子宫内膜干细胞研究

子宫内膜干细胞研究（精选十篇）

子宫内膜干细胞研究 篇1

1 肿瘤干细胞理论的发展

Makino等[4]首次提出了肿瘤干细胞假说, 指出肿瘤最初可能起源于一群特殊类型的干细胞, 即肿瘤干细胞。Lapidot等[5]在研究急性粒细胞性白血病 (human acute myeloid leukaemia, AML) 时再次发现, 仅0.1%～1.0%的白血病细胞具有致白血病的能力;1997年, Bolinet等[6]第1次分离出了这一细胞亚群, 并称之为人AML干细胞。至此, 伴随着在造血系统肿瘤中干细胞的研究进展, 肿瘤干细胞假说正式成为肿瘤发病机制研究的新热点。近十年来, 该理论有了极大的发展, 除了造血系统肿瘤外, 在各种非造血系统实体瘤中均发现了肿瘤干细胞可能存在的证据。目前, 肿瘤干细胞的研究重点首先在于肿瘤干细胞的分离、纯化和培养;然后进一步转向研究肿瘤干细胞的生物学特性, 包括其基因组学、蛋白组学表达谱等, 最后为临床肿瘤诊断与治疗提供新策略。

2 肿瘤干细胞的生物学特性

到目前为止, 尚无直接的证据来揭示肿瘤干细胞的确切特性。研究人员应用不同的分选策略, 分离出了最接近或可能包含有肿瘤干细胞的瘤细胞亚群, 通过体内外实验来鉴定其生物学特性。从肿瘤干细胞理论角度出发, 研究者逐步证实了这一细胞亚群有以下生物学特性。

2.1 高致瘤性

包括体外克隆形成能力及在免疫缺陷实验动物体内的成瘤能力, 与非肿瘤干细胞相比, 肿瘤干细胞具有更高的致瘤能力, 其能在更短的时间内, 在初始细胞数目更少的情况下, 较非肿瘤干细胞在体内外形成更多克隆, 迄今报道的成瘤性最强的是脑肿瘤干细胞, 100个CD133+的脑肿瘤干细胞即能在NOD/SCID (nonobese diabetic/severe combined immunodeficient) 小鼠体内成瘤[7]。

2.2 自我更新能力

表现为细胞具有不对称分化能力, 指细胞分裂所得的两个子细胞中, 一个保持与亲代细胞相同的分化等级, 另一个则发生定向分化。肿瘤干细胞通过自我更新, 使肿瘤细胞数量不断扩大, 保留自我原始表型的同时也累积了所有的突变, 使得肿瘤得以在各种情况持续生长。

2.3 分化潜能

即肿瘤的异质性产生的原因。目前普遍认为, 肿瘤干细胞具有横向分化及纵向分化的潜能, 即能同时向不同类型、不同分化等级的组织细胞进行分化, 从而导致了肿瘤的异质性——由共同表型细胞增殖而来的细胞得以出现新的不同的表型。也有研究证实, 肿瘤干细胞与体干细胞一样具有多向分化的能力, 其子代细胞呈现分化特征的表型及功能。脑肿瘤干细胞在体外无血清培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 和表皮生长因子 (EGF) 等生长因子后形成球体, 其中一些细胞表达天然生物活性物质narciclasine (NCS) 标记, 如巢蛋白 (Nestin) 、细胞膜糖蛋白 (CD133) 、微管相关蛋白2 (MAP2) 、神经细丝酸性蛋白 (GFAP) 等。

2.4 放、化疗抵抗性

肿瘤干细胞不仅与肿瘤的发生相关, 同时也是肿瘤治疗失败的最可能的原因, 相关研究首先集中在肿瘤干细胞的耐药性上。多个研究表明, 肿瘤干细胞拥有较一般肿瘤细胞更强的耐药性[8], 近来的研究除了研究肿瘤干细胞对化疗药物的耐受性外, 也有学者研究了肿瘤干细胞对放射治疗的敏感性及其可能的信号传导通路, 使得肿瘤干细胞的耐治疗性的研究视野更广, 更为全面深化。

3 子宫内膜癌干细胞分离

3.1 应用细胞表面特异性标记进行分离鉴定

应用细胞表面特异性标记进行分选的手段主要有两种:荧光活化细胞分选系统 (fluorescence activated cell sorting, FACS) 及磁性活化细胞分选系统 (magnetic activated cell sorting, MACS) 。MACS较为准确, 且对分选细胞的活力及功能损伤小, 但常受限于肿瘤干细胞表面标记未知, 以及实体肿瘤干细胞分离过程中蛋白酶能对细胞表面抗原产生破坏。FACS对细胞活力影响较大, 且可能会将相互粘连的细胞团分选出来, 从而影响分选的纯度, 但此技术更为方便, 具有普遍适用性。如:造血系统肿瘤干细胞标志物为CD34+CD38-, 乳腺癌干细胞的标志物为CD44+CD24 (-/low) 。虽然在许多恶性肿瘤中已经找到肿瘤干细胞可能的表面标志, 但是仍缺乏特定的大分子物质作为分选标志。当前的标志物研究常借助于正常干细胞的相关成果和技术。

CD133是首个用于分离子宫内膜癌干细胞的标志物, 其为Prominin家族成员, 含5次跨膜结构, 分子量为120Kb, 是成人干细胞表面标志物, 它的表达意味着细胞干性的保持, 被认为是胰腺癌[9]、大肠癌[10]及卵巢癌[11]等多种肿瘤干细胞的标志物。Rutella等[12]在133例子宫内膜癌标本中检测显示CD133阳性者高达62.6%, 但其他内皮和干细胞相关因子却是阴性表达, 分选的 CD133 阳性细胞在富含血清的培养基中可以4.6倍增长, 并且共表达肿瘤相关抗原 GalNAcalpha1-O-Ser/Thr MUC-1。CD133 阳性细胞有形成球囊的特性, 形成的球囊可繁殖长达12周。子宫内膜样腺癌中分选的CD133阳性细胞能够耐受顺铂和紫杉醇介导的细胞毒作用, 并且高表达基质金属蛋白酶 (MMP) 、白细胞介素8 (IL-8) 、细胞表面跨膜糖蛋白CD44和趋化因子受体 (CXCR4) , 且CD133阳性细胞能在NOD/SCID鼠中能够成瘤, 结果认为CD133有望成为子宫内膜癌分析CSC生物学特性的工具。Nakamura等[11]对Ishikawa细胞中15.5%CD133+细胞分离后进行一系列检测, 认为CD133+细胞具有更强的克隆形成能力、化疗耐受性和体外致瘤性。

Musashi-1是一种进化保守的RNA结合蛋白, 选择性表达在神经前体细胞包括神经干细胞上, 通过调节转录后的翻译过程来保持干细胞处于未分化的状态, 其在维持干细胞状态和肿瘤发生方面起到重要作用。Gotte 等[13]的研究证实子宫内膜癌细胞中存在着Musashi-1高表达且具有干细胞特性的细胞亚群, 且证实Musashi-1通过干细胞相关因子Notch-1、Hes-1及P21 (WAF1/CIP1) 来调控子宫内膜癌细胞的周期及凋亡。由此推测子宫内膜癌中存在着肿瘤干细胞。

Nanog基因对肿瘤干细胞保持其多能性和自我更新的能力具有重要作用。在子宫内膜样腺癌细胞球中高表达Nanog[14], 且与子宫良性病变相比子宫内膜样腺癌中的表达量较高, 由此推测子宫内膜癌干细胞的存在, 且Nanog有可能作为一种潜在的治疗靶点。

3.2 应用细胞生物学特性进行分离鉴定

与依靠干细胞表面标志如CD34及CD133等的分选策略相比较, 侧群细胞 (side population, SP) 方法分离肿瘤干细胞更突出了肿瘤干细胞的功能筛选的因素即抗药性, 故其结果会更为可靠。Goodell等[15]在用DNA 染料Hoechst33342 为造血干细胞染色并进行FACS 分选时发现, 有一群染色偏低, 与其他大部分细胞不一样的细胞群体, 命名为SP细胞。SP细胞是指能将荧光染料Hoechst33342泵出细胞外, 而使自身着色较浅或不着色的细胞, 这类细胞富含原始细胞和未分化细胞。在干细胞和肿瘤细胞中都存在极少量的SP细胞, SP细胞具备干细胞的多种特性且易于分离, 是一个浓缩的干细胞群体, 并高表达ABC转运家族中的耐药蛋白ABCG2/乳腺癌耐药蛋白BCRP1, 可能是肿瘤产生耐药和复发的原因。对干细胞和肿瘤组织SP细胞的分离和鉴定有可能为干细胞和肿瘤干细胞的研究提供便利的途径。SP细胞高表达CD133、C-kit及Sca-1等干细胞表面标志物, 几乎不表达细胞分化成熟的分子标志上皮膜抗原 (epithelialmembrane antigen) 、ALBU等。

2007年日本学者Kato等[16]第1次分离了正常子宫内膜的SP细胞, Tsuji等[17]研究也发现正常子宫内膜组织中含有0.03%～1.1%的SP细胞, 与正常组织相似, 肿瘤组织或肿瘤细胞系中也存在比例很低的SP细胞。Friel等[18]从子宫内膜癌细胞株AN3CA中分选出0.02%的SP细胞, SP细胞中处于G1 期的细胞比例高于非 SP细胞, SP细胞具有自我更新、化疗耐药和成瘤的特性。Kato等[19]分别在子宫内膜癌患者肿瘤组织中以及子宫内膜癌HEC-1细胞系中分离了0.1%～0.5%的SP细胞, 证实了子宫内膜癌中SP细胞具有更强的增殖能力、自我更新能力和侵袭能力, 给裸鼠种植1×104个HEC-1-SP细胞即可成瘤。

肿瘤干细胞在无血清培养基加用特殊的生长因子等体外培养条件下能进行无限扩增形成球形体 (sphere) , 这些球形体具有肿瘤干细胞标记和高致瘤性。无血清悬浮培养法最初应用于神经干细胞的分离, 即通过无血清的培养方法可以得到悬浮的干细胞球, 这在脑肿瘤干细胞的研究中得到了证实。

采用溴脱氧尿嘧啶核苷 (bromodeoxyuridine, BrdU) 法鉴定肿瘤干细胞。BrdU是 DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物, 通过竞争掺入 S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU经活体注射或细胞培养加入后, 利用抗Brdu单克隆抗体免疫细胞化学染色, 显示增殖细胞。如果细胞迅速分裂, BrdU则被稀释而检测不到;如果细胞分裂缓慢, 则可以被检测到。因此, BrdU常被用来鉴定体干细胞及其在干细胞龛中的位置, 这种细胞被称为标记阻滞细胞 (label retaining cell, LRC) 。BrdU法在肿瘤组织中鉴定肿瘤干细胞也得到了应用。Zhang等[20]将3种经BrdU标记的鼻咽癌细胞系 (5-8F、6-10B和TMNE) 植入裸鼠的背部, 长成肿瘤后检测到了 LRC (约占0.3% ) 。但是子宫内膜癌干细胞是否具有以上两种性质从而将其分离出来呢?目前尚无与此相关的研究报道。

4 子宫内膜癌干细胞特性研究

4.1 耐化疗和耐放疗

传统抗肿瘤药物大都是破坏肿瘤细胞的DNA或干扰有丝分裂而导致细胞死亡, 近来许多研究显示, 肿瘤干细胞对诱导DNA破坏的常规细胞毒药物存在明显的耐药性, 提示肿瘤干细胞可能在肿瘤耐药性发生中发挥着重要作用。2005年, Dean等[21]提出了3种肿瘤干细胞耐药模式, 即天生性耐药、获得性耐药及群体天生耐药。这种耐药性一方面可能来源于肿瘤干细胞最初自身的表型特点, 如多药耐药相关蛋白1 (MRP1) 、P-糖蛋白 (P-gp) 、三磷酸腺苷结合盒转运子 (ATP -binding cassette transporter, ABC) 转运蛋白家族中多药耐药蛋白 (MDR1) 及ABCG2 (ATP-binding cassette superfamily G member 2) /鼠Bcrp1 (Breast cancer resistance protein l) (即ABCG2/Bcrpl) 等耐药基因的表达, 使其得以泵出包括代谢产物、药物、毒性物质、内源性脂类物质、多肽、核苷酸及固醇类等多种物质, 使肿瘤干细胞一方面从一开始就较一般肿瘤细胞具有更强的耐药性;另一方面, 也可能来源于肿瘤干细胞分化过程、自我更新过程中积累的突变基因, 使其能在长期化疗过程中幸存下来。有研究显示子宫内膜癌SP细胞比non-SP (非-SP) 具有更强的对化疗药物的耐受性。子宫内膜样腺癌中分选的CD133阳性细胞能够耐受顺铂和紫杉醇介导的细胞毒作用, 并且高表达基质金属蛋白酶 (MMP) 、白细胞介素8 (IL-8) 。耐药是因为肿瘤干细胞通常处于相对静止或休眠状态, 而当前的抗肿瘤药主要是靶向迅速增生的分裂期细胞。因此, 肿瘤干细胞不受影响。

多项研究显示肿瘤干细胞表现出较普通细胞更强的辐射抵抗能力, 但具体机制尚不明确。Jeremy[22]认为细胞在放射线照射损伤后, 肿瘤干细胞少量凋亡, 大部分通过DNA修复而存活下来, 并继续大量增殖, 而非肿瘤干细胞则大部分凋亡。Kastan等[23]报道DNA受到损伤时, 可通过多种机制启动细胞周期延迟和阻滞, 以利于DNA修复。这种周期阻滞在正常细胞中是一种有利的保护机制, 但在肿瘤细胞中周期阻滞可能会增强细胞的放射抵抗, 为了了解子宫内膜癌干细胞放疗抵抗机制, 仍需进一步对细胞周期和放疗抵抗关系进行研究。

4.2 耐内分泌治疗

孕激素作为晚期、复发及要求保留生育能力的早期子宫内膜癌的治疗手段, 并获得了一定的疗效。但孕激素治疗子宫内膜癌的成功率为57%～75%, 而40%患者对孕激素不敏感或耐药。越来越多的研究显示, 肿瘤在常规治疗后复发和耐药可能与肿瘤干细胞有关, 肿瘤干细胞较一般肿瘤细胞具有更强的耐药性。最近的研究显示, 耐孕激素子宫内膜癌Ishikawa细胞中ER-a、PR-B表达明显下降, ER-β表达增强, PR-A表达基本不变。ER、PR亚型表达的失衡特别是PR-B表达的下降可能为长期孕激素耐药发生的机制之一。子宫内膜癌干细胞是否在孕激素耐药的机制中发挥着重要作用, 文献报道很少, 有待进一步研究。

4.3 其他方面

此外, 子宫内膜癌干细胞还与肿瘤的复发、侵袭转移有关。完成子宫内膜癌转移的肿瘤细胞实际上是转移性肿瘤干细胞或迁移性肿瘤干细胞[24], 因此, 目前肿瘤侵袭和转移机制研究从主要关注肿瘤细胞遗传特性, 转向关注转移性肿瘤干细胞与靶器官微环境相互作用。近来, 对于肿瘤干细胞的治疗方法有:肿瘤干细胞特异性表面标志靶点治疗、诱导分化肿瘤干细胞治疗、Hedgehog 信号转导通路的靶向治疗及针对肿瘤干细胞自我更新途径的治疗。动物实验同样取得明显治疗效果, 这些实验结果都提示肿瘤干细胞靶向治疗的前景。随着对子宫内膜癌干细胞研究的进一步深入, 势必将有助于揭示子宫内膜癌发生、发展、转移、复发及耐药的机制, 为子宫内膜癌的治疗开拓新的领域和方向, 也为其他肿瘤的治疗和新药物的研究、开发提供新的途径。

子宫内膜干细胞研究 篇2

KGF对离体子宫内膜上皮细胞生长与分泌的影响

目的.:观察KGF对离体培养的EEC生长和分泌CA125的影响. 方法:体外培养增殖期EEC,加入不同浓度KGF作用后,MTT法检测OD值了解细胞生长情况,磁酶免法测定CA125分泌. 结果:①不同浓度KGF对EEC的生长、分泌均有刺激作用,以50 ng/ml作用最明显;②MTT法所测OD值与CA125浓度有显著的相关性. 结论:KGF可促进体外培养的增殖期EEC生长和分泌,EEC分泌CA125的量与细胞生长有关.

作 者：王欣 JIA Qing 程湘 成娅 刘萍 杨合荣 王惠  作者单位： 刊 名：西北国防医学杂志  ISTIC英文刊名：MEDICAL JOURNAL OF NATIONAL DEFENDING FORCES IN NORTHWEST CHINA 年，卷(期)： 29(4) 分类号：Q813 关键词：角质细胞生长因子(KGF)   EEC   CA125   生长   分泌  

子宫内膜干细胞研究 篇3

【关键词】子宫内膜癌；CD4+CD25+　Treg细胞；免疫逃逸；　流式细胞仪；　ELISA；IL-10；TGF-β

【中图分类号】Q939.91【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2012）09-0179-03

1研究对象

选择2009年01月-2012年01月就诊于我科的子宫内膜癌患者26例，年龄28-75岁，平均（51.09±6.88）岁，所有病例均经病理学检查确诊，未做过抗肿瘤治疗，且3个月内未使用过免疫增强或抑制剂，手术病理分期、组织分类均参照国际妇产科联盟2000年标准进行。子宫内膜样腺癌10例，腺鳞癌8例，透明细胞癌3例，鳞癌5例，FIGO分期：Ⅰ期+Ⅱ期10例，Ⅲ期+IV期16例。另选择经年龄相匹配的25位健康志愿者作为正常对照组，年龄30-81岁，平均（54.25±9.20）岁。

2研究方法

2.1　标本处理：

2.1.1　外周血单个核细胞（PBMCs）制备：　采集研究对象术前、健康志愿者同一时间外周静脉血2ml，EDTA抗凝；15ml离心管内加入适量淋巴细胞分离液，将EDTA抗凝血用PBS等倍稀释后，轻缓铺在分离液面上；离心1200rpm×10min；吸取界面细胞，冰PBS洗涤2次后重悬细胞备用。

2.1.2肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）和非肿瘤浸润性淋巴细胞（NILs）制备：取手术切除的新鲜肿瘤组织、洗净，在无菌条件下去除坏死组织及结缔组织，剔除脂肪组织，剪成1mm3大小的组织块；在碎组织块中加入终浓度0.1%的胶原酶，置4℃条件下消化24小时，细胞悬液经100目钢丝或尼龙网过滤，过滤后的细胞悬液以50rpm离心10min，弃上清，加适量Hanks液稀释，在试管中依次加入100%　Ficoll-Hypaque分离液、75%　Ficoll-Hypaque分离液及细胞悬液，进行不连续密度梯度离心，2000rpmx10min，收集75%与100%之间界面上的细胞悬液备用。取距离肿瘤5cm的组织作为对照，制备非肿瘤浸润性淋巴细胞，方法同上。

2.2流式细胞仪检测：将PBMCs/TILs/NILs加样至流式检测管内，每管至少2×105个细胞，加入CD4-PE、CD25-FITC单抗和CCR4-PE，4℃孵育20分钟，加入PBS　2ml洗涤，并以200g离心沉淀5分钟，吸去上清，混匀细胞后加入0.5ml　l%多聚甲醛，上流式细胞仪（美国Beckman-Coulter公司产品）检测或置2-8℃冰箱中备用。

2.3　ELISA法测定IL-10和TGF-β水平：取100μL标准品，各组血清加入相应试剂板的微孔中，再加入生物素化抗体工作液　100μL/孔，用封板胶纸封住反应孔，室温共同孵育120分钟，自动洗板机洗涤4次，加入酶结合物工作液　100μL/孔，封住板孔，室温孵育30分钟，洗板4次。每孔中加入底物各50μL，避光37℃30分钟，见显色后加终止液50μL。用美国　ELX800全自动定量绘图酶标仪在450nm处测定OD值，计算样品含量。

2.4统计学方法：采用SPSS　11.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，非正态分布资料采用Kruskal-Wallis　H检验；两组比较采用t检验；计数资料采用χ2检验或秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

3统计学方法

采用SPSS　11.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，非正态分布资料采用Kruskal-Wallis　H检验；两组比较采用t检验；计数资料采用χ2检验或秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

子宫内膜干细胞研究 篇4

1 材料与方法

1.1 标本来源

来源于2008年7月—2009年9月我院妇产科住院病人因子宫肌瘤或子宫颈原位癌而行全子宫切除的子宫内膜组织,刮取子宫内膜标本后投入盛有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的D-Hank’s液中,30min内送实验室进行培养。患者年龄30~45岁,月经周期正常,有正常生育史,近3月未用激素类药物治疗。依据术后的内膜组织学分期,增生期15例,分泌早期10例,分泌中期10例,分泌晚期8例。

1.2 试剂及配制

①IA型胶原酶:Sigma产品,活性>125,浓度0.1%;②合成培养液:DMEM/F-12培养液,美国GIBCO公司,pH 7.2;③胰蛋白酶:活性1:250,用DMEM配成0.25%浓度,并含0.02%EDTA;④鼠抗人OPN抗体、鼠抗人细胞角蛋白、鼠抗人细胞波形蛋白、SP试剂盒。北京中杉公司提供。

1.3 细胞培养、分离、纯化

用D-Hank’s缓冲液冲洗子宫内膜组织3次。剪碎组织呈约1mm3,置入15mL玻璃离心管中。加入3倍体积的0.1%IA型胶原酶溶液,混匀后于37℃水浴中持续慢速振荡消化约30min,后加入约8~10mL D-Hank’s缓冲液并将组织制成细胞悬液,用150μm(100目)的尼龙网过滤,再经38μm(400目)的尼龙网分离腺上皮细胞和间质细胞(此时滤液中主要为间质细胞,尼龙网上的主要为腺上皮细胞)。①纯化间质细胞:将富含间质细胞的悬液以1 200r/min,离心10min,弃上清,将细胞沉淀用1mL D-Hank’s液混悬后,缓慢加到含8mL D-Hank’s液的离心管中,400r/min,离心3min,将上清移至另一离心管中,1 200r/min,离心10min,弃上清,加入1mL培养液,吹打,将悬液接种到培养瓶中培养(可用培养液冲洗离心管1~2次,将冲洗液也加到培养瓶中以增加培养的细胞数)置37℃、5%CO2培养箱中培养;②纯化腺上皮细胞:将38μm的尼龙网放在的培养皿中,用D-Hank’s缓冲液漂洗,将冲洗液吸到离心管中,500r/min,5min。弃上清,将沉淀用D-Hank’s缓冲液进行冲洗,500r/min,5min,反复进行2次。离心后,用培养液将细胞沉淀制成悬液,接种到培养瓶中置37℃、5%CO2培养箱中培养;③间质细胞接种约2h后,将悬浮的细胞及上皮细胞团吸出弃之,重新加入培养液,此时间质细胞已贴壁;上皮细胞接种约2~3h后将悬浮的细胞及上皮细胞团吸出转移到另一培养瓶中,原培养瓶加入新的生长培养液(转移后培养的细胞为上皮细胞,转移前已贴壁的细胞大部分为间质细胞)。第1次换液于2d后,以后隔2~3d更换培养液1次。培养到细胞几乎聚合成片,大约需要5~7d时间。当细胞铺满瓶底后,用消化液(0.25%胰酶含0.02%EDTA)进行消化传代。(免疫细胞化学分析用的细胞传代到置有8mm2大小的无菌洁净盖玻片的24孔培养板孔中)。

1.4 免疫细胞化学

按SP试剂盒说明进行操作:取出盖玻片置入PBS中清洗5min×3次后,立即固定15min,晾干,并贴于载玻片。加3%H2O2去离子水于玻片上,室温孵育10min,PBS洗涤5min×3次。加正常羊血清工作液于玻片上,室温孵育15min,倾去多余的液体。加PBS稀释的一抗50μL于玻片上(间质细胞鉴定用鼠抗人波形蛋白抗体滴度为1∶50;腺上皮细胞鉴定用鼠抗人角蛋白抗体滴度为1∶50;鼠抗人OPN抗体滴度为1∶50),37℃水浴箱内孵育2h,PBS洗涤5min×3次。加生物素标记的羊抗鼠IgG二抗50μL于玻片上,37℃水浴箱内孵育30min,PBS洗涤5min×3次。加辣根酶标记的链霉卵白素工作液(S-A/HRP)于玻片上, 37℃水浴箱内孵育30min,PBS洗涤5min×3次。加DBA显色液于玻片上,并于显微镜下观察,适当着色后冲洗玻片,苏木素复染,冲洗,脱水,透明,封片,显微镜下观察染色结果。

2 结果

2.1 细胞生长情况

10例分泌早期子宫内膜,培养成功10例;10例分泌中期子宫内膜均培养成功;8例分泌晚期子宫内膜,培养成功7例,1例因细胞接种密度过稀未成功;15例增生期子宫内膜,成功12例,失败3例,其中2例为分离得到的上皮细胞过少未成功,1例因上皮细胞接种密度过稀失败;接种的腺细胞团培养2h后开始逐渐贴壁,24h后贴壁良好;接种的间质细胞培养30min后开始贴壁,2h后大部分已贴壁。12h开始生长。细胞接种密度较小时,约需7~9d聚合成片,细胞生长旺盛时3~4d即聚合成片。

2.2 体外培养原代子宫内膜细胞的形态及鉴定

2.1.1 腺上皮细胞形态及鉴定

细胞长成旋涡状排列的致密单层细胞集落,其细胞呈多角形或蝌蚪形,边界清楚,排列紧密,胞浆呈颗粒状,核圆而大,核仁明显。偶见散在间质细胞插入性生长。约4~7d细胞团块铺满瓶底(图1)。细胞鉴定示至少有90%以上细胞的角蛋白(CK19)染色呈阳性反应,阳性细胞胞浆呈棕黄色(图2)。

2.1.2 间质细胞形态及鉴定

倒置显微镜下观察可见两种大小和形态不同的细胞:一种为多角形,有多个短小细胞突出,胞浆薄而透明,核圆居中,细胞排列无极性,平铺生长,这是原代及早期代次培养中的主要细胞类型;一种为梭形,具有成纤维细胞形态,胞浆丰富,核椭圆,易传代,长期培养后,细胞延伸成长梭形,相互平行排列成束,密度大的区域聚集成堆。原代培养中这种细胞很少,传代后细胞增长活力增加,成为传代培养细胞中的主要细胞。间质细胞至少可存活1月余(图3)。在细胞鉴定中有94%以上细胞的波形蛋白(Vimentin)染色呈阳性反应,阳性细胞胞浆呈棕黄色(图4)。

3 讨论

3.1 体外分离培养纯化子宫内膜细胞的临床意义

目前对子宫方面疾病,如子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)、子宫肿瘤等的研究可分为三种类型:人体试验、

动物模型及细胞模型[2]。但人体试验面临伦理障碍,不能开展;猕猴是动物试验中建立Ems整体模型的理想动物,但因其价格及动物数量问题,应用受到限制[3];而细胞模型的建立和完善,对于研究该类疾病起到了很好的推动作用。目前国内外学者已经应用子宫内膜细胞培养技术开展了多方面的研究,如Sharpe-Timms[4]研究提示,子宫内膜的结构异常是Ems发病机制之一,并且证明该技术应用于研究子宫内膜异位症(EMs)的发病机理是目前一种比较经济、理想的方法。

3.2 月经周期及细胞培养成功的影响因素

在性激素的刺激下,人体子宫内膜细胞会产生增生、分化、分泌、凋亡和再生各种生理变化,在各种生理周期中取得的标本培养出来的结果也不尽相同。本试验中,增生期子宫内膜细胞,在分离纯化后,所得到的腺上皮细胞很少,间质细胞相对较多;但分泌期子宫内膜细胞经分离纯化后,间质细胞相对较少,而腺上皮细胞相对较多。而且,在培养过程中,腺上皮细胞无法长久生长,这是因为该细胞缺少间质细胞支持,失去分化能力,不能形成腺样结构,这与Hoegh AM[5]报导的结果吻合。另外,分离的细胞活力、纯度及接种密度是子宫内膜细胞原代培养能否成功的主要因素[6]。本实验中失败原因均与分离与接种过程有关(失败4例,2例为接种密度过稀,2例为分离的上皮细胞过少)。

3.3 相关步骤的改良

在以往的实验中,王巧莲等[7]采取患者刮宫后的标本,但在取材过程中很难真正做到无菌,标本污染后直接导致培养失败。而在本实验中,为解决此问题,我们所取得的标本全部为全子宫切除的子宫内膜组织,从而能在最大程度上保持无菌,本实验没有因标本污染导致培养失败。在消化酶的选用上,因胶原酶作用温和,其消化所获得的细胞活力较强,但其价格高;而胰蛋白酶作用强,但所获得的细胞活力较胶原酶低;EDTA能通过螯合细胞间质中的二价阳离子使细胞分离[8],因此我们选取胶原酶及含EDTA的胰蛋白酶消化液,既保证了消化的效果,又在一定程度上节约了实验成本。张蕾[9]、石书芳[10]采用二次消化,所需时间长,而我们采用一次消化(30min),消化效果好,可能是因为消化过程中持续振荡,使之充分消化有关。Arici A[11]等采用200目尼龙网进行过滤,这种方法得到的细胞纯度稍低,而我们根据间质细胞体积较小的特性,考虑多次过滤以提高细胞分离纯度,因此我们采用100目及400目两次过滤、细胞贴壁方法,既保证了分离细胞的纯度,又避免过多的细胞损伤。我们此次应用的细胞分离方法所培养出的细胞纯度、活力能够达到目前所报导的先进水平[12],证明本实验技术具有可操作性。另外,本实验中,波形蛋白、角蛋白染色均成功,说明用本方法培养的细胞保持了原有细胞的特性,可为后续研究提供满意的细胞平台。

参考文献

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子宫内膜异位症合并不孕的研究进展 篇5

子宫内膜异位症（EMS）为临床常见病，其典型症状为盆腔疼痛及不孕。文献报道30%～50%EMS合并不孕，25%～50%的不孕妇女被发现有EMS存在。EMS引起不孕的机制尚不明确，单纯药物治疗不能提高妊娠率，单独助孕效果不理想，手术联合辅助生殖技术（ART）能显著提高妊娠率，治疗时应个体化。目前，研究热点集中在子宫内膜异位症引起不孕的机制及治疗方式的选择，本文就此作一综述。

EMS引起不孕的机制

EMS对生育能力的影响原因甚多，机制复杂，目前仍有争议。Gupta等［1］研究表明，EMS患者盆腔解剖及功能改变，机体免疫缺陷及免疫失衡，子宫内膜容受性下降，腹腔液及卵泡液微环境改变等因素综合作用导致卵母细胞质量下降、受精及种植能力降低，从而导致不孕。目前认为，微小或轻度的EMS可能主要通过改变腹腔的内环境及激发免疫机制影响生育功能，盆腔解剖及功能改变则是重度EMS引起不孕的主要原因。

EMS合并不孕的治疗

药物治疗：尽管药物治疗能有效缓解EMS引起的慢性盆腔疼痛，但尚无证据表明药物治疗可以提高EMS合并不孕患者的妊娠率。已经发现EMS患者使用丹那唑、口服避孕藥及促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa）较期待治疗妊娠率无显著性差异［2］。因此，单纯卵巢功能抑制并不能提高EMS合并不孕患者的妊娠率。

手术治疗：腹腔镜是诊断及初始治疗EMS的金标准［3］。李艳等［4］研究表明，Ⅲ～Ⅳ期EMS合并不孕患者行保守性手术后累计妊娠率40%，Ferrero等［5］的研究进一步发现，深部浸润型EMS合并不孕患者腹腔镜手术后累计妊娠率376%，妊娠率均较期待治疗有明显提高，因此，有学者认为［6］任何类型EMS合并不孕患者都应该手术治疗，以提高妊娠率。但有的研究发现［7］行双侧巧克力囊肿剥除术术后妊娠率较单侧手术者明显降低，中-重度EMS合并不孕患者行腹腔镜保守性手术后在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中的卵巢反应较轻-中度者明显降低［8］。因此，应全面评估腹腔镜手术的利弊，在患者充分知情同意条件下做出合理选择，对复发型EMS合并不孕患者，二次手术应慎重［9］。

手术联合药物治疗：手术与药物治疗相结合包括术前或术后辅助用药。有报道称术前用药可以减少盆腔血管供应，缩小EMS病灶，因此减少术中出血及手术需要切除的量；术后用药可祛除残存微小病灶。目前尚无证据表明术前用药可以提高受孕力，但重度内异症合并不孕患者术后使用3～6个月GnRHa可显著提高受孕力，减少行IVF前的流产率。

手术联合辅助生殖技术：研究表明［10］，EMS合并不孕患者，单独助孕效果不理想，术后积极助孕可使累计妊娠率50%。因此，手术联合辅助生殖技术是目前治疗EMS合并不孕的一种较好的方法，若手术后不能自然受孕，最长1年的期待治疗后应该积极助孕。常用的助孕方法有促排卵宫腔内人工授精及IVF-ET，其中促排卵联合宫腔内人工授精对许多不孕症是一线治疗方案，然而对EMS是否有相似的效果尚未明确，但由于其价格低廉且并发症少，对轻度EMS仍是一线助孕方法。Ⅰ～Ⅱ期EMS合并不孕患者采用克氯米芬/促性腺激素类促排卵联合宫腔内人工授精较期待治疗可以明显提高周期妊娠率，但在严重EMS中无显著作用。对促排卵治疗无效或晚期EMS合并不孕患者，IVF-ET则可以显著提高妊娠率，且IVF-ET间隔手术时间越短，妊娠率提高越显著。

IVE-ET前的药物治疗：研究表明，开始IVF-ET周期前延长使用3～6个月的GnRHa治疗，可明显提高妊娠率，减少周期放弃率，但IVF前长期使用GnRHa这一治疗方法推广为常规方法之前，还需要更进一步、更大样本量的临床研究。

目前，对EMS合并不孕的治疗，尚无大样本、多中心临床随机对照研究来对比各种方法的有效性。治疗时应综合考虑患者的年龄、不孕时间、家族史及EMS分期等，对Ⅰ～Ⅱ期EMS合并不孕，经短期观察仍未妊娠，应行腹腔镜检查，腹腔镜术后期待或者促排卵联合宫腔内人工授精，但对35岁以上患者不宜期待，建议术后积极助孕。对Ⅲ～Ⅳ期EMS合并不孕，腹腔镜或开腹手术后行IVF-ET，对复发的EMS合并不孕患者建议不行重复手术，应该尽早助孕。总之，应个体化治疗。

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子宫内膜干细胞研究 篇6

微小RNA (microRNAs, miRNAs) 是一类内源性的非编码小分子RNA片段, 通过与靶基因3'-UTR区完全或者不完全配对, miRNAs降解靶基因的mRNA或者抑制其翻译, 从而达到在转录后水平调控靶基因表达[2]。近年来, miRNAs的研究已遍布生命科学的各个领域, 尤其是在肿瘤侵袭及转移中的作用[3]。miR-125b是最为常见的miRNAs之一, 研究表明其在多种肿瘤的侵袭及转移过程中发挥重要作用[4], 但其对于子宫内膜癌细胞侵袭及转移功能的影响及相关机制还不十分明确。本研究检测了子宫内膜癌组织中miR-125b的表达与肿瘤的临床病理分期及转移相关性, 旨在探究miR-125b与子宫内膜癌转移的相关性及其可能机制。

1 资料与方法

1.1 实验材料

组织标本来自四川省妇幼保健院2012年11月至2013年11月经手术病理证实为原发性子宫内膜癌的30例患者手术切除的癌组织及其相对应的癌旁正常组织。患者年龄34~69岁, 平均48.3±5.6岁。经病理诊断主要为子宫内膜样腺癌, 根据子宫内膜癌手术-病理分期 (FIGO 2000) 其中Ⅰ期4例、Ⅱ期9例、Ⅲ期11例、Ⅳ期6例;无远处转移25例, 有远处转移5例。组织提取后置于细胞冻存管中, 液氮保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞及试剂

人子宫内膜癌细胞株HEC-1B购买于中国科学院上海生命科学研究院;新生胎牛血清购于PAA公司;DMEM培养基、0.25%胰酶购买于美国Hyclone公司;实时荧光定量PCR试剂盒购买于北京全式金生物技术有限公司;Lipofectamine 2000细胞转染试剂购买于美国Invitrogen公司;miR-125b成熟模拟片段 (mimic) 购买于上海吉玛生物技术有限公司;CCK-8试剂盒购买于日本株式会社同仁化学研究所Dojindo;Transwell小室 (8.0μm孔径) 购买于美国Minipore公司;基质胶购买于美国Sigma公司;基质金属蛋白酶13 (MMP-13) 以及GAPDH的一抗购于Cell signal technology公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、山羊抗兔HRP标记的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司;X线片为柯达公司产品。

1.2.2 细胞培养与转染

HEC-1B细胞株用含10%胎牛血清、10 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中, 37℃、5%CO2的培养箱中培养, 细胞呈贴壁生长。0.25%胰酶消化、传代。转染前1天, 以适合的密度传代细胞, 取对数生长期的细胞进行转染。将化学合成的has-miR-125b mimic和scramble mimic按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书分别转染至HEC-1B细胞中, 实验分为3组:miR-125b组 (转染miR-125b mimic) 、对照组 (转染scramble mimic) 、未处理组 (仅加入脂质体) , 转染后6小时换新鲜完全培养基。

1.2.3 RNA提取及定量检测

使用TRIzol试剂盒提取组织以及转染48小时后细胞的总RNA, 紫外分光光度仪测定RNA纯度和浓度。茎环引物逆转录合成第一链c DNA, 再以c DNA为模板, 应用PRISM 7000型定量PCR仪 (Applied Biosystemss) 进行定量PCR检测, 以U6作为内参, log10C/N (C:癌组织/N:癌旁组织) 表示癌组织相对于癌旁组织的表达情况。检测引物设计如下。miR-125b逆转录引物:5'-GTCGTATC-CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGTCUCUU-3';U6逆转录引物:5'-AAAATATGGAACGCTTCACGAATT TG-3';miR-125b定量PCR引物:上游引物:5'-GCUC-CCUGAGACCCUAAC-3';下游引物:5'-CAGTG-CAGGGTCCGAGGT-3';U6上游引物:5'-CTCGCTTCG-GCAGCACATATACT-3';U6下游引物:5'-ACGCT-TCACGAATTTGCGTGTC-3'。PCR反应条件:95℃30秒, 95℃5秒, 60℃20秒, 循环40次。PCR扩增结束后绘制溶解曲线, 对目的基因的表达采用2-ΔΔCt法行相对定量分析。

1.2.4 Transwell肿瘤迁移实验

细胞转染24小时后, 将培养小室插入到24孔板中, 取2×105个转染后细胞重悬于400μl无血清的培养基中, 将细胞混合液贴壁加入到小室的上层;小室的下层中加入含20%FBS的培养基作为趋化因子, 5%CO2、37℃条件下培养16小时后, 取出小室, 吸出小室中培养基, 小心擦去上层细胞, PBS洗2次, 甲醇室温固定5分钟, 0.5%结晶紫染色5分钟, 清水轻轻浸洗数次, 倒置晾干, 刀片揭膜, 中性树胶封片。镜下观察, 随机计数6个视野, 计算结晶紫染色细胞数, 即为穿膜细胞。

1.2.5 Transwell肿瘤侵袭实验

将冻存于-20℃的Matrigel胶4℃过夜融化, 用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至1 mg/ml, 冰上操作。将40μl稀释后的Matrigel胶包被小室多聚碳酸酯膜的上室面, 37℃孵育3~5小时, 胶凝固后备用;细胞转染后24小时, 取4×105个细胞重悬于400μl无血清的培养基中, 将细胞混合液加入到Matrigel胶的上层;小室的下层中加入含20%FBS的培养基作为趋化因子。5%CO2、37℃条件下培养24小时后, 取出小室, 吸出小室中培养基, 小心擦去上层细胞, PBS洗2次, 甲醇室温固定10分钟, 0.5%结晶紫染色5分钟, 清水轻轻浸洗数次, 倒置晾干, 刀片揭膜, 中性树胶封片。显微镜下随机计数6个视野穿膜细胞并进行统计。

1.2.6 Western blot检测细胞中相关蛋白水平变化

提取各组细胞中的总蛋白并用BCA法测蛋白浓度, 取30μg蛋白行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) , 湿转硝酸纤维膜 (PVDF膜) 后5%脱脂牛奶封闭1小时, 分别与MMP-13 (1∶1000) 、GAPDH (1∶20000) 蛋白特异性一抗稀释液4℃孵育过夜, TBST缓冲液漂洗5次, 每次5分钟, 加入相应浓度的辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液, 室温1小时, TBST缓冲液漂洗5次, 每次5分钟, 用ECL化学发光剂反应, 暗室下显影。采用Quantity One软件进行蛋白条带的灰度分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS 15.0统计学软件对数据进行统计分析, 实验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 两组以上数据的比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-125b的表达与子宫内膜癌临床病理分期及转移的关系

我们检测了30例子宫内膜癌及其对应癌旁组织中miR-125b的表达情况。结果显示, Ⅳ期肿瘤组织中miR-125b的表达较Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期肿瘤组织均明显下降, 且差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见图1A;进一步的结果显示, 相对于25例无远处转移患者标本组织中miR-125b的表达, 伴有远处转移患者的miR-125b表达明显降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见图1B。

2.2 子宫内膜癌细胞HEC-1B中转染miR-125b模拟片段

为了进一步检测miR-125b对子宫内膜癌细胞侵袭及迁移的影响, 我们通过转染成熟miR-125b模拟片段 (mimic) 恢复其在子宫内膜癌细胞HEC-1B中的表达, 转染无意片段 (scramble mimic) 作为阳性对照组, 未处理 (untreated) 细胞作为阴性对照组。结果显示, 转染miR-125b mimic后HEC-1B细胞中miR-125b的mRNA表达水平与未处理组及对照组相比, 分别增加约905倍 (P<0.01) 和907倍 (P<0.01) 。见图2。

2.3 过表达miR-125b对HEC-1B细胞迁移能力的影响

我们运用Transwell小室迁移试验检测miR-125b对肿瘤细胞迁移能力的影响。实验结果表明, 过表达miR-125b后HEC-1B细胞的穿膜细胞数明显降低 (见图3) 。统计结果表明, 肿瘤细胞在无基质胶的条件下迁移24小时后, miR-125b组穿膜细胞数约为184±35个, 较未处理组 (410±45个) 和对照组 (398±40个) 明显减少, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见图3。

2.4 miR-125b对子宫内膜癌细胞侵袭能力的影响

为检测miR-125b对肿瘤细胞侵袭能力的影响, 我们将Transwell小室包被以Matrigel基质胶。细胞侵袭结果显示, 肿瘤细胞在有基质胶包裹的条件, 过表达miR-125b组平均穿膜细胞细胞数 (123±32个) 同样明显少于未处理组 (220±30个) 和对照组 (215±35个) , 差异有统计学意义 (P<0.01) 。见图4。

2.5 miR-125b对HEC-1B细胞内MMP-13的表达的影响

为检测miR-125b介导的肿瘤抑制的机制, 我们检测了过表达miR-125b后子宫内膜癌细胞中MMP-13蛋白表达量的变化。结果如图5所示, 过表达miR-125b后细胞中MMP-13蛋白表达明显下降。

3 讨论

肿瘤的转移是一个多步骤、连续的主动过程, 这一过程中多种生长因子及细胞因子参与其中并发挥重要的作用[5], 主要包括原发肿瘤扩展浸润、细胞外基质降解、肿瘤浸润转移及继发性肿瘤生长等。转移是恶性肿瘤的重要生物学特性之一, 严重影响了肿瘤患者的治疗和预后, 了解其具体的发生步骤以及作用机制将为进一步的肿瘤生物治疗提供有利的理论基础。本实验研究结果证实, miR-125b与子宫内膜癌的临床分期及转移有关, 提示其可能在子宫内膜癌的发展浸润过程中发挥作用。

miR-125b是一类新型的非编码微小RNA分子, 是miR-125家族中的重要一员。成熟的miR-125b来源于两个前体pre-miR-125b-1和pre-miR-125b-2, 分别位于染色体11q24.1和21q21.1。报道显示其在多种肿瘤组织中的表达明显下降, 如乳腺癌、肝癌以及宫颈癌等[6~8], 提示其作为抑癌基因在多种肿瘤中发挥重要作用。我们的实验结果显示, 较Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期子宫内膜癌组织相对表达量而言, Ⅳ期组织中miR-125b相对表达量呈现不同程度的下降;同时伴有远处转移的组织较未转移的组织表达量明显减少。表明子宫内膜癌组织中miR-125b的表达与组织的临床分期及有无远处转移有关。为了进一步检测miR-125b与子宫内膜癌发生浸润及转移的关系, 我们分别运用体外侵袭及迁移实验, 检测了miR-125b对子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力的影响。实验结果表明, 过表达miR-125b明显抑制HEC-1B细胞的体外侵袭和迁移能力。以上结果表明, miR-125b在子宫内膜癌组织中可能担当抑癌基因的功能, 并且与肿瘤组织的侵袭与转移密切相关。

那么miR-125b抑制肿瘤发生侵袭和浸润的机制是什么呢?MMP-13又称骨胶原酶3 (collagenase-3) , 是基质金属蛋白酶家族 (MMPs) 中的重要一员[9]。MMP-13能够有效地裂解细胞外基质 (extracellular matrixc, ECM) 中的纤维胶原, 诱导Ⅱ型骨胶原向Ⅰ型和Ⅲ型转化, 降解Ⅳ型、Ⅸ型、Ⅹ型及ⅩⅣ型骨胶原。ECM是预防肿瘤侵袭和转移的天然屏障, 能够有效地防止肿瘤细胞的扩散, 因此MMP-13在肿瘤的转移过程中发挥重要作用[10]。有趣的是, MMP-13是miR-125b的靶基因之一。Wu等[11]的研究发现, miR-125b能够明显抑制膀胱癌细胞的体外侵袭和迁移, 但是恢复细胞中MMP-13的表达能够部分的逆转其抑制作用, 表明MMP-13参与miR-125b介导的对膀胱癌细胞体外侵袭和迁移的抑制作用。而在子宫内膜癌组织中, Tushaus等[12]的实验证实, 其中MMP-13表达量明显增加, 并且与组织浸润程度及淋巴转移密切相关。因此我们推测MMP-13可能介导参与了miR-125b对子宫内膜癌的抑制功能。我们进一步的实验表明, 过表达miR-125b后HEC-1B细胞中MMP-13表达量明显减少。

综上所述, 我们的实验证明在子宫内膜癌组织中miR-125b表达量下降与患者的临床分期及有无远处转移密切相关, 并且恢复子宫内膜癌细胞中miR-125b的表达能够明显抑制细胞的侵袭和迁移, 而这一生物学过程很可能是通过抑制MMP-13介导的。这将为子宫内膜癌的早期诊断及肿瘤生物治疗提供新的靶点。

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子宫内膜小细胞癌3例 篇7

例1, 患者, 72岁, 因绝经22年, 阴道流血及排液20余天于2008年9月收入我院。患者22年前自然绝经, 入院前20余天出现阴道排出淡黄色水样分泌物, 并伴有阴道不规则流血, 彩超检查提示宫内回声团, 收入院。既往合并高血压、糖尿病, G4P3。妇科检查:子宫萎缩欠佳, 余检查正常。肿瘤标志物:CA19-938.69 U/ml、CA1258.84 U/ml。妇科彩超检查:宫腔内不均质实性中等回声占位, 范围2.9 cm×2.2 cm×2.3 cm。入院后行宫腔镜, 病理检查示:子宫内膜小细胞恶性肿瘤;免疫组化:弹性蛋白 (Vimentin) 阳性、CD99阳性, P53 (局灶阳性) 、Ki67 60%, 余阴性。考虑子宫内膜小细胞癌, 于10月13日在全身麻醉下行开腹闭式全子宫切除术+双侧附件切除术+盆腔淋巴结活检术。术中见:无腹水, 子宫未萎缩, 双侧附件正常, 肝、胆、脾、胃肠及网膜未见异常。术后大体标本见肿瘤突向宫腔, 侵犯浅肌层, 余组织及淋巴未见侵犯, 病理及免疫组化结果证实为子宫内膜小细胞癌伴小部分子宫内膜样腺癌成分。手术病理分期:ⅠB期。患者术后于10月28日、11月27日分别予CAP方案 (环磷酰胺700 mg+多柔比星70 mg+顺铂100 mg) 静脉化疗2周期, 于2009年1月13日至2月27日放疗32次, 后再次静脉CAP方案化疗2周期, 末次化疗于2009年4月。患者术后随访至今, 共57个月, 复查CA125、CA19-9均在正常范围, 无肿瘤复发迹象。

例2, 患者, 39岁, 因阴道不规则流血4月余于2010年7月28日收入我院。患者阴道不规则流血4个月, 外院反复B超检查提示内膜增厚, 阴道不规则流血并伴有组织排出, 排出组织行病理检查提示恶性肿瘤, 遂就诊于我院。既往无特殊病史, G2P1。妇科检查未见明显异常。肿瘤标志物:CA12542.88 U/ml、CA19-96.35 U/ml、CEA 0.517μg/L。妇科彩超检查示:宫腔内形态不规则中等不均质回声5.9 cm×2.9 cm×2.4 cm, 达宫颈管下段, 距前壁浆膜层最薄0.4 cm, 提示肉瘤可能。盆腔MRI检查示:子宫内膜不规则增厚, 范围6.8 cm×2.5 cm, 以等T1长T2信号为主, 抑脂像及DWI上呈高信号, 其内有不规则低信号, 宫颈受累, 增强扫描中度强化, 盆腔多发肿大淋巴结, 提示恶性占位。盆腔CT检查示:宫腔不规则低密度影, 边缘不清, 范围7.3 cm×3.8 cm, 增强扫描强化程度低于其余子宫肌壁, 双侧腹股沟区可见多发小淋巴结, 提示:子宫体部及颈部恶性肿瘤。宫腔排出组织于我院及外院病理会诊均提示恶性肿瘤, 考虑平滑肌肉瘤、子宫内膜间质肿瘤及低分化癌可能。于8月4日在全身麻醉下行腹腔镜下全子宫切除术+双侧附件切除术+盆腔及腹主动脉旁淋巴结切除术。术中探查:无腹水, 子宫大小正常, 双侧输卵管及卵巢外观正常, 肝、脾、胃、肠管及网膜未及异常。术后病理检查示:肿瘤细胞弥漫浸润生长, 侵犯宫壁及宫颈管壁 (深度<1/2) , 可见广泛脉管内癌栓, 肿瘤细胞体积小, 呈短梭形或卵圆形, 胞浆稀少;免疫组化结果:突触素 (synaptophysin, Syn) 阳性、P16阳性, Ki-67 70%, 余阴性。病理诊断:子宫内膜小细胞癌, 手术病理分期:Ⅱ期。患者术后于8月20日起行EP方案静脉化疗 (依托泊苷150 mg+顺铂40 mg, 连用3天) , 每月1次, 共3次。于11月8日起放疗25次。化疗后1月余继续EP方案静脉化疗3周期, 末次化疗时间2011年4月。患者术后定期随访至今, 共38个月, 动态监测CA125未降至正常, 维持在40 U/ml左右, 但无明显上升;术后初次复查神经元特异性烯醇化酶 (neuron specific enolase, NSE) 18.03ng/ml轻度升高, 后逐渐降至正常水平;复查妇科检查、胸部、腹部及盆腔CT检查均无肿瘤复发迹象。

例3, 患者, 56岁, 因阴道流血半年, 增多1月余于2012年5月24日收入我院妇科治疗。患者阴道不规则流血半年, 后伴阴道排液, 入院前1个月阴道流血明显增多, 分段诊刮病理检查提示:Ⅰ型子宫内膜样腺癌, 遂收入院治疗。既往无特殊病史, G1P1。妇科检查:子宫增大如孕10周, 质中, 边界清楚, 活动度可, 余查体正常。肿瘤标志物:CA12522.55 U/ml、CA19-916.5 U/ml、CP2 6.88 U/ml、CEA 1.26μg/L均正常。盆腔MRI检查示:子宫底及子宫体内膜不规则增厚, 局部结合带模糊, 病灶为等T1长T2信号, 与浅肌层分界欠清, 在DWI上呈高信号, 增强扫描可见轻度强化, 盆腔未见肿大淋巴结, 提示子宫内膜癌。5月20日于全身麻醉下行开腹筋膜外全子宫切除术+双侧附件切除术+盆腔及腹主动脉旁淋巴结切除术。术中见:无腹水, 子宫增大如孕12周大小, 质韧, 双侧附件正常, 肝、胆、脾、胃、肠管及网膜未见异常, 腹主动脉旁和双侧髂血管区可及肿大淋巴结。术后病理检查示:肿瘤细胞弥漫浸润生长, 呈中低分化子宫内膜样腺癌及小细胞神经内分泌癌表现, 侵及肌壁近全层, 伴颈管受累, 可见淋巴管癌栓, 神经内分泌癌部分组织;免疫组化:Syn阳性, Vimentin阳性, CD99阳性, Ki-67 50%, 余阴性。手术病理分期:ⅢC期。术后于6月19日起行VP方案静脉化疗 (依托泊苷170 mg, 连用3天, 顺铂连用3天, 剂量分别为60 mg、50 mg、50 mg) , 每月1次, 共4次。于10月26日起放疗42次, 放疗后1个月继续EP方案静脉化疗2周期, 末次化疗时间2013年1月31日。术后随访至今, 共17个月, 无肿瘤复发迹象。

2 讨论

小细胞癌是一种具有神经内分泌功能的恶性肿瘤, 好发于肺部。原发性子宫内膜小细胞癌 (primary small cell carcinoma of the endometrium, SCCE) 是一种十分罕见的生殖道恶性肿瘤, 约占子宫内膜癌的0.8%[1]。目前国内外的报道多为个案, 中国人发病的病例报道目前共12例。我院近二十年收治的子宫内膜恶性肿瘤中只有3例为SCCE。

SCCE的发病年龄较子宫内膜样腺癌晚, 我院收治的3例患者发病年龄为39~72岁。SCCE的临床症状无特异性, 常见的症状为阴道不规则流血、腹痛等, 偶有报道以类癌综合征为首发表现[2], 本文中3例患者均以阴道流血为主要临床表现。

SCCE妇科检查及术前辅助检查均无特异性, 部分患者术前查肿瘤标志物CA125及CA19-9轻度升高[3,4], 我院收治的3例患者中例1 CA19-9升高, 例2 CA125升高, 例3均正常。彩超及盆腔MRI检查均提示宫腔占位, 多能提示占位为恶性表现, 但不能鉴别占位的组织类型。也有文献总结不同类型子宫内膜癌MRI特征后将低T1长T2信号、可强化作为SCCE的影像学特点[5]。我院收治的3例患者中2例行盆腔MRI检查肿瘤均表现为等T1长T2信号、可强化。

SCCE确诊需依据病理检查及免疫组织化学染色。SCCE的大体标本常表现为宫腔内肿块, 呈浸润生长或息肉样, 肿瘤切面苍白、质脆, 部分呈鱼肉样, 常伴有大面积的出血坏死。SCCE的病理组织学特点与肺小细胞癌及其他部位的小细胞癌表现是一致的, 表现为:肿瘤细胞形态相似, 为圆形或卵圆形, 呈条索状或巢状分布, 部分形成菊团状, 细胞体积较小, 大小一致, 胞浆少, 核仁大, 核分裂相多见, 局部可见细胞坏死、血管浸润。部分SCCE常与其他类型的肿瘤同时存在, 如:腺癌、腺鳞癌及中胚层混合瘤细胞等。免疫组化染色至少一种神经内分泌标志物阳性以证实肿瘤细胞具有神经内分泌功能是最终诊断SCCE的重要依据, 常用的神经内分泌标志物有:Syn、NSE、嗜铬颗粒蛋白 (chromogranin-A, Cg A) 等。SCCE的诊断至今沿用Hoeven等的诊断标准: (1) 肿瘤由单一的小型至中型肿瘤细胞组成, 致密、成片生长, 可合并或不合并其他肿瘤亚型成分; (2) 免疫组化染色在此单一细胞成分中须有至少一种神经内分泌标志物阳性; (3) 须有明确的原发于子宫内膜的证据, 如部分局限于子宫内膜, 或子宫内膜出现与SCCE有关的不同形态原发恶性肿瘤。

目前国际上尚无SCCE的治疗标准可循, 多采用手术联合放化疗的综合治疗方案, 手术范围通常参照子宫内膜癌的治疗标准, 本文中3例患者手术范围为全子宫双侧附件切除术+盆腔或 (和) 腹主动脉淋巴结切除术。放化疗则主要参考肺小细胞癌的治疗方案。既往文献中报道的化疗方案多为对小细胞癌敏感的铂类联合其他化疗药如:依托泊苷、多柔比星、紫杉醇、长春新碱等[2,6,7]。2013年NCCN指南中肺小细胞癌的一线化疗方案为:EP (依托泊苷+顺铂) 、IP (依托替康+顺铂) 、IC (伊立替康+顺铂) 。本文中2例患者采用肺小细胞癌一线化疗方案EP方案, 另一例患者则采用CAP方案。

SCCE肿瘤细胞分化差、恶性程度高, 易早期浸润及转移, 预后极差。约一半的患者在初次诊断为SCCE时已达FIGO分期晚期[6], SCCE患者术后生存时间常小于1年[2], FIGO分期Ⅲ或Ⅳ期患者的中位生存期只有5个月[6]。但也有文献报道, SCCE患者治疗后获得良好预后, 目前报道的1例FIGO (1988年) ⅢC期的患者术后无瘤生存长达13年[7], 可能与该患者接受手术联合放化疗的综合治疗有关。此外, SCCE的预后还与肿瘤分期有关, 可能与肿瘤肌层浸润程度及淋巴转移等因素有关[7,8]。本文中3例患者手术病理分期从ⅠB到ⅢC期, 均采用手术联合化放疗综合治疗, 术后定期随访 (17~57个月) , 均无肿瘤复发迹象。

参考文献

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子宫内膜细胞学评价系统探讨 篇8

1子宫内膜细胞学检查

子宫内膜细胞学检查(endometrial cytology test, ECT),是一种从子宫腔直接进行细胞学取材,对子宫内膜状态进行评价及对子宫内膜病变进行筛查的方法。多项研究结果显示,ECT筛查子宫内膜癌的敏感度为78% ~100%,特异度为66% ~100%。在我们前期关于ECT在子宫内膜癌筛查的应用研究中,对1717例存在明确手术指征行宫腔镜检查且接受ECT的患者,以分段诊刮的组织病理学诊断为“金标准”,分析子宫内膜细胞学筛查子宫内膜癌及其癌前病变的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和符合度,结果分别为87.3%、88.3%、41.9%、98.6%和88.2%[5]。

2完善子宫内膜细胞学评价系统的意义

ECT主要通过对细胞学涂片中细胞数量、细胞形态、细胞排列以及涂片背景特点进行判读,但对于子宫内膜细胞学评价系统和评价标准目前尚无国际统一标准。因此,迫切需要一套与子宫内膜组织病理学诊断结果符合率高、可重复性好,对临床工作具有指导意义的子宫内膜细胞学评价系统。通过总结早期子宫内膜细胞学阅片工作,曾于2006年《生育健康杂志》第17卷第1期发表《子宫内膜细胞学诊断系统》 一文,初步将评价系统分为三大类。第一类:未见上皮内病变细胞和恶性细胞(包括不同周期的子宫内膜细胞、子宫内膜炎);第二类:子宫内膜不典型增生;第三类:子宫内膜癌(包括Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌)。近年来,随着我们对子宫内膜病变认识的增加(包括子宫内膜组织病理学、生物学行为等),和对子宫内膜细胞学形态和结构特点的进一步总结,在2006年初步建立的《子宫内膜细胞学诊断系统》[6]基础上进行了一些修订和改进。使其能更好地与临床工作相结合, 充分体现子宫内膜细胞学筛查结果对子宫内膜病变患者的临床处理和管理的价值。

3修订后的子宫内膜细胞学评价系统

子宫内膜良性增生包括单纯性增生和复杂性增生,其细胞学表现、罹患子宫内膜癌的风险以及临床处理措施不同于子宫内膜不典型增生和正常子宫内膜细胞。因此,在子宫内膜细胞学涂片中,需要对两者进行甄别。在2006年的子宫内膜细胞学诊断系统中未涉及子宫内膜良性增生这一类子宫内膜异常情况。因此,为更好地与临床工作相结合,充分体现子宫内膜细胞学筛查结果对子宫内膜病变患者的临床处理和管理的价值,在最新修订的子宫内膜细胞学评价系统中将良 性增生归 为子宫内 膜良性病 变一类。 同时,子宫内膜疾病从子宫内膜炎到子宫内膜癌其疾病谱广,且子宫内膜的细胞学和组织学形态受到包括激素、宫内节育器(IUD)等多种因素的影响,产生各种形态变化,有时会使子宫内膜细胞学的判读产生困难, 无法将其准确归入良性增生还是不典型增生一类,因此在重新修订后的诊断系统中加入不典型子宫内膜细胞一类。对子宫内膜不典型增生一类的诊断,不再进一步细分为轻、中、重度不典型增生。子宫内膜癌这一类诊断也不再将其细化为Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌,因为对这部分人群的后续管理是一致的。

在对子宫内膜细胞学涂片进行判读时,首先对取材标本进行满意度评估,评价其是否能充分反应所取材子宫内膜状况。其后根据细胞形态和细胞排列进行评价诊断分类。新版诊断系统共分五大类。第一类:未见上皮内病变细胞和恶性细胞,包括增殖期改变、分泌期改变和萎缩性改变。第二类:子宫内膜良性病变,包括组织学诊断中的不规则增生、单纯性增生、复杂性增生、子宫内膜息肉和子宫内膜炎等。第三类:不典型子宫内膜细胞,根据其形态学特征、临床意义又进一步将其分为两类:1不典型子宫内膜细胞-意义不明确,包括各种医源性因素(应用激素、宫腔操作等)、卵巢功能失调出血等导致的子宫内膜改变;2不典型子宫内膜细胞-不除外子宫内膜不典型增生和恶性肿瘤。第四类:子宫内膜不典型增生,对应组织学诊断中的单纯性增生伴不典型增生、复杂性增生伴不典型增生,子宫内膜上皮内瘤变(EIN),子宫内膜腺体异型增生(EmGD)。第五类:子宫内膜癌,包括各种类型子宫内膜癌。

4关于子宫内膜细胞学检查评价系统的国内外研究情况

ECT在意大利、日本和美国等国家相继开展,尤其是日本,已将ECT列入《健康保健法》,推荐其作为绝经后女性子宫内膜癌筛查的首选方法[7]。ECT评价系统的建立主要是基于通过对细胞数量、细胞形态以及细胞排列特点的判读,既有利于细胞病理学医生之间具有较高的诊断一致性,与组织病理学结果有较好的符合率,同时有利于与临床沟通,对子宫内膜病变人群进行更 好的管理 与随访,获得更佳 的临床结 局,以此达到其在子宫内膜癌早诊早治中的作用。

文献中较经典的子宫内膜评价系统主要分为四大类:正常子宫内膜,不伴不典型性的子宫内膜增生, 子宫内膜不典型增生,子宫内膜癌[8~10]。四分类法评价系统较简洁,在细胞病理学医生之间的诊断重复性较高,便于学术交流。但是,子宫内膜在其周期性生长脱落过程中受到的影响因素较多,子宫内膜病变复杂,其细胞形态学表现也远比此系统所描述的情况要更复杂。因此,也有学者[11]总结多年的筛查经验、参考宫颈液基细胞学Bethesda报告系统,在经典四分类诊断的基础 上,加入不典 型子宫内 膜细胞 (atypical endometrial cells,ATEC)一类,并将其进一步分为不典型子宫内膜细胞-意义不明确(ATEC,of undetermined significance,ATEC-US)和不典型子宫内膜细胞-不能除外子宫内膜不典型增生或更高级别病变 (ATEC,cannot exclude atypical endometrial hyperplasia or more,ATEC-A)。这与我们重新修订后的子宫内膜细胞学评价系统较一致,当子宫内膜细胞学涂片中出现不典型子宫内膜细胞而又无法解释其原因时,可以使用ATEC这一术语。考虑造成细胞不典型性的原因倾向于炎症、化生或医源性因素时,使用ATEC-US的术语,这类诊断不推荐患者立即行进一步的子宫内膜检查;当子宫内膜不典型细胞考虑其更支持是子宫内膜不典型增生或子宫内膜癌来源时可使用ATEC-A这一术语,此结果同子宫内膜不典型增生诊断,建议患者行进一步的子宫内膜检查。

子宫内膜干细胞研究 篇9

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2006年10月至2007年6月在中南大学湘雅医院及湘雅二医院经剖腹或腹腔镜手术后病理证实为内异症的住院患者70例为内异症组, 年龄25～55岁, 平均年龄35.4岁。选取同期因异位妊娠, 要求绝育及输卵管吻合术等行盆腔手术而术中未发现有内异症病灶者88例为对照组, 年龄22～45岁, 平均年龄32.3岁。两组间年龄比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。为保证遗传背景相同, 内异症组及对照组均来自中国湖南汉族人群, 无血缘关系。3个月内均未服用过激素类药物, 未发现肝炎、糖尿病、结核、类风湿、妇科肿瘤或其他自身免疫性疾病。所有受试者均无遗传病家族史。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

抽取每位受试者的肘静脉血2～3 ml, 采用标准的苯酚-氯仿萃取法手工提取其DNA, -20℃保存待测。

1.2.2 PCR-RFLP扩增与分析

引物设计序列参考相关文献, 并核对Gene Bank中原始DNA序列, 经上海生物工程公司鉴定并合成。引物序列、扩增片段如下:上游引物:5′-TCCTGGCGACTAACATCGGTGACTTA-3′;下游引物:5′-AGCTACGTGCCTGACTTCTCGGACAC-3′。目标扩增片段长度为304bp。PCR反应体系为20 μl。扩增条件为:95℃3分钟, 95℃40秒, 60℃30秒, 72℃30秒, 30个循环, 72℃延伸5分钟, 4℃保温。用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 100 bp为标准分子量对照, 鉴定PCR产物。取2 μl PCR产物, 加入限制性内切酶AluⅠ0.5 μl及其缓冲液组成10 μl反应体系, 37℃ 恒温育2小时。取酶切产物1μl用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染后用成像系统显像, 判读结果。由于AluⅠ实际识别位点为AGCT, 因此使用AluⅠ酶切预期结果如下:野生型aggt (G/G) , 不能被酶切, 其酶切产物片段为304 bp;突变纯合子agct (C/C) , 能被酶切, 产生两个片段, 长度分别为96 bp, 208 bp;突变杂合子aggt/agct (G/C) , 酶切后产生3个片段, 长度分别为96 bp, 208 bp, 304 bp。

1.3 统计学分析

基因型频率按直接计数法计算, 采用卡方检验, 分析内异症组和对照组分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律, 以及比较两组基因型分布频率的差异, 计算比值比 (odds ratio, OR) 及95%可信区间 (confidence interval, CI) , 两组间基因型的两两比较以P<0.0125为差异有统计学意义, 余以P<0.05为差异有统计学意义。数据均用SPSS 13.0软件进行统计分析。

2 结 果

2.1 MIF-173位点基因多态性分析

PCR扩增产物长度为304 bp, 内异症组和对照组中均检出3种基因型:-173GG (野生型) , 不能被酶切, 产生1个片段, 长度为304 bp;-173CC (突变纯合型) , 能被酶切, 产生2个片段, 长度分别为96 bp、208 bp; -173GC型 (突变杂合型) , 酶切后产生3个片段, 长度分别为96 bp、208 bp、304 bp。见图1。

1:标记 (Mark) ;2:PCR产物;3:GG基因型; 4:GC基因型;5:CC基因型

2.2 两组Hardy-Weinberg平衡检验

计算出对照组和内异症组研究对象中MIF基因中-173G/C基因型频率观察数与期望数, 差异均无统计学意义 (P>0.05) , 表明研究对象符合Hardy-Weinberg遗传平衡, 本研究资料具有群体代表性。见表1。

2.3 两组MIF-173G/C多态性分布及比较

内异症组患者MIF-173位点多态性存在GG, GC, CC 3种基因型, 分别占57.14%, 25.72%和17.14%;G, C等位基因频率分别为70.00%, 30.00%。对照组中3种基因型分别占72.73%, 22.73% 和4.54%, G, C等位基因频率分别为84.09%, 15.91%。两组组间基因型和等位基因频率差异均有统计学意义 (P<0.05) 。内异症组与对照组比较, GG, GC基因型分布频率差异均无统计学意义 (χ2= 4.209, P>0.0125;χ2=0.190, P>0.0125) , CC基因型分布频率差异有统计学意义 (χ2=6.798, P=0.009) 。 见表2。

2.4 两组MIF基因型优势比分析

内异症组MIF-CC基因型优势比 (OR=4.345, χ2=6.798, P=0.009) 。OR值95%的CI为 (1.335～14.140) 。

3 讨 论

MIF是一种多功能细胞因子, 它限制巨噬细胞移动, 增加病灶处及腹腔内巨噬细胞浓度, 促使巨噬细胞分泌多种细胞因子及化学物质[4]。MIF在免疫反应、炎症反应、细胞生长及抑制细胞凋亡过程中起重要调节作用。国外学者研究发现, MIF可能通过多种途径促进了内异灶的发生和发展。Pakozdi等 [5]指出, MIF 可诱发内异症妇女异位和在位子宫内膜细胞中基质金属蛋白酶 (MMP-2) 的分泌、合成和激活, 从而利于异位的子宫内膜在宿主组织中植入和生长。Akoum等[6,7] 研究发现, 腹膜巨噬细胞产生的单核细胞趋化蛋白 -1 (monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) 和 MIF可能促成了内异症患者巨噬细胞的旁分泌和自分泌活性及其在腹膜腔聚集。MIF还可以促进新生血管生成, 这些机制可能加重了腹膜炎症并促进了子宫内膜的迁移、浸润、生长。另外, MIF与内异症的进展程度及其导致的盆腔疼痛和不孕等有关。

人类 MIF基因定位于第22号染色体长臂 22q (11.2) , 基因片段小于1 kb, 包含了3个外显子, 2个内含子。MIF基因存在4个多态性位点, 分别是位于启动子区的 CATT (5-8) 微卫星多态, 5′侧翼区的-173 (G/C) 单核苷酸多态和位于内含子区的 +254 (T/C) 、+656 (C/G) 的两个单核苷酸多态。近年来有研究表明MIF基因启动子区CATT (5-8) 微卫星多态, 5′侧翼区的-173 (G/C) 单核苷酸多态性影响MIF基因的转录进而影响其基因的功能, 在疾病的发生或基因的功能方面具有重要的意义, 被称之为功能多态性, 是目前多基因病遗传易感基因鉴定研究的热点。研究证实MIF基因功能多态性与多种疾病的发生有遗传易感性, 特别是在一些自身免疫性疾病中。

我们在内异症组和正常对照组中都发现了GG、GC、CC 3种基因型, 表明该位点在我们所研究的人群中均具有G/C单核苷酸多态性, 与国外单核苷酸多态性 (SNP) 数据库检索的结果一致。同时, 我们确定了基因型在两组中的分布频率, 且两组人群均符合Hardy-Weinberg遗传平衡的随机婚配大群体。比较两组人群基因型频率及等位基因频率时我们发现, 两组中均以MIF-173GG型及G等位基因为主, 与费保莹报道的我国浙江地区汉族人群和单志新报道的我国广东汉族人群中MIF-173G/C单核苷酸多态性分布结果相似, 但同周韶璋所研究的陕西人群SNP分布不一致。这与基因多态性具有种族、人群、地域等差异有关。

研究结果显示MIF-173多态位点的基因型频率和等位基因频率在内异症组和对照组之间比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。内异症组中MIF-173CC基因型的分布频率 (17.14%) 显著高于对照组 (4.54%) , (OR=4.345, 95%CI 1.335～14.140, P=0.009) , 其CI值均大于1, 可以初步认为CC基因型与内异症的易感存在相关性。CC基因型使内异症的相对危险度提高, CC基因型可能是内异症的易感基因型。

MIF-173G/C单核苷酸多态与内异症的遗传易感性相关的机制尚不明确, 可能与以下方面有关: MIF-173C等位基因具有4-膦酰基丁酸 (AP4) 应答元件结合位点, 单核苷酸的不同可导致与AP4应答元件亲和力的不同, 影响转录启动频率, 从而对MIF的表达水平造成影响。研究发现MIF-173C (GC+CC) 基因型的健康志愿者血清中MIF水平要显著高于MIF-173GG基因型的健康志愿者[8]。人在位、异位子宫内膜及腹腔液中均有MIFmRNA及蛋白的表达, 而且异位内膜的表达水平明显高于在位内膜。单核苷酸的改变可能引起MIF增多, 导致局部细胞因子及生长因子改变, 腹腔内环境变化, 从而促进异位内膜细胞迁移、浸润、生长。本研究中我们初步发现MIF-173位点G/C单核苷酸多态性与湖南汉族人群内异症的遗传易感性相关, 其CC基因型可能是内异症的易感基因型。这为MIF可能在内异症中发挥作用的假说提供了遗传学依据。

摘要：目的:检测子宫内膜异位症患者和非子宫内膜异位症患者巨噬细胞移动抑制因子 (MIF) -173位点单核苷酸多态性, 探讨MIF-173位点G/C多态性与子宫内膜异位症遗传易感性的关系。方法:应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性 (PCR-RFLP) 分析技术, 检测湖南汉族子宫内膜异位症患者70例 (内异症组) 及非子宫内膜异位症患者88例 (对照组) MIF-173酶切位点单核苷酸多态性, 并进行MIF基因分型。结果:①MIF-173位点GG, GC, CC基因型在内异症组和对照组中的分布频率分别为57.14%, 25.72%, 17.14%和72.73%, 22.73%, 4.54%, 两组组间比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。②G、C等位基因频率在内异症组中的分布频率分别为70.00%, 30.00%;在对照组中分别为84.09%, 15.91%, 两组间比较差异有统计学意义 (P=0.003) 。③MIF-173CC基因型在内异症组中的分布频率 (17.14%) 明显高于对照组 (4.54%) (OR=4.345, 95%CI 1.33514.140, P=0.009) 。结论:MIF-173位点单核苷酸多态性与湖南汉族人群子宫内膜异位症的遗传易感性相关, 其CC基因型可能是其易感基因。

关键词：子宫内膜异位症,巨噬细胞移动抑制因子,单核苷酸多态性

参考文献

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[7]Akoum A, Metz CN, Al-Akoum M, et al.Macrophagemigration inhib-itory factor expression in the intrauterine endometrium of women withendometriosis varies with disease stage, infertility status, and pelvicpain[J].Fertil Steril, 2006, 85 (12) :1379-1385.

子宫内膜干细胞研究 篇10

宫腔镜的诊断与手术，目前已越来越广泛地应用于诊治各种宫腔内疾患。其中有关异常子宫出血是宫腔镜检查最主要的指征，而子宫内膜电切术（TCRE）是目前治疗DUB的首选外科方法。本文研究观察了子宫内膜电切术治疗功血的患者的卵巢功能在术后的变化情况，希望能够揭示子宫内膜电切术后患者卵巢功能的变化规律，以指导患者术后进一步的药物治疗。

1资料与方法

1.1一般资料：本文研究所选入病例为2002年1月—2004年12月在我院就诊的功血患者66例。上述患者年龄在37-45岁之间，平均年龄为42.6岁；病程最短为1年，最长为15年，平均4.7年。所有患者均符合婦产科学第六版教材[1]，功能性子宫出血简称为功血，是指由调节生殖的神经内分泌机制失常引起的异常子宫出血，为妇科常见病。

所有功血患者，均经药物保守治疗无效，并且均已排除器质性病变。并排除了近三个月内有影响下丘脑－垂体－卵巢轴功能的治疗措施；及其肝肾功能变化、精神障碍，及其它内分泌疾病卵巢包块、急慢性盆腔炎、恶性疾患、既往子宫及附件手术史，近期有手术禁忌或拒绝手术者、不愿意或无条件随访者。

1.2方法：上述患者66例随机分为两组：TCRE组33例及子宫次全切除组33例。另同期选择30例月经正常的健康妇女作正常对照。其中TCRE组失访2例，子宫次全切除组失访3例。两组性别等一般情况无差异性，但具有可比性。

患者在月经干净后3—7天内手术，术前均未行药物子宫内膜预处理。TCRE组术前晚宫颈置入海藻扩张棒以软化扩张宫颈，手术采取连续性硬膜外麻醉，灌流液用5%葡萄糖溶液（糖尿病者用5%甘露醇溶液），在B超监视下行TCRE，环状电极切除子宫内膜，术中宫角环状电极难于切到的部位,加用滚球电极电凝。电切功率80ｗ，电凝功率60ｗ，切除组织深度至子宫内膜基底层下2.0～4.0ｍｍ的肌肉组织。子宫次全切除组采取连续性硬膜外麻醉下手术，保留双侧附件。

1.3检测指标与方法

1.3.1性激素测定采用RIA测定法，药盒为BECKMANCOULPR公司生产。测量六项血清性激素：卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、催乳素（PRL）、孕酮（P）、睾酮（T）。

1.3.2显微镜下观察患者阴道脱落细胞，计算MI值，即阴道上皮3层细胞百分比。在低倍显微镜下观察计算300个鳞状上皮细胞，求得各层细胞的百分率。一般有雌激素影响的涂片，基本上无底层细胞，卵巢功能低落时则出现低层细胞[2]。

上述观察指标分别于术前两天内、术后六个月、术后十二个月、术后十八个月分次检测。检测时间为卵泡期，若术后患者月经来潮，则于同期检查，若术后闭经者则以基础体温图或阴道彩色多谱勒超声检查卵巢加以确定。性激素检查所有血样均于患者空腹状态下，上午10时以前采取。

1.4统计学方法：上述数据应用spss 11.0软件包统计。

2结果

术前三个组相比，六项性激素水平比较，P>0.05，无统计学意义，说明术前三组性激素水平无差异。术后六个月、十二个月、十八个月时，三组相比较，子宫切除组出现FSH值、LH值升高、E2值下降的趋势，与其余两组相比P<0.05，有统计学意义，说明子宫切除组术后表现为卵巢功能下降，子宫次全切除组卵巢功能下降的幅度及速度快于TCRE组。术后六个月、十二个月时，TCRE组也出现了FSH值、LH值升高、E2值下降，卵巢功能表现出下降趋势，但与正常组比较P>0.05，无统计学意义，说明TCRE组及正常组两组性激素水平无差异。十八个月时，两组相比，有统计学意义，说明TCRE组的卵巢功能下降，与正常组相比有统计学意义。

TCRE组在术后六个月，术后十二个月的阴道脱落细胞雌激素影响水平与正常组相比无明显差异（P>0.05），但术后十八个月时阴道脱落细胞雌激素影响水平与正常组相比有统计学意义（P<0.05），显示卵巢功能低落，而子宫次全切除组术后六个月、十二个月、十八个月阴道脱落细胞雌激素影响水平下降，显示卵巢功能下降，与正常组及TCRE组相比有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

妇女的年龄和基础FSH水平是预测卵巢储备的重要指标，但卵巢年龄与实际年龄并不总是一致的，本文的研究中，术后六个月子宫切除组出现FSH、LH值上升、E2值下降的趋势，与正常组及TCRE组相比显著性差异，说明术后六个月时，子宫切除组的卵巢功能已经出现下降，而术后十二个月、十八个月卵巢功能进一步呈下降趋势，与正常组及TCRE组相比有统计学意义。

综上所述，TCRE对卵巢功能的影响不大，在保护绝经前妇女卵巢功能方面优于子宫次全切除术。在妇科治疗中占有十分重要的地位。

参考文献

[1]刘明等，宫腔镜手术对卵巢功能的影响，西安交通大学学报，2005年第6期，598-601