blot进行验证,之后用MTT法和Brd U法检测肿瘤细胞的增殖能力。干扰效率分别在m RNA和蛋白水平进行了验证,干扰效率分别达到75%和45%以上,表明对SW480细胞的i ASPP表达能进行有效的瞬时敲减。MTT又名噻唑蓝,活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为水溶性的蓝紫色结晶甲瓒,并沉积在细胞中,而死细胞无此功能,以此检测细胞相对数和相对活力。Brd U(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶的衍生物,可替代胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞新合成的DNA中,随着DNA复制进入子细胞中,Brd U特异性抗体可以用于检测Brd U的掺入,从而判断细胞的增殖和DNA合成能力。
i ASPP-si RNA转染SW4880细胞后,MTT结果显示,1 d(24 h)和2 d(48 h)后各组间细胞活力差异不显著,随着时间的延长,i ASPP干扰组相较于未转染组和转染对照组差异越来越明显,细胞增殖活力下降。而未转染组和转染对照组在各时间点均无差异。Brd U结果显示,DNA合成能力在转染48 h后即存在差异,随着时间延伸,DNA合成能力差异愈明显。细胞的增殖活力提升首先体现在DNA合成增加,细胞分裂和细胞相对数随之不断增加,推测是本实验中MTT和Brd U结果之间存在差异性的原因。i ASPP被认为通过调控肿瘤的增殖、抑制细胞的凋亡及调控侵袭转移等多种途径实现的。Jiang等[14]运用免疫组化、RT-PCR、免疫印迹检测i ASPP与临床卵巢癌的相关性,证实i ASPP的高表达与DNA合成呈正相关,Cyclin B1/CDK1复合物参与了i ASPP的调节过程,i ASPP的过表达增强了卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药性,i ASPP可作为卵巢癌的潜在预后标志物和治疗靶点。Lu等[15]在人黑色素瘤研究发现,Cyclin B1/CDK1促使i ASPP发生磷酸化,抑制i ASPP的二聚体化,从而使i ASPP以单体的形式进入核内,与p53发生结合,抑制p53的功能,发挥原癌基因的作用。