抗内皮细胞抗体

抗内皮细胞抗体（精选七篇）

抗内皮细胞抗体 篇1

1 资料和方法

1.1 研究对象

为2005年12月～2007年6月在石家庄市第一医院及河北医科大学第二医院免疫风湿科住院及门诊治疗的SLE患者。39例SLE患者的诊断均符合美国风湿病协会(ACR)1997年推荐的分类标准。以SLE疾病活动指数(SLEDAI)来判断病情的活动和缓解,SLEDAI≥9分为病情活动。活动期患者39例(男7例,女32例),平均病程(3.8±2.1)年。狼疮肾炎的诊断依据第6版《内科学》中关于狼疮肾炎的诊断标准,其中有狼疮肾炎表现者23例,无狼疮肾炎表现者16例。对照组为健康义务献血者,25例(男15例,女10例)。

1.2 标本的采集与保存

所有研究对象均于清晨空腹抽取静脉血2～3m L,自然静置3 h后提取,分装,标记血清标本,保存血清标本于-70℃冰箱备用。实验开始前将待测血清置于室温下融化并恢复至20℃～25℃备用。

1.3 主要试剂

IgG-AECA检测试剂盒(间接免疫荧光法)购自德国欧蒙医学实验诊断有限公司;s ICAM-1检测试剂盒购自DRLab.California USA。

1.4 实验方法

按照IgG-AECA试剂盒中说明书逐步操作,然后在荧光显微镜下观察,可看到阳性对照中IgG-AECA与试剂中的抗原基质人脐静脉内皮细胞(HUVEC)结合后,在靠近胞核附近的细胞质中产生一些粗糙的颗粒状的绿色荧光。将血清样本结果与阳性对照比较,最后加以确定。按照s ICAM-1试剂盒说明书步骤,以酶联免疫吸附法(ELISA)进行s ICAM-1的测定。

1.5 统计学处理

所有数据均在SPSS12.0软件下处理。计数资料的统计以率表示,采用χ2检验进行计数资料比较及四格表资料中分类变量的关联度测量,以关联系数(ψ)表示,关联系数ψ=√(χ2/N),N为总例数。ψ取值在-1至1之间,其值越大表示关联性越强。对计量资料采用t检验进行比较。P<0.05差异有显著性。

2 结果

在SLE活动期组IgG-AECA阳性的检出例数为21例,在健康对照组无1例阳性。在上述两组IgG-AECA阳性率分别为53.8%和0%,IgG-AECA阳性率在上述两组差异有显著性(P<0.05)。说明在SLE活动期组IgG-AECA阳性率明显高于健康对照组。

在SLE活动期患者中有狼疮肾炎组的IgG-AECA阳性率为69.6%,无狼疮肾炎组为31.3%,前者IgG-AECA阳性率高于后者(P<0.05)。Ig G-AECA与狼疮肾炎活动存在关联性,关联系数ψ为0.378,P<0.05。

在SLE活动期IgG-AECA阳性、阴性组患者s ICAM-1血清平均水平分别为(1004.41±650.57)ng/mL和(581.21±514.52)ng/mL,因方差不齐故采用方差不齐条件下的t检验。结果说明IgG-AECA阳性患者的s ICAM-1血清平均水平明显高于阴性患者,两组比较差异有显著性(P<0.05)。

在SLE活动期患者中有狼疮肾炎组的s ICAM-1血清平均水平为(982.93±734.13)ng/mL,无狼疮肾炎组的s ICAM-1血清平均水平为(581.11±238.30)ng/mL,前者高于后者,两组比较差异有显著性(P<0.05)。

3 讨论

肾脏存在丰富的毛细血管网床,使肾脏血管易受自身抗体导致的炎症侵袭,成为SLE常见的受累器官。肾脏受累成为SLE常见的临床表现,也是影响SLE远期预后的主要因素。

国内外一些研究结果证实,IgG-AECA与原发性和继发性血管炎的血管损伤皆有密切关系[1,2,3,4]。虽然WHO的狼疮肾炎病理分型中没有提及血管损害,但是在狼疮肾炎中血管损害普遍存在,包括血管内血栓形成、动脉和小动脉硬化以及坏死性动脉炎等[5]。

IgG型抗内皮细胞抗体(IgG-antiendothelial cell antibody,IgG-AECA)通过上调血管内皮细胞上的ICAM-1表达对SLE血管损害起重要作用,IgG-AECA和ICAM-1可能共同参与了SLE的发病和最终致多个器官受累的病情发展过程[6,7],其中与狼疮肾炎的发病有密切关系[1,8]。P VAN PAASSEN等[9]、JC TSENG[10]等的研究证实,在活动期SLE患者中IgG-AECA的血清水平高于缓解期患者和健康对照者,且IgG-AECA的滴度水平与狼疮肾炎的活动相关,这与本文的研究结果一致。

本文显示,在SLE活动期患者中IgG-AECA阳性率为53.8%,明显高于健康对照者。且在活动期患者中有狼疮肾炎组的IgG-AECA阳性率为69.6%,高于无狼疮肾炎组,差异有显著性。可认为IgG-AECA在SLE的发病中起了重要作用,与狼疮肾炎活动存在一定关联,与SLE的病情活动相关。

对于IgG-AECA如何引起血管内皮细胞损伤导致肾脏血管病变,研究结论并不一致。目前有些研究认为是IgG-AECA参与了抗体依赖的细胞毒杀伤作用。P VAN PAASSEN[9]等的研究结果认为IgG-AECA触发了血管内皮细胞的凋亡机制,引起了肾脏血管病变。而另外一些研究[8,11]则认为IgG-AECA通过激活内皮细胞,上调细胞因子尤其是ICAM-1的表达水平,诱导淋巴细胞、单核细胞与血管内皮细胞的粘附,引起免疫炎症致肾脏血管损害。

本文结果表明,在SLE活动期患者中IgG-AE-CA阳性患者的s ICAM-1血清水平高于IgG-AECA阴性患者,差异有显著性,说明IgG-AECA与s ICAM-1血清水平的上调有关。在有狼疮肾炎组s ICAM-1血清平均水平高于无狼疮肾炎组,差异有显著性,说明s ICAM-1血清水平与狼疮肾炎的发生有关。

ICAM-1是狼疮肾炎发病机制中起重要作用的细胞因子之一,DUSTIN等[12]发现ICAM-1在血管内皮细胞上表达最强。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族成员,分子量约90 kD。而s ICAM-1存在于体液循环中,便于检测,其结构与膜型ICAM-1的胞外区相似,分子量约80 kD[13]。s ICAM-1的产生方式有两种:其一为由膜型ICAM-1脱落而产生;其二为由I-CAM-1的m RNA直接翻译而生成,并由细胞直接将生成的s ICAM-1分泌到体液中。

IgG-AECA是如何上调ICAM-1的表达是这一机制的关键。有报道[14]认为,IgG-AECA激活内皮细胞后,激活的内皮细胞可进一步激活ICAM-1基因的转录因子NF-κB,启动ICAM-1的合成。ICAM-1吸引白细胞与内皮细胞的黏附,诱导炎症细胞向炎症部位聚集,引起该部位的炎症甚至一系列免疫损伤,持续存在的血管内皮细胞免疫损伤造成肾脏功能受损。

一些研究机构将IgG-AECA的阳性情况、滴度、s ICAM-1的水平与狼疮肾炎的病理分型进行了分析,发现与弥漫增生型狼疮肾炎关系密切。本研究中23例狼疮肾炎患者,有10例进行了肾脏活检,病理证实为弥漫增生型(Ⅳ型)、膜型(Ⅴ型)。鉴于标本量过小,未进行上述两指标与病理分型的关联性分析。

抗内皮细胞抗体 篇2

目的 观察抗AT1受体(AT1R)抗体对培养的大鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性的影响.方法 以人工合成的.AT1R细胞外第二环肽段(AT1R-EC Ⅱ)为抗原主动免疫Wistar大鼠,利用亲和层析法提纯免疫大鼠血清中含有抗AT1R抗体的IgGs;培养大鼠脾淋巴细胞,刀豆蛋白A(Con A)诱导其活化和增殖,分别给予不同浓度的提纯IgGs(0.01、0.1、μmol/L)和血管紧张素Ⅱ进行干预,通过CCK-8法测定脾淋巴细胞增殖情况,并确定抗AT1R抗体的作用位点.结果 Con A刺激48 h后,大鼠脾淋巴细胞CCK-8吸光度显著高于空白对照组(0.38±0.05比0.27±0.02,P＜0.05);不同浓度的IgCs剂量依赖性促进脾脏T淋巴细胞增殖(A值分别为0.53±0.03、0.71±0.04和0.94±0.05),与血管紧张素Ⅱ的作用相类似(A值为0.73±0.14、1.52±0.17和2.14±0.12);AT1R特异性阻断剂Losartan和AT1R-ECⅡ均可显著减弱含抗AT1R抗体IgGs的促增殖效应(A值由0.71±0.04分别降为0.54±0.02,P＜0.01;0.52±0.04,P＜0.01).结论 抗 AT1R抗体具有受体激动剂样效应,通过特异结合AT1R-EC Ⅱ剂量依赖性增强离体脾T淋巴细胞增殖活性.

作 者：张苏丽 杨丽红 郑荣华 李晓宇 闫莉 武烨 贺忠梅 刘慧荣  作者单位：张苏丽,郑荣华,李晓宇,闫莉,武烨,贺忠梅(山西医科大学生理教研室,山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室,太原市,030001)

杨丽红(山西医科大学病理教研室)

抗内皮细胞抗体 篇3

1 病例介绍

患者, 女, 54岁, 因痰中带血2个月, 发现肾功能不全6 d入院, 患者既往有甲亢病史10余年, 间断服用丙硫氧嘧啶, 2片/次, 3次/d, 后逐渐减量为1片/次, 1次/d, 3个月前已停药。体查:血压138 mm/80 mm Hg, 甲状腺II度肿大, 质软, 无压痛, 双肺呼吸音粗, 可闻及少许细湿啰音, 心率80次/min, 律齐, 未闻及杂音, 腹软, 无压痛。入院后尿常规+沉渣示:尿蛋白3+, 隐血3+, 变异型红细胞占70%。24 h尿蛋白定量3450 mg, 血常规示Hb 73 g/L, 白细胞数及血小板为正常, 肝肾功能:Scr 324μmol/l, BUN12.54 mmol/L, 白蛋白26 g/L。结缔组织全套:ANA (1:80) 阳性, p-ANCA阳性。GBM阳性, MPO阳性。甲亢全套:T3 1.23 ng/ml, T4 13.40μg/ml, TSH 0.013 U。肺部CT示:双肺渗出性病变;双肾彩超示:左肾120 mm×41 mm, 右肾122 mm×42 mm;肾活检光镜示15个肾小球, 14个肾小球球性硬化, 11个肾小球伴新月体形成 (其中4个细胞性大新月体, 1个细胞性环状体, 4个细胞纤维性大新月体, 2个细胞纤维性小新月体, 见图1) , 余肾小球系膜基质节段性轻-中度增生, 系膜区可见嗜复红物沉积, 基底膜节段性僵硬增厚, 毛细血管腔受压, 开放不良, 部分节段内皮细胞成对出现及炎性细胞。免疫荧光示:IgG (+~++) , C1q (+) 沉积于毛细血管袢。入院后第12天予以甲泼尼龙200 mg静滴冲击3 d后, 继予以甲泼尼龙40 mg/d, 加用环磷酰胺0.6g/次, 2次/月。患者症状明显缓解, 无痰中带血, 出院时复查肾功能示:Scr 146μmol/L, BUN 11.68 mmol/L, 尿检示尿蛋白1+, 血3+, 24 h尿蛋白定量1350 mg, 肺部CT示肺部病变明显吸收。出院1个月后, 复查血常规正常, 肾功能示Scr 124μmol/L, BUN15.13 mmol/L。肝功能:白蛋白43.2 g/L。p-ANCA弱阳性;MPO阳性, GBM阴性。胸片复查明显吸收、好转。再次给予环磷酰胺0.6 g/次, 2次/月, 将激素逐渐减量。3个月后复查p-ANCA阴性;MPO阴性, GBM阴性;血常规、肝肾功能正常, 肺部CT复查正常, 双肾彩超示左肾100 mm×40 mm, 右肾101 mm×41 mm。

2 讨论

肺出血-肾炎综合症 (good pasture syndrome, GPS) 是一种发病机制尚未明确的自身免疫性疾病, 目前大多数学者认为, 环境变化或病毒感染可诱发存在于肾小球基底膜、肺泡基底膜中的IV型胶原结构发生变化, 从而使隐藏其中的抗原决定簇暴露, 抗GBM抗体产生, 通过循环免疫复合物、T淋巴细胞介导的免疫反应引起肾脏、肺损伤。GPS常表现为三联征:肾小球肾炎 (多为新月体性肾炎) 、肺出血和抗GBM抗体形成。GPS肾脏病变光镜多数表现为大量新月体形成, 免疫荧光特征性改变主要为IgG沿GBM连续线样沉积。近年发现, 在抗GBM抗体阳性患者中, 约20%~40%的患者同时合并抗中性粒细胞胞浆抗体 (ANCA) 阳性。刘娜等[1]研究表明, 抗GBM阳性伴ANCA阳性患者肾脏病理多为新月体肾炎, 免疫荧光表现为不典型IgG、C3呈细颗粒样沿GBM线样沉积。国外有学者建议将血清抗GBM抗体与ANCA双阳性的新月体肾炎定义为IV型新月体肾炎[2]。

Hellmark等[3]曾报道1例服用4年的PTU甲亢患者合并GPS病例, 国内尚未有报道。而PTU所致ANCA相关性小血管炎病例国内外文献均有报道, 且PTU所致的ANCA相关小血管炎多有抗MPO抗体。以往认为可能与ANCA引起小血管壁损害, 暴露了GBM抗原, 导致抗GBM的产生有关[4]。但又有病例报道在抗GBM肾炎后出现ANCA相关性血管炎, 且Amishi报告1例双阳性新月体肾炎患者三年后出现ANCA相关性血管炎, 提示疾病发展过程中某种潜在的联系导致抗GBM抗体与ANCA双阳性的新月体肾炎[5]。于峰等[6]研究北大医院15例PTU诱发的ANCA阳性小血管炎患者发现, 肾脏病理以局灶坏死性新月体肾炎为主。

本例患者病理结果为新月体形肾炎, IgG (+~++) , C1q (+) 沉积于毛细血管袢, 停服PTU, 并给予激素及免疫抑制剂治疗后疗效较好, 治疗三个月后复查, 血常规、肝肾功能恢复正常。提示甲亢合并GPS预后较单纯GPS好。其机制可能是PTU致MPO-ANCA阳性小血管炎后进一步引起抗GBM的产生, 也可以考虑PTU致抗GBM肾炎后通过某种机制诱发ANCA阳性, 其发生机制有待进一步研究。

关键词：甲状腺功能九进症,肠出血-肾炎综合症,血清学诊断指标

参考文献

[1]刘娜, 赵明辉, 章友康, 等.抗肾小球基底膜抗体伴抗中性粒细胞胞浆抗体阳性肾炎 (四例报告并文献复习) .[J].中华肾脏病杂志, 1999, 15 (04) :1-7.

[2]Glassock R J, Cohen A H.The primary glomerulopathies[J].Dis Mon, 1996, 42 (2) :329-383.

[3]Hellmark T, Niles J L, Collins A B, et al.Comparison of anti-GBM antibodies in sera with or without ANCA[J].J Am Soc Nephrol, 1997, 8 (2) :376-385.

[4]Lee E J, Jeon H S, Eo S H, et al.A Case of Goodpasture’s Syndrome in a Patient with Graves’Disease[J].Korean J Nephrol, 2006, 25 (1) :121-126.

[5]Desai A, Goldschmidt R A, Kim G C.Sequential development of pulmonary renal syndrome associated with c-ANCA

[3]years after development of anti-GBM glomerulonephritis[J].Nephrol Dial Transplant, 2007, 22 (2) :926-929.

抗内皮细胞抗体 篇4

1对象与方法

1.1对象选取2014年1-12月我院临床疑似系统性血管炎相关住院和门诊患者1318例作为观察对象, 年龄8~92岁, 平均年龄50.1岁。 其中男635例, 女683例。男女之比为1∶1.07。

1.2方法 (1) 仪器:尼康荧光显微镜, ELX808酶标仪, ELX50洗板机。 (2) 试剂ANCA、抗- MPO、抗-PR3试剂盒均由欧蒙医学实验诊断有限公公司司提提供供, , 按按照照试试剂剂盒盒要要求求保保存存, , 在在有有效效期期内内使使用用。。 (3) 具体方法:所有研究对象空腹取血3ml以3000r/min离心10min分离血清, 2~8℃ 保存, 3d内完成检测, 1318份血清同时采用间接免疫荧光 (IIF) 检测法检测ANCA、p-ANCA、c-ANCA和ELISA检测法检测髓过氧化物酶抗体 (抗-MPO) 、蛋白酶3抗体 (抗-PR3) 。

1.3统计学方法统计学采用χ2检验, 阳性数据采集中同一患者多次检查时以1例参与统计, 以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1检测分析1318例患者中检出ANCA阳性21例, 阳性率为1.59%:其中p-ANCA阳性16例, 阳性率1.21%, c-ANCA阳性5例, 阳性率0.38%, 抗-MPO阳性16例, 阳性率1.21%, 抗-PR3阳性5例, 阳性率0.38%。

2.2性别分组统计男性患者635例, 检出AN- CA阳性11例占1.73%, 女性患者683例, 检出ANCA阳性10例占1.46% , 两者差异无统计学意义 (P>0.05) ;

2.3年龄段分组分析30岁以下阳性率0.54% (1/184) , 30岁以上阳性率1.73% (20/1134) , 经χ2检验, 差异有统计学意义 (χ2=21.56, P<0.01) ;对30岁以上患者每10年作年龄段阳性率分析, 结果无明显差异。

2.421例ANCA阳性病例分析21例ANCA阳性病例中以MPO-pANCA为主76.2% (16/21) ;21例ANCA阳性患者中有17例肾功能指标明显异常 (80.95%) , 表现为血尿素、肌酐、尿蛋白、尿红细胞明显升高;有8例肝功能异常占38.1%, 主要表现为血浆蛋白轻度降低。具体结果见表1、表2。

3讨论

抗中性粒细胞胞浆抗体 (ANCA) 是存在于系统性血管炎患者中的一类自身抗体, 对系统性血管炎、炎症性肠病等多种疾病的诊断和鉴别诊断具有重要的意义, ANCA抗体滴度与临床病情严重程度相关, 并可以用于监测病情活动和预防复发[2]。目前, 已经有十余种中性粒细胞胞浆成分被证实为ANCA的靶抗原, 如蛋白酶3 (PR3) 、髓过氧化物酶 (MPO) 、人白细胞弹性蛋白酶 (HEL) 、乳铁蛋白 (LF) 、组织蛋白酶G (CathG) 、杀菌/通透性增强蛋白 (BPI) 、人溶酶体相关膜蛋白2 (H-LAMP2) 、溶菌素 (LYS) 、天青杀素、防御素、烯醇化酶、葡萄糖醛酸酶。可不同的靶抗原表现为不同的荧光模式。韦格纳肉芽肿 (WG) 、显微多动脉炎 (MPA) 、坏死性新月体性肾小球肾炎 (NCGN) 和变应性肉芽肿性血管炎 (CSS) 等原发性系统性小血管炎的发病与ANCA密切相关, 临床上已将上述疾病统称为ANCA相关小血管炎。ANCA谱检测项目包括ANCA、PR3抗体和抗MPO抗体的检测, 已成为原发性小血管炎的敏感特异的血清学检测项目, 对以上疾病的早期诊断和鉴别诊断有重要价值。随着对ANCA研究的深入, 发现与其相关的疾病越来越多, 有学者报道, 在呼吸系统疾病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、结缔组织病、甲亢、恶性肿瘤、类风湿关节炎患者中可检出ANCA[3]。

本文结果显示, 本地区ANCA检出率为1.59%, 以p-ANCA为主, 主要见于中老年人, 大多数ANCA阳性患者肾功能指标明显异常, 部分AN- CA阳性患者血浆蛋白降低与肾脏受损蛋白质丢失有关。至于肝肾功能异常与靶抗原抗-PR3和抗MPO有无相关性, 有待进一步深入研究。ANCA相关血管炎的预后取决于是否得到早期诊断与治疗, 肺和肾受累是常见的致死原因, ANCA检测有助于临床早期诊断与治疗, 改善患者预后。

本文发现15岁女性患者ANCA阳性1例。抗中性粒细胞胞浆抗体相关小血管炎多发生于成人, 相关研究报道也主要集中于成人病例, 儿童病例报道较少, 陈植等报道2001-2008年北京儿童医院共诊断原发ANCA相关小血管炎患儿共20例, 由于ANCA相关患儿临床症状与体征多为:发热、胃肠道反应、、肌痛、、关节痛、、口腔溃疡、、鼻衄、、鼻窦炎和副鼻窦炎、咳嗽、咳痰、咯血、血尿、蛋白尿、屈光不正、视力下降、头痛、抽搐、心慌心悸, 易导致误诊[4], 应引起重视。

摘要：目的:探讨人群中抗中性粒细胞胞浆抗体 (ANCA) 的检出情况。方法:采用间接免疫荧光 (IIF) 法和ELISA法对1 318例疑似原发性小血管炎患者做ANCA、肝功能、肾功能指标检测, 并进行分组统计分析。结果:1 318例患者中检出ANCA阳性21例, 阳性率为1.59%, 其中p-ANCA阳性16例, 阳性率1.21%, c-ANCA阳性5例, 阳性率0.38%;抗-MPO阳性16例, 阳性率1.21%;抗-PR3阳性5例, 阳性率0.38%。对研究对象进行性别分组统计:男性患者635例, 检出ANCA阳性11例占1.73%, 女性患者683例, 检出ANCA阳性10例占1.46%, 两者无统计学差异 (P>0.05) ;年龄分组统计:30岁以下184例, 检出ANCA阳性1例, 占0.54%, 30岁以上1 134例, 检出ANCA阳性20例占1.76%, 经χ2检验, 两者有显著统计学差异 (P<0.01) ;21例ANCA阳性患者中有17例肾功能明显异常占80.95%。结论:本地区疑似原发性小血管炎患者ANCA检出率为1.59%, 以P-ANCA和抗-MPO为主, 中老年组ANCA阳性率明显高于儿童青少年组, ANCA抗体与性别关系不明显;ANCA相关患者大多肾功能受损较严重。

关键词：抗中性粒细胞胞浆抗体,髓过氧化物酶抗体 (抗-MPO) ,蛋白酶3,抗体 (抗-PR3) ,间接免疫荧光法,LI-SA法

参考文献

[1]龙武彬, 吴晓丹, 刘建, 等.ANCA相关血管炎临床分析〔J〕.四川医学, 2009, 30 (5) :642-644.

[2]辛岗, 赵明辉, 章友康.抗中性粒细胞胞浆抗体3种检测方法的比较〔J〕.北京医科大学学报, 2000, 32 (1) :82-83.

[3]李艳萍.867例抗中性粒细胞胞浆抗体检测的临床分析〔J〕.吉林医学, 2012, 33 (11) :2265-2266.

抗内皮细胞抗体 篇5

1材料和方法

1.1 标本来源

健康人血清取自健康体检者共28例,各种疾病患者血清标本69例(来自本实验室血清库),其中血管炎19例、结缔组织病25例、肾小球肾炎25例,阳性对照由德国欧蒙公司提供。所有血清置-70℃日本三洋超低温冰箱保存待检。

1.2 试剂

中性粒细胞基质片:本室自制;金标记羊抗人IgG本室自制。淋巴细胞分离液为华美生物工程公司产品 ;亲合层析提纯羊抗人IgG为华美生物工程公司产品。0.01 mol/L PBS(pH 7.4);1.5% Dextran T-500及3%葡萄糖生理盐水溶液。

1.3 胶体金溶液

由本实验室参考全国临床检验操作规程[2] 通过鞣酸-枸橼酸钠还原法制备直径为5 nm的胶体金溶液。

1.3.1 待标记蛋白溶液的制备

将待标记蛋白羊抗人IgG预先于0.005 mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜,以除去多余的盐离子,然后100 000 g 4℃离心1 h,去除聚合物。

1.3.2 待标胶体金溶液的准备

以0.1Mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调胶体金液的pH值至9.0;

1.3.3 胶体金与标记蛋白用量之比的确定:

①将胶体金调好pH之后,分装10管,每管1 ml;②将标记蛋白羊抗人IgG以0.005 mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5～50 μg/ml,分别取1 ml,加入上列胶体金溶液中,混匀。对照管只加1 ml稀释液;③5 min后,在上述各管中加入0.1 ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2 h,观察结果;④结果观察,以稳定1 ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量,即为该标记蛋白质的最低用量。

1.3.4 胶体金与羊抗人IgG的结合

将胶体金和羊抗人IgG溶液分别以0.1 mol/L K2CO3调pH至9.0,电磁搅拌羊抗人IgG溶液,加入胶体金溶液,继续搅拌10 min,加入5%BSA作为稳定剂,防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀,溶液终浓度为1%。

1.3.5 胶体金标记蛋白的纯化

先低速离心1 800 r/min 20 min,弃去凝聚的沉淀。然后将5 nm胶体金结合物用6 000 g,4℃离心1 h;仔细吸出上清,沉淀物用含1%BSA的PBS液(含0.02%NaN3),将沉淀重悬为原体积的1/10,4℃保存。在结合物内加50%甘油贮存于-70℃可保存1年以上。

1.3.6 金标抗人IgG的质量鉴定

胶体金颗粒在波长510～550 nm之间出现最大吸收值峰。用0.02 mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA,0.02%NaN3)将胶体金蛋白试剂作1︰20稀释,在721分光光度计上测OD520=0.26,符合要求。(一般应用液的OD520应为0.2～0.4)。

1.4 银染液配制

采用本实验室[3]配方液,A液:0.22%乙酸银溶液。B液: 50%阿拉伯树胶,去离子水溶解,每天摇动,5 d后取滤液使用;C液:1%对苯二酚溶液,500 mg对苯二酚溶于30 ml 0.05 mol/L,pH3.8的柠檬酸盐缓冲液中。D液:在C液中加入10～40 ml B液。银染液:将A液和D液等量混合即成(临用前配)。

1.5 中性粒细胞基质片制备

取健康人全血加1.5% Dextran T-500对倍稀释,吸取上层血浆,用淋巴细胞分离液分离,取底部中性粒细胞,用冷蒸馏水溶解残留红细胞,1 min后加等量1.8% NaCl,恢复等渗,用Hanks′液洗涤3次后,调整细胞浓度为4.5～5.5×104/ml,涂片,经4℃无水乙醇固定,干燥后置-70℃保存备用。

1.6 免疫金银染色法检测ANCA

血清标本用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)作1∶20稀释后,取20 μl滴加于中性粒细胞基质片上,置37℃湿盒,温育30 min。取出后用同一PBS洗涤3次,加金标羊抗人IgG抗体20μl滴加于中性粒细胞基质片上,放入37℃湿盒,温育30 min后取出洗涤3次。稍干后加银染液显色,置37℃ 5 min用上述PBS洗涤2次,每次5 min,待片干后,加树胶用盖玻片封片普通显微镜(高倍镜或油镜)镜检。中性粒细胞胞浆无色为阴性,胞浆呈棕黑色为胞浆型(c-ANCA)阳性。中性粒细胞核周围呈连续棕黑色环,为核周型(p-ANCA)阳性。

1.7 间接免疫荧光法(IIF)测定ANCA

采用欧蒙德国医学实验诊断公司试剂盒,严格按说明书操作。10×40倍观察结果用荧光显微镜。

2结果

用免疫金银染色法及IIF同时检测28例正常人和69例各种疾病患者血清标本,结果显示两法所得结果完全相同见表1。

注:以IIF的结果为相对标准,免疫金银染色的相对敏感性、特异性与之比较,两法符合率100%

3讨论

抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)是存在于系统性血管炎患者血清中的一类自身抗体,其抗原是多形核粒细胞(PMN)和单核细胞的胞浆成份。其靶抗原主要为MPO和丝氨酸蛋白酶3(Pr3)。1982年Davies等[4]在一组坏死性肾小球肾炎患者血清中首次报道ANCA,1985年van der Wouder又在韦格纳肉芽肿(WG)病人血清中发现了抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA),并认为对WG的诊断有特异性。除此之外,显微镜下多血管炎(MPA)、原发性坏死性新月体性肾小球肾炎(NCGN)等的发病与ANCA亦密切。临床上检测ANCA,对多种血管炎性疾病有重要意义。与ANCA密切相关的系统性血管炎称之为ANCA相关系统性血管炎(ANCA-associated systemic vasculitis,AASV),ANCA在其发病机制中有重要作用,ANCA已成为系统性血管炎的敏感血清学诊断工具。目前ANCA测定方法有多种,有间接免疫荧光法(ⅡF),酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹法,免疫沉淀法和放免法等。经典方法为ⅡF,该法有较强敏感性,是区分c-ANCA和p-ANCA的基础。ⅡF法制备中性粒细胞底物片时,可由于固定方法的差异而影响实验结果,用甲醛固定时,ANCA只表现c-ANCA,而无p-ANCA。Falk[5]证明,用此固定方法时,由于细胞浆中ANCA抗原如MPO不能从嗜天青颗粒中释放,表现为胞浆内均一的荧光染色即c-ANCA。用无水乙醇固定时,MPO等抗原物质可以从嗜天青颗粒中释放出来,由于电荷作用吸附在细胞核周围形成p-ANCA,故ANCA的荧光染色模型是人工形成的。ⅡF检测ANCA时,常因抗核抗体(ANA)存在,而出现p-ANCA假阳性。此时,可应用甲醛固定的中性粒细胞检测加以鉴别,真正的p-ANCA表现为c-ANCA,由抗核抗体(ANA)存在造成的假阳性则表现为阴性。间接免疫荧光法(ⅡF)等方法均需要特定的设备,因此国内目前开展此项工作不太普遍。我们建立的免疫金银染色法检测ANCA, 中性粒细胞基质片无水乙醇固定,以胶体金标记的羊抗人IgG为第二抗体,加银染液, 胞浆型(p-ANCA)阳性为中性粒细胞胞浆呈棕黑色,核周型(c-ANCA)阳性为中性粒细胞核周围呈连续棕黑色环。用普通光学显微镜镜检结果,克服了IIF荧光易衰减的问题,实验结果易于保存,便于基层医疗单位推广。使用时,抗核抗体(ANA)阳性时,要加做甲醛固定的中性粒细胞,减少p-ANCA假阳性。本方法与IIF经比较敏感性、特异性无明显差异,重复性实验结果一致,似可作为替代IIF测定ANCA的方法,但需大量样本验证。

参考文献

[1]Savige JA,Chang L,Wilson D.Autoantibodies and target anti-gens in antineutrophil cytoplasmic antibody(ANCA)associated vasculitides.Rheumatol Int,1996,16:109-114.

[2]叶应妩,王毓三,申子瑜主编.全国临床检验操作规程.东南大学出版社,2006.655

[3]张铁汉,刘琳,贺志安,等.银强化滴金免疫法检测肾综合征出血热IgM的研究.中华实验和临床病毒学杂志,2000,14(3):266-267

[4]Davies D,Moran ME,Niall JF,et al.Segmental glomerulonephcitis with anti-neutrophil:possible arbovirus aetiology.Br J Med,1982,285(6342):606.

抗内皮细胞抗体 篇6

1资料与方法

1.1研究对象

回顾性分析2010年1月‐2014年6月本院68例经肾脏病理确诊为AAV伴活动性肾脏损害的患者。纳入标准:1肉芽肿性多血管炎、嗜酸性肉芽肿性血管炎的诊断采用1990年美国风湿病学会 (ACR) 分类标准。2显微镜下多血管炎的诊断:多系统损害包括肾损害 (血尿、蛋白尿、肾功能不全) 、肺泡毛细血管炎或肺泡出血、皮肤损害、神经系统损害、消化系统、心血管及关节肌肉等损害。3 ANCA阳性:p-ANCA或c-ANCA阳性, 髓过氧化物酶 (myeloperoxidase, MPO) 或蛋白酶3 (Proteinase 3, PR3) 阳性。4经肾活检提示为寡免疫沉积型坏死性肾炎或新月体性肾炎。排除标准:1合并严重感染。2有活动性肺结核、肝炎和消化性溃疡。3有严重心脑血管疾病。4免疫功能缺陷。1.2治疗方法

1环磷酰胺 (CTX) 组:首先给予甲泼尼龙 (通用名:注射用甲泼尼龙琥珀酸钠, 生产厂家:辉瑞公司, 规格:500 mg, MP) 静脉注射治疗 (0.5~1.0 g/d, 3 d) , 后改为醋酸泼尼松 (通用名:醋酸泼尼松, 生产厂家:上海信宜药厂, 规格:5.0 mg) 口服治疗, 起始剂量为1 mg/ (kg·d) , 1个月后缓慢减量至5 mg, 1次/d维持, 并予环磷酰胺0.4 g每2周一次治疗, 总量达6.0~8.0 g。2吗替麦考酚酯 (MMF) 组:首先给予甲泼尼龙静脉注射治疗 (0.5~1.0 g/d, 3 d) , 后改为醋酸泼尼松口服 (同上) , 同时予吗替麦考酚酯 (1.0~2.0 g/d) 治疗。3血浆置换组:首先给予甲泼尼龙静脉注射治疗 (0.5~1.0 g/d, 3 d) , 后改为醋酸泼尼松口服 (同上) , 同时予血浆置换治疗。采用血浆分离机为Fresenius Kabi AG, 低分子肝素抗凝, 血流量为50~60 ml/min, 置换液为新鲜冰冻血浆、人血白蛋白及平衡液等。血浆置换治疗2次/周, 每次置换量为2 000~3 000 ml。平均每例 (2.4±1.3) 次。

1.3观察指标

研究观察患者治疗前后24 h尿蛋白定量、血尿素氮 (BUN) 、血肌酐 (SCr) 、血白蛋白、血尿酸、肝功能 (ALT、AST、GGTP、血胆红素) 及伯明翰血管炎活动评分系统 (Birminghan vasculitis activityyscore, BVAS) 。

1.4统计学方法

选择SPSS 16.0软件进行数据统计, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用t检验;计数资料以百分率表示, 当理论T值≥5采用四格表检验, 当1≤T<5时, 用校正χ2检验, T<1时采用四格表资料的Fisher确切概率法。当P<0.05时, 差异具有统计学意义。

2结果

2.1临床一般情况

3组患者共68例, 其中, CTX组24例, MMF组23例, 血浆置换组21例。患者年龄在36~74岁, 平均 (46.53±4.20) 岁。3组患者在年龄、性别、血肌酐、血BUN、BVAS及肾脏活检中新月体比例等方面差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。

2.2肾功能的改变

3组患者治疗前后24 h尿蛋白定量、血尿素氮 (BUN) 、血肌酐 (SCr) 的差异均有统计学意义 (P<0.05) 。CTX组与MMF组患者间治疗前后血BUN、SCr的差值间的差异无统计学意义 (P>0.05) , 血浆置换组治疗前后的血BUN、SCr的差值较CTX组及MMF组大 (P=0.034) 。见表2。

2.3预后

在治疗后的1年中, 无患者死亡, 6例患者进入终末期肾脏病需行长期肾脏替代治疗, 每组各有2例。

3讨论

ANCA相关性血管炎 (AAV) 表现为多器官多系统受累, 其起病及发展迅速, 累及肾脏时, 如诊治不及时可发展至终末期肾脏病, 需终身行肾脏替代治疗[3,4]。影响预后的关键是起病时的血肌酐水平、肾脏病变的严重程度包括肾活检时新月体的数量、小管间质受影响的程度等。

激素联合环磷酰胺 (CTX) 治疗是AAV首选的传统标准诱导缓解治疗方案, 疗效已得到肯定, 但CTX存在较大毒副作用如感染、肝功能损害[5,6,7,8,9]。吗替麦考酚酯 (MMF) 是嘌呤代谢的抑制剂, 优点在于选择性作用于淋巴细胞, 抑制T、B细胞的增生和抗体形成, 还抑制毒性T细胞的增殖。国内外多个研究证实MMF能控制AAV的活动性并获得较好的远期预后, 且耐受性好[10,11,12,13]。血浆置换在AAV患者中其可快速清除体内的循环抗体, 在国内外对照研究中疗效也得到肯定[14,15]。

本研究发现, 合理地使用激素联合免疫抑制治疗的确能够有效地减轻患者肾功能损害程度, 改善患者肾功能水平。研究证明, 对AAV肾损害患者采用甲泼尼龙冲击加CTX或MMF治疗, 对患者肾功能恢复疗效显著。新月体比例较大的患者, 早期行血浆置换治疗, 肾功能恢复更理想。由于传统CTX冲击方案患者的副反应较大, 因此本研究采用每2周注射0.4 g的方案, 既能取得较好的疗效, 亦能减少其副作用。

总的来说, 在临床实践中, 对于ANCA相关性血管炎合并肾功能损害患者的治疗, 医学工作者要根据患者实际病情选择治疗方案, 可早期行血浆置换治疗, 并灵活选择激素及不同免疫抑制疗法进行综合干预。

摘要：目的 回顾性分析不同方案治疗抗中性粒细胞胞质抗体 (ANCA) 相关性血管炎 (AAV) 肾损害的疗效。方法选择2010年1月‐2014年6月该院接诊的68例经肾脏病理确诊为AAV伴活动性肾脏损害的患者, 根据治疗方案分为3组。其中, 环磷酰胺 (CTX) 组24例, 予以甲泼尼龙冲击治疗 (0.51.0 g×3 d) , 后每2周予环磷酰胺0.4 g治疗;吗替麦考酚酯 (MMF) 组23例, 予甲泼尼龙冲击治疗后, 联合吗替麦考酚酯 (12 g/d) 治疗;血浆置换组21例, 予甲泼尼龙冲击治疗联合血浆置换治疗。对比3组患者治疗前后的临床疗效。结果 1 3组患者治疗前后24 h尿蛋白定量、血尿素氮 (BUN) 、血肌酐 (SCr) 的差异均有统计学意义 (P<0.05) 。2 CTX组与MMF组患者治疗前后血BUN、SCr的差值间的差异无统计学意义 (P>0.05) , 血浆置换组治疗前后的血BUN、SCr的差值较CTX组及MMF组大 (P<0.05) 。结论 甲泼尼龙冲击联合血浆置换方案, 能够减轻肾损害, 改善肾功能水平。在实际诊疗中要根据患者实际综合应用激素联合不同免疫抑制方案治疗。

抗内皮细胞抗体 篇7

1材料与方法

1.1 血液样品的来源

A、B、O、AB型全血标本来自健康献血者,由鄂尔多斯中心血站提供。

1.2 单克隆抗体

抗-A、抗-B单克隆抗体购自长春生物制品研究所。

1.3 凝集物制备

在4只试管中,分别加A、B、O、AB型全血1.0 mL和生理盐水1.0 mL,混匀,于1 500 rpm离心5 min,弃上清;用生理盐水洗涤3次;再加生理盐水混匀制备成10 %的红细胞混悬液。然后取4只试管,标明A、B、O、AB,分别取相应的混悬液50 μL于其中,再加抗-A及抗-B单克隆抗体各50 μL,1 500 rpm离心1 min。

1.4 淀粉-琼脂粉混合凝胶电泳

借助滤纸条在凝胶玻璃板的阴极端距边缘2 cm处并排加样。在6 V/cm 的电压下电泳1.5 h,然后停电30 min,最后再电泳30 min。电泳完毕后,将胶置于氨基黑10B染色液中染色2 h,转入5 %乙酸漂洗液中漂洗至背景干净,晾干观察结果并保存。

2结果

2.1 A、B、O、AB 4种血型红细胞血红蛋白释放试验

各血型红细胞血红蛋白释放结果差异不太明显,其中O型红细胞释放的血红蛋白相对较少,见图1。

2.2 A、B、O、AB 4种血型红细胞与单克隆抗体作用前后血红蛋白释放试验比较

单克隆抗体作用后,A、B、AB型红细胞的血红蛋白释放均较作用前相对减少;而O型红细胞的血红蛋白释放较作用前相对增多。同时,HbA2的电泳行为也有所变化,其中AB型红细胞的HbA2在单克隆抗体作用前后位置变化比较明显,见图2。

泳道1、9、17为A型红细胞,2、10为A型红细胞与单克隆抗体的作用产物,3、11、18为B型红细胞,4、12为B型红细胞与单克隆抗体的作用产物,5、13为O型红细胞,6、14为O型红细胞与单克隆抗体的作用产物,7、15为AB型红细胞,8、16为AB型红细胞与单克隆抗体的作用产物

3讨论

红细胞内血红蛋白的电泳释放可以分为初释放和再释放两大类型,第一次通电释放出来血红蛋白称为初释放;再次通电释放出来血红蛋白称为再释放[1,3],但再释放的实验结果中含有初释放的内容。

我们于1981年发现血红蛋白A2现象[4,5,6],现在看来它应当属于初释放范畴。后来又发现了再释放[2,7],并且研究了各种因素对它的影响[2,7,8,9,10,11,12,13,14]。在本研究中,我们探讨了抗-A、抗-B单克隆抗体对红细胞内血红蛋白电泳释放的影响。实验结果显示,单克隆抗体作用后,A、B、AB型红细胞的血红蛋白释放均较作用前相对减少;而O型红细胞的血红蛋白释放较作用前相对增多。同时,HbA2的电泳行为也发生了变化,其中AB型红细胞的HbA2在单克隆抗体作用前后位置变化比较明显。提示单克隆抗体作用于红细胞后,对血红蛋白电泳释放影响较大,且同时涉及到初释放和再释放。由于单克隆抗体与红细胞抗原相互作用发生于红细胞表面,因此提示红细胞内血红蛋白电泳释放涉及到了细胞膜。许红等[15]用荧光碎灭法测定了不同状态游离血红蛋白和红细胞血影膜间的相互作用,发现血红蛋白在红细胞内主要以游离态存在,只有小部分与膜结合。现已确认膜上有两种类型的结合位点:高亲和性的带3蛋白(Band 3)及低亲和性的血型糖蛋白和某些磷脂的极性头部。不同状态的Hb与红细胞膜的相互作用不同,由此不仅影响红细胞的许多特性,如膜流动性、离子通透性、变形性等,而且还可以调节红细胞内的新陈代谢水平。

根据我们的多年研究,结合本实验结果,可以认为:初释放电泳时,开始释放出来的大量Hb是红细胞内的游离Hb,主要是HbA1和HbA3,而其阴极侧的HbA2来自与一种膜蛋白结合的Hb。再释放出来的Hb,我们已经证明它是HbA1[16],来自与另一种膜蛋白结合的Hb。因为再释放的Hb是初释放后在红细胞内残留下来的,与红细胞内膜蛋白结合较为牢固。因此我们推测:再释放出来的HbA1可能是与带3蛋白结合存在的;而初释放的HbA2可能是与低亲和力膜蛋白结合存在的。

摘要：目的:探讨抗-A、抗-B单克隆抗体对红细胞内血红蛋白电泳释放的影响。方法:用A、B、O、AB 4种血型红细胞与抗-A及抗-B单克隆抗体反应后的产物进行淀粉-琼脂粉混合凝胶电泳,常规电泳后停电30 min再继续电泳,观察血红蛋白的释放情况。结果:A、B、O、AB型红细胞与单克隆抗体反应后血红蛋白释放情况不同,与此同时HbA2的电泳行为也发生变化。结论:单克隆抗体对各型红细胞的血红蛋白释放有影响。