干细胞鉴定（精选十篇）
干细胞鉴定 篇1
1 材料与方法
1.1 材料及仪器
新西兰大白兔(福建医科大学大学动物中心);DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(Hyclon公司);0.25%胰酶加EDTA(Gibco公司);Percoll分离液(Sigma公司);超净工作台(DCM-1300,苏州);自动台式离心机(LD25-2,北京);CO2孵箱(Thermo forma 311,美国);倒置显微镜(Olympus);透射电镜(HU-12A,日立公司);细胞培养板、培养瓶(Sigma公司);荧光标记CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD90-FITC单克隆抗体(美国PharMingen公司);流式细胞仪(Beckman counter Epics XL,美国BD公司)。
1.2 方法
1.2.1 兔MSC的原代培养
新西兰大白兔(福建医科大学动物实验中心提供),6周龄,体重约1.5kg,雌雄不限。3%戊巴比妥钠静脉麻醉,于无菌条件下在双侧坐骨棘处用18号骨髓穿刺针接5m L注射器,内含肝素钠0.2mL(100U/mL),各抽吸骨髓液2mL,抽吸完毕迅速将注射器内液体均匀混合,注入培养皿,用1m L注射器反复吹打培养皿中的骨髓液约5min,置入离心管,1000r/min离心10min,弃去脂肪和上清,用PBS重悬制成细胞悬液,小心加入至2倍体积1.073g/m L的Percoll分离液上层,室温下以2000r/min离心25min。收集中间乳白色的有核细胞层,再用PBS洗涤2次,加入适量的含双抗的20%胎牛血清DMEM培养液吹打制成细胞悬液,置于离心管中,1000 r/min离心15min。弃上清液,加入3mL含双抗的20%胎牛血清DMEM培养液,反复吹打,稀释成细胞悬液,以1.0×104/cm2接种于50cm2培养瓶中。于37℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中培养,3d后首次半量换液,将未贴壁的细胞全部弃掉,以后每2~3d全量换液1次。
1.2.2 兔MSC的传代
在原代培养的细胞接近铺满培养瓶底时,用0.25%胰蛋白酶消化,倒置显微镜观察,待50%细胞变为圆形时,将胰酶倒掉,加入含20%胎牛血清的DMEM培养液中止消化,再以1×104/cm2传代培养。
1.2.3 细胞形态观察
每天在倒置相差显微镜下观察MSC原代和传代细胞的生长情况及形态特征,并适时拍照。
1.2.4 细胞超微结构观察
细胞在培养皿中增殖满单层后,0.25%胰蛋白酶消化,移入离心管,1000r/min离心5min,洗涤细胞2次,末次离心后弃上清,取样行透射电镜观察。
1.2.5 流式细胞仪检测兔MSC的表面标志
取第3代MSC用PBS重新悬浮后,调整细胞浓度1×106/cm2,取100μL细胞悬液与CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD90-FITC单抗室温避光孵育30min后,用流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 MSC的生长情况及形态学特点
骨髓细胞经密度梯度离心后,接种于50cm2的培养瓶,倒置显微镜下观察培养液中存在大量大小不一的圆形细胞;24h后可见多数贴壁的圆形细胞中散在有少数多角形或短梭形细胞,有数个突起类似成纤维细胞;3~4d后梭形细胞和多角形细胞显著增多;5~6d后形成细胞集落方式生长,数量明显增多,呈现长梭形、纺锤形,细胞轮廓清晰,排列较紧密;7~9d后,细胞的生长明显加速,逐步形成大小不一、分散的细胞集落,呈放射状向四周扩展,细胞呈漩涡状或平行排列(图1);第10~12天,贴壁单层生长的细胞铺满整个培养瓶底,放射状或漩涡状生长方式更趋明显,非贴壁细胞通过换液己逐渐被清除,基本完成原代单层生长。传代细胞的细胞贴壁时间和增殖速度比原代培养要快,大约2h开始贴壁,培养约8~11d互相接触形成单层。传代细胞分裂相多见,胞体大,细胞边界不清楚,胞浆内颗粒多,显示细胞功能活跃,处于活跃的基质合成状态。传代至第10代后,细胞增殖速度减慢,细胞形态出现多样性,逐渐呈老化现象。
2.2 MSC透射电镜观察
透射电镜示:细胞胞体较大,表面有微绒毛,核大而不规则,核内以常染色质为主,核仁可见,部分细胞内有多个核仁。胞浆内见中等量线粒体,其体积较小,密度较高,可见中等量粗面内质网、部分粗面内质网束状扩张,可见少量高尔基复合体,有些细胞内可见较多次级溶酶体,细胞间未见连接(图2)。
2.3 MSC的表面抗原鉴定
经流式细胞仪检测第3代细胞样本(图3),CD34、CD45、CD29、CD90分别为0.79%、0.18%、96.8%、84.2%。CD34、CD45基本不表达,证实这些细胞是非造血干细胞;CD29、CD90表达阳性,表明分离的细胞具有MSC的特征。
(1)CD34检测为阴性;(2)CD45检测为阴性;(3)CD29检测为阳性;(4)CD90检测为阳性。
3 讨论
MSC是一种存在于骨髓的非造血干细胞,骨髓中绝大多数是造血干细胞,MSC的数量较少,一般认为MSC只占骨髓有核细胞的1/104~1/105[3~4],为了得到组织工程学需要的单一细胞,人们尝试用各种方法分离、纯化MSC。目前用于分离MSC的方法主要有贴壁筛选法和密度梯度离心法[5]。贴壁筛选法是根据MSC贴壁生长,而造血系细胞等因无法贴壁,则随培养液的更换而被清除[6]。但是,由此获得的MSC纯度不高,混合有较多的杂细胞,比如成纤维细胞、脂肪前体细胞等,所以体外培养特性不稳定[7]。密度梯度离心法是利用MSC与骨髓中其他细胞的密度不同,用特定密度的淋巴细胞分离液将MSC分离出来。这种方法应用梯度离心分离细胞,骨髓中的细胞按密度差别得以分离,所以可快速获得大量的高纯度细胞[8]。本实验用密度梯度离心法来分离培养MSC取得较好的效果。
目前尚没有十分理想的方法来鉴定MSC,主要通过细胞形态学特征如呈纺锤形、贴壁、成集落生长以及作为干细胞多分化潜能的确定(在不同的条件下,向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等分化的特性)来证明其干细胞的属性。我们分离培养的MSC从显微镜下观察,90%以上为梭形或呈纺锤形的细胞;电镜观察,细胞表面有微绒毛结构,细胞核大,核浆比例较正常细胞大,胞浆内细胞器以线粒体、内质网、溶酶体为主,说明细胞蛋白合成和分泌能力旺盛,能够大量摄取营养物质,功能活跃,显示了干细胞的幼稚特性,与成纤维细胞和血细胞等明显不同,这和文献相一致[9]。Pittenger等[10]认为,MSC细胞体积小,核浆比大,不表达分化相关标志如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶和osteopontin;在细胞贴壁附着后则细胞均一致地表达SH2,SH3CD29,CD44,CD71,CD90,CD106,CD120a,CD124等多种表面蛋白。MSC缺乏造血干细胞标记,不表达造血细胞抗原,如造血前提细胞标志抗原CD34,白细胞标志抗原CD45,淋巴细胞表面抗原CD11a,单核巨噬细胞表面抗原CD14,同时不表达分化抗原HLA-DR[10~11]。我们采用1.073g/m LPercoll密度梯度分离法,从兔骨髓中分离出单个核细胞,3d后首次半量换液,经多次换液,去除大量为贴壁的杂细胞,7~9d后细胞呈长梭形,漩涡状生长。经传代细胞逐渐纯化,至3代时采用流式细胞仪检测分离培养的细胞只表达CD29和CD90,而CD34、CD45均呈阴性表达,这表明我们分离培养的细胞是成分较为单一的MSC,而不是造血干细胞和成纤维细胞。
总之,实验结果表明利用本实验方法提取、纯化和扩增的MSC,MSC增殖能力较强,纯度高,可以作为组织工程的种子细胞,为组织工程骨的构建提供依据。
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干细胞鉴定 篇2
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( 责编辑: 幸任建华
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0( 责
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 篇3
【摘 要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果 获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。
【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定
0.引言
巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞， 具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1， 2] ， 被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象， 探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。
1.材料与方法
1.1实验对象
清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。
1.2实验方法
1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养
随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。
1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定
（1）台盼蓝染色计算存活率。
4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）； 胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混合混匀。（终浓度0.04%） ； 计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
（2）瑞氏染色计算细胞纯度。
细胞涂片自然干燥后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。随后将玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其盖满涂片，大约1分钟后，滴加等量或稍多的II液，用吸耳球轻轻混匀。冲洗：染色5-10分钟用流水染液，待干。 结果观察，将干燥后的血涂片置显微镜下观察。先用低倍镜观察涂片，再用油镜。
2.结果
2.1小鼠巨噬细胞的分离培养
（1）巨噬细胞的观察与鉴定.
巨噬细胞体外培养24h观察结果。如图1
（2）台盼蓝染色结果。
从腹腔分离出来的巨噬细胞进行台盼蓝染色结果显示巨噬细胞的成活率>95%，如图2
（3）瑞氏染色结果。
从腹腔分离出来的巨噬细胞进行瑞氏染色结果显示巨噬细胞的纯度>98%，如图3
图1巨噬细胞体外培养24h观察 图2台盼蓝染色结果
图3 瑞氏染色结果
3.讨论及结论
巨噬细胞广泛分布于体内，它不仅参与非特异性免疫，而且是特异性免疫中一类关键的细胞，参与集体众多的生理和病理反应过程，如巨噬细胞的吞噬和消除病原微生物[5]，通过加工处理提成抗原，启动特异性免疫应答[6]，以及巨噬细胞通过细胞凋亡清除吞噬的致病病原体等。由于腹腔巨噬细胞多游离存在于腹腔的腹水中，易于获得，因此许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛选免疫增强药物和探讨其作用机制时，往往选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象。
虽然腹腔巨噬细胞的提取方法都是灌胃洗腹腔后，吸出含有巨噬细胞的灌洗液了，但具体操作略有差异[7]。预先注入的巨噬细胞刺激剂有淀粉溶液、肉汤、糖原等，以产生大量的巨噬细胞计入腹腔。虽然这些刺激剂能分离收集到大量的巨噬细胞，但注入的大分子抗原物质对巨噬细胞吞噬功能有一定的影响，获得的巨噬细胞已不再是原体内巨噬细胞的基础功能。本实验提取巨噬细胞的方法是对文献中方法的改进，关键在于活体腹腔注射不含血清的培养液，轻揉腹部后静置几分钟，然后颈椎脱臼致死小鼠，无菌打开腹腔吸取腹腔液[4]。此方法相对处死小数后进行系列操作而言，洗出的灌洗液中混杂的白细胞少，提取局势细胞的纯度高，是一种简便的小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法，为巨噬细胞的相关研究奠定了基础。
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干细胞鉴定 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年健康SD大鼠45只，体重250～300 g。由潍坊医学院动物中心提供。将雌、雄SD大鼠于20∶00按1∶1比例合笼，次日8∶00阴道涂片查精子，查到精子者记为E0d。动物在常温环境下饲养，自由进食、进水，自然光照。
1.2 主要试剂
小鼠抗大鼠nestin抗体和小鼠抗大鼠GFAP抗体购自美国Chemicon公司，小鼠抗大鼠MAP2抗体购自武汉博士德生物有限公司，免疫细胞化学SP-9002试剂盒，DAB显色试剂盒购自北京中杉生物科技有限公司。
1.3 神经干细胞的分离培养和观察
取E14d SD大鼠，无菌取出胎鼠，经D-Hanks液反复冲洗，解剖镜下剥离皮肤、肌肉等组织，眼科剪剪碎脊髓，0.25%胰蛋白酶消化，吸管吹打，200目铜网过滤，离心，弃上清，加入含有DMEM/F12、2%B27、20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的生长培养基，以5×105个/m密度接种入25 cm2培养瓶中，置入37℃，5%CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞的形态及变化。细胞培养6～7 d，待原代克隆形成后，用吸管轻轻吹打15 min，将这些神经球制成单细胞悬液，以5×104个/ml密度再次接种于25 cm2培养瓶中。以后每6～7天传代1次，方法同前。
1.4 MTT检测
取生长状态良好的第3代神经干细胞球制作成单细胞悬液，按5×104个/ml接种于7个96孔培养板中，每孔培养液为100μl。同时每个培养板取空白一列加入生长培养基，每孔培养液为100μl，作为空白对照组。每24小时随机取1板，MTT比色法测570 nm波长光吸收值（OD570值），连续测7 d。以时间为横轴，OD570值为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.5 神经干细胞的分化培养
取生长状态良好的第3代神经球，离心后加入含DMEM/F12、10%胎牛血清、100 U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的分化培养基，然后接种于含已包被多聚赖氨酸的盖玻片的24孔板中。一部分神经球贴壁2 h后进行nestin免疫细胞化学染色，另一部分神经球继续培养7 d，进行微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP2）、神经胶质原纤维酸性蛋白（glia fibrillary acid protein,GFAP）免疫细胞化学染色，观察其生长及分化状况。
2 结果
2.1 倒置相差显微镜观察结果
从SD大鼠E14d鼠胚脊髓分离得到的单细胞，悬浮生长，呈圆球形，细胞饱满，折光性强。培养2 d，可见有2～5个细胞构成的细胞集落形成。细胞集落不断增大、增多，形成由十多个至数十个细胞形成的呈悬浮状态的细胞团，即为神经球，神经球边缘整齐，折光性强，细胞排列紧密。第5天，可见大量神经球形成，每个神经球细胞数可达数十个，甚至上百个。7 d后，可见许多大的悬浮的神经球，除少数体积较大的神经球中央的细胞开始出现折光性降低外，多数神经球含数十至数百个细胞，神经球呈球形、桑椹状，折光性强（图1）。传代培养后，单细胞可增殖形成小神经球，小神经球不断增大可形成由数百个细胞构成的大神经球。
2.2 MTT检测结果
根据MTT法所测OD值绘制大鼠脊髓P3代神经干细胞生长曲线，可以看出脊髓NSCs的基本生长规律是：细胞传代后1～2 d生长较为缓慢，为滞留期；3 d后细胞生长非常迅速，达对数生长期；第6天进入平台期，生长缓慢。
2.3 免疫细胞化学结果
2.3.1 nestin染色阳性细胞胞质着色，呈棕黄色。神经球内细胞均呈nestin染色阳性，胞核较大，胞质较少（图2）。
2.3.2 MAP2染色阳性细胞胞质及突起着色，呈棕黄色，胞体较小、突起长（图3）。
2.3.3 GFAP染色阳性细胞胞质及突起着色，呈棕黄色，胞体较大、突起粗而大（图4）。
3 讨论
3.1 神经干细胞的分离培养
目前，关于NSCs的分离培养主要是通过从脑或脊髓中分离NSCs，然后在体外增殖或使其永生化，由此大量获得NSCs。NSCs在体内的发育有精确的时空模式，在多种生长因子干预下，可以起到促进神经干细胞增殖和定向分化的作用[3]。NSCs增殖的生长因子主要是表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）。EGF和bFGF均具有很强的促细胞生长作用，是重要的有丝分裂原，在细胞的生长、发育与组织的损伤修复中起着重要的作用。bFGF和EGF是两种作用广泛的神经营养因子，可促进多个部位神经元的分裂和生长[4]。用bFGF或联合应用EGF和bFGF，可使来源于中枢神经系统不同部位的多潜能干细胞的分裂速度成倍增加，但两者作用时间不同。bFGF在NSCs增殖的早期阶段发挥作用，可以促进有丝分裂，使NSCs获得对EGF的反应性；EGF具有更强的促有丝分裂作用，在NSCs增殖后期发挥作用[5]。1996年，Weiss等首先成功地从成年哺乳动物脊髓内分离到了NSCs。他们发现此种细胞与先前从前脑室管膜下层分离到的能够在含有EGF的培养基内增殖的NSCs不同，其在EGF存在的条件下培养，未形成典型的细胞团块，而在bFGF存在的条件下形成了非常小的细胞团，但其不能更新和扩增，只有在EGF和bFGF共存的情况下才能产生具有自我更新和扩增能力的细胞团，说明脊髓源性NSCs和脑源性NSCs在增殖和分化调节方面有明显的不同之处[6]，同一种属不同部位来源的NSCs对生长因子的反应特性也各不相同。基于上述理论，本实验从大鼠胚胎的脊髓分离NSCs，应用无血清培养技术培养，即在基础培养液中添加了较高浓度的EGF(20 ng/ml和bFGF(20 ng/ml)，以维持脊髓源性NSCs的增殖状态。
3.2 神经干细胞的鉴定
神经元中间丝蛋白（intermediate neurofilament protein），即巢蛋白（nestin）。巢蛋白属于第Ⅳ类中间丝蛋白，中间丝的功能是形成和维持特定的组织细胞形态，是哺乳动物神经干细胞的一种主要细胞骨架蛋白。巢蛋白具有维持神经前体细胞正常形态的作用，可作为神经干细胞的标志物。神经胚形成开始时，nestin开始表达，神经细胞迁移分化时，nestin表达渐弱，到神经细胞迁移分化完成，nestin表达完全停止，被其他中间丝蛋白取代[7]。而且有研究表明，损伤的成体神经系统内也可检测到nestin的表达[8]，说明nestin的表达与NSCs的增殖、分化有关。目前，nestin作为早期神经细胞的标志物已被广泛地应用于NSCs的鉴定。本实验免疫细胞化学染色结果表明，原代及传代培养的NSCs呈nestin表达阳性。鼠胚脊髓NSCs在撤除生长因子、添加10%胎牛血清的条件下，在多聚赖氨酸包被的盖玻片上贴壁分化。免疫细胞化学染色显示分化细胞有MAP2、GFAP特异性抗原表达，表明脊髓NSCs具有分化为神经元、星形胶质细胞的能力。
综上所述，本实验中培养的脊髓神经干细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞的能力，能自我更新并提供足量神经组织细胞，可以为神经干细胞研究提供适宜的细胞模型。国内外实验已经表明，移植神经干细胞到合适部位，可适当改善神经系统退行性疾病的症状[9,10,11,12]，如帕金森病（Parkinson disease,PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）、亨廷顿病（Huntington disease,HD）和运动神经元（motor neurons,MN）相关疾病等。我们相信，随着神经干细胞定向分化机制研究的逐渐深入及完善，神经干细胞将会有更广阔的应用前景。
摘要：目的:体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞,观察其生长、增殖和分化特点。方法:利用倒置显微镜、MTT法、免疫细胞化学等方法检测神经干细胞的增殖、分化情况。结果:分离的脊髓神经干细胞可形成大量悬浮的神经球,并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈nestin阳性。在添加10%胎牛血清7d后,神经球细胞可分化为有神经元、星形胶质细胞特异性抗原表达的细胞。结论:体外培养大鼠胚胎脊髓可得到大量神经干细胞,并能分化为神经元和星形胶质细胞。
干细胞鉴定 篇5
目的:探讨人脑胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤干细胞的`培养方法,观察其体外增殖、分化等生物学特性.方法:应用改良神经干细胞培养基,11例人脑GBM标本中悬浮培养GBM的肿瘤细胞.采用有限稀释法筛选分离具有连续克隆能力的单细胞.通过免疫组化及电镜观察的方法,确定其干细胞特征;通过核型分析探讨该细胞的肿瘤性质;将确定的脑肿瘤干细胞(BTSCs)接种于不含生长因子的干细胞培养基,观察其在体外条件下分化的特点.结果:本组样本中10例(1例污染)获得具有连续克隆和增殖能力及干细胞特征的肿瘤细胞.结论:人脑GBM中存在具有自我更新和增殖潜能的BTSCs,在体外可将其分离、培养和纯化.
作 者：车晓明 崔大明 汪洋 施炜 刘天津 王柯 CHE Xiao-Ming CUI Da-Ming WANG Yang SHI Wei LIU Tian-Jing WANG Ke 作者单位：车晓明,崔大明,施炜,王柯,CHE Xiao-Ming,CUI Da-Ming,SHI Wei,WANG Ke(复旦大学附属华山医院神经外科,40)
汪洋,WANG Yang(复旦大学上海医学院解剖组胚学系,200032)
刘天津,LIU Tian-Jing(中国科学院细胞所,200032)
刊 名：中国临床神经科学 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CLINICAL NEUROSCIENCES 年，卷(期)： 15(6) 分类号：Q189 R741 关键词：胶质母细胞瘤 脑肿瘤干细胞 神经干细胞 悬浮培养 无血清培养基
干细胞鉴定 篇6
关键词：脐带,华通胶,间充质干细胞,分离培养,鉴定
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种具有自我更新、多向组织分化潜能的干细胞,可分化为骨、软骨、肌肉、血管、神经、韧带、肌腱、脂肪等,从而达到治疗多种疾病的目的,间充质干细胞来源广泛,现已从骨髓、外周血、胚胎、脂肪、脐血、脐带等组织中分离出了间充质干细胞,所有的提取方法各有优缺点,外周血、骨髓间充质干细胞培养时间长,含量少,细胞增殖分化潜能随年龄的增长而明显下降[1],尤其是冠心病患者MSCs增殖分化能力明显低于同龄健康者,体外长期扩增降低体内分化归巢潜能;脐血源MSCs分离效率低[2],胚胎易污染且存在伦理等问题限制了MSCs广泛应用。故寻找一种能替代骨髓间充质干细胞,并可弥补其缺陷的间充质干细胞,已越来越受到各国学者的关注。脐带华通胶是来源于剖腹产时的废弃物,来源广泛,免疫源性低,无伦理学等问题[1]。已有文献描述了脐带组织间充质干细胞的提取方法,本课题组均对其各种不同的方法进行了重复,效果不甚理想,为进一步提高间充质干细胞分离的效率,本文探讨了脐带华通胶间充质干细胞(umbilical cord wharton’s jelly-derived MSCs,UW-MSCs)体外分离、培养及分化增殖能力,尤其在提取方法上做了许多改进,取得了很好的效果,为实验研究及临床应用来源广泛的MSCs提供一条便捷的渠道。
1 材料和方法
1.1 材料
新生儿脐带由妇产科做剖腹产时提供(胎龄37~40周)。PE-CD90、PE-CD105、PE-CD44、PE-CD73、PE-HLA-ABC、FITC-CD45、FITC-CD34、FITC-HLA-DR抗体(Biolegend公司,美国);培养基(dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)、青霉素、链霉素(Hyclone公司,美国);胰蛋白酶、Ⅱ型胶源酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco公司,美国);地塞米松、β-甘油磷酸钠、l维生素C、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、胰岛素、吲哚美辛(Sigma公司,美国);超净台(苏州净化设备有限公司,中国),二氧化碳培养箱(Thermo公司,美国),倒置显微镜(Olympus公司,CKX-41,日本),离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司,中国),无菌一次性培养瓶、离心管、移液管(corning公司,美国);流式细胞仪(BD公司,美国)。
1.2 试剂配制
0.2%胶原酶溶液:0.2 gⅡ型胶原酶,加入DMEM培养基至100 m L,完全溶解后,0.22μm过滤除菌。
DMEM完全培养基:90%DMEM培养基+10%特级胎牛血清,含100 u/m L青霉素、100μg/m L链霉素。
成骨细胞诱导培养基:10%胎牛血清DMEM,0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/m L维生素C,100 u/m L青霉素、100μg/m L链霉素。
成脂肪细胞诱导培养基:10%胎牛血清DMEM,1μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10μg/m L胰岛素、200μmol/L吲哚美辛,100 u/m L青霉素、100μg/m L链霉素。
1.3 方法
1.3.1 细胞提取及培养
无菌取剖腹产新鲜脐带,以平衡盐溶液洗去脐带残留血液,剪成3~4 cm的小段,共剪成数段,取每一段沿静脉腔剪开,平铺后剔除静脉,再深入剪开华通胶,剔除2根动脉,取血管之间、血管与外膜之间的胶状物(此胶状物即为华通胶)并剪切成1 mm3及以下小块,再以平衡盐溶液冲洗后,浸于浓度为0.2%胶原酶溶液中,置于37℃水浴箱中17 h,组织块消化,液体呈黏稠状,加入相当于原液4倍量的含胎牛血清的培养基终止消化,并使血清的浓度达到20%,分装于培养瓶,置37℃、饱和温度的二氧化碳(CO2)培养箱,待细胞贴壁后更换完全DMEM培养基溶液,以后每隔3 d换液1次,细胞贴壁融合后传代培养[3,4]。
1.3.2 流式细胞仪检测细胞表面标志物
取扩增传第2代的脐带华通胶间充质干细胞,弃培养基,PBS轻洗2遍,用0.125%胰蛋白酶消化,血清终止消化后用磷酸盐缓冲液洗涤、重悬,调整细胞浓度为1×106/m L单细胞悬液,取1m L/管,共8管,分别加入鼠抗人单克隆抗体PE-CD90、PE-CD105、PE-CD44、PE-CD73、PE-HLA-ABC、FITC-CD45、FITC-CD34、FITC-HLA-DR各20μL,充分混匀,避光室温孵育30 min,PBS洗2遍(250×g离心10 min),重新制成细胞悬液0.5 m L,流式细胞仪检测[1,3,4,5]。
1.3.3 脐带华通胶间充质干细胞成骨细胞诱导分化
用0.125%的胰蛋白酶消化第2代脐带华通胶间充质干细胞,PBS洗涤后用完全培养基重悬,细胞按1×104接种在预置于6孔培养板中的无菌玻片上,完全DMEM培养基培养2 d后,细胞贴于玻片生长,弃去培养基,换为成骨细胞诱导培养基进行成骨细胞定向诱导分化[6,7],每3、4天换液,培养2周,显微镜下观察可见黑色不透明区域,肉眼可见白色结节时,取出盖玻片,成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)染色:取PBS冲洗后的细胞,置于冷丙酮中固定10min,滴加新鲜配制的底物液盖满样本部分,加盖封口膜薄膜,放置湿盒中,37℃作用15 min,水洗,用复染液染10 min左右,水洗,晾干,计算阳性细胞百分比。茜素红染色:细胞爬片经PBS冲洗2次后,用95%乙醇固定10 min,0.1%茜素红37℃孵育30min,弃去染料,蒸馏水充分冲洗,甘油明胶封片,镜检。
1.3.4 脐带华通胶间充质干细胞成脂肪细胞诱导分化
取第2代脐带华通胶间充质干细胞,细胞按1×104接种在预置于6孔培养板中的无菌玻片上,完全DMEM培养基培养2 d后,细胞贴于玻片生长,弃去培养基,换成成脂细胞诱导培养基,每3、4天换液1次,诱导培养2周。光镜下观察有成串的脂滴形成后(约10 d),取出盖玻片,用PBS冲洗2次,每次5 min,10%多聚甲醛固定10 min,油红“O”染色液染色10 min,60%异丙醇漂洗去除多余染液,蒸馏水冲洗10 min,显微镜下观察并采集图像。
2 结果
2.1 脐带华通胶间充质干细胞的分离、传代培养
脐带华通胶经胶原酶消化,接种于完全DMEM培养基培养2、3 d后,显微镜下可见明显粘附塑料培养瓶壁生长、成纤维样、伪足伸出、有折光性的细胞(图1)。3、4 d可形成集落生长,5、6 d细胞融合,传代1×106个/75 cm2培养瓶培养,3 d细胞即融合传代(图2)。
2.2 脐带华通胶间充质细胞表面抗原分子表达
P2代脐带华通胶间充质干细胞流式细胞仪检测高表达基质细胞抗原CD44、CD90、CD105、CD73、HLA-ABC,而不表达造血干细胞抗原CD45、CD34和白细胞相关抗原HLA-DR(见图3)。
2.3 脐带华通胶间充质干细胞成骨细胞诱导分化
脐带华通胶间充质干细胞在成骨细胞诱导体系培养基培养2周,可向成骨分化,ALP染色阳性细胞胞质呈灰黑色,染色后大部分细胞均呈阳性反应,强阳性细胞多为多角形,阳性百分率>85%(图4);茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,镜下可观察到散在的、深红色圆形或椭圆形结节(图5)。
2.4 脐带华通胶间充质干细胞成脂肪细胞诱导分化
脐带华通胶间充质干细胞在成骨细胞诱导体系培养基培养约2、3周,可向成脂肪分化,脂肪细胞油红“O”染色示胞浆充满了油滴空泡(见图6)。
3 讨论
间充质干细胞的研究是当前的热点之一,间充质干细胞在培养中可分化为肌肉、骨骼、神经等多种组织,既往研究间充质干细胞多从骨髓中提取,其在体外分离培养方法简单,但间充质干细胞在成人骨髓内含量比较低,约占有核细胞数的0.010%~0.001%,并且骨髓间充质干细胞的数量和分化能力随着年龄的增长相对减少和减弱,如果合并感染及患有肿瘤等恶性疾病时,其分化能力更表现出明显下降,限制了干细胞的研究和临床应用。现在有越来越多的学者通过脂肪、外周血、胚胎、脐血、脐带等其他途径提取干细胞,均获得不同程度的效果。脐带作为医疗废弃物以前不被重视,现在的研究可从其中的华通胶组织中分离出MSCs,且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs,免疫原性低,取材方便,无伦理学问题,因此越来越受到研究者们的关注[1]。
脐带独特的生理功能确定了其外膜与动静脉之间的华通胶组织中不仅含有大量的间充质干细胞,而且更含有大量的胶原纤维,胶原分子呈稳定的三维螺旋形状,大多数的酶对其不起作用,胶原酶是从微生物的发酵液中提取的一种酶制剂,即胶原蛋白水解酶,对胶原组织有着特异性的溶解作用,它能在生理p H和适当的温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构,使其断裂,并被分解,在这一过程中不损伤不含有胶原蛋白的间充质干细胞及其他蛋白质和组织。本实验通过胶原酶的这一特性,适当控制p H值、时间、温度,将脐带华通胶中的胶原组织溶解,解除其对间充质干细胞的禁锢,用含过量血清的培养基稀释已溶解的含大量间充质干细胞的脐带华通胶悬液,并进行分装培养,间充质干细胞可以在短时间内贴壁、快速生长,缩短原代细胞培养时间。
观察第2、3代生长良好的间充质干细胞,在标准培养条件下粘附于塑料制品,成纤维细胞样生长,流线样走向生长或漩涡样生长,流式细胞仪检测其表面标志物高表达间充质干细胞抗原CD44、CD90、CD105及CD73,并表达HLA-ABC,而不表达CD45、CD34及HLA-DR抗原,CD44、CD90、CD105及CD73是间充质干细胞表面特异抗原,CD34和CD45是造血干细胞标志性抗原,白细胞相关抗原DR低表达可证明分离出的脐带华通胶间充质干细胞免疫原性弱,不能引起排斥反应,异体移植几乎不受影响。在相应的诱导条件下,可向成骨、成脂肪分化[8]。所有的检测结果均符合国际细胞疗法协会关于间充质干细胞的鉴定标准。
在本实验研究中,脐带华通胶通过胶原酶在特定的条件下消化从而提取间充质干细胞,原代细胞培养时间短,获取细胞数量多,无疑是理想的提取间充质干细胞方法之一,此方法较之以前的同类方法改进了关键步骤,方法简单,且来源不受限制,易培养、传代、扩增、纯化,此方法的建立为间充质干细胞的进一步实验研究及临床应用提供了良好的种子细胞。
参考文献
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干细胞鉴定 篇7
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级2周龄雄性大鼠一只 (体质量75g, 由桂林医学院实验动物中心提供) 。
1.2 试剂
DMEM/F12和胎牛血清;胰蛋白酶;兔抗大鼠FITC-CD29、PE-CD90单克隆抗体;兔抗大鼠Nse单克隆抗体, SABC免疫组化试剂盒 (北京欣博盛生物科技有限公司) 。
1.3 BMSCs的分离、培养及传代
大鼠断颈处死, 无菌分离四肢长骨, 暴露骨髓腔, 用注射器吸取无血清培养液反复冲洗骨髓腔, 收集冲洗液, 离心 (800r/min×6min) , 弃上清, 用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞, 计数后以109/ml密度接种于25cm2的培养瓶, 记P0, 37℃培养箱中培养。48h后半量换液, 以后每3天换液一次。至10~13d左右, 贴壁细胞80%~90%汇合时, 0.125%胰酶消化, 约1~2min, 1传2, 记P1, 以此类推, 利用BMSCs易消化的特点达到纯化目的, 须严格控制酶的量和消化时间。每次传代用新培养瓶, 以弃去贴壁非常牢固的细胞, 通过多次传代对细胞进行纯化。
1.4 形态学观察
用倒置显微镜观察并拍照。
1.5 BMSCs细胞表型鉴定
取生长良好的P3代细胞, 制成细胞爬片, 用4%多聚甲醛固定30min, 10%BSA封闭30min, 将适度稀释的荧光标记的单克隆抗体FITC-CD29、PE-CD90分别加入不同的切片上4℃过夜, 荧光显微镜下观察荧光分布, 拍照。
1.6 BMSCs定向诱导分化
取同一批P3代细胞, 制成细胞爬片, 适当培养待贴壁后分为对照组和诱导剂组。诱导剂组采用1mmol/Lβ-ME的10%FBS低糖DMEM预诱导, 24h后用含2mmol/Lβ-ME无血清低糖DMEM诱导6h, 对照组中不加诱导剂, 一直培养。
1.7 神经元样细胞的免疫组化鉴定
采用SABC免疫组化法, 用4%多聚甲醛固定30min, 0.1%Triton X-100透膜30min, 3%H2O2/甲醇消除内源性过氧化物酶, 封闭血清孵育20min, 将一抗 (兔抗大鼠Nse) 按适当比例加于玻片上, 4℃湿盒内过夜, 次日加生物素化二抗后37℃下孵育30min, 加SABC, DAB显色, 苏木素复染, 观察, 拍照, 以PBS代替一抗作阴性对照。
2 结果
2.1 倒置显微镜观察
原代分离的细胞大小均一、圆形、折光性强, 悬浮, 红细胞居多;48h后可见部分细胞贴壁, 成短梭形;4~5d开始快速增殖;培养8~10d后细胞渐铺满培养瓶, 成长梭形, 漩涡状生长 (图A) , 此时结束原代培养, 进行传代扩增, 以去除结节状分布的小圆形细胞 (图B) 和长梭形的贴壁性强的成纤维样细胞 (图C) 。传代培养的细胞3~4h即贴壁, 细胞增殖后以梭形为主, 排列有明显方向性 (图D-F) 。不添加任何生长因子, 细胞传5~6代左右, 老化现象严重。
A:原代培养9d (×200) B:随传代去除的结节分布的杂细胞 (×200) C:随传代去除的成纤维样细胞 (×200) D:第一代BMSCs (×200) E:第二代BMSCs (×200) F:第三代BMSCs (×200) 图A~F细胞培养过程中的形态学观察 (倒置光学显微镜下观察;×200)
2.2 BMSCs表型鉴定
P3代细胞免疫荧光显示BMSC的表面标记物CD29、CD90阳性 (图G-H) 。
2.3 BMSCs的神经元诱导结果
倒置显微镜观察, BMSCs在1h左右开始, 即发生形态变化, 扁平、梭形的细胞胞浆回缩, 向核集中, 1~3d后出现多个延长的胞体突起, 类似于神经元样细胞的假足 (图I) ;而空白组始终未变化 (图J) 。免疫细胞化学染色显示, 实验组神经元样细胞的胞体及部分突起成棕黄色, Nse阳性表达 (图K-M) ;与诱导组同时间点的空白组几乎全为阴性 (图N) 。
I:伸出假足的神经元样细胞 (×200) J:空白组无明显假足形成 (×200) K:诱导早期Nse阳性表达 (×200) L:诱导晚期的Nse表达 (×200) M:诱导晚期的Nse表达 (×400) N:空白组Nse阴性表达 (×200) 图I~Nβ-ME诱导P3代细胞后的形态学变化和Nse的表型鉴定 (FN:倒置光学显微镜下观察;K-M:免疫组化染色;×200)
2.4 未加任何诱导剂组
空白组培养30d左右时BMSCs的自分化观察, 可见神经样细胞和圆形透亮的凋亡细胞。 (图O-Q)
O:双极神经元样结构, 可见突起末端的分支 (×200) P/Q:典型神经元样细胞, 可见多个树突和单个较长的轴突样结构 (×200) 图O~Q BMSCS自分化的形态学观察 (倒置光学显微镜下观察;×200)
3 讨论
BMSCs是骨髓中除造血干细胞以外的非造血性干细胞, 正常时只有极少数在增殖期, 在骨髓中的丰度很低, 约占骨髓有核细胞的0.001%~0.01%[1], 但取材方便, 易于体外分离和扩增, 具有多向分化的潜能[2]。目前获取BMSCs的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞分选法、免疫磁珠法4种[2]。本实验通过全骨髓贴壁法, 利用细胞不同的贴壁特性, 随传代完成对BMSCs的纯化, 并通过诱导证实了其分化能力, 为今后进一步的研究和应用奠定了基础。
干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的尚未分化的原始细胞, 具有经培养不定期的分化并产生特化细胞的能力, 根据来源不同可分为造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞等。间充质干细胞广泛存在于机体的多种组织 (骨髓、脐带血、脂肪组织等) 中, BMSCs是骨髓中胚层未分化的间充质干细胞, 正常时只有极少数处于增殖期, 在骨髓中的丰度很低, 约占骨髓细胞总数的0.001%~0.1%, 是由形态、增殖能力及分化潜能各不相同的不同亚型的异型性细胞群构成[3]。由于目前尚缺乏特异的干细胞标记物, 也难以通过分化或增殖能力的不同, 将一种亚型同另一种亚型区分开来, 因此无统一的获取高纯度BMSCs的方法。对于BMSCs的体外分离培养主要有以下4种:密度梯度离心法、全骨髓贴壁法、流式细胞分选法、免疫磁珠法。 (1) 密度梯度离心法利用骨髓细胞成分的比重不同采用细胞分离液有效的将骨髓细胞分层且对细胞活性影响小, 但缺点在于破坏BMSCs相应的微环境, 丢失大量可能促进BMSCs生长的细胞因子; (2) 免疫磁珠法和流式细胞仪筛选技术法在分选过程中, 对细胞的活性影响特别大, 可导致提取的细胞活性丧失、增殖能力消失, 而且耗费巨大, 因此应用也普遍较少; (3) 全骨髓贴壁法作为一种简单、经济、高效的方法, 被越来越多的应用[3]。研究发现, BMSCs参与构成造血干细胞的生存和分化的微环境, 通过分泌细胞外基质成分对造血干细胞的分化成熟进行调控, 体外培养条件下可跨胚层多向分化, 具有很强的可塑性[4]。目前大多数实验室通过BMSCs不表达造血干细胞标记物CD14、CD34、CD11b和白细胞表面标记物CD45, 而表达CD29、CD44、CD71、CD90和CD106等标记物进行初步鉴定;阶段特异性胚胎干细胞抗原-4 (SSEA-4) 和神经节苷酯 (Ganglioside) 可用于准确鉴定BMSCs, 以及现在正在研制的用特异性单克隆抗体分离BMSCs类群。与胚胎干细胞和神经干细胞相比, BMSCs有着难以比拟的优势[5,6]: (1) 取材、移植方便、安全、损伤小、来源丰富, 骨髓穿刺便可获得; (2) 短期内可大量扩增:体外培养时, 起始生长速度缓慢, 约6~7d开始, 增长速度明显加快; (3) 低免疫原型:因细胞处于原始状态, 不易被识别, 所以不存在免疫排斥的特性, 没有血型匹配问题; (4) 具有较强的分化潜能、可塑性和跨胚层分化能力, 其分化表现出明显的组织特异性, BMSCs所到达的组织微环境决定其分化方向; (5) 归巢性:损伤信号可以刺激干细胞向受损器官、组织迁移分化, 能够归巢到受损病灶, 对受损的细胞进行修复; (6) 易被外源基因转染并且能高效、稳定表达多种治疗性外源基因; (7) 能在宿主体内长期存活。
本实验采取的全骨髓贴壁法主要是通过利用BMSCs贴壁而造血干细胞悬浮的方法以及BMSCs与成纤维细胞等贴壁细胞对胰酶消化反应 (包括胰酶的用量和消化时间) 的不同, 利用消化的时间差, 并通过传代, 达到分离纯化BMSCs的目的, 其中BMSCs较成纤维细胞, 单核细胞更易被消化, 此法操作简单, 对细胞微环境和细胞活性影响都很小, 使其易于保持在类似于骨髓内生长时的微环境, 经过2~3次传代, 便可得到相对纯化的BMSCs。在整个机械分离大鼠骨髓的过程中, 应注意严格的无菌操作, 在剥离皮肤、游离四肢肌肉及分离骨髓的各个过程完成后, 要注意及时更换无菌器械, 不能存在侥幸心理, 避免污染。另外, 由于BMSCs生长时的密度依赖性, 在传代时应注意适当的比例, 以1传2为宜, 在传代过程中一定要注意消化时间, 以消化1~2min, 梭形细胞变圆时加含血清培养液终止消化为宜, 切忌消化时间过久。实验发现尽管BMSCs具有向神经元样细胞分化的能力, 但诱导体系和培养体系仍需改善, 因为细胞培养过程中存在不同程度老化现象, 表现为原本梭形的细胞呈宽大的噗状, 细胞胞质内出现空泡和颗粒。诱导后形成的细胞由于一些原因尚无法在功能上进一步确定是否为神经元细胞, 所以只能暂时称之为神经元样细胞。本实验最主要的意义是在一定程度上证明了BMSCs在无诱导条件下发生了自分化现象形成了神经元样细胞, 由于对细胞自身的干预很少, 使得后续研究的精确性得以保证。以往的研究和本实验均表明, 在特定的诱导条件下BMSCs能够分化为神经元样细胞。
BMSCs移植已开始在临床上用于治疗多种神经系统疾病, 取得了相对不错的效果[7], 但是对治疗机制尚不十分清楚, 研究发现移植后的BMSCs分化为神经元样细胞的比例较低, 认为可能是通过其分泌营养因子、生成血管、释放激素和抑制炎性反应来发挥治疗作用, 而并非发生真正意义上的细胞取代[8~10]。既然这样, 笔者认为可以另辟思路, 去繁就简, 先去掉药物诱导这一环节, 通过分析比较BMSCs的直接移植和自分化为神经样细胞后再移植治疗神经系统疾病的效果, 这样可排除药物诱导对BMSCs的相应基因表达的干扰, 使机制或通路的研究尽可能简单, 以便进一步阐明, 而一旦确定相应治疗机制后, 再通过药物诱导, 荧光定量PCR技术和Western技术分析通路中相关基因和蛋白分子水平的改变。与传统的直接药物诱导比较, 这样可大大提高有效诱导药物的筛选和药物有效成分提取的效率, 避免不必要的研究。为了尽可能减少诸多因素对BMSCs的干扰, 其自分化就显得至关重要。本实验在形态学上初步证明了BMSCs在10%FBS的DMEM培养液, 5%CO2, 37℃培养条件时, 接种于25cm2培养瓶中培养30d左右时, 可见明显的神经元样细胞形态的细胞, 与此同时其余的细胞均发生凋亡并逐渐消失 (图o-q) , 但是自分化后形成的神经元样细胞的数目少, 单个分布, 无法进行下一步的表型鉴定和相关的细胞电生理功能研究, 这一缺陷应该可以通过接种75cm2培养瓶来获取相对较多数量的神经元样细胞, 以进行免疫荧光和免疫组化鉴定及后续的突触和电生理功能的研究, 该方面正在实验验证中。本实验在一定程度上证明了BMSCs确实存在自分化现象, 也是本实验设计的可行性依据, 而国内的文献鲜有报道BMSCs的自分化这一现象。
综上所述, 实验通过全骨髓贴壁法, 利用细胞不同的贴壁特性, 随传代完成对BMSCs的纯化, 并通过诱导证实了其分化能力, 更重要的是在一定程度上证实了BMSCs在培养过程中的自分化, 为相应的后续实验奠定了坚实的基础。
摘要：目的 探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 方法以及通过形态学观察BMSCs在培养过程中是否存在自分化现象。方法 应用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs, 倒置显微镜下观察细胞形态, 直接荧光抗体染色法鉴定培养的细胞, 免疫细胞化学方法鉴定其向神经元的诱导分化。结果 原代末期及传代的BMSCs呈均一长梭形生长, 第三代荧光抗体染色CD29, CD90阳性表达, 神经元特异性标记物Nse (神经元特异性烯醇化酶) 表达阳性, BMSCs在未加任何诱导剂时培养30d时发生了自分化现象。结论 贴壁培养法是一种有效的获得高纯度BMSCs的方法, 在体外培养时BMSCs可发生自分化现象。
关键词：骨髓间充质干细胞,全骨髓贴壁法,细胞培养,自分化
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干细胞鉴定 篇8
1 材料与方法
1.1 细胞系和细胞培养基
U251细胞系由中南大学肿瘤研究所惠赠。特级胎牛血清（Hyclone）、DMEN/F12(1:1）培养基（Gibco）、B27添加剂（Gibco）、重组人表皮生长因子（EGF,PeproTech）、重组人碱性成纤维生长因子（b FGF,PeproTech）。配制成10%的含血清培基和含EGF(20ug/L）、bFGF(20ug/L）、2%B27的无血清培基。
1.2 检测试剂
小鼠抗人CD133单克隆抗体（R&D System），小鼠抗人Nestin单克隆抗体（Chemicon）,FITC标记山羊抗小鼠IgG(Boster）,Cy3标记绵羊抗小鼠IgG(Sigma）。
1.3 细胞培养及传代
将U251细胞接种于培养瓶中，用10%的含血清培基贴壁培养，每48小时按1:3的比例传代一次，使之大量扩增。取处于对数生长期的细胞，用D-Hanks液漂洗两遍后，0.25%胰酶消化，自制巴斯德吸管机械吹打成单细胞悬液，洗去胰酶重悬于无血清培基。台盼兰染色并用计数板计数，调整成5×105/孔接种于6孔板，在37℃，5%CO2培养箱中悬浮培养。增殖形成肿瘤干细胞球后，将其收集并机械吹打，在保存细胞活力的前提下尽量将肿瘤干细胞球吹散，重悬于无血清培基，按1:2比例传代于6孔板。
1.4 肿瘤干细胞的诱导分化
取性状稳定的第3、4、5代的肿瘤干细胞球，反复吸打成细胞悬液，用D-Hanks液漂洗两遍后，直接接种到10%的含血清培基中，肿瘤干细胞球完全转变成单层贴壁细胞并增殖后，按1:3的比例传代。
1.5 U251细胞在无血清和含血清培基中交替培养，肿瘤干细胞的冻存和复苏
按1.3所示的方法在无血清培基中培养出典型的肿瘤干细胞球后，按1.4所示的方法接种到含血清培基并传代一次后，再按1.3所示方法接种到无血清培基。如此在无血清和含血清培基中交替培养，重复3次。
取处于对数生长期的含血清培基贴壁培养的U251细胞，用以无血清培基配制的含10%DMSO的冻存液保存细胞于液氮中。一个月后常规方法复苏，无血清培基重悬细胞，按1.3所示方法悬浮培养。取肿瘤干细胞球反复吹打成细胞悬液后冻存、复苏、再培养，方法及材料同血清培基贴壁培养的U251细胞。
1.6 肿瘤干细胞球的免疫组化
取培养到第5代的肿瘤干细胞球及其反复吹打后的细胞悬液，离心后滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，静置待干，4%多聚甲醛固定，正常血清封闭（对Nestin染色尚需在此之前用0.4%Triton X-100处理标本30min），抗CD133或抗Nestin一抗孵育4℃过夜，Cy3或FITC标记二抗避光孵育37℃30min，每步骤间均用0.01M PBS冲洗3遍。封片后置荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 肿瘤干细胞球的形成
将U251细胞接种至无血清培基，2h后倒置相差显微镜观察，大部分细胞悬浮生长，但仍有部分细胞贴壁并长出突起，见图1A。24h后部分孔中可见肿瘤干细胞球，第三天贴壁细胞仍较多，贴壁细胞有不规则突起，但增殖不明显；此时各孔明显可见肿瘤干细胞球生成，部分肿瘤干细胞球表层细胞长出突起并贴附培养板底壁，见图1B。本实验室采用相似方法和培基培养的人胚胎神经干细胞球没有这种现象。传代后肿瘤干细胞球增殖较迅速，且贴壁细胞和贴壁的肿瘤干细胞球均明显减少，见图1C。培养到第三代，培养板中几乎无贴壁细胞，肿瘤干细胞球呈典型的球形，边缘规则无突起，折光性好，细胞间连接较紧密，见图1D。第三代后肿瘤干细胞球增殖速度，形态等都较稳定。约72h传代一次，如培养超过5d，肿瘤干细胞球大多停止生长，折光性下降，并可见肿瘤干细胞球周围有絮状物生成。
[A:U251细胞接种到无血清培基2h后，大部分细胞呈球形并悬浮生长（×100）;B:接种72h后，可见肿瘤干细胞球生成，其表层细胞长出突起并贴附培养板底壁，周围可见贴壁细胞，但增殖不明显（×40）;C:在无血清培基中接种72h后的人胚胎神经干细胞球，形状较规则，未见到细胞突起（×40）;D:无血清培基中培养的第三代的U251细胞，培养板中几乎无贴壁细胞，肿瘤干细胞球形状较规则，折光性好（×40）]
2.2 诱导分化
吹打成细胞悬液的脑肿瘤干细胞转移到含血清培基中后表现出很强的贴壁能力，2h内绝大部分细胞开始贴壁，细胞形态及增殖性与原始的U251细胞相似。
肿瘤干细胞球转移到含血清培基中后，4h内可见几乎所有的肿瘤干细胞球贴附培养板底壁，见图2A；随后肿瘤干细胞球变扁，培养细胞从肿瘤干细胞球中迁移出来，向四周爬行生长，见图2B。48h内绝大部分肿瘤干细胞球完全转变成单层贴壁细胞，均较本实验室相同条件下培养的神经干细胞球明显迅速。
[A:脑肿瘤干细胞球接种到含血清培基中4h后，部分细胞开始贴壁分化，但大体仍维持细胞球状态（×40）;B:接种36h后，大部分细胞从脑肿瘤干细胞球中迁移出来，向四周爬行生长，细胞呈梭形（×40）]
2.3 U251细胞的反复贴壁和悬浮培养及肿瘤干细胞的冻存和复苏
U251细胞在含血清培基中呈贴壁生长，而在无血清培基中呈悬浮状态生长并形成脑肿瘤干细胞球，且都能在相应的培养基中连续传代。更换培养基后U251细胞的生长方式很快发生转换，重复几次后这种转换能力并不减弱。
贴壁培养的U251细胞经冻存、复苏后仍能顺利的分离培养脑肿瘤干细胞，且其生成脑肿瘤干细胞球的能力未见减弱。肿瘤干细胞球吹打成的细胞悬液经冻存、复苏、再培养后，细胞成球数量减少，增殖缓慢。考虑可能与反复吹打导致细胞活力下降，及将脑肿瘤干细胞球吹成单细胞悬液较困难，而未吹散的残存肿瘤干细胞球直接冻存后复苏困难，大部分不能存活等因素有关。
2.4 未分化的脑肿瘤干细胞能表达CD133和Nestin
本实验中从U251细胞中分离培养的脑肿瘤干细胞球中的脑肿瘤干细胞，及吹打后散在的单个未分化脑肿瘤干细胞均呈CD133和Nestin染色阳性，见图3。
[A:U251细胞BTS中的BTSC标记CD133阳性（×100）;B:U251细胞BTS中的BTSC标记Nestin阳性（×100）;C:单个的未分化BTSC标记CD133阳性（×400）;D:单个的未分化BTSC标记Nestin阳性（×400）]
3 讨论
干细胞（Stem cell,SC）是一类具有自我更新能力并通过自我更新获得永生化且具有分化潜能的细胞。人们同时也注意到，肿瘤无限增殖特性与正常干细胞相似。那么肿瘤中是否存在某种具有干细胞相似性质的细胞，是否正是它们在主导着肿瘤的发生、增殖、转移和复发？肿瘤细胞是否就是源于正常干细胞的变异？迅速发展的干细胞理论能否帮助我们在长期困扰人类的肿瘤起源问题上取得突破？
近年来，研究者在血液和乳腺肿瘤干细胞的理论和实验研究方面取得的一些进展向我们揭示了实体肿瘤干细胞存在的可能性[3,4,5]。2003年，Singh和Hemmati各自独立证明了神经上皮来源脑肿瘤中存在干细胞性质的肿瘤细胞[1,2]。本研究中，我们从U251细胞中分离出脑肿瘤干细胞，并连续传代，观察其形成脑肿瘤干细胞球的能力和分化能力；用免疫荧光法证实神经干细胞相关标志物CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞中的表达。
脑肿瘤干细胞是一个较新的概念，其起源并不确切，脑肿瘤干细胞有自我更新、分化等能力，提示着它们可能来源于正常的神经干细胞。而脑肿瘤干细胞与正常神经干细胞有着相似的标志物，也从一个侧面支持了肿瘤干细胞来源于正常的干细胞[1,2,6]。Recht和Seyfried从基因突变的角度也提出NSC有可能是脑肿瘤干细胞的起源细胞，并在神经系统肿瘤发生的最初阶段起着重要的作用[7,8]。
脑肿瘤干细胞理论指出脑肿瘤可能由少数脑肿瘤干细胞通过不断的自我更新和增殖、分化而来[1,9]。我们在实验中观察到只有少数的细胞能在悬浮状态下长期存活并生成脑肿瘤干细胞球，这些细胞即脑肿瘤干细胞。这些脑肿瘤干细胞可持续传代，细胞数量不断扩增，在一定条件下能分化为单层贴壁细胞并与原始U251细胞相似。以上实验现象也符合脑肿瘤起源于脑肿瘤干细胞的观点。
脑肿瘤干细胞理论的提出和脑肿瘤干细胞的分离，培养及鉴定均具有重要意义。首先，脑肿瘤干细胞理论为脑肿瘤的来源，脑肿瘤的增殖、转移和复发等研究提供了全新的思路；其次，脑肿瘤干细胞可成为脑肿瘤基础研究的重要材料，进而有可能提出新的治疗理论，发现新的治疗药物和方法；最后，由于脑肿瘤干细胞与神经干细胞的相似性，可以预见二者的研究必将相互促进，特别是神经干细胞相关的一些成熟的理论将在脑肿瘤研究领域引发新的思考。
参考文献
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干细胞鉴定 篇9
关键词：骨髓间充质干细胞,无血清培养,细胞培养,流式细胞仪
骨髓间充质干细胞 (MSCs) 来源于中胚层, 是具有自我更新及多向分化潜能的成体干细胞之一。在体外不同诱导条件下, 可跨胚层向中胚层细胞如脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞等分化[1]。近年来研究发现, MSCs还可以分化为神经元、神经胶质细胞、肝细胞等[2]。MSCs易取材、免疫原性低、供体无明显并发症等特点, 使其成为细胞治疗、基因治疗及组织器官再造的理想材料[3,4]。MSCs存在于人和动物的多种组织中, 骨髓中的MSCs最易分离获得, 但含量极低, 约为0.001%～0.010%[4,5], 因此, MSCs体外分离纯化、培养、扩增至足够数量是实验研究和临床应用的前提。本实验旨在探索MSCs体外分离纯化、培养、扩增、鉴定的方法, 以获得大量、高纯度、高活性的MSCs, 为MSCs的系列研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 实验动物
清洁级3周龄Wistar大鼠 (甘肃省中医学院实验动物中心提供) , 雌雄不限, 体重100～150 g。
1.2 主要试剂
DMEM/F12 (美国GIBCO公司) , 胎牛血清 (杭州四季青) , 胰蛋白酶 (Sigma公司) , Percoll分离液 (Pharmacia公司) , 转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、牛血清白蛋白、纤粘连蛋白、低分子肝素、青霉素、链霉素 (Sigma公司) , 噻唑蓝 (MTT) 、二甲基亚砜 (DMSO, GIBCO公司) , CD29mAb-FITC、CD44mAb-FITC、CD34mAb-PE (BD公司) 。
1.3 主要实验仪器
CO2培养箱 (SANYO-IWCD-175型) , 超净工作台 (SW-CJ-2FD) , FACSAria型流式细胞仪 (BD公司) , 倒置相差荧光显微镜 (尼康公司)
1.4 方法
1.4.1 原代大鼠骨髓MSCs的分离、培养和传代
将大鼠颈椎脱臼处死, 浸泡于75%的酒精中15～20 min, 无菌条件下分离股骨、胫骨, PBS冲洗, 去除骨两端, 用DMEM/F12反复冲洗骨髓腔, 经1 ml注射器吸制成单细胞悬液, 按1∶1比例将其加入到Percoll分离液中 (1.083 g/ml) , 以2 000 r/min离心20 min, 吸取中间雾状的单细胞层, 并用DMEM/F12洗涤两次, 1 000 r/min离心20 min, 其中一部分加入有血清组培养基中, 另外一部分加入无血清组培养基中, 按照3×104个/毫升的密度将细胞接种于培养瓶中, 置于37℃、饱和湿度、含5%CO2的孵箱中培养, 3 d后更换培养基, 去除未贴壁细胞, 以后每2～3 d换液一次, 待细胞融合达70%以上, 用0.25%胰蛋白酶 (含0.02%EDTA) 消化, 按1∶2的比例传代。倒置相差荧光显微镜下观察细胞生长和形态。
有血清组培养基为含10%胎牛血清、氢化可的松 (10-6mol/L) 、青霉素 (100 U/ml) 及链霉素 (80 mg/ml) 的DMEM/F12培养基。无血清组培养基为含转铁蛋白 (100μg/ml) 、亚硒酸钠 (10 mg/ml) 、胰岛素 (10μg/ml) 、牛血清白蛋白 (1 mg/ml) 、纤粘连蛋白 (40 ng/ml) 、氢化可的松 (10-6mol/L) 、青霉素 (100 U/ml) 及链霉素 (100 mg/ml) 的DMEM/F12培养基。
1.4.2 MSCs增殖水平的检测及生长曲线的绘制
采用MTT法, 分别对两组培养、生长状态良好的第一、二、三代细胞, 以5×103/孔的密度分别接种于96孔板中。有血清组每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培养基200μl, 无血清组每孔加入自制培养基200μl。每组设5个平行组, 置37℃、含5%CO2的孵箱中培养。两组每3 d换液一次。此后每天同一时间, 两组分别随机拿出一板加入MTT溶液 (5 mg/ml) 20μl, 继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养6 h, 吸弃孔内液体, 每孔加入150μl DMSO。将96孔板放置在酶联免疫监测仪上震荡20 min, 用双波长测定法, 酶联免疫测定监测波长492 nm, 参比波长630 nm, 测定OD值。取5孔OD值的均值, 以时间为横坐标, 以无血清组OD均值和空白对照孔OD均值的差值为纵坐标, 绘制生长曲线。
1.4.3 MSCs表面CD分子监测
收集第三代MSCs, 用胰酶消化细胞, 制成悬浮细胞, 调整细胞浓度为5×107个/毫升。分别取100μl细胞悬液, 加入两组样品管和对照管, 两组样品管中分别加入FITC标记的兔抗大鼠CD34、CD45、CD44、CD29抗体 (1∶100稀释) , 对照管中加入同型对照抗体, 4℃避光孵育30 min后, 加入2 ml细胞染色缓冲液 (PBS+1%FBS+0.1%Na N3, 0.22 mm滤器过滤) , 混匀1 000 r/min离心5 min, 弃上清液, 加入0.5 ml细胞染色缓冲液重选细胞, 流式细胞仪监测、分析。
1.4.4 MSCs细胞周期的测定
参照Cycle Test试剂盒说明书进行操作, 分别取两组细胞的第三代MSCs, 胰酶消化, PBS漂洗2～3次后, 70%酒精4℃固定24 h, 取100μl细胞悬液, 加入PI染料1 ml, 4℃避光孵育30 min, 流式细胞仪监测细胞周期。
2 结果
2.1 原代MSCs的分离和培养
实验中分离的原代MSCs体外培养48 h后, 细胞数量明显增多, 原来单个散在的细胞呈集落生长, 多呈圆形、椭圆形, 部分呈梭形, 贴壁生长。72 h后换液去掉漂浮细胞见少数贴壁细胞开始分裂增殖, 部分区域形成细胞团簇, 细胞为纺锤形, 呈现典型的成纤维细胞样外观。7 d后首次全量换液, 贴壁细胞大部分呈梭形, 栅栏样分布, 细胞数目增多, 融合度为70%。无血清组第4～5 d出现较多贴壁细胞, 9～10 d有明显的细胞丛生长, 18～20 d细胞融合成片 (见图1中A、C) ;有血清组第2～3 d出现较多贴壁细胞, 7～8 d有明显的细胞丛生长, 14 d细胞融合成片 (见图1中B、D) 。
2.2 MSCs生长曲线的绘制
采用MTT法分别测定两组的第三代MSCs。细胞生长曲线显示:两组细胞的增值能力相似, 生长曲线均呈“S”形。有血清组细胞经过3 d左右的滞留期后, 进入细胞对数生长期, 到第7～8 d细胞逐渐融合, 到达生长平台期;无血清组细胞经过5 d左右, 进入细胞对数生长期, 第10 d细胞逐渐融合, 到达生长平台期 (见图2) 。
2.3 流式细胞仪监测MSCs表面CD分子表型
选取两组第三代MSCs, FITC间接标记, 流式细胞仪检测, 结果显示:两组的大鼠MSCs均表达CD29、CD54, 不表达CD34、CD45 (见图3) 。经统计学分析, 两组细胞之间无显著性差异 (P>0.05) 。
2.4 MSCs细胞周期检测
采用流式细胞仪分别监测分析G0/G1期、G2/M期细胞百分比, 有血清组平均值分别为46.4%、10.9%, 无血清组分别为68.0%、9.2% (见表1、图4、图5) , 两组比较差异有显著性 (P<0.05) 。
3 讨论
MSCs是一种来自中胚层发育的早期干细胞, 不仅有多向分化和支持造血功能, 还有免疫抑制和诱导免疫耐受的作用, 其与肿瘤的发生发展也可能密切相关。在整个生命过程中, 组织器官无论是处于稳定状态还是环境改变时, 都需要这些骨髓来源的MSCs不断补充、更新, 因此, 具有广阔的应用前景。
从骨髓中分离MSCs的方法主要有贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法4种。后两种对细胞的活性影响较大, 甚至会导致细胞完全失去活性。本实验采用Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合分离纯化MSCs, 依据比重差别, 用比重1.083的Percoll淋巴细胞分离液分离骨髓MSCs, 经梯度离心后, 能有效地将绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板去除, 获取纯度较高的单个细胞, 再根据造血细胞和MSCs的贴壁性能差异, 经体外贴壁培养, 获得纯度较高的MSCs。
大部分研究者在进行动物细胞体外培养时仍采用有血清培养基。血清的主要作用在于给细胞提供生长所需的生长因子、激素和其他营养物质。但血清价格昂贵, 容易被支原体、病毒等微生物感染, 此外血清中大量复杂的成分对细胞的分离纯化有很大影响。鉴于上述不利因素, 从20世纪50年代开始, 细胞生物学家为研究血清单个成分在细胞培养中的作用, 寻找合适的补充因子, 以替代血清。Hayashi和Papeleu.P分别利用添加细胞因子的无血清培养基均培养出目的细胞[6,7]。
本研究采用添加细胞因子的无血清培养基。添加的因子中, 亚硒酸钠能消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害;受体与转铁蛋白/Fe3+复合物结合是细胞获取必要微量元素 (铁) 的主要来源;白蛋白可以和很多物质, 如维生素、激素、生长因子等结合从而稳定和调节上述物质的活性, 并有调节渗透压, 避免细胞受机械损伤等作用;胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸合成, 抑制细胞凋亡, 是重要的细胞存活因子;纤粘连蛋白是细胞的贴壁因子。本研究用此种无血清培养基成功培养出大鼠骨髓间充质干细胞, 同时, 该培养基所有添加的物质及剂量均已知, 有助于今后进一步研究骨髓间充质干细胞定向分化的调控, 提高实验的精准性。此外, 流式细胞仪检测无血清培养下的细胞68.0%处于细胞周期的G0/G1期, 而有血清培养下的细胞46.4%处于细胞周期的G0/G1期, 说明无血清培养的条件能较好地保持细胞处于G0/G1期, 使其保持更好的分化潜能, 较好地保持其干细胞特性。
综上所述, 本研究找到MSCs体外分离纯化、培养、鉴定的方法, 为MSCs的系列研究奠定了基础。
参考文献
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新生小鼠心肌细胞的纯化培养与鉴定 篇10
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新生KM小鼠,1~3日龄,雌雄不限,由山东省绿叶制药有限公司实验动物中心提供。DMEM(低糖):美国GIBCO;胎牛血清(FBS):杭州四季青;胰蛋白酶:吉泰生物;胶原酶Ⅱ:上海生物工程;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brdu):SIGMA;多聚甲醛:北京益利;5%Triton-X-100:美国Amresco;抗CTnT单克隆抗体:晶美生物;FITC标记的羊抗小鼠多克隆抗体;DAPI:美国Sigma;Trizol试剂(北京天为时代)、AMV逆转录酶和oligo dT18(Promega)
1.2 仪器与设备
DL-5000冷冻离心机,HERAcell CO2培养箱;Leica倒置显微镜,Zeiss META 510激光共聚焦显微镜;PE9700型PCR仪;electrophoresis documentation and analysis system电泳凝胶成像系统,JEM-1230型透射式电子显微镜。
2 实验方法
2.1 新生小鼠心肌细胞的分离、纯化与培养
2.1.1 心肌组织分离
取出生后1~3 d的新生小鼠,消毒后送入超净工作台内剖取心脏,放入装有预冷的D-hanks液的平皿中,去除心耳,剪开心脏,预冷D-hanks液中洗净血渍,转入干燥平皿,在冰盘上细心将心室肌剪成1~2mm3大小的组织块。
2.1.2 心肌细胞分离与收集
将组织块转移至锥形瓶,加10m L混合酶(0.08%胰蛋白酶和0.04%胶原酶Ⅱ),置37℃水浴摇床内摇荡,消化10 min,弃去首次消化悬液。再向锥形瓶中加入10m L混合酶,消化8 min,收集悬液,如此重复,直至组织块消失。分别收集每次消化悬液,加等量含4%FBS的MEM培养液,800 r/min离心弃上清。重悬后洗涤离心,将离心管的上清倒掉,加入1m L含15%FBS+MEM培养液,重新制成混悬液。将收集的细胞悬液用200目不锈钢网过滤,滤除细胞团块及组织块,将滤液收集到平皿中,离心收集细胞沉淀。
2.1.3 细胞接种培养与纯化
将细胞沉淀用培养液重悬计数后,接种于玻璃培养瓶。接种密度:5×105/m L,0.05%CO2、37℃培养箱中培养。利用差速贴壁法培养2h后去除成纤维细胞。小心吸取细胞悬液,移入明胶包被后的6孔培养板,第1~3天加入0.1mmol/L Brdu抑制非心肌细胞增殖,每2~3天换液一次。
2.2 新生小鼠心肌细胞的鉴定
2.2.1 细胞存活率检查
接种前取细胞悬液,以0.4%台盼蓝适当稀释,混匀后吸取1滴于血球计数器上,置显微镜下观察,死细胞被染成蓝色,不着色为存活细胞。
2.2.2 心肌细胞形态学观察
在倒置相差显微镜下观察心肌细胞生长状态、形态变化,观察心肌细胞搏动。
2.2.3 免疫荧光鉴定与细胞纯度鉴定
制作细胞爬片,在培养的第7天,取出细胞爬片。4%多聚甲醛室温固定20 min,在37℃条件下10%山羊血清封闭30 min,用抗c TnT单克隆抗体(1∶100)4℃孵育过夜,清洗。37℃下FITC标记的羊抗小鼠多克隆抗体(1∶200)孵育1 h,清洗后用DAPI复染,封片镜检拍照。以上每个步骤均采用PBS清洗3次。选取5张细胞染色后的玻片,每一张随机选取5个不重复的视野,计数心肌细胞标志物阳性细胞,计算其占总细胞数的百分比。
2.2.4 RT-PCR检测心肌特异基因表达
根据Gene Bank小鼠α-MHC、β-MHC、c TnT、β-actin的mRNA序列,利用Primer Premier 5.0设计特异引物对,上海生工合成引物。取培养至第7天的心肌细胞,用不含钙镁的PBS清洗一次,加入Trypsin-EDTA(0.25%tryspsin,1m M EDTA·4Na)消化贴壁细胞,终止胰酶活性后,离心收集5×105细胞,加Trizol试剂1m L提取总的RNA。采用该院建立的方法[9],选取传至第3代的小鼠MSCs作为实验对照。
c DNA合成体系:oligo(dT)18引物(25pmol/m L)3μL,总RNA(300ng/μL)3μL,ddH2O(DEPC处理)4μL,总体积10μL;65℃变性5 min后迅速置冰上,再加入以下组分:5×AMV buffer 4μL,10mmol/L dNTP mix 4μL,,AMV Reverse Transcriptase1μL,ddH2O(DEPC处理)总体积20μL;42℃延伸1 h,70℃保温10 min,终止反应,存于-20℃备用。
PCR扩增上一步逆转得到的c DNA。PCR扩增体系:12.2μL ddH2O,2μL 10×PCR缓冲液(含Mg Cl2),1.6μL 10mmol/L dNTP Mix,分别加入1μL 25μmol/L上游引物,1μL25μmol/L下游引物,0.2μL2.5U/μLTaqDNA聚合酶,2μLc DNA模板,总体积20μL。扩增引物与反应条件见表1。将产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
2.2.5 透射电镜观察
琼脂预包埋:取10m L 3%~4%琼脂溶液于闪烁小瓶,40℃加热直至琼脂融化(现用现做)。选取生长良好的心肌细胞,用橡皮刮刮下贴壁的心肌细胞,连同培养基一起移入离心管,1500 r/min,离心10min,弃上清。PBS清洗一次。重悬于微量离心管中,用40℃预热的巴斯德吸管取1m L左右融化的琼脂,插入管底加入。30秒快速离心使细胞样品成小团。将离心管置冰上加速琼脂固化,剥离后用刀片将琼脂块切成1mm厚薄片备用。
标本处理与电镜观察:琼脂块用20g/L戊二醛固定2h,常规酒精梯度脱水,环氧树脂618包埋,超薄切片后,以枸橼酸铅、醋酸铀双重染色,透射电子显微镜观察。
3 实验结果
3.1 心肌细胞分离纯化
实验显示,采用混合酶(0.08%胰蛋白酶和0.04%胶原酶Ⅱ)在37℃恒温低速磁力搅拌条件下短时多次消化新生小鼠心肌组织,可获得较多的心肌细胞,台盼蓝染色显示成活细胞数在98%。其所用酶浓度低、消化时间短,细胞贴壁生长良好。经差速贴壁法去除成纤维细胞,加入Brdu抑止成纤维细胞增殖。培养2~5 d后观察,视野中绝大多数为已搏动的心肌细胞或心肌细胞团,成纤维细胞无明显增殖。
3.2 形态学观察
倒置相差显微镜下观察显示:第1天心肌细胞呈圆形,基本贴壁,有单个存在、也有聚集成团,且出现自发性搏动的心肌细胞(图1a);第2天心肌细胞变形不明显,个别心肌细胞呈Y形(图1b),且搏动时收缩明显。大部分细胞贴壁铺开生长。以0.1%胰蛋白酶消化分离得到的心肌细胞周围可见许多细胞碎片。第3天具有自发性搏动的心肌细胞个数未增多,可见同簇细胞的同步跳动。采用0.1%胰蛋白酶消化得到的心肌细胞,在培养第3天即见部分心肌细胞发生脱落,在贴壁的心肌细胞周围可见较多的细胞碎片。采用混合酶消化分离得到的心肌培养物形态上及搏动情况均较好。加入0.1mmol/L 5-Brdu对心肌细胞的生长并无明显影响。
3.3 免疫细胞化学标记
抗c TnT抗体免疫荧光染色后,结果显示心肌细胞培养物中绝大部分呈心肌细胞阳性(图1c);对照的骨髓间充质干细胞(MSCs)呈阴性反应。心肌细胞培养物中抗c TnT免疫荧光阳性细胞占99.07%(322/325)。
3.4 RT-PCR检测心脏发育相关基因表达
心脏发育相关基因:α-MHC、β-MHC、c TnT以及内参β-actin的RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后,心肌细胞和心脏组织泳道中均只有一条目标带,与预期长度相吻合,说明三者均为特异性扩增片断(图1d)。未经诱导处理的MSCs两型MHC基因以及c TnT表达不明显。实验结果表明,获得心肌细胞具备c TnT表达功能。
3.5 电镜观察
采用琼脂预包埋,能够较好地收集数量较少的心肌细胞,有利于细胞的固定和后续处理。培养的心肌细胞肌丝发达、游离的核糖体、糖原及线粒体丰富,肌节明显,粗肌丝与细肌丝相间排列形成明显的Z线;线粒体多分布于核周或排列在肌丝之间,嵴呈板状,与线粒体长轴垂直或平行,密度排列,心肌细胞核为1~2个,椭圆形,核仁清晰,染色质分布均匀。
4 讨论
去除非心肌细胞(如成纤维细胞、内皮细胞)提高纯度是心肌细胞分离培养的关键问题之一,也是控制心肌样微环境,排除实验干扰因素的重要措施。一方面,去除和抑制成纤维细胞是获得更高纯度心肌细胞培养物的前提。采用差速贴壁法能纯化心肌细胞至90%~95%纯度,但成纤维细胞增殖迅速,不适于心肌细胞长期培养的实验。在培养中加入有丝分裂抑制剂5-Brdu抑制成纤维细胞的DNA合成,可达到抑制成纤维细胞增生的目的。此外,使用细胞铲刮除成纤维细胞以及重复贴壁法也能提高心肌细胞纯度。另一方面,剔除成纤维细胞,减少非心肌细胞来源的可溶性成分。尽管与非心肌细胞混合培养中有利于心肌细胞功能和代谢的协同性,但非心肌细胞分泌的某些生物活性物质影响其邻近心肌细胞的形态结构和生理功能[10,11],且可能与心肌细胞产生的物质混淆[12],不利于心肌微环境的控制。
获得物理形态较好、功能正常的心肌细胞是实验成功的基础。本文采用胰蛋白酶与胶原酶Ⅱ混合酶短时反复消化的方法分离心肌细胞,避免单酶过度消化造成大量心肌细胞丧失贴壁和自动节律性搏动,能够获得形态结构(包括超微结构)和初步检测功能正常的心肌细胞。另外,消化时间过长、温度过高均会使心肌细胞丧失活性。明胶包被6孔培养板促进心肌细胞贴壁生长。通过对心肌细胞进行形态学和显微结构观察,确认心肌细胞结构和功能大致正常。
分析两型MHC和c TnT的表达,有利于分析确认诱导前后细胞类型和功能状态[13,14]。目前认为,心肌细胞是一种高度分化的近终末细胞[15],仅有两种肌球蛋白重链基因表达即α-MHC和β-MHC,成年期以α-MHC表达为主,胚胎期以β-MHC首先表达,心肌细胞作为近终末分化细胞存在两型MHC基因表达。c TnT是心肌特异表达的心肌肌钙蛋白基因,c TnT蛋白是紧密附着于收缩纤维上的调节蛋白,也是细胞内钙离子的主要缓冲因子,其结合力的改变影响钙离子内稳态,从而影响钙离子依赖的生理机制。