血管内皮生长因子检测

血管内皮生长因子检测（精选八篇）

血管内皮生长因子检测 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象

RA组标本源于2010年8月1日至2013年12月31日期间就诊我院伴有膝关节积液的RA患者中, 收集RA患者的外周血及膝关节积液待测。从我院RA患者中随机抽取40例, 其年龄在23~78岁之间;平均年龄为 (53.80±13.45) 岁;其中男性10例, 女性30例。同时, 随机抽取我院骨关节炎伴膝关节积液40例患者作为对照组, 即OA组, 收集OA患者的外周血和膝关节滑液待测。OA组年龄在24~82岁之间;平均年龄为 (56.60±12.12) 岁;其中男性12例, 女性28例, 收集OA患者的外周血及膝关节液待测。

1.1.2 入选标准

RA符合美国风湿病学会1987年RA诊断标准[4];OA符合中华风湿病学会推荐的膝骨关节炎的诊断标准[5], 且合并膝关节腔积液;理解并愿意参加此项研究, 愿意签署知情同意书。

1.1.3 排除标准

合并急性感染、肿瘤及其他自身免疫性疾病的;合并有心、肺、脑等其他重要脏器严重病变的;近半年内使用过免疫抑制剂。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集

所有受试对象均采集膝关节关节液和清晨空腹静脉血各3 m L, 2 h内静置凝固后离心法取上清, 将其置于-80℃冰箱保存, 同批检测VEGF。

1.2.2 VEGF检测

采用酶联免疫吸附测定法检测血清及关节液VEGF水平, 严格按照试剂盒 (购于武汉博士德生物工程有限公司, 批号:253864906) 说明书要求操作。

1.3 统计学处理

计量资料用 (±s) 表示, 组间比较用t检验;计数资料组间比较用χ2检验;线性相关探讨血清与关节液VEGF的相关性。

2 结果

2.1 年龄与性别构成

RA组平均年龄为 (53.80±13.45) 岁, OA组平均年龄为 (56.60±12.12) 岁, 两组年龄差异无统计学意义 (t=0.978, P=0.331) 。RA组和OA组性别构成无统计学差异 (χ2=0.251, P=0.616) 。

2.2 VEGF含量的测定

RA患者血清VGEF含量 (94.41±43.32) ng/L, 明显高于OA组 (35.60±17.08) ng/L的含量, 差异有统计学意义 (t=7.987, P<0.001) 。RA患者关节液VGEF含量 (188.26±90.76) ng/L, 明显高于OA对照组的含量 (69.72±30.42) ng/L, 差异有统计学意义 (t=7.832, P<0.001) 。

2.3 关节液及血清中VEGF含量的关系

关节液中VEGF含量与血清中VEGF含量具有较强的相关性 (r=0.714, P<0.001) (见图1) 。

3 讨论

RA是一种以关节软骨侵蚀为主要表现的全身性自身免疫性疾病, 其病理特征为关节滑膜的慢性炎症及血管翳的形成, 并出现关节软骨和骨的破坏, 引起关节畸形和功能障碍。全球总发病率为0.4%, 男女之比为1︰2.5, 以30~50岁为发病高峰。我国RA患病率约为0.2%~0.4%[6]。目前RA的诊断标准, 大多仍沿用1987年美国风湿病学会的诊断标准:关节内或周围晨僵持续至少1 h;至少同时有3个关节软组织肿胀或积液;腕、掌指、近端指间关节区中至少1个关节区肿胀;对称性关节炎;有类风湿结节;血清RF阳性;X线片至少有骨质疏松和关节间隙狭窄。符合以上7项中的4项者可诊断为RA, 其敏感性为91%~94%, 特异性为89%[7]。鉴于以上分类标准, 对于典型病例诊断并不困难, 但对于不典型及早期RA易出现误诊或漏诊。如未给予有效治疗, 2年关节侵蚀破坏率达75%, 以后病情逐渐加重可造成永久残疾。因此早期诊断、早期治疗至关重要。

1994年Fava首先通过免疫组织化学的方法检测发现RA患者的滑膜组织中有VEGF蛋白表达。VEGF作为血管新生的重要诱导剂, 在介导RA滑膜血管新生时炎症病理发展过程中具有十分重要的作用, 被认为是重要的促血管生成因子之一[8]。同时也为RA临床病理诊断和治疗提供了重要的参考, 程畸等[9]临床病例分析结果表明RA患者滑膜液中VEGF的表达水平比正常人和骨性关节炎患者滑膜组织中的VEGF都要高。Ballara等[10]研究发现RA早期血清VEGF和第1年放射学破坏程度间存在明显相关性, 放射学破坏小于平均值的患者其血清VEGF浓度水平要低。这些结果提示高VEGF水平与RA的发病, 新生血管的形成及病情进展有密切联系。Byzova等[11]体外模型研究表明VEGF能诱导内皮细胞的增殖和迁移。同时, VEGF还能激活纤溶酶原激活物及其抑制剂, 促进蛋白酶和间质胶原酶的分泌, 导致细胞基质的降解, 利于血管的新生和分化, 形成血管翳, 后者能引起骨、软骨和关节的破坏, 导致不可逆的关节功能丧失。VEGF增强血管通透性, 血浆纤维蛋白原的外渗能形成纤维蛋白凝胶, 暂时性地允许和支持新生血管的内向性生长, 利于血管形成[12]。同时外渗的血管收缩因子和凝血因子能侵蚀软骨基质, 造成关节的破坏和慢性炎症的形成, 加重RA的临床症状, 导致关节畸形和强直。研究表明VEGF是联系各种炎性因子的枢纽, 直接促进滑膜组织新生血管形成, 增强血管通透性, 在RA的滑膜血管翳的形成中起关键作用。本研究发现RA患者血清及关节液中VEGF高表达, 进一步证实了VEGF在RA疾病发生发展中的重要作用。

OA是一种慢性进行性骨关节病, 临床表现以关节疼痛肿胀、僵硬和功能障碍为主要症状。OA的发病机制尚不明确, 软骨细胞的免疫机制可能参与了关节的病理骨化进程[13]。本实验在OA患者血清及关节液中检测到VEGF的表达, 提示VEGF在OA疾病的发展过程中扮演着某种特殊的角色, 与Bonnet等[14]报道一致。

在临床工作中, 对于典型的RA患者鉴别诊断并不困难, 但对于不典型RA如血清阴性, 不伴有小关节对称性肿痛, 无明确晨僵, 仅表现为膝关节疼痛肿胀者, 往往诊断为骨关节炎, 导致误诊误治, 错失了RA的治疗时机, 最终导致膝关节软骨不可逆损伤, 不但增加了医疗成本, 而且给患者造成极大痛苦。作为临床工作者, 不得不谨慎对待每一位“膝关节疼痛”患者。本实验表明RA患者血清及关节液中VGEF含量明显高于OA患者, 差异具有统计学意义, 在血清阴性, 难以鉴别的患者当中, VEGF含量的测定可以成为鉴别诊断的参考指标, 我们还证实关节液中VEGF含量明显高于血清中, 并且二者有相关性, 检测关节液中的VGEF可能比血清更敏感可靠。鉴于本课题样本量较小, 参考值的确定还有待于大样本实验的支持。

摘要：目的 通过对类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis, RA) 和骨关节炎 (osteoarthritis, OA) 患者血清及关节液的血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 的检测, 探讨VEGF在两种疾病中的鉴别意义。方法 采用酶联免疫吸附试验方法检测RA组 (40例) 、OA组 (40例) 血清及关节液中VEGF的含量。结果 RA组血清VEGF含量 (94.41±43.32) ng/L, 明显高于OA组 (35.60±17.08) ng/L, 差异有统计学意义 (t=7.987, P<0.001) ;RA组关节液VEGF含量 (188.26±90.76) ng/L, 明显高于OA组 (69.72±30.42) ng/L, 差异有统计学意义 (t=7.832, P<0.001) ;关节液中VEGF和血清中VEGF含量之间存在相关性 (r=0.714, P<0.001) 。结论 VEGF在RA患者体内高表达, 可作为RA与OA鉴别的参考指标。

血管内皮生长因子检测 篇2

【关键词】 乌龙丹；关节炎，类风湿；血管内皮生长因子；中药复方；动物实验

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的关节滑膜组织是一种具有很强侵蚀作用的病变组织，其生长及病理学行为在许多方面类似于肿瘤组织。滑膜组织表现为增生性侵蚀性生长、滑膜组织肥厚、血管翳形成。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是参与RA滑膜病变中的重要细胞因子，促进了炎症的发展和滑膜新生血管的形成，通过一定的方式阻断滑膜中VEGF表达，有望成为治疗RA的一项新手段[1]。我们应用乌龙丹治疗RA，获得了良好的疗效。为了探讨其治疗机制，我们设计了如下实验。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠（由黑龙江中医药大学实验动物中心提供）40只，体重为（l90±20）g，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 主要试剂及药品 雷公藤多甙片（由三九黄石制药厂生产）；鸡Ⅱ型胶原（CⅡ）（由上海生物医学工程研究所生产），临用时，于无菌条件下用0.1 ml·L-l冰醋酸充分溶解，当CⅡ的浓度为

0.4 mg·ml-l时，置于4 ℃冰箱过夜后，与弗氏完全佐剂等体积混合，振荡乳化，制成CⅡ乳剂（每

0.5 ml含CⅡ1 mg）。VEGF测定所用Elisa试剂由上海生物医学公司提供。乌龙丹（乌骨藤、穿山龙、秦艽、杜仲、白芍、川断、木瓜、威灵仙组成）由黑龙江中医药大学药学院国家中药材规范化生产及质量标准实验室制备，每克浸膏相当于生药5.3 g，以生理盐水配制混悬液灌胃。

2 实验方法

2.1 胶原诱导的关节炎模型制备及分组 Wistar雄性大鼠适应性喂养1周后，随机选出8只为正常组。其余大鼠于颈、背部5个部位皮内注射CⅡ乳剂总量0.5 ml（含1 mgCⅡ）。第21天同法0.3 ml加强注射。将造模成功的40只大鼠随机分为模型组，阳性对照组，乌龙丹高、中、低剂量组，每组8只。

2.2 给 药 正常组与模型组给予1 ml蒸馏水灌胃；乌龙丹高、中、低剂量组分别给予14 g·kg-1、

7 g·kg-1、3.5 g·kg-1乌龙丹灌胃；阳性对照组给予9 g·kg-1雷公藤多甙片。各组均于造模第10天开始给药，共给药28天。

2.3 取 材 给药第28天，脱颈法处死大鼠，由眼眶取血，离心分离血清，同时以镊子拉开造模鼠足-踝关节，使关节腔增大，以装有1 ml蒸馏水的注射器反复冲洗关节腔，吸取关节滑液。采用Elisa法测定血清中VEGF含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.4 实验数据采集与测定

2.4.1 大鼠一般状况 包括大鼠体重、毛色、反应、活动情况。

2.4.2 关节炎指数积分 采用Wood氏关节炎评估标准，4只足爪中每只足爪的损害都分为0～4级，计算四肢的总积分，最高分数为16分，给药后每7天评估积分1次，并进行记录。具体评分标准为0分：正常；1分：红肿涉及1个指关节；2分：红肿涉及2个及以上指关节或整个足爪轻度红肿；3分：足爪红肿较重；4分：足爪重度红肿，缺乏弹性。

2.4.3 关节肿胀率测定 造模后用水溶积置换法测定大鼠致炎侧，即左踝关节毛际以下容积。以第1天测得的值为基值，给药28天后测得的值与之相比所得比值为关节肿胀率。

2.4.4 血清与滑膜液VEGF含量测定 采用酶联免疫吸附法（Elisa）测定。

2.5 统计学方法 用SPSS13.0软件处理，结果用

表示，计量资料的组间比较采用单因素方差分析，组内比较釆用q检验、LSD检验、t检验方法，以P<0.05为差异有显著性；P<0.01为差异有高度显著性；P>0.05为差异无统计学意义。

3 结 果

3.1 大鼠一般情况 正常组大鼠体重不断增加，活动自如，皮毛有光泽，无明显异常出现；第2次免疫加强后，造模组大鼠出现体重增长缓慢，活动受限，毛发干枯；乌龙丹高、中、低剂量组均比模型组一般情况好，相比较而言，乌龙丹中剂量组一般情况最好。

3.2 各组大鼠关节炎指数积分 给药后第7天、14天、21天、28天，与模型组相比，乌龙丹各剂量组和阳性对照组的关节炎指数积分均降低，且具有显著性差异（P<0.01或P<0.05）；与阳性对照组比较，乌龙丹各剂量组的关节炎指数积分均有所提高，具有显著性差异（P<0.01）；乌龙丹组高、中、低剂量组之间比较，中剂量组对关节炎指数积分降低效果最好，且与低剂量组和高剂量组相比具有统计学意义（P<0.01）；与低剂量组相比，高剂量组关节炎指数积分降低的效果比低剂量组偏好，具有统计学意义（P<0.01），见表1。

3.3 关节肿胀率变化比较 各治疗组与模型组比较，关节肿胀率均有明显降低，具有显著性差异（P<0.01）；乌龙丹各剂量组与阳性对照组相比较，均有不同程度的改善，但是无统计学意义（P>0.05）；乌龙丹各剂量组间比较，高、中剂量组优于低剂量组，不过只有中剂量与低剂量组比较具有统计学意义（P<0.05），高剂量组与中剂量组比较无统计学意义（P>0.05），见表2。

nlc202309020811

3.4 血清与滑液VEGF含量 模型组大鼠血清及滑液VEGF检测结果见表3，可见大鼠血清及滑液中VEGF均有明显升高，与正常组比较具有显著性差异（P<0.01）；乌龙丹各剂量组与模型组相比较，均有不同程度的改善，其中乌龙丹中剂量组改善最为显著，与乌龙丹低、高剂量组相比较具有显著性差异（P<0.01或P<0.05）。

4 讨 论

RA是一种常见的以慢性滑膜增生为特点，进而导致关节软骨和骨进行性、不可逆性破坏的慢性、炎症性、自身免疫性疾病，最终导致关节畸形和功能丧失。滑膜炎和关节破坏是RA发病机制中两个最重要的病理环节。RA发病早期就以血管密度改变和新生血管形成为特征性表现。因为增生的滑膜需要血管代偿性增加[1]。RA的发生和发展的关键步骤就是新生血管生成，促血管形成因子包括白细胞介素-8（IL-8）和VEGF等[2]。

特别是VEGF，多项研究证明多种因素可上调VEGF[3]，促进血管生成，并导致持久性滑膜炎[3]，并且已证实VEGF与关节炎的严重程度正相关[1]。抑制VEGF可能是一个有希望的目标、新的治疗策略[1，3-6]。

RA属于中医学的尪痹、历节、鹤膝风等范畴，其病因病机主要是正气亏虚，风寒湿热之邪外袭，痹阻经络，气机失调，痰瘀内生，郁久化毒，损害筋骨关节，导致骨质侵蚀和骨质疏松。我院经临床实践总结认为，在RA病程中寒湿多、湿热少，肾阳虚多、肾阴虚少，痰瘀毒贯穿整个病程。我院以此理论开发出的乌龙丹制剂，由乌骨藤、穿山龙、秦艽、杜仲、白芍、川续断、木瓜、威灵仙组成。方中乌骨藤味微辛、涩，性温，归肝经，祛风湿、活血；穿山龙性平、味苦，归肝肺经，祛风除湿、活血通络。两药相合共奏祛风湿、活血通络之功效，为君药。臣以杜仲味甘、性温，归肝、肾经，补肝肾，强筋骨；川续断苦辛、微温，入肝、肾经，补肝肾，续筋骨，调血脉，共奏补肝肾、强筋骨之功效，助君药强筋骨除痹痛。佐以白芍养血、止痛、敛阴；木瓜舒筋活络、和胃化湿；秦艽祛风除湿、和血舒筋、清热；威灵仙祛风除湿、通络止痛。纵观全方散中有收、寓通于补、寒温得宜，共奏祛风除湿、补肾、通络止痛之功效。通过本实验我们发现，给予胶原诱导关节炎模型大鼠各剂量乌龙丹后，实验大鼠一般状况、关节炎指数积分及关节肿胀率均有不同程度的改善，其机制可能是通过调节关节滑液及血清中VEGF，阻断了滑膜血管新生、血管翳形成，从而抑制RA滑膜增生和关节破坏，这也可能是其取得临床疗效的机制之一。

5 参考文献

[1]Paleolog EM，Miotla JM.Angiogenesis in arthritis：role in disease pathogenesis and as a potential therapeutic target[J].Angiogenesis，1998，2（4）：295-307.

[2]Moon SJ，Park MK，Oh HJ，et al.Engagement of toll-like receptor 3 induces vascular endothelial growth factor and interleukin-8 in human rheumatoid synovial fibroblasts[J]. Korean J Intern Med，2010，25（4）：429-435.

[3]Wang CH，Yao H，Chen LN，et al.CD147 induces angiogenesis through a vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible transcription factor 1α-mediated pathway in rheumatoid arthritis[J].Arthritis & Rheumatism，2012，64（6）：1818-1827.

[4]Ballara SC，Miotla JM，Paleolog EM.New vessels，new approaches：angiogenesis as a therapeutic target in musculoskeletal disorders[J].Intemational Joumal of Experimental Pathology，1999，80（5）：235-250.

[5]Ouyang BS，Gao J，Che JL，et al.Effect of electro-acupuncture on tumor necrosis factor-α and vascular endothelial growth factor in peripheral blood and joint synovia of patients with rheumatoid arthritis[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine ，2011，17（7）：505-509.

[6]程琦，宋文刚，王宁，等.类风湿性关节炎滑膜组织中VEGF 表达及临床意义[J].中国当代医药，2011，18（25）：70-71.

血管内皮生长因子检测 篇3

1 对象与方法

1.1 研究对象 病例组选择2005年1月至2007年10月于我院呼吸内科住院病例老年结核性胸腔积液(结核组)31例经临床证实,抗结核治疗有效,随访2月无复发,其中男14例,女17例,年龄60~81岁,平均(69±12)岁;恶性胸腔积液患者(恶性组)30例(肺癌18例、间皮瘤8例、转移瘤4例)均经细胞学或病理学证实,其中男19例,女11例,年龄61~86岁,平均(73±13)岁。

1.2 方法 治疗前2组患者分别给予常规抗痨及化疗4~6周后经患者同意行胸腔穿刺。2组经B超定位后,常规操作,于胸腔内置入中心静脉导管,外接一次性引流袋进行引流,引流量第1天为800~1000 ml,不引流时予肝素帽封管,抽取胸腔积液后立即送检。

1.3 试验方法 所有患者治疗前后分别收集15 ml胸腔积液4 ℃低温3000 r/min离心10 min,取上清液于-20 ℃冻存待测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测胸腔积液中VEGF、转化生长因子-β(TGF-β)水平,试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司,严格按说明书要求操作。采用酶速率法测定胸腔积液中腺苷脱氨酶活性。

1.4 统计学方法 数据以均数±标准差undefined表示,采用SPSS 13.0软件包进行统计分析,各组间的比较采用t检验,用Pearson相关系数分析2种变量间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组腺苷脱氨酶水平比较

观察指标:观察2组患者治疗前胸部B超、胸液中腺苷脱氨酶水平。结核组胸腔积液中腺苷脱氨酶(50±17) U/L,恶性组胸腔胸液中腺苷脱氨酶(23±9) U/L,结核组胸腔积液中腺苷脱氨酶水平较恶性组显著升高,2组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 2组患者治疗前后胸液中VEGF、TGF-β比较

治疗前恶性组胸腔胸液中VEGF、TGF-β水平均较结核组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

注:与结核组比较,▲P<0.05

治疗后恶性组胸腔胸液中VEGF、TGF-β水平均较结核组无显著差异(P>0.05)。见表2。

注:与结核组比较,▲P<0.05

结核组胸腔积液中治疗前后VEGF、TGF-β水平无显著变化,恶性组治疗后VEGF、TGF-β水平较治疗前显著下降(P<0.05)。

2.3 胸腔积液中VEGF、TGF-β相关性分析

统计学处理结果提示胸腔积液中VEGF与TGF-β水平呈正相关(r=0.438,P<0.05)。

3 讨论

胸腔积液中的VEGF可能来源于多种类型细胞,如间皮细胞、胸腔积液中的浸润细胞(如炎性细胞、恶性肿瘤细胞)。但目前仍不清楚恶性胸腔积液中VEGF是以间皮细胞还是以肿瘤细胞表达为主。肿瘤细胞诱导的微血管生长及肿瘤环境中血液循环建立的过程,对肿瘤的生长,浸润和转移都有重要作用。肿瘤微血管内皮细胞在趋化因子作用下募集于肿瘤缺血缺氧组织,在诱导因子的刺激下发生定向分化,形成成熟内皮细胞,并在促血管生长因子如VEGF和TGF-β作用下形成血管。胸膜组织无论是在正常或异常状态下,均有VEGF受体表达[2]。本研究亦显示老年恶性胸腔积液患者胸水中VEGF浓度较结核性胸腔积液显著增高。有文献报道VEGF在老年恶性胸腔积液中的表达增高,其表达水平与年龄、TNM分期以及是否有吸烟史有关。高龄患者VEGF不仅刺激肿瘤细胞血管增生,也增加血管通透性,从而使肿瘤细胞较易通过和转移。大量研究提示检测胸腔积液VEGF水平有助于良、恶性胸腔积液的鉴别[3]。

目前腺苷脱氧酶活性检验被广泛用于诊断结核性胸膜炎,结核性胸腔积液中腺苷脱氨酶活性明显高于恶性胸腔积液,以33 U/L作为腺苷脱氨酶诊断结核性胸膜炎的临界值[4],其敏感性较高。随着对实体肿瘤的血管生成和功能认识的深入,大量血管生长因子及血管生长抑制因子的发现使人们认识到肿瘤内血管生长具有可调节性。其中VEGF及其受体(VEGFR)和TGF-β是目前发现的最重要的促肿瘤血管生长因子,能促进肿瘤血管内皮细胞的增殖、迁移和存活,增加肿瘤血管的通透性,在肿瘤血管生成过程中发挥关键作用[5]。缺氧是有效的VEGF基因表达刺激因子。缺氧诱导的VEGF表达增高被认为与肿瘤对放射治疗及化学治疗产生抵抗相关。目前认为许多细胞因子对VEGF表达有调控作用,其中TGF-β是最有效的刺激因子之一。研究显示恶性胸腔积液TGF-β体内、体外均可诱导产生VEGF,对兔子胸腔内注射TGF-β可刺激产生VEGF,并呈剂量相关性[6]。本研究亦显示老年恶性胸腔积液患者胸腔积液中VEGF水平与TGF-β水平呈正相关,但TGF-β诱导产生VEGF的确切机制及细胞内传导途径仍有待进一步研究。老年恶性胸腔积液患者具有发现晚、转移早的特点,部分患者明确时体质状况差,不能耐受化、放疗。采用酶联免疫吸附法检测VEGF和TGF-β水平,对老年患者胸腔积液的鉴别和预后提供重要信息。比较胸腔积液中VEGF水平与TGF-β水平及腺苷脱氨酶活性在对诊断老年患者结核性胸腔积液和恶性胸腔积液具有重要价值。

VEGF及TGF-β在恶性胸腔积液的形成中起重要作用,尤其老年恶性胸腔积液中的表达增高,其水平高低与预后有关[7]。本组老年患者结核组胸腔积液治疗前后VEGF、TGF-β水平无显著变化,而恶性组胸腔积液治疗前后VEGF、TGF-β水平显著下降(P<0.05),表明老年恶性胸腔积液中VEGF及TGF-β的表达对判断患者的病情和预后可能具有一定意义。

参考文献

[1]Hamed EA,El-Noweihi AM,Mohamed AZ,et al.Vasoactivemediators(VEGF and TNF-alpha)in patients with malignantand tuberculous pleural effusions[J].Respirology,2004,9(1):81-86.

[2]Gravelyn TR,Michelson MK,Gross BH,et al.Tetracyclinepleurodesis for malignant pleural effusions.A 10-year retro-spective study[J].Cancer,1987,59(11):1973-1977.

[3]Ruiz E,Aleman C,Alegre J,et al.Angiogenic factors andangiogenesis inhibitors in exudative pleural effusions[J].Lung,2005,183(3):185-195.

[4]熊盛道,徐国鹏,熊维宁.白细胞介素-18和腺苷脱氨酶活联合检测鉴别结核性与恶性胸腔积液的价值[J].中华结核和呼吸杂志,2007,10(3):779-780.

[5]Toi M,Matsumoto T,Bando H.Vascular endothelial growthfactor:its prognostic,predictive,and therapeutic implications[J].Lancet Oncol,2001,2(11):667-673.

[6]Gary Lee YC,Melkerneker D,Thompson PJ,et al.Trasform-ing growth factor-βinduces vascular endothelial growth factorelaboration from pleural mesothelial cells in vivo and in vitro[J].Am J Respir Crit Care Med,2002,165(1):88-94.

血管内皮生长因子检测 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

SOSP-9607细胞株购自中山大学实验动物中心;Roswel Park Memorial Institute-1640 (RPMI 1640) 培养基购于GibcoBRL公司, 按说明书配制, 4℃保存;特级胎牛血清购于以色列Kibbutz Beit Haemek公司, 分装, -20℃保存;反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 试剂盒购于Fermentas公司, 引物由广州瑞真生物技术有限公司合成;caveolin-1小片段干扰核糖核酸 (si RNA) 由广州复能基因公司合成、筛选;caveolin-1、VEGFR-2 (兔抗人) 一抗购于美国Sigma公司, 二抗 (山羊抗兔) 购于广州美津生物公司。其余试剂由本实验室自行配制。

1.2 细胞培养及分组

SOSP-9607细胞按106个/ml接种于25 cm2塑料培养瓶中, 37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。每3~4天换液一次。当细胞扩增铺满80%时, 以5×105个/ml的密度进行传代培养。使用广州复能基因公司构建的caveolin-1 si RNA慢病毒载体及相应包装质粒转染293T细胞产毒, 收集并浓缩病毒液, -80℃保存备用。使用病毒液感染SOSP-9607细胞, 获得caveolin-1表达抑制型细胞。分别对caveolin-1表达抑制型细胞和正常SOSP-9607细胞使用含有25 ng/ml VEGF的RPMI 1640培养基孵育30 min, 获得VEGF+caveolin-1si RNA组和VEGF组细胞。

1.3 逆转录-多聚酶链式反应 (RT-PCR)

按Trizol试剂说明书提取细胞RNA。按照逆转录试剂盒的说明进行操作得到c DNA。设计引物序列见表1, 由广州瑞真生物技术有限公司合成。PCR反应条件如下:94℃预变性5 min;94℃变性60 s, 60℃退火60 s, 72℃延伸60 s;34个循环后72℃延伸10 min。取PCR产物, 应用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成相系统扫面并进行灰度分析。

1.4 Western Blotting检测caveolin-1、VEGFR-2蛋白水平的表达

在培养皿中加入裂解缓冲液含有50 m M Tris·Cl (p H 8.0) 、150 m M Na Cl、0.02%Na N3、0.1%十二烷基硫酸钠 (SDS) 、100μg/ml苯甲基磺酰氟 (PMSF) 、1μg/ml Aprotinin、1%Triton100, 冰浴20 min, 用细胞刮刮下细胞裂解物, 4℃12 000 r/min离心10 min, 上清液为裂解后产生的蛋白。加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液, 煮沸5 min, 12 000 r/min离心2 min, 取上清液进行聚丙烯酰氨凝胶 (SDS-PAGE) 电泳。依次经电泳、电转、洗膜、封闭、一抗 (1∶1 000) 37℃孵育、洗膜、二抗 (1∶1000) 37℃孵育、洗膜、显影、定影、扫描及灰度分析。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析, 计量资料数据以均数±标准差表示, 各组样本均数间的比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOSP-9607细胞中caveolin-1、VEGFR-2 m RNA水平的表达

RT-PCR检测caveolin-1、VEGFR-2 m RNA水平的表达, 结果显示:与对照组相比, VEGF组细胞caveolin-1 m RNA表达增加 (P<0.01) , VEGFR-2 m RNA表达明显增加 (P<0.01) ;与对照组相比, VEGF+caveolin-1 si RNA组细胞caveolin-1m RNA表达减少, 而VEGFR-2 m RNA表达增加 (P<0.05) , 与VEGF组差异不大 (P>0.05) 。见图1、2 (图1为反转录聚合酶链式反应扩增产物琼脂糖凝胶电泳图;图2为各实验组VEGFR或caveolin-1信使核糖核酸表达水平与β-actin表达水平的相对值) 。

A:对照组;B:VEGF组;C:VEGF+caveolin-1 si RNA组

A:对照组;B:VEGF组;C:VEGF+caveolin-1 si RNA组;与对照组相比, *P<0.05, **P<0.01

2.2 SOSP-9607细胞中caveolin-1、VEGFR-2蛋白水平的表达

与对照组比较, VEGF组细胞caveolin-1、VEGFR-2蛋白表达均明显增加 (P<0.01) , VEGF+caveolin-1 si RNA组细胞caveolin-1蛋白表达减少, 且VEGFR-2蛋白水平表达减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图3、4 (图3为聚丙烯酰氨凝胶电泳图;图4为各实验组VEGFR或caveolin-1蛋白质表达水平与β-actin表达水平的相对值) 。

3 讨论

骨肉瘤常见于20~30岁年轻人, 是最常见的原发性骨恶性肿瘤。肿瘤的血管生成对肿瘤的生长和增殖是必不可少的, 同时对肿瘤的侵袭、转移亦起着重要作用。因此, 研究肿瘤血管生成并阻断它已成为世界上治疗肿瘤的新热点[1]。大量实验结果证明, VEGF在肿瘤血管生成中处于核心地位, 是目前已知活性最强、专属性最高的肿瘤血管生长诱导剂, 其他血管生成因子的作用大多通过增强VEGF的表达而间接实现的。Fontanini等[2]发现, 大量的新生血管可促进骨肉瘤癌前病变的进一步发展, 侵袭性增强。而且, VEGF的受体VEGFR-1、VEGFR-2也在骨肉瘤中高表达, 与骨肉瘤患者的临床特征和预后关系密切[3,4]。尽管如此, 但在VEGF刺激下的肿瘤细胞和血管内皮细胞中由VEGFR介导血管生成的分子机制仍然知之甚少。

caveolin-1是caveolae (小窝) 的重要结构蛋白, 参与了caveolae的形成以及细胞增殖、分化、凋亡和血管生成的信号通路的调控, 与肿瘤的发生、发展和转移有密切关系。Yang等[5]研究了大鼠原发性前列腺癌及转移性前列腺癌的多个癌细胞株, 发现在大鼠正常前列腺上皮细胞中caveolin-1表达微弱;在原发性前列腺癌细胞中其表达加强、呈胞浆弥漫性;在转移性前列腺癌细胞中, 其表达更强, 呈浓集颗粒状。同样, 在正常人前列腺上皮细胞中caveolin-1表达亦呈阴性, 而在原发性前列腺癌细胞中偶见颗粒状浓集表达。其他如肾癌、膀胱癌中caveolin-1也表达增高, 提示caveolin-1增高与肿瘤发生、发展有关[6]。Horiguchi等[7]发现在肾透明细胞癌中, caveolin-1表达明显增加, 特别是转移性肿瘤、低分化肿瘤和有血管侵袭的肿瘤。Joo等[8]也在肾透明细胞癌中发现caveolin-1可以促进肿瘤微血管生成。

本研究中RT-PCR和Western Blot结果均发现si RNA沉默骨肉瘤细胞株SOSP-9607中的caveolin-1表达可以降低VEGF对VEGFR-2的刺激作用, 并对VEGFR-2m RNA的表达影响不大, 而对其蛋白水平的表达有影响, 提示caveolin-1在VEGF刺激骨肉瘤细胞株SOSP-9607 VEGFR-2表达的信号中可能起着关键作用, 并有可能是通过蛋白水平的调控发挥作用。

综上所述, 骨肉瘤的生长和转移均是血管生成依赖性的, 抑制骨肉瘤的血管生成从而阻断骨肉瘤的营养供给和转移途径可望成为治疗骨肉瘤的新策略。本实验为临床选择合适的靶点治疗抑制骨肉瘤的血管生成提供实验依据。

参考文献

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血管内皮生长因子与羊水量关系研究 篇5

1 资料与方法

1.1 研究对象

胎盘和胎膜组织取自2008年2月～7月在南京医科大学第一附属医院择期剖宫产的单胎、足月、无妊娠合并症的孕妇, 孕龄37+～40+周, 其中羊水过少组20例, 羊水正常组22例及羊水过多组17例。3组孕妇既往均无心血管、泌尿系统及糖尿病病史, 近期无胎膜早破、早产及感染情况。并且年龄、孕龄、胎盘重量及脐带长度比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。所选羊水量异常的病例均为不明原因的羊水量异常, 排除胎儿畸形及其他病理情况。

1.2 诊断标准

根据第7版《妇产科学》以羊水指数 (AFI) ≤5.0 cm、AFI≥18.0 cm作为筛选羊水过少和过多的标准, 以术中实际羊水量作为诊断标准。术中通过小切口切开子宫全层, 人工破膜即用吸引器收集羊水, 容积法测量留于吸引器的血污染羊水量 (负压瓶中事先放入肝素12500 U抗凝) , 测定血与羊水混合液中的血细胞比容 (HCT) , 根据公式计算混合液中血量[2], 从而计算实际羊水量。混合液中血量= (血和总羊水混合液×羊水中HCT) ÷产前HCT。

1.3 方法

3组孕妇的胎盘娩出后立即在直视下剪取胎盘中央母体面一小块组织并剪一块胎膜组织, 0.9%氯化钠液冲洗干净后均剪成1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm组织块两份, 一份以10%多聚甲醛固定, 24小时内行石蜡包埋;另一份置于0.9%氯化钠液中放置-80℃冰箱备用。

1.3.1 免疫组织化学法

石蜡包埋后的标本4 μm连续切片, 脱蜡, 柠檬酸盐水浴修复20分钟, 保温10分钟, 新鲜配置的3%H2O2封闭5分钟, PBS洗净后分别加入1∶100的小鼠抗人VEGF多克隆抗体 (武汉博士德公司) 4℃过夜, PBS液充分洗涤后分别加入辣根过氧化酶标记的1∶200山羊抗小鼠IgG (cell signal公司) , 室温30分钟, PBS洗净后DAB显色, 苏木素复染。染色阳性的细胞胞浆呈棕黄色颗粒, 阴性对照以PBS代替一抗。

1.3.2 图像采集

使用Olympus显微镜, 图像由SharpCapture250D图像采集系统采集。

1.3.3 结果判定

采用双盲法计数, 以镜下细胞核和 (或) 细胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性判断标准, 根据阳性染色细胞的百分数评分:<5%为0分;5%～25%为1分;26%～50%为2分;51%～75%为3分;>75%为4分;再结合染色强度进行评分[1]:不显色为0分, 弱阳性为1分, 阳性为2分, 强阳性为3分, 最后将阳性率评分与强度评分相乘所得之积的和计为该组织的免疫组化最终评分, 每例标本选取一张切片, 每张切片选取5个视野。

1.3.4 免疫印迹法

每组随机抽取10例, 称取200 mg组织于冰上匀浆提取蛋白。4℃低温离心机以12000 r/min离心10分钟, 取上清, branford法测定蛋白浓度, 样品加入SDS缓冲液, 100℃变性5分钟, 12%的十二烷基磺酸钠聚丙酰胺电泳 (SDS-PAGE) 。5%浓缩胶, 80V电泳25分钟, 进入分离胶改为160 V, 75分钟。硝酸纤维素膜250mA恒流电转45分钟 (AQP1) , VEGF 250 mA恒流电转60分钟。5%脱脂奶粉37℃封闭1小时。小鼠抗人VEGF多克隆抗体工作浓度均为1∶200, 1∶400β-actin, 辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IgG浓度为1∶2000, 最后经增强化学荧光发光法显影。利用南京大学捷达凝胶成像分析系统测定条带的积光光密度值 (IOD) 。

1.4 统计学分析

实验数据记录采用undefined, 用SPSS 15.0统计软件进行one way ANOVA方差分析。

2 结 果

2.1 免疫组织化学法检测结果

2.1.1 VEGF在胎盘、胎膜中的定位

3组胎盘、胎膜的胞浆内均见到棕黄色颗粒, VEGF表达于羊膜的上皮细胞、绒毛膜及胎盘滋养细胞的胞浆和小血管中 。

2.1.2 VEGF在3组胎盘、胎膜组织中表达强度的比较

由表2可见, 3组在胎盘组织中VEGF的表达强度比较, 差异无统计学意义 (F=1.496, P>0.05) 。在胎膜组织中VEGF表达强度的比较, 差异有高度统计学意义 (F=9.721, P<0.01) 。

2.2 免疫印迹法检测结果

2.2.1 VEGF在胎盘、胎膜中的蛋白表达

3组胎盘、胎膜标本检测到VEGF蛋白的表达, 胎盘和胎膜样本在46KD处出现杂交条带, 见图1。

注:1～3为胎盘组织; 4～6为胎膜组织; 羊水过少组:1、4; 羊水正常组:2、5;羊水过多组:3、6。

2.2.2 IOD值结果比较

3组胎盘组织中VEGF的IOD值比较, 差异无统计学意义 (F=1.044 , P>0.05) ;3组胎膜组织中VEGF的IOD值比较, 差异有高度统计学意义 (F=10.999, P<0.01) 。见表3。

3 讨 论

VEGF是目前已知最强的促血管生成因子, 主要调节血管内皮细胞的分化、增殖、迁移, 同时也是一种有效的血管渗透性调节因子, 可调节蛋白的外渗, 在胎膜和胎盘中有表达, Ross等[2]进一步研究表明, 在胎盘的胎儿面和胎膜有血管通路存在, 它们是羊水量调节的主要部位, 胎羊微血管延伸到羊膜的外表面, 贯穿于整个绒毛膜, 因此整个胎膜参与了跨膜转运, 而且晚期羊膜和绒毛膜的微血管表面积达到了7000 cm2, 这个通路极大地加快了水和溶质通过羊膜进入胎儿血循环的运输, 这个转运能力是巨大的, 液体通过胎膜进入膜内的血管交换的能力是决定液体转运率的重要决定因素, 因此凡是影响胎膜和胎膜血管供应和渗透性的因素都是调节跨膜吸收的关键介质。本研究通过免疫组织化学法检测, 显示3组胎盘、胎膜中均有VEGF的定位表达, VEGF表达于羊膜的上皮细胞、绒毛膜及胎盘滋养细胞的胞浆和小血管中, 这与文献报道一致, 再次说明了微血管通路的存在, 介导了液体的跨膜转运过程。同时我们发现VEGF表达于羊膜的上皮细胞中, 既往报道人和灵长类动物羊膜中无血管, 说明虽然人类羊膜无血管存在, 但有VEGF表达, 同样能参与液体的转运。Matsumoto等[3]对胎羊的研究发现, VEGF存在于羊膜的上皮细胞、绒毛膜及胎盘滋养细胞的胞浆, 在这些组织中VEGF164是主要的转录物, 羊水的跨膜吸收增加可通过增加胎膜血管的密度和渗透性实现, 从而改善羊水过多的症状。Daneshmand等[4]对孕晚期的胎羊静脉内缓慢地输入过量的0.9%氯化钠液7L超过3天, 增加了大量的胎儿尿液, 少量增加胎儿的吞咽, 然而羊水量仅增加了12.8%, 这表明跨膜吸收大大增加, 对这些胎羊的胎盘和胎膜的VEGF分析发现, VEGF mRNA比对照组增加了2～4倍, 这个结果说明当跨膜转运增加时, VEGF的表达量增加。现有的证据表明, 胎羊梗阻、血管容量增加、胎膜和胎盘的胎儿面上调VEGF。临床中胎盘功能减退伴随羊水量减少、胎儿缺氧, 因此设想缺氧是否增加膜内吸收, Cheung等[5]使足月妊娠的羊缺氧4天, 羊膜细胞在含氧量2%的环境中培养24小时, 结果无论是胎膜细胞还是在培养的羊膜细胞中VEGF mRNA水平明显增加, 以上研究表明, VEGF在不同状态下的表达差异, 适应羊水调节的需要。本研究发现羊水过少组、羊水正常组、羊水过多组的胎膜组织VEGF的表达强度和VEGF的IOD值均呈上升趋势, 并且差异有高度统计学意义 (P<0.01) , 说明胎膜VEGF的蛋白表达量随着羊水量的增加相应上调;胎膜上的VEGF参与晚期羊水量的调节, 进一步说明了羊水的跨膜吸收的增加可通过增加胎膜血管的密度和渗透性实现, 从而改善羊水过多的症状, VEGF的上调和羊水跨膜吸收增加有关, 羊膜可能是VEGF作用的靶器官[6], VEGF可能是重要的介质。本研究发现在羊水量不同的3组胎盘组织中VEGF表达无差别, 说明在人类, 无病理情况及缺氧情况下, 胎盘不参与羊水量的调节, 但缺氧情况下胎盘调节羊水量的机制尚不明确。VEGF与血管的发生、调节血管的通透性有关, 羊和其他一些动物的羊膜和绒毛膜之间存在微血管网, VEGF可通过促进其胎膜的血管生成, 增加血管的通透性来上调羊水量的吸收, 但详细机制需进一步研究。

参考文献

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血管内皮生长因子检测 篇6

1 材料与方法

1.1 研究对象

购自大连医科大学动物实验中心SPF级雄性SD大鼠60只,3个月龄,体质量(280±30)g,随机分为4组,生理盐水治疗组(NS组)15只,碱性成纤维细胞生长因子组(b FGF组)15只,血管内皮生长因子组(VEGF组)15只,血管内皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子(VEGF+b FGF组)15只。

1.2 主要试剂和仪器

10%水合氯醛、4.0%甲醛,PBS液、VEGF、b FGF、一抗兔抗人v WF抗体,二抗生物素抗兔抗体,石蜡切片机、体式手术显微镜及显微手术器械、电子温度计、电生理压力测定仪,高速离心机、HE染色试剂盒等。

1.3 动物模型建立

用10%水合氯醛3m L/kg腹腔注射麻醉,待大鼠麻醉后,用胶布将四肢固定手术台上。剪去后肢大腿及腹股沟部的毛,皮肤用强力碘消毒和酒精消毒,双侧腹股沟处取切口1cm,在体式显微镜下钝性分离包裹股静脉,股动脉和股神动脉鞘内,股动脉是淡红色的,在内侧,股静脉颜色略深,居中间,最外侧是股神经,利用显微操作系统结扎并切断股动脉各分支,将股动脉远端近ā窝处连接电生理压力测定仪测其内压,在股动脉中下1/3处结扎使其内压降至原内压的1/5,查无出血点,缝合。

1.4 给药方式

NS组、VEGF组分别隔日一次腹腔注射生理盐水1m L、100μg/LVEGF 1m L;b FGF组隔日一次后肢股内侧多点肌肉注射100μg/L b FGF 1m L;VEGF+b FGF组隔日一次腹腔注射100μg/L LVEGF 1m L+后肢股内侧多点肌肉注射100μg/L b FGF 1m L,共治疗21d。

1.5 观察项目

于7d、14d、21d观察大鼠后肢缺血情况如:间歇性跛行情况、皮肤颜色改变、皮温改变、足溃疡情况等。

1.6 实验取材

饲养至3个月时将大鼠引颈处死,取后肢股内侧肌肉组织,4.0%甲醛固定。

1.7 组织切片及免疫组织化学检测

在室温下以将用4%的甲醛浸泡24h后组织石蜡中,按横纹肌纵面切片,3μm,免疫组化标记一抗采用兔抗人v WF抗体(ab694:Abeam Ltd,Cambridge,UK),二抗采用以生物素抗兔抗体,然后切片通过链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物结合显色,细胞核行HE染色,同时进行阳性与阴性对照,切片放大22.5倍。

1.8 统计学方法

数据及计算结果用均数±标准差(χ—±s)表示,采用SPSS17.0统计软件处理数据,计量资料的两组间比较采用两样本t检验分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果分析

2.1 于7d、14d、21d观察大鼠后肢缺血情况

间歇性跛行情况、皮肤颜色改变、皮温改变、足溃疡情况等,见表1~3。VEGF+b FGF组各情况显著低于b FGF组、VEGF组及NS组,差异有显著性统计学意义(P<0.01);b FGF组、VEGF组低于NS组,差异有统计学意义(P<0.05);b FGF组、VEGF组之间差异无显著性意义(P>0.05)。可见VEGF与b FGF联合应用可促进后肢动脉硬化闭塞大鼠的血管再生。

2.2 电子温度计测量足部皮肤温度变化

N S组平均(2 9.2±0.5)℃,b F G F组平均(3 0.6±0.3)℃,VEGF组平均(30.2±0.2)℃,VEGF+b FGF组平均(32.7±0.4)℃。VEGF+b FGF组显著高于b FGF组、VEGF组及NS组,差异有显著性统计学意义(P<0.01);b FGF组、VEGF组高于NS组,差异有统计学意义(P<0.05);b FGF组、VEGF组之间差异无显著性意义(P>0.05)。可见VEGF与b FGF联合应用可改善后肢动脉硬化闭塞大鼠的血液循环。

2.3 侧支血管再生情况

术后3个月缺血区肌肉组织内侧支血管再生计数,见图1~4。VEGF+b FGF组侧支血管再生显著高于b FGF组、VEGF组及NS组,差异有显著性统计学意义(P<0.01);b FGF组、VEGF组高于NS组,差异有统计学意义(P<0.05);b FGF组、VEGF组之间差异无显著性意义(P>0.05)。可见VEGF与b FGF联合应用可促进后肢动脉硬化闭塞大鼠的血管再生。

3 讨论

近年来,下肢动脉硬化闭塞的治疗主要包括手术治疗(动脉旁路转流术[3]、大隐静脉旁路转流术、动静脉转流术[4]等)、腔内介入治疗(包括经皮腔内血管成形术、支架置入术等)和非手术治疗(药物治疗),但均存在治疗后再闭塞的问题,目前未能得到很好的解决,尤其是远端血管无流出道、多节段、长段闭塞、严重狭窄、膝下小动脉的病变的患者,因无适合的人工血管而自体静脉材料又有限等原因;而非手术治疗所用的药物(抗血小板聚集、扩张血管、抗凝、溶栓、改善血流动力学等药物)效果均不理想。通过各种方法或手段促进缺血肢体新生血管生成和侧支循环的建立,可能是治疗此类患者有效的方法之一。Isnert等[2]提出了治疗性血管再生的概念,它的提出为这类疾病的治疗带来了希望,在基因治疗和干细胞移植领域都呼应了此理论,基因治疗对严重肢体缺血患者的作用还在试验的初期,初步实验结果显示VEGF及b FGF可刺激新生血管的生成,但到目前为止还缺少大宗安慰剂对照、双盲、大样本病例的临床研究。

本实验采用建立大鼠后肢动脉硬化闭塞模型,采用安慰剂对照、双盲法证明了VEGF和b FGF联合应用能促进大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生见图1~4,VEGF+b FGF组侧支血管再生显著高于b FGF组、VEGF组及NS组,差异有显著性统计学意义(P<0.01)。由于VEGF和b FGF均为内皮细胞的有丝分裂原,体内和体外实验均证实有促进血管生长的作用[5]。George[6]报道b FGF与v EGF有明显的时间和浓度关系,b FGF不但具有保护神经细胞的作用,而且能直接或间接地调节VEGF的表达,增加内皮细胞的VEGF和b FGF在大鼠后肢动脉硬化闭塞引起的缺血区的表达增加趋势[7],促进血管内皮细胞分裂、毛细血管出芽生长,诱导蛋白溶解酶生成,增加内皮细胞出芽穿透基质的机率等功能,能特异性促进内皮细胞增殖[8],并提高血管通透性和改变细胞外基质,从而促进血管的增殖。缺血导致b FGF分泌且作用于缺血的血管壁,促进VEGF表达,同时又直接促进血管内皮细胞的增殖,起到与VEGF协同作用[9]。

总之,VEGF和b FGF联合应用能有效促进大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生,为临床治疗下肢动脉硬化闭塞提供新的治疗依据。

摘要：目的 探讨联合应用血管内皮生长因子(VEGF)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生的作用机制。方法 建立大鼠后肢动脉硬化闭塞模型60只,随机分为4组,生理盐水治疗组(NS组)15只,碱性成纤维细胞生长因子组(bFGF组)15只,血管内皮生长因子组(VEGF组)15只,血管内皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子(VEGF+bFGF组)15只。NS组、VEGF组分别隔日一次腹腔注射生理盐水1mL、100μg/LVEGF 1mL;bFGF组隔日一次后肢股内侧多点肌肉注射100μg/L bFGF 1mL;VEGF+bFGF组隔日一次腹腔注射100μg/L LVEGF 1mL+后肢股内侧多点肌肉注射100μg/L bFGF 1mL,共治疗21d。分别于7d、14d、21d观察大鼠后肢缺血情况如:间歇性跛行情况、皮肤颜色改变、皮温改变、足溃疡情况等。继续饲养至3个月后取后肢股内侧部位肌肉组织行免疫组化观察血管数。结果 VEGF+bFGF组微血管密度显著高于bFGF组、VEGF组及NS组,差异有显著性意义(P<0.05);其他各组间差异无显著性意义(P>0.05)。可见VEGF与bFGF联合应用可促进后肢动脉硬化闭塞大鼠的血管再生。结论 VEGF联合bFGF能促进大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生,为临床治疗下肢动脉硬化闭塞提供新的治疗依据。

关键词：血管内皮生长因子,碱性成纤维细胞生长因子,下肢动脉硬化闭塞,血管再生

参考文献

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血管内皮生长因子检测 篇7

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2 0 1 4年1-1 2月唐山市华北理工大学附属医院住院治疗D M E患者9 6例, 按治疗方法分为观察组和对照组各4 8例。其中男性2 6例, 平均 (5 0.4±4.2) 岁;女性2 2例, 平均 (5 3.7±3.9) 岁。入选标准:所有病例均确诊为糖尿病, 且经荧光素眼底血管造影及光学相干断层扫描技术证实有D M E, 并排除影响O C T检查的其他眼部疾病[4]。

1.2 治疗方法

对照组采用单纯糖皮质激素 (曲安奈德, 4 m g) 治疗, 玻璃体腔内注射, 1次/月, 疗程6个月。观察组采用糖皮质激素 (曲安奈德, 剂量4 m g) 联合抗VEGF (成都康弘生物科技有限公司生产的康伯西普, 剂量0.5 mg) , 玻璃体腔内注射, 1次/月, 疗程6个月。注射前, 患者外用加替沙星眼药水4次/d, 连续3 d。

1.3 疗效评价

疗程结束后比较两组患者矫正视力, 采用国际化标准视力表对患者治疗前后视力进行评估, 比较治疗前后的视力情况。治疗后与治疗前相比:视力升高为提高, 视力下降为降低, 视力不变为稳定。

1.4 统计学处理

数据应用SPSS 17.0统计软件分析, 计量资料以±s表示, 采用t检验;计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

两组患者年龄、性别、DM病史、术前的视力差异均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

(±s)

2.2 疗效评价

2.2.1 治疗前后视力比较

治疗6个月后, 观察组与对照组矫正视力分别为4.32±0.13和4.64±0.15, 均高于治疗前, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。

(±s)

2.2.2 治疗后观察组与对照组视力比较

治疗6个月后, 观察组矫正视力好于对照组, 差异有统计学意义 (t=2.95, P<0.05) 。

2.2.3 治疗后观察组视力变化

观察组在治疗1个月、3个月和6个月后的视力提高患者分别占54.17%、66.67%、62.50%;对照组治疗1个月、3个月和6个月后的视力提高患者分别占35.42%、45.83%、47.92%, 见表3。

3 讨论

传统的治疗DEM的方法包括, 激光光凝治疗、抗炎治疗等。但其效果不理想, 未能有效的延缓DEM的进程, 导致患者视力下降, 甚至失明[5,6,7]。

本文通过糖皮质激素联合抗VEGF治疗DEM, 发现联合治疗后, 患者的视力得到很大改善, 矫正视力高于单纯糖皮质激素治疗, 研究发现, 联合治疗在治疗后1、3、6个月后, 视力均有所提高。Martidis等用曲安奈德4 mg玻璃体腔注射治疗16例激光光凝治疗无效的DME, 分别在1、3、6个月时间点的随访显示, 所有病例视力均有提高, 分别为2.4行、2.4行、1.3行, 这与本文的结论一致。最近, 抗VEGF药物治疗DEM收到广泛关注。其代表药物包括, 哌加他尼钠、贝伐单抗和雷珠单抗。通过临床实践发现, 抗VEGF的不良反应少, 且眼内炎发生概率均较低[8]。解决了传统疗法不良反应多, 并发症概率高的问题。

[例 (%) ]

研究表明患者积极控制血糖, 保持血糖平稳颇具挑战[9]。今后的研究需要延长观察时间, 并同时监测糖化血红蛋白的变化。

摘要：目的探讨抗血管内皮生长因子 (VEGF) 药物联合糖皮质激素治疗糖尿病黄斑水肿 (DME) 的疗效。方法收集2014年1-12月唐山市华北理工大学附属医院住院治疗DME患者96例。分为单纯糖皮质激素治疗的对照组和抗VEGF药物联合糖皮质激素治疗的观察组, 每组48例。观察治疗6个月后两组患者的视力变化情况。结果治疗后两组的视力均有所改善, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。观察组视力提高趋势明显, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。治疗后3个月疗效较治疗后1个月明显提高, 治疗后3个月和6个月差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论抗VEGF联合糖皮质激素更为有效, 可能与抗VEGF促进血管再生相关。

关键词：糖尿病黄斑水肿,抗VEGF药物,糖皮质激素,普通视力

参考文献

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[8]Papadopoulos N, Martin J, Ruan Q, et al.Binding and neutralization of vascular endothelial growth factor (VEGF) and related ligands by VEGF Trap, ranibizumab and bevacizumab[J].Angiogenesis, 2012, 15 (2) :171-185.

血管内皮生长因子检测 篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取60例胃癌根治术后标本组织蜡块及40例正常胃黏膜组织蜡块,60例标本中,病理类型:管状腺癌15例,黏液腺癌22例,乳头状腺癌17例,印戒细胞癌6例,分化类型中:高分化25例,中分化18例,低分化17例。分期中:Ⅰ期22例,Ⅱ期17例,Ⅲ期14例,Ⅳ期7例。所有病理均未接受放疗、化疗等。

1.2 检测方法及评价标准

1.2.1 TFF1

采用免疫组织化学染色超敏两步法(SP染色),DAB显色,苏木素复染,吹干,操作按SP试剂盒说明书进行。阴性对照采用生理盐水磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗,余步骤相同。阳性信号为细胞出现黄色或棕黄色染色,综合染色强度和阳性范围进行评分。每例取5个高倍视野(400倍),每个视野计数100个细胞,计算阳性细胞百分率,取平均百分率为显色指数,阳性范围>25%中度着色、明显高于背景者为阳性。

1.2.2 COX-2

检测过程同TFF1,阳性信号为细胞胞浆和胞膜上出现黄色或棕黄色染色。每例取5个高倍视野(400倍),用病理图像分析仪测定阳性信号平均灰度值,灰度值越高,表示COX-2表达强度越弱。

1.2.3 VEGF

检测过程同TFF1,阳性信号为细胞胞质和胞膜上出现黄色或棕黄色染色,每张切片中看到有>5%的肿瘤细胞胞质或胞膜染色,即判定为VEGF阳性。

1.3 评价方法指标

分别检测胃癌组织及正常胃黏膜组织中的TFF1、COX-2、VEGF的表达水平,比较其差异。研究胃癌组织中的TFF1、COX-2、VEGF水平与病理类型、分化分期等的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,计量资料采用均值±标准差表示,两组计量资料的比较采用t检验,多组定量资料的比较采用方差分析,计数资料的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和正常胃黏膜组织中的TFF1、COX-2及VEGF水平

胃癌组织中的TFF1表达率明显低于正常胃黏膜组织,其COX-2水平明显低于正常胃黏膜组织,而VEGF阳性率显著高于正常黏膜组织。见表1。

2.2 不同病理类型的TFF1、COX-2、VEGF水平的比较

各病理类型间的TFF1、COX-2、VEGF水平无差异。见表2。

2.3 分化类型与TFF1、COX-2、VEGF水平的比较

各分化类型间的TFF1、COX-2、VEGF水平无差异。见表3。

2.4 不同病理分期的TFF1、COX-2、VEGF水平的比较

各病理分期间的TFF1、COX-2、VEGF水平有差异。见表4。

3 讨论

本研究观察胃癌组织中TFF1、COX-2、VEGF的表达水平,并研究其与胃癌分化分期的关系。国内外的许多研究发现TFF1与胃癌的发生、发展密切相关。本研究中胃癌组织的TFF1表达率(41.67%)明显低于正常胃黏膜组织(100%),研究认为TFF1在体外可抑制胃腺癌AGS细胞的生长,其抑制作用呈剂量依赖性,目前研究发现TFF1的表达从正常胃黏膜,经肠化生、不典型增生演进到胃癌的过程中逐步降低[5],研究均提示TFF1可能是一种胃肿瘤抑制因子,但是其具体机制未明,可能与启动子区域甲基化有关[6]。与TFF1相反的是,COX-2被认为与许多肿瘤的发生发展密切相关[7],本研究中,胃癌组织的COX-2灰度值[(195.42±19.53)]明显低于正常胃粘膜组织[(216.46±18.57)],即胃癌组织的COX-2表达水平高于正常胃黏膜组织。环氧化酶是前列腺素合成过程中一个重要的限速酶[8]。生理状态下一般不表达,只有在细胞内外广泛的刺激下才呈诱导性表达。在肿瘤细胞的增殖、凋亡过程中起重要作用[9],它的表达有利于癌细胞发生浸润与转移,肿瘤细胞中COX-2的表达可通过上调黏附因子、基质金属蛋白酶等从而促进肿瘤细胞发生浸润与转移[10]。本研究综合TFF1表达率与COX-2灰度值及VEGF阳性率在对肿瘤组织的影响。并发现不同病理及分化类型间的TFF1、COX-2、VEGF水平无差异,各病理分期水平的TFF1、COX-2、VEGF水平有差异。分期水平越高,TFF1表达率及COX-2灰度值越低,而VEGF阳性率则越高。提示TFF1、COX-2、VEGF与胃癌的侵袭转移等有关。

综上所述,TFF1、COX-2、VEGF水平在胃癌组织及正常胃粘膜组织中的表达明显不同,并与肿瘤的分期密切相关,预示其与肿瘤的淋巴及血液转移等密切相关。

参考文献

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