脐血单个核细胞

脐血单个核细胞（精选六篇）

脐血单个核细胞 篇1

关键词：肝硬化失代偿期,脐血,单个核细胞,肝功能

肝硬化是临床常见病,其治疗重点及难点在于如何有效促进肝细胞再生并代替纤维组织。在各种原因导致的肝细胞急慢性损伤及修复的过程中,肝细胞的再生起重要作用。有证据显示脐血单个核细胞可在特定环境下可分化成肝干细胞及肝细胞,从而参与肝结构和功能的修复和重构,改善患者的肝脏功能[1]。笔者研究了人脐血有核细胞输注对失代偿性肝硬化的治疗效果,试图寻找一种治疗肝硬化的新方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例为2010年1～12月郑州人民医院住院的肝硬化患者,行输注脐血单个核细胞者29例,选取同期住院未行输注脐血单个核细胞患者20例作为对照组。治疗组中,男19例,女10例;年龄43～67岁,平均52.4岁;病毒性肝炎后肝硬化26例,酒精性肝硬化3例;肝功能Child B级9例,Child C级20例。对照组中,男13例,女7例,年龄41～68岁,平均51.9岁;病毒性肝炎后肝硬化18例,酒精性肝硬化2例;肝功能Child B级6例,Child C级14例。诊断及分型标准依据2005年修订的慢性乙型肝炎防治指南[2]。两组患者人口学资料、病程、肝硬化原因构成、Child-Pugh分级等比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 治疗方法

患者入院后均同时行内科对症治疗,包括保肝、利尿治疗。两组患者综合药物治疗基本一致。如非抢救或病情特殊需要,尽量避免使用白蛋白、血浆或凝血酶原复合物等。治疗组在对照组基础上输注脐血单个核细胞。所有治疗在患者知情同意情况下进行,均已签署《知情同意书》。80例健康供脐血产妇于婴儿娩出后断脐,无菌条件下将脐血收集到含抗凝剂的采血袋中。淋巴细胞分离液梯度离心分离出有核细胞,以生理盐水重悬,调整细胞密度为1×106～3×106/ml。输注方法:首次采用经肝动脉穿刺介入输注,之后各次经前臂静脉输注,每次输注1×108～3×108个脐血单个核细胞,每周1次,平均每人2.8次。

注:与术前比较,t=2.255,*P=0.036;t=2.700,☆P=0.014;t=2.259,▲P=0.035;t=3.059,#P=0.006

1.3 疗效观察

术后观察指标包括三部分:一是临床症状、体征;二是实验室指标,包括术前及术后4、8周复查血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、血浆白蛋白(ALB)、胆汁酸(TBA)、甲胎蛋白(AFP)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(FIB)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT);三是影像学检查(肝脏B超、CT)。

1.4 统计学方法

采用SPSS 11.5统计学软件进行分析,计量资料数据以均数±标准差表示,比较采用方差分析和Dennett-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床症状及体征

对照组与治疗组患者分别进行治疗4周后,大多数患者临床症状、体征开始改善,其中食欲改善、乏力减轻分别为17例(85.0%)和27例(93.1%);浮肿、腹水减少分别为16例(80.0%)和25例(86.2%);腹胀减轻分别为16例(80.0%)和24例(82.8%);黄疸减轻分别为9例(45.0%)和16例(55.2%)。两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 肝功能改变

治疗组患者进行脐血有核细胞输注4周后,肝功能化验指标已经出现变化,但差异无统计学意义(P>0.05)。至第8周时TBIL与术前比较明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),ALB较术前升高,差异有高度统计学意义(P<0.01);ALT、胆汁酸较术前有所降低,差异无统计学意义(P>0.05)。对照组患者ALT下降在4周时差异亦有统计学意义(P<0.05)。但除ALT外其余指标至第8周差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 凝血功能改变

进行脐血有核细胞输注后,治疗组患者PT第4周时已较术前下降,术后4周及8周与术前相比差异均有统计学意义(P<0.05),反映凝血功能有所改善;术后4周及8周FIB较术前上升,APTT、TT较术前略有降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。对照组患者各指标治疗前后未见明显差异(P>0.05)。见表2。

2.4 不良反应

有1例患者输注脐血单个核细胞时出现术后低热(37.9℃),24 h内自行缓解。其余治疗组患者及对照组患者中均未发现不良反应。

3 讨论

失代偿性肝硬化临床治疗上主要以保肝对症及预防并发症为主,治疗总体效果不甚理想。脐血作为造血干细胞的一个来源近年来受到临床和科研工作者的广泛关注。Kakinuma等[1]及唐晓鹏等[3]证明脐血单个核细胞具有横向分化能力,在一定条件下可以诱导分化为肝细胞,表达肝细胞表面标志如ALB、CK18、Thy-I、c-kit等。Lee等[4]证明,在肝纤维化患者正常功能的肝细胞数量大为减少,脐血单个核细胞可随循环植入肝脏增殖分化成肝细胞,从而改善肝功能。郑宣鹤等[5]、唐晓鹏等[6]以脐血治疗肝衰竭患者,均发现可以有效升高白蛋白、降低胆红素、转氨酶及改善凝血功能。

注:与术前比较,t=2.859,*P=0.010;t=2.523,#P=0.025

本研究显示经输注脐血单个核细胞治疗后的肝硬化失代偿期患者,患者症状好转,其胆红素水平较输注前降低、白蛋白水平升高,同时凝血酶原时间减少,反映患者肝脏功能有所改善。在输注途径的选择方面,笔者采用了首次给予肝动脉穿刺介入输注,之后经静脉输注的方式。经肝动脉穿刺介入输注,一方面可增加到达肝脏的单个核细胞数量,另一方面可先行肝动脉造影排除小肝癌可能。但其为有创操作,增加患者痛苦、费用,并有动脉栓塞等风险,患者不易接受,故除首次之后的输注均采用了经前臂静脉的方式。本研究观察的治疗时间较短,输注的单个核细胞是否能够在体内持续成活、真正控制或减轻患者的肝纤维化及肝硬化、疗效是否为一过性还是能持续存在尚待进一步观察确定。总体来说本研究证实输注脐血单个核细胞对肝功能的某些方面改善是有帮助的,有望成为失代偿性期肝硬化治疗的有效手段之一。

参考文献

[1]Kakinuma S,Tanaka Y,Chinzei R,et al.Human umbilical Cord bloodas a source of transplantable hepatic progenitor cells[J].Stem Cells,2003,21(2):217-227.

[2]中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南[J].中华肝脏病杂志,2005,13(12):881-891.

[3]唐晓鹏,陈丽敏,李异,等.脐带血单个核细胞体外培养分化为肝细胞的实验观察[J].中国输血杂志,2006,19(6):435-437.

[4]Lee KD,Kuo TK,Whang-Peng J,et al.In vitro hepatic differentiationof human mesenchymal stem cells[J].Hepatology,2004,40(6):1275-1284.

[5]郑宣鹤,唐晓鹏,陈军,等.脐血与成人鲜血治疗重症肝炎疗效比较[J].湖南医科大学学报,1996,21(6):549-552.

脐血单个核细胞 篇2

[关键词] 血管内皮生长因子；急性心肌梗死；单个核细胞

[中图分类号] R542.22   [文献标识码] A   [文章编号] 2095-0616（2012）01-22-03

Study of the expression of vascular endothelial growth factor by peripheral blood mononuclear cells in patients with acute myocardial infarction

HONG Canghao  TANG Guofa  LIU Xiaohong

Department of Cardiology,E'gang Hospital,Wu Iron and Steel Group,E'zhou 463002,China

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of VEGF levels in the supernation of cultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in AMI.We also explored the relationship between VEGF and left ventricular systolic function in AMI. Methods 28 patients with AMI and 12 controls were used for this study.PBMCs were isolated from perispheral blood on days 1,5,10 and 15 after the onset of AMI.PBMCs were cultured for 24h.VEGF levels in the culture media were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results (1)VEGF levels in the cultured medium of PBMCs after incubation of 24 h (PBMC-VEGF) were elevated gradually and reached a peak on day 5, which was significantly higher than that of control (343.2±82.5pg/mL vs 143.3±24.2pg/mL,P＜0.05).(2)Peak PBMC- VEGF levels showed no correlation with peak creatine phosphokinase (CK) levels.(3)Improvement of left ventricular systolic function during the course of AMI showed significantly higher PBMC-VEGF levels than patients without improvements (P＜0.05). Conclusion PBMC-VEGF played an important role in the improvement of left ventricular systolic function by promoting angiogenesis and reendothelialization after AMI.

[Key words] Vascular endothelial growth factor;Acute myocardial infarction;Peripheral blood mononuclear cells

血管内皮生长因子在缺血性心脏病发病机制中起着重要作用，动脉粥样硬化的形成，冠状动脉成形术后再狭窄都与生长因子参与的细胞增殖、迁移、分化与凋亡有密切关系。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种特异作用于血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）强有力的有丝分裂原，在缺血、缺氧及血管损伤时能促进VEC增殖、迁移及诱导血管生成，是迄今所发现最强的一种血管内皮生长因子。由于冠心病是以心肌缺血为主要特征，外源性VEGF已成为目前促血管生成、重建冠状动脉侧枝循环的研究热点。目前，在应用外源性VEGF基因转染治疗心肌缺血方面研究很多，而对不同来源的内源性VEGF在心肌缺血时所起的作用研究甚少。本研究通过观察AMI患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分泌的VEGF水平的动态变化来探讨不同来源的内源性VEGF在AMI患者中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

患者为2010年1月～2011年6月笔者所在医院心血管内科住院确诊的急性心肌梗死患者28例，其中男20例，女8例，平均年龄（58.7±7.9）岁。12例正常体检者作对照，其中男9例，女3例，平均年龄（55.6±6.3）岁。28例AMI患者均进行了冠脉造影（coronary angiography，CAG），并实施经皮腔内冠状动脉球囊扩张和支架植入术（percutaneous transluminal coronary angioplasty and stent，PTCA+stent），所有患者均常规服用阿司匹林和氯吡格雷，并根据医生建议服用β-受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等药。28例患者CAG检查结果：单支血管病变11例，2支血管病变9例，3支血管病变8例。合并高血压病的有15例（54%），高脂血症23例（82%），糖尿病7例（25%），18例患者有吸烟史（64%），8例有冠心病家族史（28%）。

1.2 急性心肌梗死的诊断

根据WHO标准持续典型的胸痛30 min以上；典型心电图动态变化；心肌酶（肌酸磷酸激酶及其同工酶MB或肌钙蛋白）动态变化。具有以上中任何2项即可确诊。

1.3 正常对照者入选条件

对照组与AMI组进行性别、年龄配对，经病史询问无心血管疾病史，体格检查无阳性体征，胸片、心电图、肝肾功能、生化常规检查无异常者。合并严重心衰、肝、肾功能衰竭、感染性疾病、肿瘤、外周血管病、脑卒中者予以剔除。

所有患者在发病2 d内进行床旁心脏彩色多普勒超声检测左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF），半月后（出院时）复查LVEF（由心脏彩超室专人质控检测）。

1.4 主要仪器和试剂

CO2培养箱：美国Formal Scientific公司；Lympus倒置显微镜：日本；酶联免疫检测仪：美国EL312eVEGF酶联免疫检测试剂盒：北京晶美生物工程有限公司（进口分装），检测灵敏度为30 pg/mL，批内、批间误差均＜9.5%；淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypaque液，中科院血液研究所；PBS液：新鲜配制；RPMI-1640：GIBCO，美国；小牛血清：笔者所在医院中心实验室制备；双抗：青霉素100 IU/mL，链霉素100μg/mL。

1.5 研究方法

1.5.1 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离和培养及标本的提取

1.5.1.1 PBMCs的分离  （1）在AMI患者发病的第1、5、10、15天分别抽取20 mL静脉血放入肝素抗凝离心管内，摇匀，用PBS液稀释血液1倍，对照组仅抽1次静脉血。（2）取淋巴分离液4 mL，放入15 mL离心管中。（3）将稀释全血沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于淋巴分离液上，稀释血液与分离液体积之比约为2∶1。（4）用水平离心机以2 000 rpm离心20 min，离心后，单个核细胞位于血浆和淋巴分离液界面层。（5）吸取界面单个核细胞层，用PBS洗涤3次，每次1 500 rpm离心10 min，吸弃上清，加入1 mL RPMI 1640，混匀，细胞计数，用苔盼蓝染色，计算活细胞数，均＞95%。

1.5.1.2 PBMCs的培养 （1）用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液重悬单个核细胞，并将细胞浓度调节至5×106/mL。（2）取1 mL浓度为5×106/mL PBMCs悬液放入24孔培养板中，在37℃，5%CO2条件下于培养箱中进行细胞培养。

1.5.1.3 标本的提取 分别于6、12、24 h收取PBMCs培养的上清液，置-70℃冰箱保存待测。

1.5.2 血清肌酸磷酸激酶（CK）最大值的测定 AMI患者发病后每4 小时测1次CK直到最大值（由检验科专人质控检验）。

1.5.3 VEGF的测定 外周血单个核细胞培养分泌的VEGF量均采用双抗夹心酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定，浓度单位为pg/mL。按试剂盒说明进行操作。

1.6 统计学处理

应用SPSS17.0软件包进行统计分析，主要统计指标均进行正态性检验，对于偏态分布的计量资料，对数转换达到近似正态分布后，再进行比较。各统计指标均以（）表示。采用直线相关分析法分析相关指标间相关性，计量资料的组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMCs产生的VEGF水平的动态变化

PBMCs培养产生的VEGF水平在不同培养时间段呈动态变化，用“PBMC-VEGF”表示PBMCs培养产生的VEGF水平。为了便于观察，首先对AMI发病第1天分离的PBMCs培养产生的VEGF进行统计分析。见表1。从表中可见PBMC-VEGF水平随着培养时间的延长而逐渐增加，在12 h和24 h时均显著高于对照组（P＜0.05）。取培养24 h的PBMCs产生的VEGF量作为观察PBMCs分泌VEGF能力的统计指标。AMI患者从发病第1～15天，PBMC-VEGF水平呈动态变化。见表2。从表中可见，AMI组PBMC-VEGF水平从发病第1天开始升高，在第5天达峰值为（343.2±82.5）pg/mL，显著高于对照组的（143.3±24.2）pg/mL（P＜0.05）。随后呈下降趋势，但仍显著高于对照组，到发病第15天PBMC-VEGF水平仍显著高于对照组（P＜0.05）。

2.2 VEGF与心肌酶CK的相关性

AMI患者心肌酶峰值CK为929.8～3 827.2 IU/L，平均（2 185.9±320.3）IU/L。为了探讨VEGF水平与急性心肌梗死时心肌酶升高的关系，对外周血单个核细胞PBMC-VEGF水平与CK峰值进行线性相关分析，PBMC-VEGF峰值与CK无显著相关性。

2.3 VEGF水平与左室收缩功能的关系

为了探讨VEGF水平与左室收缩功能（LVEF）的关系，将入院时LVEF水平（52.3±2.6）%与半月后（出院时）复查的LVEF水平（52.7±2.8）%进行比较，结果两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。将LVEF水平分成两组，A组为AMI患者半月后复查时LVEF水平不低于入院时LVEF水平，有12例，B组为AMI患者半月后复查时LVEF水平低于入院时LVEF水平，有16例，然后分别比较A、B两组PBMC-VEGF水平之间的关系。见表3。

3 讨论

VEGF是现今发现的众多血管生长因子中最有力的血管生成因子，VEGF通过与细胞表面的特异受体结合而发挥作用，目前发现有3种特异受体分别为flt-1、flk-1/KDR和flt-4，属酪氨酸激酶受体家族第三亚型[1]，其中flt-1和flt-1/KDR主要在血管内皮细胞表达，在人的冠状动脉内皮细胞和心肌细胞中均有高水平表达，提示VEGF在心血管系统的功能主要以旁分泌和自分泌的形式实现[2]。

本研究发现，从AMI患者外周静脉血中分离出的单个核细胞能分泌VEGF，PBMCs分泌的VEGF在AMI后即呈上升趋势，于心梗后第5天上升到最高峰，随后10 d内仍维持高值状态，且显著高于对照组，但PBMCs分泌VEGF的高峰值与心肌酶CK高峰值无显著相关性。从以上结果可见，AMI后，由PBMCs产生的VEGF水平迅速上升，目前，鲜有此类报道，其发生机制尚不清楚，可能与AMI发生后，产生VEGF的PBMCs的种类发生改变和（或）其分泌VEGF的功能得以加强有关，其发生机制有待进一步研究。Zhao等[3]发现，心肌梗死处VEGF mRNA基因表达在AMI后2 h就迅速增高，12 h达高峰。引起VEGF表达增加的原因是多方面的。以上结果显示，心肌缺血、缺氧可能是刺激心肌细胞VEGF迅速高表达并在特定时间内持续的主要始动因素，AMI后分泌的生物活性物质可能是AMI亚急性期VEGF持续高表达，并维持一定时间的原因之一[4]。

在研究VEGF水平与AMI患者左室收缩功能关系时发现，左室收缩功能有改善的AMI患者，其PBMC-VEGF水平显著高于左室收缩功能下降的AMI患者。推测AMI患者左室收缩功能的改善可能与PBMCs产生的内源性VEGF在参与修复损伤血管内皮和促进血管生成方面有密切关系。VEGF是迄今所发现最强的一种血管内皮生长因子，能特异地作用于靶细胞－VEC，促进其有丝分裂及血管形成。Zhao等[3]发现，梗死区有VEGF mRNA的表达，同时伴有血管密度高水平表达可持续7 d以上，提示VEGF可能参与心肌梗死的血管重建。Wu等[5]研究发现重组VEGF基因能改善AMI患者的左室收缩功能，局部梗死区心肌室壁异常运动也明显改善。以上结果显示，通过有效方法使特定部位的内源性VEGF基因和蛋白表达升高到一定程度，就能充分发挥其促血管生成，增加缺血心肌灌注，改善AMI患者左室收缩功能。

单个核细胞不但能分泌VEGF，且能介导VEGF对炎性细胞的趋化反应，与炎性细胞在血管生成中的作用有关[6]。Ripa等[7]发现，冠心病患者建立侧支循环以改善进行性冠脉狭窄的能力与单核细胞缺氧时产生的VEGF mRNA的能力有关，建立侧支循环的患者与没有建立侧支循环的患者相比，单核细胞缺氧时VEGF mRNA表达水平有显著差异。以上结果提示，急性心肌梗死时，单个核细胞趋化、粘附在损伤的血管内皮部位，促使内源性VEGFm RNA高表达及VEGF蛋白大量生成，发挥VEGF促内皮细胞分裂、增殖、修复血管内皮和促进缺血区侧枝循环的建立等作用，增加缺血区血流灌注，抑制缺血、梗死范围的进一步扩大，达到改善心脏收缩功能的作用。推测在AMI发生时，通过促进粘附在冠状动脉内皮损伤处PBMCs产生的VEG FmRNA高表达，可达到改善AMI患者心功能目的，详细的机制有待更深入的研究。

在AMI患者急性期，由PBMCs产生的VEGF在改善左室收缩功能方面可能起重要作用。

[参考文献]

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[2] Korpisalo P，Yl-Herttuala S.Stimulation of functional vessel growth by gene therapy[J].Integr Biol （Camb），2010，2（2）：102-112.

[3] Zhao T，Zhao W，Chen Y，et al.Vascular endothelial growth factor （VEGF）-A： role on cardiac angiogenesis following myocardial infarction[J].Microvasc Res，2010，80（2）：188-194.

[4] Dremina NN，Shurygina IA，Lushnikova EL，et al.Effect of endothelial growth factor on postinfarction remodeling of rat myocardium[J].Bull Exp Biol Med，2009，148（3）：441-446.

[5] Wu G，Rana JS，Wykrzykowska J，et al. Exercise-induced expression of VEGF and salvation of myocardium in the early stage of myocardial infarction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296（2）：H389-H395.

[6] Koch S， Tugues S， Li X， et al. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors[J]. Biochem J，2011，437（2）：169-183.

[7] Ripa RS，Jrgensen E，Baldazzi F，et al.The influence of genotype on vascular endothelialgrowth factor and regulation of myocardial collateral blood flow in patients with acute and chronic coronary heart disease[J]. Scand J Clin Lab Invest，2009，69（6）：722-728.

脐血单个核细胞 篇3

为此本研究采用灭活RA滑膜液单个核细胞干预非灭活RA滑膜液单个核细胞,观察非灭活RA滑膜液单个核细胞分泌IL-10水平的变化。以探讨T细胞疫苗治疗RA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 检测对象

活动性RA患者20例,均为2007年1月至2007年5月在哈尔滨医科大学第二附属医院住院诊治患者,全部符合1987年美国风湿病协会的RA分类标准,并选择活动期病例,即符合下例5项中4项者:①休息时有中等疼痛;②晨僵>1h;③有3个以上关节肿胀;④关节触痛>8个关节;⑤血沉(Westerge法)>28mm·h-1。此外,患者在受试前1月内未用过激素及免疫抑制剂等影响免疫功能的药物.20例中女15例,男5例,年龄23～61岁,病程2～7年不等。

1.2 方法

1.2.1 关节滑膜液单个核细胞(synovial fluid mononuclear cell SFMC)的制备

无菌条件下抽取RA患者膝关节液5ml,Hanks液对倍稀释,用Ficoll分离液(TBD公司)按常规密度梯度离心法2000r/min,15min,获得SFMC.将制备的SFMC用PBS液洗涤3次(1500r/min,5min),细胞计数,用10%FCS-RPMI1640培养液制备成细胞浓度为2×106/ml的悬液,台盼兰拒染法鉴定活细胞数>95%。

1.2.2 关节滑膜液灭活单个核细胞的制备

取0.5ml2×105/ml SFMC离心去上清,加0.3%甲醛溶液1ml混匀,4℃冰箱避光固定15分钟[5]。固定后的细胞悬液离心弃上清,加PBS液离心(1500r/min,5min)洗涤4次,用10%FCS-RPMI1640培养液制备成细胞浓度为2×105/mL的细胞悬液。

1.2.3 细胞分组与培养

将浓度为2×106/mL的SFMC悬液1ml接种于6孔培养板中,分为对照组:2×106的非灭活SFMC,实验组:2×106个非灭活SFMC与2×105个灭活SFMC混合培养。将培养板置于37℃,5%CO2孵育箱培养48h,分离上清,-20℃冻存待测。

1.2.4 细胞因子IL-10的测定

取冻存的培养液上清,常温融化,采用武汉博士德公司人IL-10试剂盒,以酶联免疫吸附双抗夹心法(ELISA)检测。根据试剂盒提供说明书进行操作,每个样品和标准品均设复孔。

1.2.5 统计学处理

应用SPSS14.0软件作统计分析,统计数据用均数±标准差(±s),采用配对资料的t检验分析。

2 结果

细胞因子IL-10水平实验组较对照组显著升高(P<0.01),见下表及下图:

实验组及对照组IL-10水平(pg/ml)

注:与对照组比较P<0.01

图:实验组与对照组细胞分泌IL-10水平(pg/ml)的比较

3 讨论

3.1 实验取材部位的选择

在各种器官特异性自身免疫疾病中可以产生体内激活和克隆扩增的自身免疫性细胞,它们移动致病灶处并在该处聚集成为炎症的中心。类风湿关节炎的基本病理改变为滑膜炎,其中可以看到大量的滑膜衬里增生及大量的炎性细胞浸润[10]。外周血及滑膜液细胞的对比研究发现在滑膜中发现的致病性自身反应性淋巴细胞在外周血中检测不到[11,12]。由于自身反应性T细胞及致病性炎细胞具有向关节滑膜聚集的特性,关节滑膜组织及滑膜液细胞已成为寻找及发现与RA病因有关的致病性细胞及因子的理想之地。类风湿关节炎TCR疫苗的研究即取材于RA的滑膜细胞。故本实验以RA膝关节滑膜液为取材对象。

3.2 观察指标的选择

新近研究表明,RA患者关节滑液中单个核细胞Th1/Th2比例失衡,分泌IFN-γ等细胞因子的促炎性Thl细胞明显占优势,而抗炎性Th2细胞分泌IL-4。IL-10等细胞因子相对减少[13],此为RA的重要发病机制之一。实验和临床观察证实,纠正RA局部的促炎症细胞因子和抗炎症细胞因子的平衡失调状态,可以缓解或阻止滑膜炎症的发生和发展[14]。IL-10是一种具有抗炎作用的细胞因子,主要由Th2细胞分泌,在体内可表现出较强的针对IFN-γ等Th1型细胞因子的免疫抑制和抗炎作用[15,16]。并可拮抗巨噬细胞等抗原提呈细胞(APC)分泌的细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α等[17]。MARITA研究发现,在胶原诱导性关节炎大鼠中,用重组人类白介素10治疗类风湿关节炎能明显减轻关节红肿症状,对骨质破坏有保护作用[18,19]。Cuzzocrea等认为内源性的IL-10在类风湿关节炎滑膜中有抗炎作用,并有免疫调控作用测。T细胞疫苗及TCR多肽疫苗的动物实验及临床实验均证实:T细胞疫苗及TCR多肽疫苗可诱导分泌IL-10的调节性T细胞的生成,通过增加分泌IL-10的调节性T细胞的数目是其发挥治疗作用的重要方式之一[21,22]。

在本实验中我们观察到灭活的RA滑膜液单个核细胞可以诱导非灭活RA滑膜液单个核细胞分泌IL-10.与对照组相比,灭活的RA滑膜液单个核细胞诱导的IL-10分泌水平有统计学意义(P<0.01)。这一结果提示:未经克隆筛选的RA滑膜液混合细胞可能具有诱导分泌IL-10的CD4+调节性T细胞生成的作用。其机理有待进一步研究。

摘要：目的观察类风湿关节炎灭活滑膜液单个核细胞对非灭活滑膜液单个核细胞分泌IL-10水平的影响。方法抽取类风湿关节炎(RA)患者关节液，分离关节液单个核细胞，分为对照组：2×106的非灭活单个核细胞，培养条件为37℃，5％CO2孵育箱培养48h；实验组：细胞数为2×106个非灭活单个核细胞与甲醛灭活后的单个核细胞按1：10混合培养．用ELISA法测定培养上清中IL-10的水平．结果实验组较对照组IL-10水平明显升高(P＜0．01)．结论灭活滑膜液单个核细胞对非灭活滑膜液单个核细胞IL-10分泌有促进作用，提示未经克隆选择的RA滑膜液混合细胞可能具有诱导分泌IL-10CD4调节性T细胞的生成作用．

脐血单个核细胞 篇4

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取南京市第二医院住院分娩的血清HBV-DNA阳性的产妇及其新生儿55例, 依据入院时血清HBV-DNA的检测结果分为病毒高载量组 (≥10 6copies·ml-1, n=25) 和低载量组 (<106copies·ml-1, n=30) 。所有产妇孕28周起予HBIG 200IU注射, 每2周1次。另外, 选择乙肝病毒标志物阴性的产妇及其新生儿10例作为阴性对照组。有以下情况的产妇及其新生儿不在此研究范围:产妇患有产科并发症、内科并发症;产妇孕期曾予特殊药物治疗;胎儿异常和 (或) 畸形。

1.2 标本的收集与处理

分别采集产妇静脉血和新生儿脐带抗凝血各10ml, 用生理盐水对倍稀释后缓慢加入等体积淋巴细胞分离液 (购自北京索莱宝科技有限公司) , 于水平离心机上以2000r·min-1离心20min, 用毛细吸管轻轻取出位于血浆与分离液界面层呈白膜状的PBMC, 加入生理盐水20ml混匀, 在水平离心机上以1500r·min-1离心5min, 倒去上清液, 如此重复3次, 重悬后-70℃冻存备用。新生儿于免疫注射前取静脉血2ml测血清HBV-DNA, 产妇血清HBV-DNA检测在门诊检验科完成。阴性对照组产妇及其新生儿同时同方法采血检测。

1.3 PBMC中DNA的提取

将冻存PBMC水浴解冻后提取细胞内DNA, 并进行DNA荧光定量测定。DNA提取试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司, 具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4 HBV-DNA的测定

血清HBV-DNA检测采用荧光定量PCR法检。试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司, 每次检测均设阳性、阴性及空白对照, 具体操作按试剂盒说明书进行。

1.5 统计学处理

所有数据均用SPSS15.0软件处理, 检验水准α=0.05, 率的比较用χ2检验。

2 结果

2.1 阴性对照组产妇及其新生儿血清HBV- DNA和PBMC HBV- DNA检测

阴性对照组产妇血清和PBMC HBV- DNA均阴性, 新生儿血清和脐血PBMC HBV-DNA亦均为阴性。

2.2 产妇血清HBV-DNA载量与其新生儿血清HBV-DNA的关系

病毒高载量组产妇的新生儿血清HBV-DNA阳性率为20% (5/25) , 低载量组产妇的新生儿血清HBV-DNA均阴性, 两组新生儿间血清HBV-DNA阳性率差异有统计学意义 (χ2=4.402, P<0.05) 。

2.3 产妇血清HBV-DNA载量与产妇及其新生儿脐血PBMC HBVDNA阳性率的关系

病毒高载量组产妇PBMC HBV-DNA阳性21例, 低载量组产妇PBMC HBV-DNA阳性13例, 高病毒载量组产妇PBMC HBV-DNA阳性率高于低病毒载量组 (分别为84.0%和43.3%) , 两组差异有统计学意义 (χ2=9.554, P<0.05) 。病毒高载量组产妇的新生儿脐血PBMC HBV-DNA阳性11例, 低载量组产妇的新生儿脐血PBMC HBV-DNA阳性4例, 病毒高载量组产妇的新生儿脐血PBMC HBV-DNA阳性率高于低载量组 (分别为44.0%和13.3%) , 两组差异有统计学意义 (χ2=6.466, P<0.05) 。

2.4 产妇与新生儿之间PBMC HBV-DNA阳性率的关系

产妇PBMC HBV-DNA阳性, 其新生儿脐血PBMC HBV-DNA阳性率较高 (13/21, 61.9%) , 产妇PBMC HBV-DNA阴性, 其新生儿脐血PBMC HBV-DNA阳性率则较低 (2/19, 10.5%) , 两组间差异有统计学意义 (χ2=5.395, P<0.05) 。有4例新生儿脐血PBMC HBVDNA及血清HBVDNA均阳性, 11例仅脐血 PBMC HBV-DNA阳性, 1例仅血清HBV-DNA阳性。

3 讨论

3.1 新生儿PBMC HBV-DNA测定的意义

PBMC是T、B淋巴细胞, 巨噬细胞, NK细胞等免疫活性的细胞集合体, 可分泌多种细胞因子, 调节机体细胞免疫和体液免疫。HBV为泛嗜型病毒, 除感染肝细胞外还可感染多种组织细胞。HBV感染PBMC后可在其中复制, 甚至整合入PBMC的基因组内, 改变其免疫因子的分泌, 进而影响机体对乙肝病毒的免疫清除功能。

近年研究认为, PBMC在乙肝母婴传播中起着重要作用, HBsAg阳性孕妇的新生儿PBMC HBV-DNA也应作为HBV宫内感染的指标之一[7]。在新生儿中, PBMC与血清的HBV-DNA阳性情况不完全一致, 部分新生儿仅有PBMC HBV-DNA阳性。本研究中11例新生儿仅PBMC HBV-DNA阳性, 1例新生儿仅血清HBV-DNA阳性。早期Shen等[8]就曾报道2例出生时仅PBMC HBV-DNA阳性的新生儿15月龄时转氨酶升高, 认为胎儿感染HBV后储存于白细胞, 出生后HBV从白细胞释放致肝脏而导致新生儿肝炎。若早期没有对新生儿进行PBMC HBV-DNA的检测, 这部分新生儿就会被漏诊, 并有可能在日后发展成慢性乙型肝炎、肝硬化甚至肝癌。

另外, 新生儿PBMC感染HBV可影响其后期免疫接种的成功率。有研究[9]显示:新生儿PBMC HBV-DNA阳性者免疫失败率明显高于PBMC HBV-DNA阴性新生儿;新生儿PBMC HBV-DNA阳性者细胞培养上清液中的IL- 2水平明显低于PBMC HBV-DNA阴性和正常对照组新生儿, 而后两组之间差异无统计学意义;无论出生时新生儿血清HBV-DNA阳性或阴性, PBMC HBV-DNA阳性者7月龄时免疫接种失败率均显著高于PBMC HBV-DNA阴性者。考虑可能由于乙肝病毒感染了新生儿PBMC, 影响其免疫因子的分泌, 削弱了机体对乙肝病毒的抵抗能力, 从而造成免疫失败率的增加。因此, PBMC HBV-DNA 的检测是对血清HBV-DNA检测的重要补充, 在血清HBV-DNA检测的基础上再检测PBMC中的HBV-DNA, 能更准确地判断宫内感染, 这对于筛选高危婴儿、追加免疫治疗以减少乙型肝炎慢性携带、肝硬化及肝癌发生也具有一定意义。

3.2 产妇及新生儿血清HBV-DNA载量与PBMC HBV-DNA之间关系

乙肝病毒携带产妇血清病毒载量越高, 新生儿宫内感染几率越大, 这在以往的研究中已取得共识。通常认为, 宫内感染的指标是新生儿血清HBV-DNA和 (或) HBsAg阳性, 关于产妇及新生儿PBMC HBV-DNA与血清HBV-DNA的相关性的研究尚存在争议。在对慢性乙型肝炎患者PBMC的研究中发现:血清HBV-DNA载量与PBMC HBV-DNA的阳性率呈正相关, 血清HBV-DNA载量越高, PBMC HBV-DNA阳性率也越高[2]。对孕产妇的研究中结果则差异较大:有的研究[3]认为, 血清HBV-DNA阳性的产妇PBMC HBVDNA 阳性率明显高于血清HBVDNA阴性产妇;但也有研究认为, HBV- DNA可独立存在于PBMC中, PBMC中HBV-DNA与血清HBV-DNA无关[4,5]。本研究将血清HBV-DNA阳性产妇分为高病毒载量组和低病毒载量组, 发现血清高病毒载量组产妇PBMC中HBVDNA阳性率明显高于低病毒载量者。

关于产妇和新生儿之间PBMC HBVDNA的相关性在各项研究[3,5]中均给予了肯定。本研究结果亦显示:产妇PBMC HBV-DNA阳性, 其新生儿脐血PBMC HBV-DNA阳性率较高;产妇PBMC HBV-DNA阴性, 其新生儿脐血PBMC HBV-DNA阳性率则较低, 产妇PBMC HBV-DNA与新生儿脐血PBMC HBV-DNA具有显著的关联性。感染HBV的PBMC可作为载体介导HBV在母婴间的垂直传播[6], 故不难理解母婴间PBMC HBVDNA存在显著相关性。我们认为, 在常规检测产妇及新生儿血清HBV-DNA的基础上, 有条件时加测PBMC HBVDNA, 并把握它们之间的相关性, 对于高危孕妇及新生儿的预测及筛查有着重要的辅助作用。

参考文献

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[2]崔纷, 王东平.荧光定量检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBVDNA的含量及其意义[J].临床肝胆病杂志, 2006, 22 (2) :97-98.

[3]苏雪松, 郭凤婵.外周血单个核细胞感染乙型肝炎病毒对新生儿宫内感染的影响[J].中国妇幼保健, 2004, 19 (9) :98-100.

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[5]魏俊妮, 王素萍, 冯丽萍, 等.乙型肝炎病毒宫内感染的细胞分子机制[J].现代预防医学, 2005, 32 (2) :94-104.

[6]Gatta A, Giannini C, Lampertico P, et al.Hepatotropic viruses:new insights in pathogenesis and treatment[J].Clin Exp Rheu-matol, 2008, 26 (1Suppl48) :S33-38.

[7]史晓红, 王素萍, 李淑珍, 等.太原市HBsAg阳性孕妇新生儿HBV感染状况的研究[J].山西医科大学学报, 2004, 35 (1) :18-19, 24.

[8]Shen HD, Choo K B, Wu TC, et al.Hepatitis B virus infection of cord blood leukocytes[J].J Med Virol, 1987, 22 (3) :211-216.

脐血单个核细胞 篇5

1 材料和方法

1.1 实验动物及其分组

取45只8周龄Wistar大鼠 (清洁级, 由大连实验动物中心提供) , 体重200~220g, 雌雄不限。按照随机数表法随机分为:实验组 (n=15) 、对照组 (n=15) 、假手术组 (n=15) 。实验中对动物的处置符合我国相关伦理学规定[3]。动物在 (23±2) ℃饲养室饲养。

1.2 实验主要试剂和仪器

SABC试剂盒, MBP克隆抗体, BSA封闭液 (武汉博士得) ;DAB显色系统 (北京中杉金桥) ;恒温冰冻切片机CM1900 (德国LEICA) ;台式离心机 (美国Sigma) 。

1.3 骨髓单个核细胞的分离、纯化

大鼠用10%水合氯醛 (0.3m L/100g) 腹腔注射麻醉, 碘伏、酒精溶液常规消毒。切除大鼠股骨、胫骨, 用5%肝素生理盐水混合液冲洗骨髓腔, 将悬浮液进行1500r/min、离心10min, 弃去上清液。用2m L PBS稀释, 放置在含有2m L淋巴细胞分离液的离心管中, 2000r/min、离心20min, 吸取白色界面层, 用2m L的PBS洗涤两次, 离心10min、1000r/min。由此得到的悬液保存在DMEM培养基中, 并将细胞浓度调节到6×108m L-1。台盼蓝检测细胞活性在90%以上, 4℃保存, 2h内移植。

1.4脊髓损伤动物模型的制作及骨髓单个核细胞细胞移植

参照杨建华[4]脊髓全横断模型建模:将实验组和对照组大鼠腹腔麻醉 (10%水合氯醛0.3 m L/100 g) 成功后固定于无菌操作台, 定位T9脊髓棘突并作标记, 术区常规消毒3遍, 在标记上下行正中切口长约2.0, 使椎骨暴露, 咬除相应棘突、椎板, 借助显微外科剪在T9节段打开椎管, 直至完全暴露脊髓组织, 用自制脊髓横断刀 (取剃须刀片刀刃部长约3cm宽约0.5cm) 迅速、轻柔、完全离断脊髓, 大量生理盐水冲洗, 逐层缝合, 常规消毒, 脊髓损伤模型制备完成。术后给予腹腔内青霉素注射防感染, 早晚挤压、按摩腹腔辅助排便、排尿。

实验组造模过程中在脊髓横断处上下两端各注射15μL浓度为6×108L-1的BMMNCs悬液;对照组造模过程中在脊髓横断处上下两端各注射15μL PBS缓冲液;假手术组只咬除对应的棘突、椎板, 不损伤脊髓, 然后逐层缝合。

1.5 运动功能评估

各组动物分别在SCI后1d、5d、1w、2w、4w和6w后, 随机每组抽取5只大鼠进行BBB评分。为避免对实验结果影响, 每次评分前都会协助大鼠排空尿液、粪便, 并且分别由两人同时独立进行BBB评分。参照BBB评分[5]项目表, 仔细观察大鼠双侧后肢的运动功能并分别对大鼠的左、右后肢进行运动功能评分。每只大鼠严格按照标准评分3次, 最后取其平均值。

1.6 组织学和免疫组化分析

到达各时间点后处死大鼠, 取材、切片常规脱蜡水化、3%H2O2处理, 微波修复抗原, 分别滴加一抗:兔抗鼠髓鞘碱性蛋白多克隆抗体, 4℃过夜后分别滴加生物素化山羊抗兔Ig G, 在37℃孵育30min, 加SABC工作液, DAB显色, 苏木素染色, 封片观察。

1.7 统计学分析

采用SPSS17.0统计分析软件进行处理, 实验数据采用:①均数±标准差 (±s) 表示, ②组间比较采用独立样本t检验, ③多个样本均数间的两两比较用q检验 (P<0.05) 为差异具有统计学意义, P<0.01为差异有显著性统计学意义。

2 结果

2.1 功能评估

2.1.1 术后动物一般情况

所有大鼠均能耐受手术, 手术后前几天饮水及进食食物较少, 此后饮食逐渐恢复至正常水平。术后出现切口感染1例, 未见血尿、下肢溃疡等并发症出现, 偶尔可见术后大鼠间的相互攻击。术后积极防治并发症, 感染的大鼠给予加大青霉素剂量及术后感染切口每日换药;术后尿潴留大鼠, 每天早晚各一次按摩、挤压膀胱协助排尿, 直至完全恢复;术后死亡1例。

2.1.2脊髓神经功能评价

参照BBB评分[5]标准要求严格进行评分, 所有大鼠均在实验前进行BBB双后肢运动功能评分, 且全为满分21分, 均符合实验要求。实验组和对照组大鼠在脊髓全横断术后1d双侧后肢运动功能均完全丧失, 双侧下肢均呈拖行状态, 5d后双侧下肢的运动功能开始逐渐恢复, 但是各组未见明显的差异;2w后实验组和对照组出现了轻微的髋、膝关节主动运动, 但是实验组评分结果较对照组稍高但差别不具有统计学意义 (P>0.05) ;4W后上述两组出现了髋、膝关节明显的主动运动, 踝关节轻微运动, 实验组较对照评分结果高, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

注:与假手术组比较, aP<0.05;与对照组比较, bP<0.01。

2.2 组织学和免疫组化染色结果

MBP蛋白免疫组织化学染色 (图1~3) 发现, 4周后在实验组脊髓损伤处发现有些细胞的核呈棕紫色阳性, 对照组呈棕色的细胞明显少或无, 表明移植的骨髓单个核细胞在宿主体内已有向髓鞘细胞方向分化的趋势, 实验组在BMMNCs治疗作用下脱髓鞘的轴突髓鞘再生明显。

3 讨论

近些年来有关干细胞移植的方法来治疗急性脊髓损伤修复的研究一直是神经-生物科学领域的热点, 倍受基础和临床科研工作者的青睐。目前大量动物实验研究均已经证实BMMNCs[2]能对脊髓损伤有一定的修复作用。BMMNCs因提取简单而且不必进行培养非常适合进行移植治疗, 为大鼠移植治疗SCI提供新的种子细胞。BMMNCs具有自我更新、分化的潜能, 并且还能释放某些细胞因子促进神经和血管再生[6,7], 并促进脊髓功能的恢复, 然而在体内恢复机制很复杂, 目前仍不明确。

本实验通过BMMNCs移植并观察脊髓损伤区附近微环境中髓鞘碱性蛋白表达, 免疫组织化结果均表明受损伤大鼠脊髓的神经功能恢复与髓鞘碱性蛋白表达有一定的相关性。

脊髓组织损伤后可使损伤组织分泌相应的神经化学物质、增加了微血管通透性和周围组织的水肿等一系列的病理生理改变, 这种病理生理变化必然导致损伤后脊髓组织自身成分的改变, 这其中也包括中枢神经系统 (CNS) 中髓鞘的主要组成成分-髓鞘碱性蛋白 (MBP) 变化。MBP是CNS髓鞘的主要结构蛋白[8], 是维持神经元髓鞘结构和功能稳定的重要物质基础, 其主要生理功能是通过与髓鞘膜带负电荷的磷脂在髓鞘浆膜面的相互作用, 促使少突胶质细胞质面融合而成多层膜结构的主要致密线维持鞘的紧密性, 而且在髓鞘形成过程中具有启动作用。Olesson Y[9]等研究发现在大鼠脊髓损伤模型中通过免疫组织化学的方法观察到在脊髓损伤组织中许多神经细胞体皱缩并且组织呈海绵状水肿表现, 其内存在一个胶质细胞原纤维酸性蛋白免疫应答的显著增加和MBP染色的明显减少, 其丢失的髓鞘碱性蛋白进入脑脊液中, 脊髓损伤后损伤部位的缺血及炎症和免疫反应可导致血脊髓屏障的破坏, 使其毛细血管内皮细胞间隙增宽, 血管壁连接松散, 血脊髓屏障的通透性增加, 此破坏并不局限于损伤部位且向损伤部位的周边区域扩散[10]。

在本实验研究中, 移植BMMNCs的大鼠后肢运动功能从2周起明显优于对照组。第6周后的大鼠的HE染色显示明显愈合和组织形态修复完好。用髓鞘碱性蛋白免疫组化显示阳性髓鞘细胞增多及部分运动神经元中突触蛋白光密度增加。并且实验组的BBB评分中明显优于对照组, 且有大量的髓鞘阳性细胞个数增加, 可能是促进内源性修复机制之一, 这种机制与BMMNCs的移植呈高度相关性。本实验通过组织学和免疫组化检测等方法, 发现BMMNCs能在脊髓损伤环境中存活, 6周后依然能够检测到, 而且有效促进了截瘫的大鼠后肢功能恢复。并且发现, 在宿主存活的单个核细胞不仅促进了髓鞘的修复, 而且提高的髓鞘细胞的量随周期的延长有逐渐增加的趋势, 6周时增加的量与对照组相比有统计学差异。脊髓损伤的恢复行为学测试表明实验组的后肢运动功能较对照组大鼠恢复明显, 所有大鼠在脊髓损伤前BBB评分为21, 术后1d~6w每个时间点BBB评分移植组均高于对照组。骨髓单个核细胞移植能促进大鼠的后肢运动功能恢复, 于Chopp[11]等研究发现移植人MSC细胞相似。另外本研究结果发现, BMMNCs移植后6周的行为学观察, 实验组和对照组大鼠的后肢功能均有所改善, 但前者明显比后者好。这一现象说明BMMNCs移植入大鼠脊髓损伤处可以促进损伤脊髓的修复和再生。这与文献报道的其他各种干细胞 (神经、胚胎和骨髓干细胞) 治疗脊髓损伤相似[12~14], 说明植入细胞能融入血管结构并长期存活体内促进再生血管, 而且基本适应机体内的微环境, 并能分泌相关细胞因子, 来继续促进损伤脊髓功能的恢复, 防止继发性脊髓损伤的可能。

脊髓损伤后神经元再生和重塑是一个十分复杂的课题。本研究从动物行为学和组织形态MBP含量这两个方面显示了BMMNCs可促进脊髓全横断损伤后髓鞘细胞的再生、上调了髓鞘碱性蛋白的表达, 这可能是BMMNCs促进大鼠后肢功能改变的原因。在本实验中未进行PCR检测和western blot检测, 至于BMMNCs是否通过刺激MBP基因的转录或其他机制来促进MBP的合成还有待进一步研究。

摘要：目的:探讨同种异体骨髓单个核细胞 (BMMNCs) 移植对脊髓全横断损伤区局部微环境中髓鞘碱性蛋白表达的影响。方法:取8周龄Wistar大鼠45只, 雌雄不限、每只体重200220g, 随机分为3组:实验组 (n=15) 、对照组 (n=15) 、假手术组 (n=15) 。对实验组和对照组大鼠建立脊髓全横断损伤动物模型。实验组造模后对脊髓横断处上下两端立即注入骨髓单个核细胞;对照组对脊髓横断处上下两端注入磷酸盐缓冲液 (PBS) ;假手术组不损伤脊髓, 仅剪除T810棘突和椎板后逐层缝合。于细胞移植后的1d, 5d, 1w, 2w, 4w和6w分别行BBB大鼠后肢功能评估来判断脊髓神经功能恢复情况, 并采用免疫组织化学检测观察大鼠脊髓髓鞘碱性蛋白的表达。结果: (1) BBB评分结果显示各时间点假手术组均为正常范围, 实验组和对照组分值随时间均逐渐增加, 且实验组较对照组高 (P<0.05) , 但均未达到正常组水平, 术后4周实验组BBB评分较对照组增加显著, 差异有统计学意义 (P<0.05) ; (2) 免疫组织染色结果显示各时间点实验组和对照组大鼠脊髓中髓鞘碱性蛋白的表达量高于假手术组, 且实验组高于对照组 (P<0.05) 。结论:同种异体的骨髓单个核细胞移植可能改变了局部的微环境并上调了脊髓内髓鞘碱性蛋白的表达。

脐血单个核细胞 篇6

近几年对某些恶性肿瘤病人的外周血单个核细胞的研究发现Th1/Th2平衡发生偏移, Th2优势偏移与肿瘤恶性程度呈正相关, 并认为这是肿瘤免疫逃逸的机制, 因为机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主, 向Th2的偏移降低了病人的抗恶性肿瘤能力[1,2]。目前, 国内外缺乏恶性腹水型肿瘤大鼠血清中的Thl/Th2类细胞因子基因表达水平变化的文献。本研究旨在探讨腹水型肿瘤大鼠外周血单个核细胞中IFN-γ、IL-4基因表达水平, 进一步了解恶性肿瘤机体肿瘤免疫状态的变化。

1材料与方法

1.1材料

大鼠淋巴细胞分离液购自TBD公司, 大鼠总RNA提取试剂盒购自上海华舜公司, 逆转录试剂盒购自上海生工公司。Walker-256细胞株购自中国医学科学院药物研究所。纯系健康Wistar大白鼠20只, 雄性, 鼠龄6周, 购自内蒙古大学动物中心。

1.2方法

1.2.1实验动物分组

将20只随机分为2组, 每组10只:A组:正常鼠对照组;B组:Walker-256腹水型大鼠模型组。

1.2.2 Walker-256腹水型肿瘤大鼠模型的制作

将冻存的Walker-256细胞株37℃复苏呈液态, 1 000r/min离心5min, 沉淀用生理盐水悬浮至约含5×106个细胞/ml, 取0.2mL注入大白鼠腹腔内。接种第七天, 抽取少量腹水涂片, 瑞氏染色, 光学显微镜下观察。

1.2.3外周血单个核细胞分离

接种两周后采血, 按试剂说明分离单个核细胞。

1.2.4 RT-PCR方法检测大鼠MNC中IL-4、IFN-γmRNA的表达

(1) 细胞总RNA的提取:参照总RNA抽提试剂盒W 6701使用说明操作。

(2) 第一链cDNA的合成:参照MMLV第一链CDNA合成试剂盒使用说明进行。

(3) IL-4、IFN-γDNA的体外合成:

1) 引物序列:β-actinP1:5′-GTGAACCCTAAG-GCCAACC-3′, P2:5′-TCAGGATAGAGCCA

CCAAT-3′产物712bp。IFN-γ上游引物P1:5′-ACGCCGCGTCTTGGTTTTG-3′, 下游引物P2:5′-TTGTGCTGGATCTGTGGGTTG-3′产物378bp。IL-4上游引物P1:5′-TTACCC

GTCTCATTTGC C-3′, 下游引物P2:5′-TTC-CCACTTTGCTGTTCC-3′, 产物394bp。

2) PCR扩增条件:94℃预变性4min, 94℃变性30s, 54℃退火30s, 72℃延伸40s, 共35个循环, 72℃充分延伸10min, 4℃保存。3) PCR产物DNA电泳观察鉴定后用GRS-1000凝胶成像分析系统, 测定产物DNA含量, 以IL-4DNA含量/β-actinDNA含量、IFN-γDNA含量/β-actinDNA含量分别表示IL-4DNA、IFN-γDNA的相对含量。

2结果

2.1腹水瑞氏-姬姆萨染色片

图1A为购自中国医学科学院药物研究所带有Walker-256癌肉瘤细胞株的大鼠腹水瑞氏-姬姆萨染色图, 图中可见Walker256癌细胞核大, 分叶。B为本研究复制的腹水型肿瘤大鼠的腹水瑞氏染色图, 图中可见腹水核分裂相多见, 核浆比增大的癌细胞, 与所购细胞株同源, 证实腹水模型建立成功。

2.2 RT-PCR检测结果

检测结果分别见图2, 3和表1, 2

1、3—泳道:B组, 2、4—泳道:A组, M—泳道:Marker

1、2、5—泳道:B组, 3、4—泳道:A组, M—泳道:Marker

ttest*, P<0.05vsgroupA

3讨论

Th细胞亚群是评估机体免疫状态和免疫能力的一个综合指标, Yamazaki等[3]认为, 检测患者血清中的Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4可很好的评价机体T细胞的抗肿瘤效应, 抗肿瘤免疫应以Thl占优势状态, 若细胞因子中以IFN-γ占优势, 肿瘤患者极少发生淋巴结转移;若以IL-4占优势则相反。一旦由Thl向Th2漂移, 造成免疫抑制状态, 机体的抗肿瘤免疫将受到严重削弱。

本研究利用RT-PCR检测实验动物外周血单个核细胞IL-4、IFN-γ基因的表达水平, 结果显示Walker-256腹水型大鼠IL-4基因表达水平高于对照组 (P<0.05) , 而IFN-γ基因的表达水平则低于对照组 (P<0.05) , ) 。上述研究结果证实了肿瘤机体免疫状态存在Thl向Th2漂移的现象, 细胞免疫严重受抑制。该研究与李亚荣等关于人癌性腹水患者外周血Th1和Th2细胞免疫状态研究结果一致[4]。这也提示不仅人而且啮齿类动物癌性腹水机体也存在Th1/Th2平衡向Th2细胞漂移的现象。

随着分子生物学、生物工程、免疫学基础理论的发展, 肿瘤免疫学已成为最活跃的生命科学研究领域之一。为诱导有效的抗肿瘤免疫, 我们可以采用能够提高Thl类细胞因子表达及抑制Th2类细胞因子表达的新疗法, 激活免疫系统的生物效应[5], 对肿瘤进行杀伤或抑制, 达到根治肿瘤的目的。本实验Walker-256腹水型大鼠不失为一个好的动物模型。

参考文献

[1]Shibata M, Nezu T, Kanou H, et al.Decreased production of interleu-kin12and immune responses are marked in cachectic patients with colorectal gastric cancer.J Clin Gastroenterol, 2002;34 (4) :416—420

[2]姚新生.Th1和Th2研究概况.国外医学.免疫学分册, 2002;25 (6) :290—293

[3]Yamazaki K, Yano T, Kameyama T, et al.Clinical significance of ser-um TH1/TH2cytokines in patients with pulmonary adenocarcinoma.Surgery, 2002;131 (Suppl1) :S236—S241

[4]李亚荣, 夏大文, 唐艳, 等.癌性腹水患者外周血THl、TH2细胞免疫反应状态的研究.激光杂志, 2006;27 (2) :85