视网膜神经

视网膜神经（精选七篇）

视网膜神经 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取出生46 d的SD大鼠 (中山大学实验动物中心提供) 36只, 雌雄不拘。全部饲养于标准鼠笼中, 维持12 h白昼, 12 h夜晚时间周期。

1.2 视神经钳夹伤建模方法

以1%戊巴比妥钠 (30 mg/kg) 腹腔注射麻醉大鼠, 按Nakazawa等[7]的方法暴露视神经;剪开外眦角, 沿角膜缘外1 mm剪开球结膜, 向后钝性分离暴露视神经。用头部宽1 mm, 长18 mm的微血管止血钳 (上海医疗器械有限公司) 夹持10 s, 直接检眼镜观察视网膜, 视网膜无缺血性改变者为成功模型;缝合球结膜和外眦角, 涂金霉素眼膏。术中注意尽可能钝性分离球后筋膜组织并避开血管, 减少对眼球血液供应的影响, 同时注意原位操作, 尽可能减少对视神经的牵拉。

1.3 处理方法

A组 (正常对照组) 不经任何处理;B组 (模型组) 、C组 (GB治疗组) 大鼠暴露并钳夹视神经;B组实验前1周每日腹腔注射NS, 容积参照GB的剂量 (40 mg/kg) , 造模后继续腹腔注射NS直至处死。C组实验前1周腹腔注射GB 40 mg/kg (广州市药检所提供) , 于造模后继续腹腔注射1周直至处死。三组分别在术后1周, F-VEP检查后随机处死大鼠行HE染色光镜检查, 每组各4只, 其余2周后作RGCs计数。

1.4 闪光视觉诱发电位 (F-VEP)

每组随机抽取8只大鼠, 采用BIO-2000型视觉电生理检查系统 (重庆贝澳电子仪器有限公司) 检查闪光视觉诱发电位 (flash visual evoked potentials, F-VEP) 。检查时关闭照明, 暗适应10 min后, 进行双眼F-VEP采集。背景参数:Ganzfeld闪光刺激器, 光强为10 db, 刺激频率为1.9 Hz单闪刺激模式, 波形叠加80次, 阈值设定为50 m V。主要观察AP1 (N1-P1振幅) 和LP1 (P1波潜伏期) , 振幅的大小以微伏 (μV) 为单位, 潜伏期以毫秒 (ms) 为单位, Nl谷底至Pl顶峰为Nl-Pl的振幅值 (AP1) , 起始至P1顶峰的时间为P1峰潜伏期 (LP1) 。实验数据为3次测量的平均值。

1.5 组织切片制作及RGCs计数

三组分别在造模后1周, F-VEP检查后随机处死大鼠, A、B、C组各4只。造模后2周, 处死所有大鼠。在角膜缘12:00位缝线作标记并摘取眼球。立体解剖显微镜下去除眼前节和晶状体后放入4%多聚甲醛溶液中固定过夜, 沿纵轴将眼球两边开窗, 组织脱水后行石蜡包埋, 选取包含视神经的纵切面, 沿12:00-6:00经线并沿视神经中央对剖开眼球, 连续切片 (切片厚度4μm) , 行苏木精-伊红 (HE) 染色。400倍放大倍率的视野显微镜下, 从12:00-6:00锯齿缘 (经视盘中央) , 计数整个经线上的RGCs, 取其平均值。

1.6 统计学处理

利用统计学软件SAS 6.12对数据进行处理, 计量资料采用 (±s) 表示, 多组间比较行方差分析, 两两比较行t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组光学显微镜观察结果

A组HE:神经纤维层较厚, RGCs呈立方形, 排列紧密, 胞浆丰富, 胞核饱满且染色较均匀, 神经胶质细胞较少 (图1、2) ;B组HE:神经纤维层极薄, RGCs稀少, 同时神经胶质细胞明显增多 (图3、4) ;C组HE:RGCs胞体大小正常, 数目较正常略少, 视神经损伤后2周, 神经纤维层轻度变薄 (图5、6) 。

2.2 三组RGCs数的比较

视神经损伤2周, 垂直经线上RGCs计数结果为A组 (281±39) 个, B组 (112±20) 个, C组 (228±35) 个, A、B、C三组间比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.3 三组视神经损伤后1周和2周时的F-VEP比较

视神经损伤后1周, B组较A、C组LPl波延长、AP1降低 (P<0.05) , C组与A组LP1、AP1比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。视神经损伤后2周, B组的LPl较前1周进一步延长, AP1进一步降低, A、B、C三组LPl、AP1比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。见表1、图7。

*与A组比较, P<0.05;△与B组比较, P<0.05

注:左侧为损伤后1周, 右侧为损伤后2周;上、中、下依次为A、B、C组

3 讨论

视神经钳夹伤后, RGCs经历机械性损伤的快速死亡阶段, 剩余存活RGCs发生类似于青光眼视神经病变的慢性损伤过程[8,9]。Dezawa等[10]研究认为视神经损伤后RGCs退化的快与慢, 存活时间的长与短, 和RGCs轴突的再生潜力有直接的关系, 存活时间越长, 其再生潜力越大。视神经损伤后, 若能够采取积极有效的治疗措施减少和延缓RGCs在细胞快速丧失期的退变, 就可能会明显提高视神经功能的恢复[11,12]。

术后1周和术后2周的大鼠视网膜组织HE染色切片, 光学显微镜下观察可见:正常对照组神经纤维层较厚, RGCs呈立方形, 排列紧密, 胞浆丰富, 胞核饱满且染色较均匀, 神经胶质细胞较少;模型组神经纤维层变得极薄, RGCs胞体减小, 数目稀少, 同时神经胶质细胞明显增多;GB治疗组术后1周, 神经纤维层厚度基本正常, RGCs胞体大小正常, 数目较正常略少, 术后2周, 神经纤维层轻度变薄。模型组视神经钳夹伤后, RGCs形态和数量均明显受损。而GB治疗组与模型组比较, RGCs胞体大小正常, 数目仅轻度减少。应用术后2周的大鼠视网膜组织HE染色切片, 400倍的光学显微镜下直接计数各组大鼠视网膜整个垂直经线上 (12:00-6:00) 经视盘中央的RGCs数目:正常对照组 (281±39) 个, 模型组 (112±20) 个, GB治疗组 (228±35) 个。模型组RGCs数目较正常组明显减少, 而GB治疗组RGCs数目明显优于模型组。以上研究结果初步证明GB能改善视神经钳夹伤后RGCs存活数量和时间。

F-VEP是以闪光刺激视网膜在大脑枕叶皮层而诱发的一组电信号, 反映视觉信息在视路中传导的总体情况, 是客观评价视功能的重要参考指标[13]。主要观察指标为主波的潜伏期及幅值, 潜伏期的长短反应髓鞘的器质完整性和功能状态, 振幅的高低反应轴索的功能状态[14]。正常视神经纤维在筛板后有髓鞘, 其神经冲动的传导为跳跃式;视神经损伤时, 髓鞘变性脱落, 潜伏期延迟且振幅降低[15]。

本研究F-VEP的测定中采用全视野单闪刺激模式, 刺激的强度和频率易于控制。结果显示, 视神经损伤后1周, A、B、C三组的Pl波的潜伏期和振幅分别为[ (90±4) ms, (19±3) μV]、[ (110±6) ms, (11±3) μV]和[ (94±4) ms, (18±2) μV];视神经损伤后2周, A、B、C三组的Pl波的潜伏期和振幅分别为[ (92±11) ms, (21±3) μV]、[ (186±15) ms, (7±2) μV]和[ (104±12) ms, (14±3) μV]。证明GB能有效缓解视神经钳夹伤后引起的大鼠视功能的损伤。F-VEP结果与各组大鼠视网膜形态学改变相符合, 说明腹腔注射银杏内酯B能部分抑制大鼠视神经钳夹后RGCs凋亡, 具有一定的RGCs保护作用, 并能部分缓解视功能的损伤。有关GB对RGCs功能的保护作用及机制将进一步深入研究。

摘要：目的:探讨银杏内酯B对视神经钳夹伤后大鼠视网膜神经节细胞 (RGCs) 的保护作用。方法:取出生后42 d的SD大鼠36只, 随机抽取12只为A组 (正常对照组) ;24只分离暴露视神经并进行视神经钳夹后随机分为B组 (模型组) 和C组 (GB治疗组) , 每组12只。每只鼠的右眼用于实验。A组不作任何处理, B、C组分别于实验前1周每日腹腔注射相应体积生理盐水和银杏内酯B (GB) 40 mg/kg, 术后继续给药1周, 术后1、2周分别行闪光视觉诱发电位和HE染色光镜检查, 并计数术后2周视网膜垂直经线RGCs数。结果:术后1周, A、B、C三组的LPl和APl分别为[ (90±4) ms, (19±3) μV]、[ (110±6) ms, (11±3) μV]和[ (94±4) ms, (18±2) μV], B组与A、C组比较差异有统计学意义 (P<0.05) ;术后2 w, A、B、C三组的LPl和APl分别为[ (92±11) ms, (21±3) μV]、[ (186±15) ms, (7±2) μV]和[ (104±12) ms, (14±3) μV], RGCs数目分别为 (281±39) 个、 (112±20) 个、 (228±35) 个, 各指标A、B、C三组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:银杏内酯B能抑制部分大鼠视神经钳夹后RGCs凋亡, 具有一定的视神经保护作用。

视网膜神经 篇2

1 临床资料与方法

1.1 一般资料

选择1993年1月-2003年1月，我院门诊通过询问家族史，检查视力、视野、散瞳查眼底及荧光素眼底血管造影及视觉诱发电位，确诊20例40只眼，其20例视网膜色素变性患者均为中、晚期重症患者。男15例，女5例，年龄最小43岁，最大68岁，平均年龄61岁，均为双眼。

1.2 诊断依据及检查方法

1.2.1 家族史

14例患者有家族史，其家族兄弟姐妹中约2/3发病病例有进行性夜盲和视野缺损。婚姻史：20例患者中均无近亲结婚史。发病年龄均起于儿童及少年期，绝大多数在30岁以前发病，而后逐渐加重。

1.2.2 视力

20例患者均为0.3以下，视野呈管状15°～20°。荧光素视网膜血管造影：20例患者均表现为主要是视网膜色素上皮的功能异常，色素斑块遮挡荧光，色素脱失处出现窗样缺损，屏障代偿处渗漏等，其晚期病例显示脉络膜血管萎缩。暗适应：20例患者均有不同程度的杆体细胞功能明显严重下降，晚期杆体功能丧失，而锥体曲线阈值也升高，形成高位单相曲线，最终暗适应曲线变为平直。色觉：18例患者均出现了色觉缺陷，最典型者为蓝色者，2例出现了红绿色盲。ERG：其改变为潜伏期延长或振幅进行性降低直至熄灭。眼底表现：视神经盘颜色蜡黄，视网膜血管狭窄和骨细胞样色素散布，最典型的是视网膜上皮脱色素萎缩，视网膜呈青灰色。同时合并其他眼部改变，20例中有16例后囊下后极部皮质浑浊，4例合并近视等。治疗标准：显效：术后35 d视力增进0.1～0.15;有效：视力增进0.1～0.12+1;无效：患者自感视物清晰度好，但视力检查未增进。

1.3 治疗方法

均采用入院术前1周的药物治疗，静脉点滴： (1) 10%葡萄糖注射液200 ml联合复方丹参注射液20 ml。 (2) 10%葡萄糖注射液200 ml联合辅酶A注射剂200 U，三磷酸腺苷注射液40 mg，维生素B6注射液100 mg，胞二磷胆碱注射液0.75 g。肌肉注射盐酸山莨菪碱注射液10 mg，术前2 d用抗生素眼水点眼麻醉球后和下穹隆结膜麻醉。手术步骤： (1) 切开结膜于下方角膜缘下5 mm～7 mm处平行角膜缘切开球结膜约8 mm。 (2) 暴露下直肌，首先于下直肌止端下方伸入一斜视钩或用3-0号丝线由直肌下穿过，向上牵引在下直肌和眼球筋膜间进行分离，然后在其两侧边缘向后剪开眼球筋膜，充分暴露下直肌，用小剪在下直肌肌腹和眼球间向后分离直肌，直到斜视钩能无阻地触到视神经为止。 (3) 按摩视神经：左手提起下直肌止端牵引线，右手持斜视钩紧贴眼球壁伸入球后触及视神经，在视神经的左、右两侧做按摩，每侧按摩30～60次，其方法是将斜视钩沿视神经前后移动，其范围8 mm～10 mm，按摩时左手牵引直肌止端的缝线应随着斜视钩按同一方向活动。 (4) 埋线：将1号铬制肠线剪成10 mm长线段，将其经下直肌两侧用针头(磨短的腰穿针头)送入球后，每侧4～5根，共8～10根。

2 结果

18例显效，2例有效，疗程12 d～40 d，平均27 d，其中2例患者因年龄较大、时间较长，病情发展至晚期，通过3个月的口服曲克芦丁片、烟酸片、地巴唑和维生素C片，配合盐酸山莨菪碱10 mg肌肉注射，有效改善视网膜血液循环，1 d 2次，视力提高一排一个视标外，其余18例患者视力提高在两排以上。20例患者术后除2例有轻度头痛给抗炎止痛药口服，症状消失，余未出现不良反应，随访观察时间为30个月～36个月，平均32个月，20例患者均未见病情复发。

3 讨论

视网膜色素变性分为： (1) 常染色体隐性遗传; (2) 常染色体显性遗传; (3) 性连锁隐性遗传。其中常染色体隐性遗传中同胞姐妹中多于一人患病，年轻时就出现视力下降和夜盲。而常染色体显性遗传至少2～3代直接垂直遗传，发病缓慢，成年后出现典型的表现，白内障合并症发生较晚。性连锁隐性遗传其独有男性受累，男性患者通过其女儿遗传，约50%男性后代受累，10岁以内幼年时发病，病变明显，进展快，至40岁左右视力已降至0.1以下，甚至失明，其女性携带者常常有椒盐状眼底。

视网膜色素变性是一组以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性视网膜变性疾病[1]，从目前资料显示发病率为1/3 000～1/5 000，全世界约有150万人视网膜色素变性，不仅生理功能阙如或严重异常，而且最终可在晚年视功能完全丧失，尽管世界各国都做了大量治疗尝试，但最终不尽满意。我科针对病例及适应证选择20例视网膜色素变性施行视神经按摩及球后埋线，不但有效改善了眼底视网膜循环，而且通过远期效果观察其杆体细胞、锥体细胞功能也有不同程度提高，尤其是暗适应(代表杆体功能敏感指标)也有所好转，使患者的生活质量有了不同程度提高，同时也增强了患者战胜疾病的信心。目前我科只选择了20例视网膜色素变性患者进行了手术治疗，未见1例出现严重的并发症，这不能说明无并发症，只能说明初期开展此手术较谨慎和开展的例数较少，今后有待进一步总结、完善、观察。

摘要：目的探讨视神经按摩术联合1号铬制肠线球后埋藏对原发性视网膜色素变性的远期视力视野治疗效果。方法20例40只眼均为原发性视网膜色素变性病例, 术中均采用了视神经按摩术, 1号铬制肠线球后埋藏及术后应用能量制剂、血管扩张剂和促进吸收药物, 参与细胞代谢药物联合应用治疗。结果20例40只眼视力及视野均有不同程度的提高及扩大, 而且半年以后视力、视野、眼压连续随访观察, 效果较满意。结论视神经按摩术及1号铬制肠线球后埋藏其手术方法简单, 无不良反应, 相对安全, 视功能恢复比较满意。

关键词：视网膜色素变性,视神经按摩术,铬制肠线埋藏,疗效

参考文献

视网膜神经 篇3

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康新西兰大白兔40只，体重2.5～3Kg，雌雄不限。采用电凝器电凝兔双眼巩膜表面至少三组静脉以及角膜缘周围血管建立慢性高眼压模型,以眼压升高>22mmHg,并能持续1周为诱发慢性高眼压成功[4]。选取造模成功的24只（48眼）兔慢性高眼压眼，随机分为4组慢性高眼压模型组，每组6只兔（12眼），分别观察7、14、21、28d。另取正常兔6只（12眼）只剪开其球结膜作为假手术对照组（简称对照组）。

1.2 慢性高眼压动物模型的建立

速眠新0.1ml/kg兔耳缘静脉注射行全身麻醉，沿角膜缘剪开球结膜270°,分离并暴露巩膜表面静脉,电凝器电凝双眼巩膜表面至少三组静脉以及角膜缘周围血管,高频电凝功率为20～50mw,时间为5s，直至血管组织发白,血流阻断。对照组只剪开球结膜，未进行巩膜表面静脉以及角膜缘周围血管电凝。兔双眼眼压测量使用schiotz眼压计,根据造模成功标准排除术后眼压升高不理想个体。

1.3 组织取材与切片

动物到达存活时间点后，用速眠新注射液(0.3～0.8ml/kg)肌肉注射麻醉动物后，迅速摘除眼球，立即置于PFA液中固定(固定12小时后剪开角膜去除晶状体和玻璃体继续固定12小时)。取视乳头正下方(6点位)1㎜处4㎜×6㎜大小的视网膜组织，用伊红标记取好的视网膜组织的近视乳头侧。冲洗后梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡定位包埋。将包埋好的视网膜标本沿近视乳头侧向远视乳头侧连续切片，片厚4µm，每一标本切片5～8张。

1.4 免疫组织化学染色

本实验采用免疫组织化学染色—辣根过氧化物酶–链酶卵白素（Streptavidin/Peroxidase,S-P）法，具体步骤如下：(1)切片常规脱蜡至水；(2)新鲜配制3%H2O2室温下封闭30min；(3)抗原修复；(4)封闭液封闭，37℃孵育30min；(5)滴加适当比例稀释的一抗（兔抗人CNTF多克隆抗体，兔抗人CNTFRα多克隆抗体），4℃冰箱内过夜，同种标本以PBS液代替一抗作阴性对照；(6)滴加生物素标记的二抗，37℃孵育1h；(7)滴加辣根酶标记的链霉卵白素(HRP—SP)，37℃孵育30min；(8)DAB显色10min；(9)苏木素复染；(10)梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

切片通过与电脑相连的Biosens DigitalImaging systemV1.6高清晰度彩色病理图文分析系统做细胞CNTF及CNTFRα蛋白表达的半定量分析。40×10倍显微镜下每张切片随机选取5个视野，以胞浆出现棕褐色颗粒为阳性判定标准，以平均积分光密度值(IOD)表示CNTF及CNTFRα表达的相对强度。

1.5 统计学分析

实验所得计量资料用均数±标准差表示。采用SPSS13.0软件包进统计分析。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用配对t检验。取α=0.05为检验水准，P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

CNTF及CNTFRα的免疫组织化学染色结果（见图1、2）。

在对照组中，CNTF与CNTFRα主要存在RGCs层，在其它各层CNTF与CNTFRα呈散在颗粒状分布。慢性高眼压损伤后，在视网膜的外核层、外网状层、内核层、内网状层和节细胞层CNTF及CNTFRα表达均显著增加，并呈弥漫性分布。在造模后7、14、21d与对照组比较相差非常显著(P<0.01)，在造模后第7d,CNTF及CNTFRα表达最高，在造模后28d仍显著高于对照组(P<0.05)（见表1、2）。

注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

青光眼是一种常见的致盲性眼病，其视神经损害的病理基础是视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cell,RGCs)及其神经纤维的丧失。多种视神经损伤模型的实验研究均报道视神经损伤后视网膜中CNTF表达增强[5]。我们用免疫组织化学方法检测的结果显示，在对照组中RGCs层有大量的CNTF及CNTFR存在，在其它各层也存在散在颗粒状分布的CNTF及CNTFR。慢性高眼压损伤后，CNTF及CNTFR在视网膜外核层、外网状层、内核层、内网状层和节细胞层表达显著增加，并呈弥漫性分布，CNTF及CNTFR分布区域相同。Valter等[6]2003年9月报道用免疫组织化学方法和用高分辨率的共聚焦显微镜观察发现在正常的和光损伤的大鼠视网膜中CNTFR主要分布在RGCs层，并且还发现在其它各层的CNTFR呈颗粒状散在分布，而且CNTF与CNTFR共区域分布，本实验中我们观察到了同样的结果。

有学者经研究认为光损害、视神经横切导致了Müller细胞的活化，并伴随CNTF分泌表达增加[7]。我们本次的实验结果显示慢性高眼压损伤导致了视网膜自身CNTF和CNTFR的表达增加，最高表达均在造模后第7d，这可能是Müller细胞活化的结果。视网膜通过CNTF和CNTFR表达增强以减轻神经元的变性过程，抑或促进其再生和修复，这可能是节细胞一种自我保护机制。虽然以往的报道显示CNTF能促进节细胞的存活和再生，但内源性的或外源性的CNTF均未能最终防止节细胞的最终死亡。本实验结果显示慢性高眼压损伤后虽然出现了CNTF及CNTFR的表达增高，但这种增高都未能保持持续的上升，至28d表达有所下降，这是否与微环境中存在神经生长抑制因子的表达有关？这些机制还有待进一步详细的研究。

参考文献

[1]Cui Qi,Lu Qiang,So KF,et al.CNTF,not other trophic factors,promotes axonal regeneration of axotomized retinal ganglion cells in adult Hamsters[J].Invest Ophthamol Vis Sci,1999,40:760-766.

[2]Davis S,Aldrich TH,et al.LIFRa and gpl30as heterodimerizing signal transducer of the tripartite CNTF receptor[J].Science,1993,260:1805-1808.

[3]Sendtner M,Krontzberg GM,Thoenen H.Ciliary neurotrophic factor prevents the degeneration of motor neurons after axotomy[J].Nature,1990,345:440-441.

[4]徐岩,陈祖基,宋洁贞.复方卡波姆诱发的兔高眼压模型与其它兔高眼压模型的比较研究[J].中华眼科杂志,2002,38(3):172-175.

[5]Honjo M,Tanibara H,Kido N,et al.Expression of ciliary neurotrophic factor activated by rtinal Müller cells in eyes with NMDA and kainic acid-induced neuronal death[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41:552-560.

[6]Valter K,Bisti S,Stone J.Location of CNTFRalpha on outer segments:evidence of the site of action of CNTF in rat retina[J].Brain Res.2003,985(2):169-75.

视网膜神经 篇4

1材料与方法

1.1 RGCs的纯化及接种培养

出生后1天的SD大鼠, 酒精溺死, 无菌取眼球, 含100U/ml青霉素、50μg/ml链霉素的冷D-hank’s液中冲洗3次, 放于冰浴培养皿中;于解剖显微镜下将视网膜完整的分离出, 置于无菌冷D-hank’s液中冲洗3次。

分离出的视网膜, 于超净台内加入适量的0.25%胰蛋白酶消化, 37℃胰酶消化15分钟;以含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、50μg/ml键霉素的DMEM/F12培养基进行中和, 经300目网过滤, 1200r/min离心5分钟。10%胎牛血清、100U/ml青霉素、50μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞;重悬细胞液内加入MAC387抗体 (稀释浓度为1:100) , 轻轻混匀;混匀细胞液置于羊抗鼠IgG包被的培养皿中, 37℃孵育45分钟, 每15分钟轻轻晃动;吸取非黏附细胞悬置于OX-7包被的培养皿中, 37℃孵育45分钟;轻轻吸掉未黏附的细胞悬液, PBS轻洗培养皿3次;用0.125%胰酶轻轻冲洗培养皿壁, 黏附于培养皿壁细胞脱落后, 含血清的DMEM/F12终止消化;1000r/min离心3分钟。无血清培养基重悬;将细胞悬液于相差显微镜下计数, 以1×105/ml细胞种植密度接种于包被好的6孔培养板中。

1.2 RGCs的免疫荧光鉴定

经纯化培养的第3天的RGCs, 用Thy-1.1单克隆抗体的免疫荧光细胞化学染色进行RGCs鉴定。共聚焦显微镜观察并照相。

1.3 含药血清制备

益气养阴活血中药复方 (由三七、黄芪等组成) :黑龙江中医药大学药学院制备提供。药物含药血清的制备参照文献[1]。

1.4 分组及给药

对照组:20%空白血清的DMEM液, 正常中药干预组:20%中药含药血清的DMEM液, 高糖组:20%空白血清的50mmol/L葡萄糖DMEM液, 高糖中药干预组:20%中药含药血清的50mmol/L葡萄糖DMEM液

1.5 细胞活性检测

CCK-8。RGCs的纯化同前;纯化的RGCs种植于96孔培养板内, 实验每孔加入100微升10000个细胞, 37℃孵育;细胞贴壁后, 对照组 (25mmol/L) 以无血清培养基培养, 高糖组 (55mmol/L) 以无血清培养基加入葡萄糖调整, 每24小时换液1次;于RGCs贴壁及培养24、48、72小时, 每孔100μl培养基加入10微升的CCK-8试剂;在细胞培养箱内继续孵育3小时, 用酶标仪检测, 450nm测定吸光度, 计算抑制率。抑制率= (1-高糖组吸光度值/正糖组吸光度值) ×100%。

1.6 统计学处理

所有数据均用SPSS13.0软件建立数据库, RGCs生长抑制率数据以 (平均值±标准差) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 多组间两两比较采用q检验。

2结果

2.1 纯化培养RGCs的镜下观察

Wistar大鼠的视网膜细胞悬液经纯化后, 接种于无血清的神经基质培养基24小时, 见细胞有突起长出, 细胞近似圆形;48小时可见细胞形态均一, 细胞逐渐延长并增粗, 相差显微镜下突起明显可见;72小时细胞体较大, 细胞突起较长, 突起的长度可达细胞体直径的数倍, 细胞间可见突起相互连接。

2.2 RGCs的抗Thy-1鉴定

用大鼠RGCs的特异标记物Thy-1.1的单克隆抗体标记培养48小时和72小时的RGCs, 共聚焦显微镜下72小时的RGCs间突起相互连接, 并可见突起存在分支;共聚焦放大图片可见, RGCs周边被抗Thy-1荧光染色的效果更加明显。

2.3 益气养阴活血中药血清对高糖条件下RGCs生长抑制率的影响

见表1。

与正常对照组、正常中药干预组比较*P<0.05, **P<0.01;与高糖组比较△P<0.05, △△P<0.01;与本组24h比较#P<0.05, ##P<0.01

3讨论

糖尿病视网膜病变 (DR) 包括视网膜微血管病变和视网膜神经病变。近几年的研究结果显示, 糖尿病患者的视网膜神经元和胶质细胞的功能损害常较微血管改变更早, 在视网膜各级神经元中, 视网膜神经节细胞 (RGCs) 是视网膜中唯一能投射轴突形成视神经纤维的神经元, 也是把视网膜视觉信息传递到视觉中枢的唯一传出神经元, 对视网膜功能有重要影响。早期Barber研究中报道, 糖尿病7个月后导致大鼠视网膜内膜厚度减少22%[2];随后的组织学方法研究也已经证实糖尿病患者视网膜组织的神经细胞层的厚度明显削减, RGCs数量减少, 揭示RGCs在糖尿病状态下出现死亡[3,4]。本实验通过体外培养纯化的RGCs, 并给予高糖干预, 也发现RGCs在高糖环境中生长受到抑制, 证实了高糖情况下存在着视网膜神经损害。因此, 加强对糖尿病视网膜神经保护和视网膜神经损伤的研究将有利于正确认识DR的本质, 并实现预防和逆转早期糖尿病视网膜神经病变, 进而达到防止DR的目的。

中医理论认为本病表现为虚实夹杂、本虚标实的证候特征, 气阴两虚、肝肾亏损、目络瘀阻是其基本病机, 气阴两虚贯穿于病变发展的全过程[5]。由此, 众多学者在DR治疗中将益气养阴、活血化瘀作为选方之一。本实验证实益气养阴活血中药的药物血清可降低高糖培养下RGCs的生长抑制率, 在一定程度上可以对视网膜起到保护作用, 这可能是益气养阴活血法防治DR的药物干预途径之一。

参考文献

[1]谢学军, 李芳梅, 张梅, 等.补肾活血法对Müller细胞谷氨酸摄取功能的影响.中国中医眼科杂志, 2008, 18 (1) :19.

[2]Barber AJ, Lieth E, Khin SA, et al.Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes early onset and effect of insulin.J Clin Invest, 1998, 102:783.

[3]Takahashi H, Goto T, Shoji T et al.Diabetes-associated retinal nerve fiber damage evaluated with scanning laser polarimetry.Am J Ophthalmol, 2006, 142:88.

[4]Ozdek S, Lormeville YH, Onol M, et al.Assessment of fiber layer in diabetic patients with scanning laser polarimetry.Eye, 2002, 16:761.

视网膜神经 篇5

1 材料与方法

1.1 实验动物

Lewis大鼠3只, 4～5周龄, 雌雄不限, 体重90～100g。

1.2 主要试剂

胎牛血清 (FBS) 、DMEM和DMEM/F12 培养液、胰蛋白酶、MTT溶液; PE标记小鼠抗大鼠CD45单克隆抗体、FITC标记小鼠抗大鼠CD90单克隆抗体、小鼠抗大鼠一抗、FITC标记羊抗小鼠二抗;视蛋白 (opsin) 、巢蛋白 (nestin) 和微管蛋白 (MAP-2) 单克隆抗体。

1.3 大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养

将Lewis大鼠用过量3%戊巴比妥钠腹腔注射处死, 大鼠断头, 取其四肢, 浸泡在75%的酒精中, 消毒好器械, 将装四肢的烧杯拿入层流室, 在操镜台的瓶皿中将四肢去皮肉, 得到的骨头放入干净的酒精中洗一洗, 再用PBS冲淋干净, 放入另一瓶皿中待用。将股骨、胫骨的两端骨骺剪开, 用装有PBS的针筒冲洗到一个干净的皿中, 将这些液体装入刻度离心管中, 待离心。1000r/min离心5min, 弃上清。根据细胞沉淀量的多少, 加入10～20mL PBS, 制成骨髓单细胞悬液。将其按1:1的体积比, 小心加在Filcoll-hypaque层上面, 2000r/min离心20min。吸取中间不透明的单个核细胞层, 再以1:2的体积比加入PBS, 混匀, 1000r/min离心10min, 去上清。细胞沉淀加入含用含15%胎牛血清、1ng/mL bFGF的低糖DMEM培养基10mL, 重悬细胞, 留取10μL悬液计数 (台盼蓝染色) , 其余细胞1000r/min离心5min, 弃上清。用含15%胎牛血清、1ng/mL bFGF的低糖DMEM培养基调节细胞密度, 最后以2×105细胞/cm的密度接种于培养瓶中, 置于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养, 按1:1进行传代培养。

1.4 BMSCs 生长曲线的绘制

取3代、4代BMSCs, 用0.25%胰蛋白酶室温消化后, 离心, 制成单细胞悬液, 以2×103/mL均匀加入到两块48孔培养板内传代, 每孔培养液为1mL。置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。7d内每日相同时间在显微镜下, 消化后计数, 每板计数6孔, 6孔取均值, 绘制生长曲线。

1.5 BMSCs 细胞周期的检测

取3代BMSCs, 用0.25%胰蛋白酶室温消化, 离心, 制成细胞悬液, 调整细胞浓度为1.0×106/mL, 经70%预冷乙醇固定30min、50mg/L RNA酶0.3mL, 37℃处理30min, 移入流式细胞仪专用试管并加入50mg/L的碘化丙啶0.4mL, 4℃避光染色30min, 流式细胞仪检测细胞周期。

1.6 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定

取生长接近融合的BMSCs细胞, 用0.25%胰蛋白酶消化5min后, PBS液洗1遍, 1000r/min离心5min, 弃去上清, 收集细胞。分别装至2个玻璃管中, 分别加入PE标记小鼠抗大鼠CD45单克隆抗体, FITC标记小鼠抗大鼠CD90单克隆抗体各10μL, 另取2个玻璃管分别加入等量同型IgG作为阴性对照。将玻璃管内液体充分摇匀后于常温暗处孵育30min, 用PBS液洗涤3次, 每一次加PBS液约2mL, 1000r/min离心5min, 去除上清液, 收集细胞, 用PBS重悬至5mL, 流式细胞仪检测。

1.7 Mtt法检测各组BMSCs活性

收集实验组和对照组细胞重悬液, 以每孔1×104接种于96孔培养板内, 每孔200μL, 5%CO2, 37℃孵箱中孵育, 分别于培养后3d、5d、7d行MTT法检测细胞活力, 检测方法:每孔加入20μLMTT溶液 (5mg/mL) , 37℃继续孵育4h后终止培养, 除去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜, 振荡10min。在酶标仪在波长570nm处测量各孔的吸光值, 每组取8孔, 计算吸光值平均数, 重复3次, 取3次的平均数。

1.8 BMSCs的标记

传三代MSCs后加入含B rdU10μg/mL、10% 胎牛血清的DMEM培养液, 在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下孵育, 隔天换液。6～7d细胞生长接近融合时, 用小鼠抗人B rdU 单抗行免疫组织化学染色和免疫荧光染色来观察标记的效果。

1.9 BrdU 标记BMSCs悬液的制备

移植前1h, 收集5×106个未诱导的BMSCs和经bFGF诱导后1天的混合细胞, 1000r/min离心3min, 0.4%台盼蓝染色计数活细胞;D-hanks 1mL重悬细胞, 加入CM-DiI (1μg/μL, ) 5μL, 37℃, 30min;将上述细胞再置于4℃, 5min;1000r/min离心3min, D-hanks洗3次;D-hanks 1mL重悬细胞制成单细胞悬液, 4℃备用。

1.10 B rdU 标记

MSCs视网膜下移共对6只大鼠 (12只眼) 进行了手术。所有进行视网膜下腔移植的大鼠, 均采用外路法经巩膜行视网膜下腔移植。用10%水合氯醛麻醉成功后, 以大鼠右眼为移植细胞注射眼, 用一滴2.5%的苯肾上腺素点眼, 15～30秒后, 再滴加一滴1%的硫酸阿托品, 保证瞳孔扩大。当注射右眼的时候用左手扶着大鼠的头, 这时大鼠的鼻子朝右。然后用28号针头在角膜缘外2mm处做切口, 分离结膜及其下筋膜, 暴露巩膜。隧道做好后再用10μL的Hamilton注射器配以32号针头, 将10μL细胞液注射到大鼠的视网膜下间隙。注射时轻轻将32号针头推进隧道, 调整针头方向从颞下1/4推向鼻上1/4。在手术显微镜下通过瞳孔可以清楚的看见钝性的针头的末端触及神经视网膜。轻轻的推进针头直至感到有轻微的阻力, 然后慢慢的将液体注射到视网膜下间隙。若看见视网膜脱离, 证明注射是成功的。以大鼠左眼为手术对照眼, 在视网膜下间隙注射等量的PBS液, 方法同前。术后第1、5、10、15 d观察所有大鼠的眼底。

1.11 标本的处理

各组于移植术后15d过量麻醉处死动物后, 取出眼球, 其中3只大鼠共6只眼, 显微镜下去除角膜和晶体, 冰冻包埋剂包埋, 行冰冻切片, 切片厚度12μm, 先后用小鼠抗人B rdU 单抗、FITC 标记羊抗小鼠二抗和小鼠抗大鼠Rhodopsin 单抗、Cy3标记羊抗小鼠二抗进行免疫荧光双重标记后, 在荧光显微镜下寻找的移植细胞, 寻找到标记细胞后行连续切片, 直至标记细胞消失。另外3只大鼠共6只眼置于10% 中性甲醛溶液固定, 石蜡包埋, 连续切片, 用小鼠抗人B rdU 单抗和二步法过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗进行反应, DAB显色后, 置于光镜下观察。

2 结果

2.1 BMSCs 的形态学观察

原代细胞接种1d后开始贴壁, 但数量不多, 细胞形态多样, 类圆形较多;2～3d后, 贴壁细胞逐渐增多, 形态以类圆形居多并出现少量细胞呈短梭形或菱形;4～6d后, 贴壁细胞呈单克隆样生长, 形成分散的、大小不一的细胞集落, 新生的细胞位于中心, 多呈圆形, 周围的细胞逐渐成为梭形, 贴壁细胞数量明显增多;7～9d后, 细胞集落迅速增多扩大并逐渐融合;2～4代的细胞呈单层分布, 局部相连呈片, 增值速度加快, 形态以长梭形为主, 并有少量细胞呈圆形、三角形或多角形。

2.2 生长曲线

由BMSCs 生长曲线可见, 早期的细胞分裂较缓慢, 第2天进入快速增殖期, 细胞生长活跃, 大约持续至第5天, 细胞分裂进入平台期, 增殖缓慢或轻微下降, 近似呈“S”形生长曲线 (图2) 。

2.3 细胞周期

3代BMSCs细胞通过流式细胞仪显示, 90.27%的细胞处于G0～G1期, 其余9.73%的细胞处于G2期、S期和M期, 4代细胞:G0～G1期为93.28%, 其余各期为6.72%, 表明BMSCs大多数处于静止期, 只有少数处于活跃的增殖期, 符合干细胞具有的高效扩增及分化潜能的特征。

2.4 鉴定

表面标记物CD45、CD90的表达检测, 3代和4 代 BMSCs 细胞高表达CD90, 几乎不表达CD45。流式细胞仪结果显示, 传3代CD90 (+) /CD45 (-) :92%, 4代CD90 (+) /CD45 (-) :90% (图2) 。

2.5 两组细胞的存活率

共培养组对BMSCs的增殖活力及功能的影响与对照组无显著性差异, 见表1。

2.6 经过

BrdU 单抗和FITC 标记二抗作用后的移植眼冰冻切片, 在荧光显微镜下可见B rdU 标记的BMSCs主要分布于视网膜的外核层, 内核层和神经节细胞层, 移植细胞内未见色素存在。对照眼冰冻切片则未见带荧光的细胞, 部分细胞也聚集成团, 细胞内未见色素。经BrdU单抗和过氧化物酶标记的二抗作用、DAB 显色后的移植眼石蜡切片, 在光学显微镜下可见BrdU标记的BMSCs主要位于神经视网膜下, 并且没有观察到细胞整合到神经视网膜内多数细胞形态完整, 并主要集中在注射部位。

3 讨论

干细胞对治疗青光眼、黄斑变性、视网膜色素变性等引起视网膜不可逆性损伤为特征的疾病, 具有广阔的应用前景。BMSCs具有较强的增殖能力, Deans等研究证实BMSCs可以传至40代而分化能力并无显著改变[1], 而且BMSCs具有向多个胚层分化的潜能, 在不同的诱导微环境作用下, 可以分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、心肌细胞、肌腱、脂肪细胞、肝细胞等多种细胞[2,3], 因此, BMSCs是未来用于细胞移植治疗很有前途的种子细胞。

本实验利用贴壁培养法分离新生鼠BMSCs, 该方法操作简便实用, 对细胞干扰较小, 通过传代对BMSCs进行纯化, 细胞周期检测表明BMSCs具有干细胞多向分化的生长特性;目前尚未发现鉴定BMSCs的特异性标志物, BMSCs通常表达CD44、CD49e、CD81和D90等抗原, 而不表达CD3、CD11b、CD14、CD34和CD45等造血系细胞表面特异性抗原[4,5]。因为分离出的细胞往往主要混杂造血系细胞, 因此现在较多文献采用排除法进行BMSCs的鉴定, 本实验通过流式细胞仪鉴定BMSCs的表面抗原, 显示CD90 (+) /CD45 (-) 比例较高, 初步证实所获得的细胞是BMSCs。

BMSCs作为一种多潜能的成体干细胞, 是目前干细胞移植治疗神经变性疾病研究的焦点。由于视网膜细胞变性损伤, 导致不可逆致盲眼病, 现有治疗方法不能阻止视网膜变性。任何恢复视觉的策略大都需要细胞替代或者细胞移植, 用有功能的细胞替代损伤的细胞, 从而恢复视觉功能[6,7]。干细胞具有极强的可塑性和定性分化特性成为理想的供体细胞, 但诱导转化所需时间长, 诸多影响因素不可控, 以及伦理学问题、免疫排斥反应和形成畸胎瘤的危险, 限制了干细胞的临床应用。我们设想直接将骨髓间充质干细胞诱导转分化光感受器细胞, 缩短转化时间, 减少作用因子, 然后将其植入动物模型内, 观察其对视网膜变性受损的光感受器细胞的替代治疗作用。1992年, Reynolds和Weiss首次从小鼠脑纹状体分离得到神经干细胞 (NSCs) 。随后, 在小鼠和人的睫状体中发现一类细胞, 称为视网膜干细胞 (Retinal stem cell) , 具有神经源分化潜能。这一实验的成功提出自体细胞移植的可行性, 从而避免了异体移植的免疫排斥反应。有研究发现移植到成人视网膜上的NSCs可以整合到宿主视网膜中, 但是NSCs不能分化为具有视网膜表型的细胞。视网膜干细胞能够分化具有视网膜表型的细胞, 但是该细胞缺乏迁移和整合能力。研究发现来自孕三个月胎儿的成体干细胞, 其移植和整合能力最佳, 但必须面临伦理学、移植的有效性及免疫排斥反应等问题[8,9]。Vierbuchen等提出在Ascl1, Brn2和Myt1l转录因子作用下可将成纤维细胞直接分化为诱导神经元细胞 (iN) 。但能够通过类似的策略将骨髓间充质干细胞诱导为特定类型的功能神经元 (如光感受器细胞, RPE等) 则尚未见报道。因为骨髓间充质干细胞来源于患者的自身骨髓, 不存在免疫排斥以及伦理学的问题。结果显示变性视网膜的微环境有利于移植细胞的存活, 迁移和分化, 未诱导的BMSCs在宿主视网膜内存活和迁移能力较弱, 而经bFGF诱导后混合细胞在宿主视网膜内的存活和迁移能力增强, 但分化能力明显受限[10]。目前, 任何恢复视觉的治疗策略大都需要细胞替代或者细胞移植, 用有功能的细胞替代损伤的RPE或者光感受器细胞, 从而恢复视觉功能, 如何使我们的种子细胞在视网膜移植后, 既具有较强的存活和迁移能力, 又具有较好的分化能力, 就可以发挥其对宿主视网膜的修复和重建功能, BMSCs具有极强的可塑性和定性分化特性成为理想的供体细胞。

参考文献

[1]Deans RJ, Moseley AB.Mesenchymal stem cells:biology andpotential clinic uses[J].Exp Hematol, 2000, 28 (8) :875-884

[2]Herzog EL, Chai L, Krause DS.Plasticity of marrow-derived stemcells[J].Blood, 2003, 102 (10) :3483-3493

[3]Jiang Y, Jahagidar BN, Reinhardt RL, et al.Pluripotency ofmesenchymal stem cells derived from adult marrow[J].Nature, 2002, 418:41-49

[4]Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al.Multilineage potential ofadult human mesenchymal stem cells[J].Science, 1999, 284 (5411) :143-147

[5]Conget PA, Minguell JJ.Phenotypical and functional properties ofhuman bone marrow mesenchynral progenitor cells[J].CellPhysiol, 1999, 181 (1) :67-73

[6]Gamm DM, Wang SM, Lu B, et al.Protection of Visual Functionsby HumanNeuralProgenitors in a Rat Model of Retinal Disease[J].PLOSONE, 2007, 338:1-10

[7]Jin K, Mao XO, Batteur S, et al.Induction of neuronal markers inbone marrow cells:differential effects of growth factors andpatterns of intracellular expression[J].Exp Neurol, 2003, 184:78-89

[8]Schmidt A, Ladage D, SchinkOthe T, et al.Basic fibroblast growthfactor controlsmigration in human mesenchymal stem cells[J].StemCells, 2006, 24:1750-1758

[9]Castro RF, Jackson K A, Goodell MA, et al.Failure of bone marrowcells totransdifferentiate into neural cells in vivo[J].Science, 2002, 297:1299

视网膜神经 篇6

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选择新西兰大白兔36只,由重庆医科大学实验动物中心提供,体重2.0～2.5 kg;随机分为正常组4只,孕酮组和对照组,各16只,孕酮组和对照组再依不同再灌注时间,各按造模后12、24、48、72 h分为四组,各组4只。

1.2 试剂与仪器

试剂:孕酮注射液、速眠新(长春军需大学兽医研究所提供),链霉卵白素—过氧化物酶(Histostain TM-SP)免疫组化试剂盒、TUNEL试剂盒(ROCHE公司提供),兔多抗Bcl-2 IgG(武汉Boster公司提供)。仪器:GD-8型多媒体彩色图像病理分析仪。

1.3 模型建立

采用常规饲养新西兰大白兔。对照组和孕酮组分别在缺血前24 h肌内注射4 ml/kg生理盐水和4 mg/kg孕酮,1%地卡因滴眼局部麻醉,并给予速眠新0.3 ml/kg耳缘静脉注射。麻醉成功后将大白兔置于兔架固定器上固定,将连接生理盐水瓶输液管的4号半针自大白兔角膜缘穿入前房固定,升高输液瓶至与眼球垂直距离150 cm处(14.63 kPa眼内压),使网膜血管断流,可见球结膜苍白外观,维持1 h,遂将输液瓶高度渐放低,至兔眼球水平,恢复视网膜血供。

1.4 标本制作

给予0.3 ml/kg速眠新耳缘静脉注射麻醉动物,摘除眼球并编号。眼球于4%多聚甲醛固定6 h,只保留眼球视网膜,放入10%和20%蔗糖溶液内各2 h,30%蔗糖溶液内过夜;OCT包埋剂填充眼球,沿矢状面作连续5μm切片;HE染色并于光镜下观察对照组和孕酮组视网膜细胞在不同时间点的形态变化,测量从内界膜到内核层间的长度。

1.5 免疫组化法检测Bcl-2蛋白表达

采用0.3%H2O2室温处理切片10 min,蒸馏水洗3次,浸入pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液中,加热达98℃断电,95～98℃处理30 min,冷却后滴加山羊血清封闭液,处理20 min,加Bcl-2多克隆抗体,4℃过夜,PBS洗3次,加入生物素化羊抗兔IgG,37℃处理90 min,PBS洗3次,加试剂S-A/RP,37℃处理30 min,PBS洗5次,DAB显色10 min后脱水、透明、封片。

1.6 凋亡检测

采用新制备的4%多聚甲醛溶液室温下固定切片30 min,PBS洗片,放入0.3%H2O2溶液中恒温处理10 min,PBS洗3次;将其置于新配制的4℃0.1%Triton X-100及0.1%枸橼酸钠缓冲液中各处理5 min,PBS洗3次;加TUNEL混合反应液,37℃处理60 min,PBS洗3次;滴加Converter-POD,37℃处理30 min,PBS洗6次,每次洗5 min;DAB显色15 min,中性树胶封片。阳性对照组于反应体系前用DNA酶Ⅰ消化,阴性对照组不加末端核糖核酸转移酶。

1.7 观察指标

于光镜10×40视野下进行结果观察,每只眼球取4张片观察,每张切片取4个视野。HE染色:测量从内核层到内界膜间的长度,并计数内核层每100μm长视野内的细胞数;计量每100μm长视野内表达Bcl-2和凋亡阳性细胞数。

1.8 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差表示,两组均数比较采用t检验,多组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜组织学情况

光镜下观察,孕酮组视网膜内层厚度厚于对照组,两组比较各时间段差异均有统计学意义(P<0.05)。孕酮组视网膜内核层细胞数多于对照组,且细胞排列较规整,两组比较各时间段差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

注:与对照组比较,*P<0.05

2.2 Bcl-2蛋白表达情况

正常组视网膜Bcl-2染色阴性。孕酮组缺血再灌注24 h后可见Bcl-2阳性表达,阳性细胞数为(11.47±1.53)/100μm;对照组缺血再灌注24 h在视网膜节细胞层可见阳性着染,阳性细胞数为(7.06±1.15)/100μm,两组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 细胞凋亡情况

正常组视网膜TUNEL染色阴性,无凋亡。对照组缺血再灌注12 h,视网膜节细胞层和内核层可见凋亡细胞,缺血再灌注24 h凋亡达到峰值,且凋亡细胞主要见于视网膜内核层,而视网膜外核层凋亡细胞表达不明显,24 h后凋亡细胞数量逐渐下降,缺血再灌注48 h时凋亡征象已明显减弱。计数凋亡高峰期(缺血再灌注24 h)孕酮组和对照组视网膜内核层阳性细胞数分别为(4.03±0.55)/100μm和(9.45±1.63)/100μm,两组差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

视网膜急性缺血性疾病临床常见,如闭角型青光眼急性发作期、视网膜中央动脉阻塞等,目前主要治疗措施是恢复视网膜血液循环。但视网膜血液再通后会出现视力下降甚至出现不可逆的视力损害,其损伤的病理生理机制十分复杂,是目前国内外研究的难点之一。本实验所采用的提高眼压方法制作视网膜缺血模型,已被许多实验研究证实可行[1,2]。

本实验研究结果显示,用TUNEL法原位标记凋亡细胞主要位于视网膜节细胞层和内核层,直观地证明了缺血再灌注损伤的视网膜存在神经元凋亡现象。Niu等[3]研究证明,凋亡是视网膜缺血再灌注损伤后神经节细胞死亡的重要方式,电子显微镜观察发现,在视网膜不同类型的细胞死亡中,凋亡是主要形式之一。有研究认为,神经缺血再灌损伤由微血管的损伤和炎症、钙超载、一氧化氮合酶、NF-κB及其诱导的因子及氧自由基等多种因素引起。Wang等[4]研究证实,视网膜缺血再灌注损伤中凋亡是神经元丢失的重要因素之一,细胞凋亡受多种相关基因调控如Bax、Caspase、Bcl-xl、Bcl-2等。本实验研究结果发现,孕酮组神经元凋亡数目均少于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)。说明孕酮可减轻神经损伤,减少缺血-再灌注后细胞凋亡,该结果与既往研究相符[5,6]。多种因素在缺血、缺氧时调节细胞的生存与死亡。目前认为,在细胞凋亡过程中会出现P53、Bax、Bad等基因的表达,激活蛋白水解酶,使DNA的修复酶如PARP和DNA-PKcs等降解,最后导致细胞凋亡。抑制细胞凋亡过程中的信号转导包括抑制凋亡基因如Bcl-2、Bcl-xl等基因被激活表达,从而抑制细胞凋亡。探讨凋亡与相关基因的关系将为寻找视网膜急性缺血性疾病的治疗方法提供新线索。

Bcl-2是从小鼠B细胞淋巴瘤中分离得出的原癌基因,编码26 ku的胞浆蛋白,在成熟或走向凋亡的细胞中不表达,而在各种正常细胞的激发和发育中表达[5]。已发现的Bcl-2家族成员包括Bcl-2、Bcl-x、tmcl-1、Bak、Bax、Bag-1等[7]。Bcl-2蛋白位于核膜、线粒体外膜和内质网,不存在于其他膜性结构上[8]。Bcl-2的功能是通过阻止细胞凋亡早期环节而阻止凋亡的发生,可加速DNA修复,通过阻止受损的DNA转录出对细胞凋亡基因有激活作用的相关信号或相关产物起作用。本实验结果显示,孕酮组Bcl-2蛋白表达高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示孕酮可上调视神经损伤中Bcl-2基因的表达,加速DNA损伤的修复,起到神经保护作用。

孕酮可减轻神经缺血-再灌注后的神经元凋亡,而上调Bcl-2表达可能是其发挥神经元保护作用的分子机制之一,作为一种自身合成的神经甾体激素,孕酮具有不良反应小的特点,是一种潜在的有应用前景的神经保护药物。

参考文献

[1]Qiao SH,Chi HF.Effect of erythropoietin on neutronal apoptosis andcaspase-2 expression after retinal ischemia-reperfusion injury[J].Chinese Journal of Neuroanatomy,2005,21(5):521-525.

[2]Yu YN,Li XF,Bi LF.Effect of taurine on rat retinal ischemia afterreperfusion[J].medical journal of the Chinese People's Armed PoliceForces,2006,17(4):276-279.

[3]Niu YJ,Gao YX,Yuan CY,et al.Effect of basic fibroblast growth factoron expression of apoptosis-related genes in retinal ischemiareperfusioninjury[J].Chinese journal of ocular fundus diseases,2005,21(5):310-313.

[4]Wang XD,Kashii S,Zhao L,et al.Vitamin B₆protects primate retinalneurons from ischemic injury[J].Brain Res,2002,940:36-43.

[5]Cervantes M,Gonzalez-Vidal MD,Ruelas R,et al.Neuroprotectiveeffects of progesterone on damage elicited by acute global cerebralischemia in neurons of the caudate nucleus[J].Arch Med Res,2002,33(1):6-14.

[6]Kumon Y,Kim SC,Tompkins P,et al.Neuroprotective effect ofpostischemic administration of progesterone in spontaneously hypertensiverats with focal cerebral ischemia[J].J Neurosurg,2000,92(5):848-852.

[7]Betz AL,Ennis SR,Schtlke GP.Blood brain barrir sodium transportlimits development of brain edema during partial ischemia in gerbils[J].Stroke,1989,20:1253-1259.

视网膜神经 篇7

1 病例介绍

患者男性, 48岁, 干部, 因“突发神志不清3h余”入院。患者既往有高血压病史6年, 最高血压180/100mmHg (1mmHg=0.133kPa) , 长期口服“络活喜”降压治疗, 平素血压控制在140/90mmHg左右。2012年2月8日16:50左右患者在活动状态下突发神志不清, 120送至当地医院, 患者出现咳淡血性泡沫样痰, 行头、胸部CT示蛛网膜下腔出血、两肺弥漫性渗出影 (见图1、2) 。患者在当地医院急诊科随即出现心率下降, 最低降至40余次/min, 指脉氧下降至60%左右, 立即给予气管插管、球囊辅助通气、肾上腺素静推等处理, 并转入我院ICU抢救治疗。

入院时患者中度昏迷, GCS评分4分, 颈软, 两侧瞳孔等大, 直径约2.5mm, 对光反射存在, R 33bpm, 两肺呼吸音粗, 可闻及湿性啰音, 两下肺呼吸音低, HR 130bpm, 窦性、心律齐, 各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音, BP 99/56mmHg, 腹软, 双下肢无浮肿, 双侧Babinski征 (+) 。血气分析:pH7.28, PaO256mmHg, PaCO241mmHg, Lac 2.1mmol/L。入院诊断: (1) 蛛网膜下腔出血; (2) 神经源性肺水肿; (3) 高血压病3级 (极高危组) 。

2 救治经过

(1) 入室后立即予以呼吸机机械通气, 并于2012年2月11日行经皮气管切开术。 (2) 给予脱水降颅压、预防脑血管痉挛、抗感染、预防应激性溃疡、减轻肺水肿等对症治疗。 (3) 维系生命体征及内环境稳定, 完善相关检查。患者经积极抢救生命体征渐平稳, 于2012年2月12日神志转清, 听诊两肺呼吸音稍粗, 未闻及干湿啰音。2012年2月13日复查头颅CT+CTA+胸部CT见颅内血肿有所吸收, 两肺渗出明显改善, 两侧颈内动脉、椎基底动脉及脑内大动脉未见明显异常 (见图3、4) 。患者顺利撤离呼吸机, 气管切开处供氧3L/min, 氧合指数可达300mmHg以上。2012年2月23日患者病情平稳, 转出ICU行康复治疗。近期回访, 患者恢复良好, 已回到工作岗位。

3 讨论

自发性蛛网膜下腔出血 (SAH) 是较常见脑血管病之一, 常突然发病, 致残、致死率高, 约占急性脑卒中的10%, 占出血性脑卒中的20%[2]。神经源性肺水肿 (NPE) 是继发于各种中枢神经系统损害的急性肺水肿, 该病起病迅速, 治疗困难, 预后不良[3]。出血性脑卒中并发神经源性肺水肿的发病机制为:出血性脑卒中时病变侵及丘脑下部、丘脑及脑干, 致脑功能紊乱并释放大量α-肾上腺能递质, 引起弥漫性、一时性血管强烈收缩, 血流从高阻的体循环运转到低阻的肺循环, 肺毛细血管静水压上升, 毛细血管壁通透性增强, 产生肺水肿[4]。蛛网膜下腔出血可引起脑血管痉挛、脑积水、肺部感染等一系列并发症, 每一阶段的并发症都可能对患者形成二次打击, 如果认识不足或处理不当都可能导致病情加重, 甚至死亡[5]。而本例SAH合并NPE患者病情凶险, 如诊治失误将耽误救治导致患者死亡。本例的成功体会是:

3.1 准确的诊断

神经源性肺水肿诊断依据为: (1) 颅脑损伤特别是重度颅脑损伤 (GCS<8) 或开颅术后突发呼吸困难、紫绀、大量粉红色泡沫痰; (2) 心率加快, 呼吸频率>30次/min, 脉氧下降, 虽经吸氧无缓解; (3) 双肺布满湿啰音, 早期胸片可显示肺纹理增强, 轻度间质改变, 晚期表现斑片或云雾状阴影, 边缘模糊; (4) 血氧饱和度、动脉血氧分压急剧下降, 吸氧时血气分析PaO2<60mmHg, PaCO2>50mmHg; (5) 既往无心肺疾病, 无过量、过快输液情况等。本例若判断失误如误以为急性左心衰, 必将耽误抢救造成不良后果。

3.2 救治措施果断及时准确

由于NPE与脑组织损害互为因果, 治疗方面与其他的肺水肿不尽相同, 应兼顾肺水肿与脑出血两个方面, 特别强调降低颅内压、抑制交感神经过度兴奋。 (1) 镇痛镇静:保证患者安静休息, 调整血压水平, 避免血压剧烈波动, 维持MAP在90mmHg以保证脑灌注; (2) 脱水降颅内压:20%甘露醇125ml静滴q8h, 10%人血白蛋白10g静滴q12h, 白蛋白输完后予速尿20mg静推, 甘露醇与速尿交替使用, 同时注意液体出入平衡, 纠正水电解质紊乱, 维持内环境稳定; (3) 预防脑血管痉挛:预防性使用钙离子拮抗剂防止或减少出血造成的脑血管痉挛, 尼莫同静脉持续泵入; (4) 抗纤溶药物:6-氨基己酸12g bid, 推迟血块溶解和防止再出血; (5) 肺水肿治疗:保持呼吸道通畅, 入室时立即予机械通气, 并尽早行气管切开;应用血管扩张剂硝普钠, 改善微循环、降低肺循环负荷;短期大剂量应用肾上腺皮质激素减轻肺水肿, 甲基强的松龙连续应用3d分别为500mg、240mg、120mg; (6) 预防和治疗肺部感染、应激性溃疡; (7) 尽早行营养支持, 保持二便通畅。

蛛网膜下腔出血合并神经源性肺水肿来势凶猛, 进展迅速, 预后差。NPE是一个复杂的病理生理过程, 神经系统损伤和肺脏损伤亦可能相互促进病情进展, 从而影响患者的预后[1,6]。神经源性肺水肿一旦出现, 病死率极高, 文献报告可达52.6%~86.7%[7,8]。只有对其保持足够的重视和清醒的认识, 早期诊断, 及时积极有效的治疗方可提高抢救成功率, 改善预后。

关键词：蛛网膜下腔出血,神经源性肺水肿

参考文献

[1]Baumann A, Audibert G, Mc Donnell J, et al.Neurogenic pulmonary edema[J].Acta Anaesthesiol Scand, 2007, 51 (4) :447-455.

[2]揭毅, 张其梅.自发性蛛网膜下腔出血30例临床分析[J].中国实用神经疾病杂志, 2010, 13 (13) :76-77.

[3]姚晓喜, 陈继华, 黄仁彬.神经源性肺水肿12例临床分析[J].中国实用神经疾病杂志, 2006, 9 (3) :113.

[4]孟维芳.新生儿缺氧缺血性脑病并发神经源性肺水肿28例分析[J].临床荟萃, 1999, 14 (10) :447.

[5]Wagner KR, Xi G, Hau Y, et al.Early metabolic alterations in edematous perihematomal brain regions following experimental intracerebral hemorrhage[J].Neurosurg, 1998, 88:1058-1065.

[6]韩业兴, 谷建平, 陈革新, 等.神经源性肺水肿发病机制研究进展[J].中国现代临床医学, 2006, 5 (5) :32-35.

[7]田力学, 韩宏彦, 刘胜利, 等.创伤性神经源性肺水肿的治疗 (附19例临床分析) [J].创伤外科杂志, 2001, 3 (2) :125.