肿瘤微环境的调控

肿瘤微环境的调控（精选五篇）

肿瘤微环境的调控 篇1

关键词：浮游微藻,群落结构,对虾养殖,生态调控

养殖水环境的优化是对虾健康生长的前提保证,浮游微藻是养殖水体中的重要组成部分,其群落结构与养殖池塘水体质量、对虾的健康养殖有着密切关系[1,2],因此,利用微藻的生态调控功能来改善养殖水环境成为目前研究的热点之一。许多学者对不同养殖模式、养殖季节、养殖地域等虾池浮游微藻的群落分布情况做了调查,并对在养殖实践中与对虾健康关联较大的、易形成优势种群的微藻进行了生态位研究,这些研究对建立以优良微藻为基础的生态调控技术奠定了基础。文章从虾池浮游微藻群落结构变动规律及养殖环境因子影响等多个方面,探讨在养殖中构建优良微藻藻相的方法,以期结合养殖生产实践,构建以浮游微藻为核心的藻相调控技术,为提高对虾的养殖效益和减小养殖风险等提供参考。

1 浮游微藻在对虾养殖水体中的作用

在养殖水生态环境中,浮游微藻扮演着初级生产者的角色,是水生态系统中能量供应和物质循环的重要一环,对构建稳健平衡的生态系统起着重要的作用。它可以通过光合作用向系统中源源不断地输送有机物,同时增强水中溶氧量(DO),为虾池中对虾和浮游生物的生长提供氧气,还可加速水体中还原性有害物质的氧化,优化水质。此外,浮游微藻的种群分布还对虾池的水色有着重要的影响,一般认为水色是水产养殖中水体环境质量的外观表现,不同的水色往往能反映出不同的水质营养状况,而微藻的细胞形状、大小、适应性分布和体色均是影响水色的重要内容,如绿藻繁殖较多时水色呈鲜绿色,硅藻大量繁殖时水色呈黄褐色,甲藻大量繁殖时水色呈酱油色,蓝藻大量繁殖时在水面上会浮有一层翠绿色的浮膜,水体透明度低,特别是在下风处表现尤为明显[3]。

在养殖初期,微型浮游微藻可作为对虾的天然活饵料,故虾池藻相结构可能会影响对虾的成活率和健康状况[4,5,6]。同时浮游微藻在维持养殖中、后期环境的稳定与优化方面更起着重要作用。因为随着中、后期投饵量的加大和虾类排泄物的逐渐积累,水体的有机质等逐渐丰富,微藻可吸收水体中各种营养盐,有效预防水体富营养化趋势的发生,减少水中氨氮(NH4-N)和亚硝氮(NO2-N)等有害物质。有研究认为绿藻类和硅藻类具有吸收有害物质、保持水质“活、爽”的功能,是可用来构建优良藻相的备选种类[7]。例如,将绿藻类的波吉卵囊藻(Oocystis borgei)和微绿球藻(Nannochloris oculata)进行固定化处理后用以养殖生态优化,对酸碱度(pH)提高有一定作用,水体中的NH4-N和NO2-N因被有效吸收而减少,且在一定程度上还促进了对虾免疫酶活性,增强了对虾的抗病力[8,9]。而不良的微藻大量繁殖会给对虾的健康生长带来胁迫,许多研究表明赤潮和水华类微藻的种类和数量与对虾发病程度有正相关性[7,10,11]。如赤潮类的甲藻种类,蓝藻类的微囊藻属(Microcystis)、鱼腥藻属(Anabaena)和颤藻属(Oscillatoria)种类等,其分泌的毒素可能会给对虾的健康生长带来危害[12,13]。

2 虾池中浮游微藻的变动特点

2.1 不同养殖模式的浮游微藻

目前对虾养殖模式较多,按谢立民等[14]的研究分类,有传统的潮位差纳排水模式,高位池动力提水模式,半封闭淡水添加模式,全封闭生态养殖模式,循环水养殖模式和混养模式等,以上模式所用的池塘类型若按虾池位置及进排水方式,主要又可以分为集约化养殖池和半集约化养殖池2种。集约化养殖池多建于开放性海区,取水便捷,虾池四周砌混凝土或铺设地膜护坡,放养密度大,配套设施完善,具有高效、稳产的特点。而半集约化养殖池多建于河口或近岸的低盐度洼地,排水不变,多为传统土塘,放养密度小,配套设施低。

海水养殖的虾池浮游微藻主要以海生硅藻类为主,盐度对微藻的群落结构影响明显,如张汉华等[10]对海水集约化高位精养虾池浮游微藻种类的调查显示,调查期间盐度12.28～29.60,养殖前期浮游微藻优势种主要有伏氏海毛藻(Thalassiothrix frauenfeldii)、菱形海线藻(Thalassionem anitzschioides)、日本星杆藻(Asterionella japonica)、中肋骨条藻(Skeletonem acostatum)和洛氏角毛藻(Chaetoceros lorenzianus)等,到了中、后期,随着氮(N)、磷(P)营养盐的丰富,一些耐污性较强的绿藻类等也出现在优势种之列,如绿球藻(Chlorococcus sp.)、栅列藻(Scenedesmus sp.)、实球藻(Pandorina sp.)、直板藻(Penium sp.)和盘星藻(Pediastrumn sp.)。但由于养殖海水盐度仍较高,优势种依然包括许多硅藻类,如中肋骨条藻和柱状小环藻(Cyclotella stylorum)等。另外,虾池的养殖海水一般来自于外海,经过滤等处理后引入,但由于虾池具有不同于外海的特殊生态环境,如水体营养丰富、人为干扰性强等特征,所以与外海微藻群落结构相比,虾池的微藻密度一般大于外海,但微藻种类较外海少。

对对虾低盐度集约化养殖池浮游微藻群落结构的研究显示,虾池微藻的组成中,绿藻类较为常见,但蓝藻类常在种类数量上占较大的比例,且优势种也多为蓝藻类,如颤藻、假鱼腥藻(Pseudanabaena)、螺旋藻(Spirulina)和微囊藻属等,养殖后期优势种的优势度尤其突出,多样性较低,两者呈负相关性[4,15,16]。后期水体的富营养化是颤藻等蓝藻类大量发生、形成高密度的主要原因,蓝藻的大量繁殖有可能抑制硅藻和绿藻类等的生长,且不易调控。一些蓝藻优势种之间也存在相互共存或抑制的关系,微藻群落的演替有时具有突发性、时间短和速度快等特点。申玉春等[17]在研究集约化养殖池浮游微藻的演替时指出,浮游微藻的演替速度快说明虾池浮游微藻群落不稳定,有可能和水体盐度等理化因子的变化造成水体环境不稳定有关。

对集约化虾池和半集约化养殖土池之间浮游微藻群落结构组成所做的比较研究发现,半集约化虾池养殖后期的微藻多样性指数一般要高于集约化虾池,而优势度却相反,两者具有显著负相关[15]。由于营养盐对微藻种类的形成有着重要的影响,半集约化虾池对虾放养密度较低,投饵较集约化池少,水体营养盐等理化因子一般低于集约化池,这可能是造成虾池微藻的密度和优势度等不同于集约化虾池的主要原因。此外,养殖土池的环境和管理状况一般也较集约化池出现更多复杂因素,如土池岸边和池底会生有茂密的挺水或沉水植物,还可能存在着数量丰富的能摄食微藻的底栖螺类等,池塘清淤的底泥留在岸边也可能被雨水重新冲刷入池,增氧机的管理和药剂的投放是否科学等,这些都会直接或间接影响土池环境因子和微藻种类分布的变动。而集约化虾池出现的微藻高优势度特征表明在池塘营养逐渐丰富的条件下,喜肥耐污的种类如蓝藻类容易滋生。

2.2 不同养殖季节的浮游微藻

浮游微藻普遍具有明显的季节更替现象,不同的浮游微藻对温度和光照的需求不同,夏季水温高、光照强、日照时间长、水体pH高,这些气候因素很适合一些喜高温的蓝藻生长,所以浮游微藻种群中蓝藻类比较常见。而在冬季,气候环境与夏季相反,浮游微藻种群常由隐藻、甲藻、小型绿藻、金藻、某些裸藻和硅藻等组成[18]。而某些广温性微藻在不同的季节都有出现。

对广东省湛江市东海岛的对虾集约化养殖池春、秋季浮游微藻的调查研究显示,春季检出微藻28种,秋季21种,优势种均较突出,春季的优势种有旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、窄面角毛藻(C.paradoxus)和日本角毛藻(C.inpponica),秋季的优势种有蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、波吉卵囊藻、细弱海链藻(Thalassiosira subtilis)和条纹小环藻(Cyclotella striata)[19]。而2季均出现的优势种有啮蚀隐藻(Cryptomonas erosa)、颤藻(Oscillatoria sp.)、铜绿微囊藻(M.aeruginosa)、细小平裂藻(Merismopedia tenuissima)和微绿球藻等,多为绿藻类和蓝藻类,说明这些微藻具有适应不同季节的广生态位特征。刘孝竹等[16]对秋、冬季集约化虾池的研究显示,在养殖中后期蓝藻类大量发生形成优势种,水体营养盐和盐度等对微藻结构的影响比较大。

另外,在南方沿海地区夏、秋季经常会出现台风和强降雨等恶劣天气,降雨会对气温、虾池水温、pH和DO等产生重要影响,虾池的微藻结构可能也会随之出现变动。查广才和周昌清[20]报道过在养殖中出现的台风和大雨等恶劣天气对养殖水体环境有显著的影响,会造成水体不稳定,对浮游微藻的生长影响明显,例如在晴好天气,浮游藻类的种类和密度增加,而长期阴雨或强降雨,浮游藻类的种类和密度会显著降低。可见恶劣天气等的干扰也是影响浮游微藻群落结构的重要因素,需加强对这方面的关注和深入研究,找出应对措施,规避养殖风险。

2.3 不同养殖地域的浮游微藻

中国南方气候温暖,在广东、广西和海南等地区都有大面积养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)或斑节对虾(Peneaus monodon)等喜温性的虾类。此外,福建、浙江沿海,辽宁和山东环渤海湾区域以及青岛地区附近等也大力发展海水、咸淡水等对虾养殖。

黄翔鹤和王庆恒[21]对湛江和海南高位池浮游微藻的研究结果表明,在此区域的高位池养殖中后期微藻优势种具有突出性和单一性特征,主要以喜肥或耐污的绿藻和蓝藻类为主,并且注意到微藻优势种的变动对水环境的调控有重要影响,由优良的微藻控制的池塘水质稳定,养殖良好。

吴斌和廖思明[22]对广西北海凡纳滨对虾养殖池塘的微藻研究发现,池水的盐度与微藻的种类关系密切,绿藻和硅藻类在盐度较高(盐度密度大于1.01)的池塘常形成优势种,而在盐度较低(盐度密度小于1.01)的池塘中占优势地位往往是颤藻和裸藻类,提出控制池塘水体盐度是调控藻相的重要因素。

李雪松等[23]对福建泉州湾虾池浮游微藻的调查显示,虾池盐度在16～20,优势种群以喜高盐的硅藻为主,在绝对优势种没有出现前,营养盐含量和微藻的密度呈负相关关系。在硅藻类成为优势种后,水体硅酸盐的水平成为限制硅藻发展的重要因子。到养殖后期,检出有许多赤潮性的能分泌毒素的甲藻类,经调查发现虾池在纳潮换水过程中水源受到自身高强度排污废水的污染,导致出现养殖水体富营养化现象,从而使虾池赤潮类微藻爆发,给对虾的健康养殖带来很大的负面影响。可见,在养殖实践中针对虾池排泄废水的管理已显得相当重要,若在养殖过程中造成回流污染会显著改变虾池微藻的群落结构和时空分布,进而有可能危胁对虾的健康生长。

曾建刚和蒋霞敏[24]对浙江上虞地区凡纳滨对虾池微藻的动态变化进行了分析,认为水质的逐渐富营养化引起蓝藻类的微囊藻大量繁殖,最终导致水质恶化。且在富营养化基础上形成的过高生物量和数量特征的微藻不利于虾池水环境的优化,提出调控虾池微藻密度的建议。

杨秀兰等[25]的研究认为浮游生物在黄河三角洲盐碱地封闭式低盐度池对虾养殖成功中发挥着关键作用,特别是微藻中一些喜N的蓝藻、绿藻和裸藻类,在大量繁殖的同时对外源性有机质(如残饵和虾排泄物)分解形成的丰富营养盐、总氨等进行利用和转化,促进了池塘营养链的优化,有效地维持了高密度对虾的正常生长和封闭式虾池水质的自我调节。

在对莱州湾鱼、虾混养净水围隔中浮游微藻的调查发现,N和P营养盐是浮游微藻的限制因子,N/P的变化能显著影响微藻结构的变动[26]。矫晓阳[27]调查了渤海营城子湾沿岸虾池的微藻,共检测出微藻有硅藻、甲藻、蓝藻、绿藻、金藻和裸藻类等,种类在94种以上,其中硅藻达59种。虾池与海湾沿岸的浮藻群落物种以及多样性之间存在一些差异,有些微藻存在于虾池而不见于海湾沿岸水体,而有些微藻却只见于沿岸水体,反映了虾池与沿岸生态环境之间的差异,以及不同微藻对生存环境的要求有所不同。

综上所述,不同地域之间虾池浮游微藻的分布有一些共性特征,如随着养殖的进行,喜肥或耐污性的微藻多会在养殖中逐渐形成优势,但也会由于地域环境、物候变化、养殖模式和管理模式等不同造成虾池微藻分布有差异,即便是在同一地域,不同位置或不同池塘的微藻分布也会由于环境、人为干扰等造成的微藻生态位需求差别而具有不同的特征。

2.4 不同养殖阶段的浮游微藻

虾池不同养殖阶段浮游微藻的群落结构与养殖水体营养盐、盐度等各种理化因子的变化有密切关系。在养殖初期营养盐含量较低,一般可通过添加一些含有N和P等营养盐的单胞藻类生长素等来肥水培藻,以优化健康的微藻藻相,防止不良微藻在早期滋生而给幼虾生长带来胁迫。对水源的引入进行管理以防引入的外海水源中含有不良微藻等。查广才等[4]和刘孝竹等[16]针对低盐度集约化虾池的微藻群落结构研究显示,在养殖前期微藻的种类主要是绿藻类和硅藻类,某些种类能较好地适应低营养盐。随着养殖的延续水体有机质等营养的积累、水体中悬浮颗粒物增多和透明度下降,开始出现中度富营养状况,一些喜肥耐污的微藻种类,如颤藻类等在养殖中期开始大量繁殖,常成为优势种或常见种,且优势度随着后期富营养化程度的升高而增高,特别是在养殖后期,优势种容易向单一方向发展,微藻多样性降低,最后可能爆发水华或赤潮,直接给对虾养殖带来严重危害。有研究显示颤藻类水华等还极易引发“倒藻”,导致大量羟胺、硫化物的释放,有毒气体的产生,造成对虾因应激致病而死亡[28]。因此,在养殖中期构建优良微藻藻相结构具有重要的意义,可尝试通过引入经培育的多种优良微藻等方法,在中期构建出稳定、优良的藻相,以期在养殖中后期有效地抑制蓝藻类等不良微藻的繁殖,增强微藻的多样性。同时,优良微藻还可通过吸收过剩营养盐等有效地减轻富营养化的趋势,以保持养殖环境的稳定。

3 浮游微藻与理化因子的关系

浮游微藻优势种群变动还会受到虾池各种理化因子的影响,探讨理化因子和浮游微藻之间的关系有助于寻找有效解决优化微藻藻相问题的方法,因此以下就虾池中几种重要的理化因子进行阐述。

温度是影响微藻分布的重要因子,这主要与不同微藻的最适温度有关。对于大多数微藻来说,最适温度在18～25 ℃[29],但不同浮游微藻的最适温度不同,如波吉卵囊藻的最适生长温度是25～30 ℃,多在秋季出现[19]。在粤西海域中,角毛藻、诺氏海链藻(Thalassiosira nordenskioldi)和微小斜纹藻等(Pleurosigma minutum)多出现于春季(水温为23～24 ℃),波吉卵囊藻、细小平裂藻和蛋白核小球藻等多出现在秋季(水温为29～3l ℃)[30]。

光照是影响浮游微藻生长的重要因子。一般而言,微藻光合作用会随光照强度的变化而变化,在低光照下,光合作用速率与光强呈正比,但当达到饱和光强后,光合作用速率保持平稳,如果光照再强,微藻就会产生光抑制现象,其光合作用会下降或停止[29]。不同的微藻对光照的适应强度有所不同,一般甲藻比硅藻更适应较高的光强,硅藻又强于绿藻,而蓝藻较能适应低光强,SCHEFFER和RINALDI[31]报道颤藻在高光强下其光合作用会受到抑制。

盐度是影响水生生物原生质渗透压的一个重要因素,它对虾池微藻群落结构的分布也具有重要的影响。硅藻类一般较其他种类微藻更适应较高盐度的环境。对某些微藻的比较研究表明,啮蚀隐藻表现出广温广盐性质,具有较宽的生态位幅度,而蛋白核小球藻喜高温的环境,并且对盐度的适应性范围也窄于啮蚀隐藻[32]。谢立民等[14]的研究也认为水体中盐度是影响微藻群落组成的主要因素,在盐度较低的虾池中,蓝藻会占优势,当盐度介于10～30时,舟形藻和桥湾藻类等硅藻会形成优势。

pH的变化是水中理化因子和生物活动的综合结果。水中浮游微藻进行光合作用,吸收二氧化碳(CO2),放出氧(O2),会使pH上升。在一定条件下,pH升高也会使含N和P等离子部分减少,微藻一般喜好接近中性而非碱性的pH条件[33]。偏碱性的水体适合于蓝藻的大量繁殖与生长而抑制了绿藻等的生长,但通常情况下当环境pH大于8.5～9.0时,对浮游微藻的生长是有害的[34]。

NH4-N由非离子氨(NH3-N)和离子铵(NH+4-N)组成,其中对虾类有毒性的是NH3-N,当水中NH3-N平均质量浓度达到0.45 mg·L-1时,虾的生长速度减慢50%[35]。NH4-N的质量浓度一般随着浮游微藻密度的增高而降低。一些微藻具有较强的吸收NH4-N、磷酸盐(PO4-P)等除污功能,如已在工业除污中使用的螺旋藻(Spirulina)、蛋白核小球藻等[36]。由NH4-N等组成的无机氮(DIN)可增加池水的营养,使微藻大量吸收而迅速生长。而微藻死亡后有机体分解又产生NH4-N等,所以在养殖水体中DIN含量的变动也影响着浮游微藻的种类和生物量等的变化。

浮游微藻的数量、分布及季节变化与水体中可被直接利用的营养盐含量及变化情况密切相关,如DIN、无机磷(DIP)的含量。营养盐是构成虾池初级生产力的限制因素。不同微藻对营养盐的需求不同,如微绿球藻在ρ(NO3-N)为28.30 mg·L-1和ρ(PO4-P)为2.08 mg·L-1时,生长效果较好[37],这说明微藻间可能存在竞争或共存的关系,同时也是维持水体中微藻生物多样性的基础。孙耀等[38]研究结果显示,一些海洋浮游微藻对DIN和DIP的最适质量浓度下限分别为79.9和18.0 μg·L-1。所以,有必要根据虾池的水质情况和浮游微藻对营养盐等因子的需求进行系统的调查与分析,为合理构建、优化养殖水体的藻相结构提供适宜的营养参数和生态参数。而针对养殖后期蓝藻经常容易大量繁殖的现象,有学者认为低N/P有利于蓝藻进行固氮作用,高N/P则有利于绿藻繁殖,由此提出引入某些对蓝藻有拮抗作用的优良藻类进行选择性施肥以控制蓝藻生长[39]。而对集约化虾池后期出现的高优势度颤藻类和各种环境因子做的多元分析研究显示,颤藻密度和水体中有机质(COD)指标呈正相关关系,即虾池中丰富的有机质为颤藻类提供了优势的生长环境[40]。通过施用芽孢杆菌(Bacillus sp.)和光合细菌(Photosynthetic bacteria)等有益微生态制剂,可有效分解和利用有机质[41,42]。因此,针对养殖后期常出现与不良微藻大量繁殖相关性很强的有机质丰富的现象,可探讨在虾池投放微生态制剂的方法降解虾池有机质,以期能有效地抑制不良微藻的快速繁殖。

由此可见,浮游微藻的种类分布、数量变动等和虾池中各种环境因子的动态是密切相关的,环境因子的变动有可能会改变浮游微藻的群落结构。可通过生物统计学等方法深入地研究对微藻影响的关键环境因子,然后再尝试通过对环境因子的调控来有效改良微藻群落结构、优化微藻藻相,这将是一个重要的探索方向。另外,浮游动物的摄食压力也会影响虾池浮游微藻的密度和种群结构变化,这也是值得研究的新亮点。

4 浮游微藻与水质调控

对虾的养殖实践证明微藻藻相的变动会影响水环境的稳定和对虾健康的生长,进而影响养殖效益。其中池塘微藻优势种群的变动不容忽视,优势种群主导着微藻生态功能的发挥。尝试通过人工干扰的手段在虾池中构建以优良微藻优势种为基础的稳定的藻相结构,将有益于改善养殖环境。目前,一般认为在对虾养殖生产中通常以绿藻类和硅藻类为优势种的池塘为好,其水质稳定,水色优良,病害少,对虾生长亦较好,其中裸藻类也能有效构建池塘良好水色,但其藻相易受环境影响出现不稳定的现象[7]。而以蓝藻为优势的水体中,或在甲藻经常出现的环境中,对虾一般生长缓慢而且容易引发病害。因此认为,在养殖过程中以培养绿藻类和硅藻类为主的健康水系较好。

绿藻类的许多微藻具有耐污、耐盐等宽生态位的性质,可用于养殖中、后期逐渐富营养化的水体环境,形成的藻相也相对稳定,容易保持池水的“活、爽”,并且微藻种类数丰富,对于微藻多样性的增强也有益处。一般认为,养殖水体中生物多样性较低,微藻种类单一,优势度过高,不利于养殖水体生态系统的稳定,也不利于加强对虾抵抗胁迫因子的力度。因为提高微藻生物多样性可有效增强虾池生态系统的信息含量,维持微藻藻相的动态平衡,有效地应对各种干扰给环境带来的扰动。若微藻种类过于单一,即使是易保持养殖水体“活、爽”的绿藻类,当数量达到一定的阈值,也可形成绿藻水华,严重破坏水环境生态系统,导致对虾应激死亡[16]。有研究认为过低的多样性指数容易导致对虾不同程度地出现病害和死亡症状[5,11]。因此,有必要结合微藻的生态位、密度和物种多样性指数等因子的变化,及其对虾池水质环境的影响等进行系统的研究与分析,科学筛选出生产性能良好、环境兼容性强的优良藻株,如一些已在试验和生产中常用到的波吉卵囊藻、微绿球藻、蛋白核小球藻、新月菱形藻(Nitzschia closteriu)和啮蚀隐藻等[8,43,44]。对微藻进行合理配比后再寻求稳定地扩大培养,检验于养殖实践,以达到利用优良藻相优化对虾养殖环境的目的,进而建立以微藻生物技术为核心的池塘藻相调控技术。

5 浮游微藻与对虾养殖

实践已证明虾池微藻藻相结构的分布和变动与对虾健康养殖有密切关系,在养殖生产中,如中、后期的高位池,经常会出现蓝藻类的快速繁殖,可分泌毒素的颤藻或微囊藻类往往可形成高密度的水华,显然会增加养殖风险,是造成对虾应激性发病或死亡的重要原因。一些微藻水华如颤藻水华还可能会因为天气变化或养殖环境变化等因素引发“倒藻”现象的发生,释放有毒物,进一步给养殖带来较大危害。因此,如何控制不良微藻特别是有害藻类的过度繁殖而形成优势是养殖实践中比较突出的问题之一。利用生态位调控来改变适宜不良微藻生长的环境,利用种间竞争的关系培养优良微藻来抑制有害微藻的大量滋生,目的都是为了建立适宜对虾生长的健康生态环境,降低虾类生长胁迫和养殖风险。利用优良微藻来优化养殖环境,培育良好水色,保持虾池生态系统的有益平衡和抗干扰能力,维持稳定、健康的水质环境,有益于对虾的健康养殖。

6 展望

食物温度“微调控”营养吸收 篇2

食物的温度，不仅仅影响口感，还会改变食物内部的组成，特别是花样繁多的主食，因主食富含淀粉，温度的改变会引起消化吸收的变化。

淀粉类食物的消化难度不仅与纤维含量有关，还与淀粉的糊化和老化程度，以及食物的硬度、粘度等有关。淀粉的糊化和老化均受到温度的影响。没有足够的温度，淀粉不能充分糊化，也就是“不熟”。熟了之后一旦降温，淀粉分子又会重新聚拢，向生的方向回归，发生粘度下降、硬度上升等变化，即所谓的“老化回生”。淀粉分子回生之后，会产生“抗性淀粉”，也就是不容易被人消化吸收的淀粉分子，只有进了大肠后才被微生物所发酵。

温热的食物除了易于消化之外，也有利于促进胃部的血液循环。温度明显低于体温的食物，特别是冰镇、冷冻的食物，会暂时收缩胃部血管，抑制局部血液循环，降低消化液分泌和胃肠蠕动速度。

有肥胖或糖尿病困扰的人，如果吃温热的食物，而且又是精白细软的，则不是最好的选择。因为温度越高淀粉糊化度越也高，容易消化，会导致餐后血糖急剧上升，对控制血糖极为不利。不过，消化不良、胃肠不好、身体瘦弱者，本来消化液分泌少或消化酶活性较低，再用冷冻食物来冰镇自己的胃，会影响食物的消化吸收，这种做法显然不明智。

温度改变脂肪类食物的吸收率，影响血脂变化

血液中游离脂肪酸的变化也与胰岛素的变化密切相关的。正常情况下，胰岛素除了能降低血糖外，还能抑制脂肪酸分解，促进甘油三酯合成。对于肥胖、血脂异常，以及胰岛素敏感性下降等的人而言，当摄入大量碳水化合物时，会引起餐后胰岛素水平过高，促进甘油三酯、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白等的合成，同时血液中的脂肪酸又无法被及时有效地代谢氧化，从而造成餐后血脂升高。蛋糕、曲奇、蛋挞、肉粽、汤圆、糯米烧卖等诱人美食，由大量油脂和精白淀粉或白糖组合，为最佳“黄金搭档”，在油脂和碳水化合物的双重冲击下，血糖、血脂升高将更明显。

还有，食物温度对脂肪代谢的影响也值得关注。动物油脂在低温时以固态形式存在，加热时以液态形式存在。像肉粽、肉包子、肉饼、牛羊肉等食物，由于含饱和脂肪酸较高，其脂肪融化的温度高于体温。若趁热吃，融化状态下的脂肪有利于胃肠吸收。若凉后再吃，其脂肪呈固态，酯酶对脂肪的消化吸收速度会比较慢，不会使得餐后游离脂肪酸水平升高过快。

温馨提示

每个人应根据身体状况选择合适的食物，品尝美食时也要注意合适的食物温度。如果胃肠消化功能强大，又是肥胖或患有高血压、高血脂、高血糖者，建议食物放凉后再吃，只要“不冰牙”即可，以增加抗性淀粉，延缓餐后血糖和血脂上升，并改善肠道菌群，是有益无害的。如果消化能力特别差，又是很瘦弱的人，还是吃温食好，否则不容易消化，给消化道雪上加霜。当然，也不建议吃滚烫的食物，热腾腾的饭菜还是要吹一下，等下降到40℃左右不烫时再放进嘴里。否则，口腔、食道和胃黏膜就会被烫熟而变性，增加癌症风险。

肿瘤微环境与宫颈癌的研究进展 篇3

1 宫颈癌的发生与肿瘤微环境

肿瘤微环境的主要生理特点是低氧、低p H以及高组织间隙液压[3]。正是因为这样一些特点, 才使得肿瘤细胞生存环境中存在大量的生长因子、细胞趋化因子和各种蛋白水解酶所产生的免疫炎症反应, 这种特点都十分利于肿瘤细胞的增殖、侵袭、黏附、血管生成以及耐药。

1.1 低氧

肿瘤组织无限制增殖, 决定了其对能量需求高, 因此, 对氧气和葡萄糖等能量物质的消耗要比正常组织高许多。有学者发现, 缺氧宫颈癌细胞发生转移的比例较高, 而且通过生物荧光探测技术检测宫颈癌组织中乳酸含量来间接反映肿瘤组织的缺氧程度, 结果显示, 发生转移的原发癌灶的乳酸含量是未发生转移的癌灶中乳酸含量的2倍[4]。Semenza[5]发现缺氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1) 可以识别位于促红细胞生成素 (erythropoietin, EPO) 编码区下游转录增强子的一段被称为缺氧反应元件 (hypoxia response element, HRE) 的特异性DNA序列, HIF-1与HRE的结合介导了EPO基因的转录。随后许多研究证实, HIF-1的转录调节活性不仅仅局限于产生EPO的细胞, 而是几乎所有哺乳动物细胞系受到缺氧后的一种普遍反映。Birner等[6]发现, 正常组织没有或者弱阳性的HIF-1表达, 宫颈癌组织中HIF-1α表达阳性或者强阳性, 而且HIF-1表达水平越高, 预后越差, 因此HIF-1α的表达高低可以做为早期宫颈癌的一个独立预后指标。

血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 是最早发现的能被缺氧诱导的促血管生成因子。Suzuki等[7]发现VEGF mRNA主要在坏死区周围的缺氧肿瘤细胞表达。而HIF介导基因产物的表达, 包括VEGF和促血管生成素-2 (angiopoietin, Ang-2) , 通过诱导重建肿瘤细胞的血管网络来使肿瘤细胞处于缺氧环境, 但新血管的形成往往是扭曲和不规则的, 因此, 运输氧气、营养以及药物的效率很低。Ryan等[8]的研究表明, HIF-1α或者HIF-1β的缺陷或者丢失不仅可以明显减缓肿瘤的生长速度, 而且还可以使肿瘤组织内新生血管的生成明显减少, 说明HIF-1可以通过参与调节肿瘤内新生血管的生成来影响肿瘤的生长。越来越多证据表明, HIF-1可以做为靶向治疗肿瘤的靶点。

1.2 低p H

研究表明, 肿瘤酸度在肿瘤增殖、肿瘤耐药以及肿瘤转移方面起着很重要的作用[9]。以前认为, 影响肿瘤酸度的重要决定因素是无氧代谢, 通过上调HIF-1α和适应乳酸产生的糖酵解表型, 使细胞能够在缺氧环境下生存。然而, 肿瘤组织也能够在糖酵解产生乳酸量少的情况下创造酸性环境, 提示有氧代谢也参与了肿瘤酸度的形成。

目前认为, 影响肿瘤酸度的因素有: (1) 肿瘤灌注不足; (2) 缺氧和异常代谢; (3) 跨膜p H值的调节能力增加。肿瘤细胞中存在多种离子交换体, 在建立肿瘤微环境的酸性环境中起着重要的作用。V型ATP酶 (V-ATPases) 是一种细胞的质子泵离子通道, 在细胞内外p H的调控中起重要的作用, V-ATPases可以将肿瘤细胞代谢过程中产生的大量H+运输到细胞外, 以维持一个相对中性细胞内的p H值、酸性的管腔p H值和酸性细胞外p H值。被排出肿瘤细胞外的H+就会随着浓度梯度进入正常细胞组织内并大量积聚, 激活酶级联反应而导致细胞坏死或者凋亡, 从而利于肿瘤的侵袭与转移。有研究表明, 肿瘤微环境的酸性环境能诱导溶酶体的分泌增加和活化, 激活蛋白水解酶来促进细胞外基质的降解和重构, 这都有助于肿瘤的侵袭[10]。Nishi等[11]分别对20例正常宫颈, 20例低级别上皮内瘤变宫颈组织, 20例高级别上皮内瘤变宫颈组织, 以及20例浸润性宫颈癌组织的免疫组化检查显示, 糖酵解水平随着组织病理学分级的提高而提高, 提示肿瘤酸度在宫颈癌进展中起重要作用。

1.3 高组织间隙液压

正常组织中, 由于血管通透性较低, 淋巴回流网络丰富, 所以组织间隙液压一般处于比较低的水平;恶性肿瘤毛细血管通透性增加以及淋巴引流障碍, 导致肿瘤组织间隙液压增高。高组织间隙液压可能阻止大分子物质向肿瘤中心区域的运输, 从而可能会影响肿瘤的血供。Fyles等[12]通过在宫颈癌放化疗前治疗高组织间隙液压的前瞻性研究表明, 宫颈癌患者可以从放化疗前治疗高组织间隙液压中获益, 推测高组织间隙液压在宫颈癌进展中起重要作用。Michael等通过对77例宫颈癌患者的前瞻性研究结果显示, 宫颈癌组织的组织间隙液压高于正常组织, 高组织间隙液压的肿瘤组织含氧量更低, 同时放射治疗治愈率也低。近年来研究表明, 高组织间隙液压可以作为预测放化疗预后的标志物[13]。

2 宫颈癌的转移与肿瘤微环境

肿瘤的转移潜力依赖于肿瘤细胞和促进肿瘤细胞生长、生存、血管生成、侵袭、转移等内环境因素的相互作用, 是一系列复杂、多步骤、多因素相互作用的序贯连续过程。

2.1 低氧与宫颈癌转移

肿瘤转移包括两个过程, 首先肿瘤细胞与细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 接触, 肿瘤细胞溶解ECM及周围组织, 这样肿瘤细胞才能离开原发部位向其他部位转移。其次, 肿瘤转移依赖于血管的生成, 而肿瘤血管的生成依赖于血管内皮细胞。肿瘤微环境中的成纤维细胞与肿瘤细胞相互作用, 促进肿瘤血管的生成, 进而促进肿瘤的转移。研究表明, 低氧可以增加肿瘤转移的潜力, 主要通过两种途径, 一是通过对肿瘤细胞遗传和表观遗传方面来改变肿瘤细胞的侵袭和转移能力;二是通过表达可以影响肿瘤细胞与ECM联系的一些分子, 从而对肿瘤转移起决定性的作用[14]。Ellingsen等[15]研究表明, 宫颈癌的转移跟原发肿瘤的低氧环境有关, 多种机制可能涉及缺氧诱导转移。缺氧可诱导点突变和DNA链断裂导致的缺失、扩增和基因组不稳定。此外, 无论是通过基因扩增或通过正常的生理过程, 激活氧传感器、缺氧的信号转导通路和DNA的转录因子, 缺氧均可能导致临时增加转移级联中所涉及的基因产物的表达。

2.2 低p H与宫颈癌转移

Walenta等[16]通过对34例宫颈癌患者的组织研究发现, 肿瘤酸度在转移性宫颈癌患者组织中的表达明显高于非转移性宫颈癌患者组织。通过对这34例患者8年的临床随访发现, 肿瘤复发以及因肿瘤死亡的大部分患者属于高肿瘤酸度组, 生存分析的结果显示, 低肿瘤酸度的患者无病生存率要明显高于高肿瘤酸度的患者, 所以, 肿瘤酸度可以作为预测宫颈癌预后的一个指标。

3 宫颈癌的耐药与肿瘤微环境

目前研究已基本证实肿瘤微环境中的缺氧状态及低p H值是肿瘤细胞耐药的重要原因之一, 而高组织间隙液压与肿瘤耐药的关系尚不明确, 缺氧及低p H值导致肿瘤耐药的主要原因有以下几点。

3.1 肿瘤缺氧可能导致血管生成以及细胞永生化相关基因的激活, 这些基因的表达可能导致肿瘤耐药的生化途径的改变, 如缺氧可以选择对P53介导的细胞凋亡失去敏感性的细胞和缺乏DNA错配修复的细胞;P-糖蛋白和叶酸拮抗剂可以诱导肿瘤药物耐药, 而缺氧可以增加P-糖蛋白和二氢叶酸还原酶的表达[17]。

3.2 缺氧也可以干扰内质网蛋白质的折叠, 这可能会造成肿瘤细胞对拓扑异构酶-Ⅱ靶向药物的耐药, 增加P-糖蛋白的表达以及多重耐药[18]。

3.3 肿瘤内血管结构和功能的异常, 减少肿瘤细胞与化疗药物接触的机会[19]。

3.4 大多数化疗药物主要作用于处于S、M、G2期的细胞, 而缺氧导致肿瘤细胞停滞于G1期, 从而使得肿瘤细胞对化疗药物不敏感[20]。

3.5 在氧充足的条件下, 许多抗癌药物产生可以破坏DNA的自由基。这些药物接受生物来源的电子, 然后将电子传输给氧气。如多柔比星进行化学还原的半醌自由基, 反过来降低了氧的超氧化物, 可能有助于细胞毒性[21]。因此, 在低氧浓度的自由基介导的细胞毒作用的药物, 其活性降低。

宫颈肿瘤细胞微环境在宫颈癌的发生、转移及耐药中有重要的作用, 在宫颈癌相关的研究中, 应该强调肿瘤微环境方面的研究, 有助于进一步阐明宫颈癌的发病机制、转移以及耐药的机制, 并对宫颈癌临床诊断、治疗提供依据。

摘要：宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一, 其死亡率为妇女恶性肿瘤的首位, 严重威胁妇女的健康。目前研究表明, 肿瘤微环境是肿瘤细胞增殖、分化的主要场所, 其在肿瘤的发生、转移及耐药方面有很重要的作用。宫颈癌肿瘤微环境的研究有助于进一步阐明宫颈癌的发病机制、转移以及耐药的机制, 并对宫颈癌临床诊断、治疗提供依据。

肿瘤微环境的调控 篇4

事实上,肿瘤微环境发生的系列改变与抗肿瘤血管生成治疗耐药密不可分。肿瘤微环境是肿瘤细胞在生长过程中与细胞外间质相互作用后形成的肿瘤细胞生长的特殊环境,在这个微环境中细胞及细胞因子相互作用,并发生了极其精细而复杂的变化。本文主要综述肿瘤微环境反应性改变介导抗血管生成耐药分子机制的研究新进展。

1 其他血管生成因子和促血管生成通道

1.1 其他的血管生成因子

血管生成是一个受多个信号通路调控的复杂过程。VEGF是肿瘤新生血管形成的主要促进因子,但许多研究表明,肿瘤新生血管形成过程中会产生成纤维细胞生长因子(FGF-2)、白细胞介素-8(IL-8)、胎盘生长因子(PIGF)、转化生长因子(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、基质衍生因子(SDF-1α)等其他促血管生成因子。从理论上讲,任何一种血管生成抑制剂都不可能抑制所有的血管生成因子及其下游信号通路,相反当VEGF信号通路被阻断后可能会代偿性地使微环境中其他生长因子增多。例如,Crawford等[6]发现一些肿瘤经过抗VEGF治疗后,肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞(tumor associated fibroblast,TAF)表达的PDGF-C将上调,上调的PDGF-C能促进肿瘤血管生成。在难治性小鼠肿瘤模型中,抑制PDGF-C可阻断血管生成并减慢肿瘤生长速度。在进展期胰腺癌小鼠模型中,单独使用VEGFR2抑制剂(DC101)后,肿瘤中FGF-2表达水平升高,随后联合使用DC101和可溶性FGF受体较单独使用DC101能更显著减慢肿瘤生长[7]。在鼠肿瘤模型中,抗胎盘生长因子(anti-PIGF)能有效地抑制对抗VEGFR-2抗体耐药的肿瘤生长。临床观察也支持在晚期肾细胞癌中,血管生成因子(VEGF除外,如b FGF、肝细胞生长因子、IL-6)的增加发生在抗血管生成治疗进展之前[8]。总的来说,这些结果表明不依赖VEGF的信号通路,如FGF、PDGF、EGF或PTGF可能参与肿瘤抗VEGF治疗耐药[9]。因此,多靶点抑制及联合用药是抗血管生成治疗的未来研究方向。

1.2 其他促血管生成通路

除了VEGF信号通路,还有一些重要的通路可促进肿瘤血管生成,如促血管生成素(angiopoietin,Ang)家族及其酪氨酸激酶受体2(Tie2)与血管生成密切相关[10];血管周细胞产生的Ang-1主要介导血管成熟,而内皮细胞产生的Ang-2与血管壁破坏及增加血管生成有关。有研究[11]发现Ang和Tie2结合抑制剂(trebananib)联合紫杉醇治疗复发卵巢癌较安慰剂组明显延长PFS(7.2个月比5.4个月)。Lindholm EM等[12]研究发现,在基底细胞样肿瘤模型中,联合使用贝伐珠单抗和PI3K/m TOR信号通路抑制剂可明显增加对肿瘤的抑制作用。DLL/Notch和JAG/Notch信号通路抑制剂可通过不同的机制影响肿瘤血管生成。前者可增加肿瘤新生血管数量,但这些血管功能障碍且灌注差,血供明显降低而抑制肿瘤生长;JAG/Notch信号通路抑制剂可通过增加溶性血管内皮生长因子受体-1(Svegfr-1/s Flt-1)表达水平,影响周细胞与内皮细胞的相互作用,从而减少肿瘤血管形成及灌注,为抑制肿瘤生长提供新的治疗方向[13]。

2 缺氧

抗血管生成治疗通常会明显减少肿瘤内部血管及血流量,加重肿瘤缺氧。乏氧诱导因子-1(HIF-1)是肿瘤细胞内氧平衡的重要转录因子,缺氧可上调HIF-1表达水平,进而诱导或代偿性上调其他的血管生长因子,如FGF2、Ang-2等;同时HIF-1ɑ调节乏氧内皮细胞自主表达系列基因,编码细胞表面血管生成因子受体,促进新生血管形成,改善氧供[14]。其次,乏氧状态上调的HIF-1ɑ可诱导肿瘤细胞分化为干细胞、诱导上皮-间充质转变(EMT)导致细胞间黏附作用减弱,促进肿瘤浸润和转移;同时使用HIF-1抑制剂或使用si RNA将HIF-1基因敲出后,U87胶质瘤细胞迁移率明显降低[15]。另外乏氧可诱导产生促转移蛋白(如SDF-1α、HGF)和促侵袭的细胞外基质分子,从而增加肿瘤细胞的侵袭能力[16],且有研究[17]发现,贝伐珠单抗治疗中的直肠癌患者血浆内的SDF-1α上调与远处转移有关。

缺氧微环境可以动员骨髓来源细胞参与新生血管的形成。在胶质母细胞瘤鼠模型中,HIF-1ɑ部分通过SDF-1α诱导髓源CD45+细胞募集,包括Tie2+,VEGFR1+,CD11b+和F4/80+亚群,以及内皮细胞和周细胞的祖细胞,这些细胞可以通过表达基质金属蛋白酶(MMP-9)来诱导血管形成及血管重塑[18]。另外研究[19,20]发现,在对抗血管生成治疗耐药的肿瘤小鼠模型中CD11b+Gr1+髓系细胞更多,这些细胞可以激活肿瘤基质细胞分泌IL-6、SDF-1ɑ等因子促进血管增生,使肿瘤对血管生成抑制剂产生耐药。此外,缺氧促进肿瘤干细胞相关基因(HIF-1ɑ、DLK1基因)激活,并提高干细胞相关蛋白(OCT3/4、SOX2)的表达水平,增加肿瘤干细胞的比例而促进肿瘤的进展和转移,缺氧还调节内皮细胞和其他细胞旁分泌因子表达维持干细胞[21]。总的说来,缺氧可以通过多种途径参与到肿瘤血管生成,是目前抗血管生成治疗失败的原因之一。

3 肿瘤细胞自噬

自噬是真核细胞通过溶酶体对胞内多余或受损的细胞器等进行降解的生物学过程,保证细胞的内环境处于稳定状态。自噬现象在肿瘤中具有抑制和促进两方面的作用。一方面,在肿瘤早期,通过自噬清除受损细胞器,促进蛋白分解代谢,减轻炎性反应,维持细胞内环境稳态,从而抑制肿瘤细胞生长;另一方面,在肿瘤进展期,肿瘤细胞处于缺氧或营养不足状态下,通过自噬降解、循环利用细胞内营养物质,促进肿瘤生长。抗血管生成治疗加重肿瘤内缺氧促进肿瘤细胞自噬,增强了肿瘤细胞存活能力从而对引起抗血管生成治疗的耐药。有研究[22]发现索拉菲尼能增加细胞自噬作用,因此其对胶质瘤的治疗效果并不确定,但联合使用索拉菲尼和自噬抑制剂氯喹(chloroquine)能显著抑制肿瘤的生长及延长胶质瘤模型小鼠的存活时间。因此,有学者指出应用自噬抑制剂有助于克服抗血管生成治疗耐药。

4 肿瘤基质细胞

肿瘤的基质细胞主要包括免疫细胞、成纤维细胞和周细胞等。周细胞分泌旁分泌生存因子刺激内皮细胞的分化及生存的信号通路,调节血管的稳定和成熟。肿瘤血管较高的周细胞覆盖率也是抗VEGF耐药的主要原因。然而有研究[23]发现,在肝细胞癌模型中,索拉菲尼敏感组及耐药组中肿瘤血管ɑSMA+周细胞覆盖率没有显著差异,不赞成血管成熟度增加是抗血管生成治疗耐药机制之一。TAF可通过产生PDGF-C增加周细胞覆盖率,并促进内皮细胞迁移和血管形成,而不依赖VEGF通路;此外,TAF产生的DDAH2可以刺激e NOS表达,增加NO的产生,从而促进血管内皮细胞增殖、转移及血管形成,抑制DDAH2活性可能成为一个有前景的治疗策略[24]。另外,肿瘤乏氧微环境能招募许多肿瘤相关的免疫抑制细胞、炎性细胞,如MDSCs、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)到肿瘤微环境中,分泌IL-10、IL-16、TGF-、VEGF等,调控肿瘤血管形成的同时进一步招募髓源性抑制细胞(MDSCs)到微环境中,导致肿瘤免疫逃逸并调控血管生成,促进肿瘤的生长和转移[25]。Shojaei F等[26]发现抗VEGF耐药产生与CD11b+Gr1+髓细胞在肿瘤组织的浸润有关。上调CD11b+Gr1+髓细胞中Bv8表达水平能增加髓细胞在肿瘤组织中浸润,并促进血管形成,同时阻断VEGF和Bv8产生的肿瘤抑制效果比单独使用VEGF抑制剂更显著[27]。

5 血管生成方式多样性

5.1 血管共选择

血管共选择即肿瘤依靠周围已存在的血管生长,而不启动新生血管形成。Kuczynski等[23]研究发现,在肝细胞癌模型中,索拉菲尼耐药组中血管共选择占所有肿瘤血管比例达到(75.0%±10.3%),且研究中发现索拉菲尼耐药组中Vimentin、ZEB1、ZEB2等促EMT转录因子的表达水平显著上调,因此认为血管共选择可能与EMT相关。另外,Ang-2在肿瘤血管共选择中起重要作用,同时靶向VEGF和Ang控制肿瘤生长效果较单独靶向VEGF更明显[28]。抗血管生成治疗的原理是针对肿瘤新生血管,而血管共选择并不存在新生血管的形成,因此这部分肿瘤会产生耐药。

5.2 血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)

Zhou等[29]检测67例宫颈鳞状细胞癌组织发现VM和HIF-1ɑ的阳性率分别是38.81%和64.18%,且两者的表达呈正相关(r=0.339,P<0.05),推测肿瘤乏氧微环境中高表达的HIF-1α能促进VM的形成。目前,缺氧在肝细胞癌、尤文氏肉瘤、黑色素瘤中被证明能诱导VM形成,且与MEK/ERK信号通相关[30]。VM是肿瘤细胞分化为血管内皮样细胞并沿着管道壁排列形成的管道状结构,为肿瘤组织提高营养物质,VM的存在一定程度上解释了抗血管生成耐药的原因。

6 小结

在过去的几十年中,抗血管生成药物已被证明能够暂时提高一些实体肿瘤患者的PFS,但不可避免的耐药现象限制了抗癌疗效,而耐药机制并不十分明确,其中肿瘤微环境在促进肿瘤发生、生长、转移及肿瘤耐药中起重要作用;肿瘤微环境中各种细胞及细胞因子通过不同的通路及机制参与抗血管生成耐药,但具体机制研究尚不深入,需进一步探索抗血管生成治疗后肿瘤微环境的变化,寻找抗血管治疗的新靶点,提高抗血管生成治疗的临床效果,从而改善肿瘤患者的PFS、OS,减少耐药的发生。

摘要：血管生成对肿瘤的发生、发展及转移起重要作用,抗血管生成治疗成为肿瘤治疗的新靶点,然而抗血管生成治疗存在耐药现象,且在临床中的益处都是短暂的,通常会迅速地出现肿瘤的生长、进展和转移,这与肿瘤微环境的变化密切相关。目前,耐药机制尚未明确,本文主要从其他促血管生成因子或通道、缺氧微环境、细胞自噬、肿瘤基质细胞及其他血管生成方式等方面简述了肿瘤微环境介导抗血管生成治疗耐药的分子机制,以期发现肿瘤血管生成的新靶点,改善抗血管生成治疗的临床效果。

肿瘤微环境的调控 篇5

程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)及其配体程序性死亡配体-1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是近年研究比较透彻的免疫检查点分子。PD-1是T细胞表面重要的抑制分子,其配体为PD-L1和PD-L2。PD-1的胞浆结构域包含了免疫受体酪氨酸抑制基序及免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptoe tyrosine-based swith motif,ITSM),PD-1与PD-L1相结合后通过ITSM募集含有酪氨酸磷酸酶的SH2结构域抑制TCR信号,从而传递负性信号[2]。激活的T细胞一过性表达PD-1,而PD-1持续性表达则与T细胞耗竭及无能相关[3]。肿瘤细胞可固有或诱导性表达PD-L1,其与肿瘤浸润T淋巴细胞(tumour-infiltrating lymphocytes,TILs)表达的PD-1相互作用从而发挥重要的负性调控作用,是肿瘤免疫逃逸的主要原因之一[4]。迄今已在多种肿瘤中发现癌细胞表达PD-L1与预后不良相关。2012年新英格兰医学杂志报道了抗PD-L1、PD-1抗体在晚期肿瘤患者中获得了持久的肿瘤消退及疾病稳定期,这两个里程碑式的临床试验使肿瘤免疫治疗进入了一个新时代[5,6]。不断累积的研究结果还提示:肿瘤细胞表达PD-L1及增加的TIL密度可能是抗PD-1/PD-L1免疫治疗有效的预测因素[7]。因此明确肿瘤组织TIL密度及PD-L1表达既有助于了解肿瘤微环境的免疫状况、评估预后,此外可作为生物标记物筛选适宜的患者行免疫治疗。本研究检测了116例卵巢浆液性腺癌患者的肿瘤组织CD8+TILs密度及PD-L1的表达情况,并分析了CD8+TILs密度及癌细胞PD-L1表达水平与患者预后的关系,希望为卵巢浆液性腺癌患者行肿瘤免疫分型、合理实施抗PD-1/PD-L1免疫治疗提供基本的信息。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2004年7月至2010年12月于上海交通大学医学院附属仁济医院行肿瘤细胞减灭术的116例卵巢浆液性腺癌患者组织标本,每例患者临床病理、手术及随访资料完整。患者年龄30~81岁,平均年龄58岁;FIGOⅠ、Ⅱ期患者34例,FIGOⅢ、Ⅳ期患者82例。所有卵巢浆液性腺癌患者均为初发,术前未行新辅助化疗。每例卵巢癌标本行CD8+TIL密度及PD-L1检测。

1.2 主要试剂

山羊抗人PD-L1多克隆抗体、小鼠抗人CD8单克隆抗体及小鼠Ig G1同型对照均购自英国Abcam公司,山羊Ig G同型对照抗体购自美国Gene Tex公司,免疫组织化学二抗试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司,其他试剂及仪器由中心实验室提供。

1.3 实验方法

采用免疫组织化学PV二步法。标本蜡块制备成4μm连续切片,经脱蜡和水化后,滴加3%过氧化氢溶液室温作用10分钟,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍,每遍5分钟,置于p H 6.0柠檬酸盐缓冲液中微波加热20分钟进行抗原修复,自然冷却至室温,PBS冲洗3遍,每遍5分钟,滴加一抗,即山羊抗人PD-L1多克隆抗体(抗体终浓度4μg/ml)或小鼠抗人CD8单克隆抗体(1∶50)或同型对照抗体,4℃孵育过夜,PBS冲洗3遍,每遍5分钟,使用相应的二抗试剂盒,每张切片滴加二抗50分钟,室温下DAB避光显色,在光学显微镜下控制显色时间,3~5分钟后蒸馏水冲洗终止显色。苏木精复染1分钟,自来水冲洗返蓝,梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封片。研究中使用人胎盘组织作为PD-L1表达的阳性对照。

1.4 结果判定标准

免疫组化切片均由2名资深病理科医师双盲独立观察评估。PD-L1以细胞质或细胞膜出现黄至棕褐色颗粒为阳性显色。PD-L1表达采用半定量积分法,结合染色强度和阳性细胞百分比来评定阳性表达病例。因PD-L1在胎盘组织固有表达,以胎盘组织作为阳性对照,染色强度计分:0分为不染色;1分为弱染色;2分为中度染色但弱于阳性对照;3分为染色强度等同或强于阳性对照。先在低倍镜下观察整张切片,将肿瘤组织分成2个区域:癌巢和间质。于癌巢区随机选择5个高倍视野(400×),以着色肿瘤细胞占视野中肿瘤细胞的百分比进行观察评分:阳性细胞率<5%为0分、≥5%~<25%为1分、≥25%~<50%为2分、≥50%~<75%为3分、≥75%为4分。两项相乘后5个视野求算数平均数得到最后的评分:0~<2分为阴性表达;≥2~<4分为弱阳性;≥4~<8分为中度阳性;≥8~12分为强阳性。低表达组:阴性+弱阳性;高表达组:中度阳性+强阳性。

此外,通过计数胞膜上有CD8阳性染色的淋巴细胞个数检测CD8+TILs的浸润情况。先在低倍镜下观察整张切片,分别在癌巢及间质区选取CD8阳性细胞丰富的3个高倍视野(400×)计数阳性细胞,并求平均值。以癌巢内CD8+TILs的中位数作为临界(cut-off)值,≤中位数为CD8+TILs低密度组,>中位数为CD8+TILs高密度组。基于癌巢中CD8+TILs数量与癌细胞PD-L1表达水平的免疫分型分为4组:PD-L1高表达CD8+TILs高密度组、PD-L1高表达CD8+TILs低密度组、PD-L1低表达CD8+TILs高密度组、PD-L1低表达CD8+TILs低密度组,分析4组不同免疫分型患者的生存时间。

1.5 随访

采用查阅住院及门诊病历和电话联系的方式对116例浆液性卵巢癌患者进行随访,所有患者随访资料完整。生存时间计算按确诊至死亡时间或确诊至末次随访时间,按月计算。末次随访时间为2015年12月。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行分析。肿瘤细胞PD-L1表达水平与癌巢及间质CD8+TILs数目的关系采用Spearman相关性分析。以寿命表法计算116例浆液性卵巢癌患者的中位生存时间(OS)及5年生存率;采用乘积极限法(Kaplan-Meier)进行单因素生存分析,绘制生存曲线,对数秩检验(Log-Rank Test)进行生存曲线比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-L1蛋白在卵巢浆液性腺癌组织中的表达情况

PD-L1蛋白表达主要定位于卵巢浆液性腺癌细胞的细胞质和细胞膜。卵巢浆液性腺癌PD-L1高表达的比例为70.69%(82/116),在PD-L1高表达病例中癌细胞往往呈弥散性表达PD-L1(见图1),PD-L1局限性高表达于肿瘤侵袭区域的现象并不常见。

2.2 卵巢浆液性腺癌组织中CD8+TILs的数量

116例卵巢浆液性腺癌组织癌巢内CD8+TILs的中位数为7.5个/HPF(1~28个/HPF),间质内CD8+TILs的中位数为11.5个/HPF(2~30个/HPF)。图2显示癌巢及间质内CD8+TILs。

2.3 卵巢浆液性腺癌组织中CD8+TILs的数量与癌细胞PD-L1表达的相关性

采用Spearman相关性分析发现,癌细胞PD-L1高表达与癌巢内的CD8+TILs数目呈显著的负相关(r=-0.210,P=0.024),而与间质内的CD8+TILs数目无相关性(r=-0.147,P=0.117)。

2.4 基于癌巢中CD8+TILs数量与癌细胞PD-L1表达水平的免疫分型的构成比

以癌巢内CD8+TILs的中位数7.5个/HPF为临界值,PD-L1高表达CD8+TILs高密度组、PD-L1高表达CD8+TILs低密度组、PD-L1低表达CD8+TILs高密度组、PD-L1低表达CD8+TILs低密度组的标本分别为36例(31.03%)、46例(39.66%)、22例(18.97%)、12例(10.34%)。

2.5 基于癌巢CD8+TILs密度及癌细胞PD-L1表达水平的不同免疫分型患者的生存时间

116例浆液性卵巢癌患者的中位OS为47个月,5年生存率为39%。采用Kaplan-Meier进行基于癌巢CD8+TILs数量的单因素生存分析,癌巢CD8+TILs低密度组患者的中位OS为43个月,癌巢CD8+TILs高密度组患者的中位OS为64个月,对数秩检验对两组患者生存曲线进行比较,结果提示生存率曲线分布差异有统计学意义(P=0.001)。

Kaplan-Meier分析基于癌巢CD8+TILs数量及癌细胞PD-L1表达水平的不同免疫分型患者的生存时间,PD-L1低表达CD8+TILs高密度组患者的中位OS未得到,PD-L1高表达CD8+TILs高密度组、PD-L1高表达CD8+TILs低密度组、PD-L1低表达CD8+TILs低密度组患者的中位OS分别为53、42、51个月。对数秩检验对4组不同免疫分型患者生存曲线进行比较,结果提示PD-L1低表达CD8+TILs高密度组患者生存期最长,且4组生存率曲线分布差异有统计学意义(P=0.001),见图3。

3 讨论

3.1 卵巢浆液性腺癌肿瘤细胞PD-L1的表达

肿瘤细胞表达PD-L1及增加的TILs密度可能是抗PD-1或PD-L1免疫治疗有效的生物标记物,因此明确肿瘤组织PD-L1表达情况具有重要的临床意义[8]。然而令人遗憾的是,有关卵巢浆液性腺癌组织中PD-L1的表达情况及其与患者预后的关系却所知甚少。本研究首次检测了国内较大样本量的卵巢浆液性腺癌组织中PD-L1的表达,结果显示70.69%(82/116)的肿瘤组织中癌细胞高表达PD-L1。迄今除我们的研究外,另一项样本量较大的研究由日本学者Hamanishi等[9]报道,该团队检测了70例石蜡包埋的卵巢癌组织标本,结果发现75%(21/28)的卵巢浆液性腺癌、63.64%(14/22)的卵巢透明细胞癌、81.82%(9/11)的卵巢子宫内膜样腺癌、0(0/2)的卵巢黏液腺癌高表达PD-L1。两项研究中卵巢浆液性腺癌高表达PD-L1的比例较接近。

正常组织极少表达PD-L1,而多种癌细胞如肺癌、恶性脑瘤、黑色素瘤、胃癌及胰腺癌细胞高表达PD-L1,此外肿瘤微环境中的髓系细胞也可表达PD-L1[4]。什么机制促使癌细胞PD-L1表达上调呢?目前已知可能有2种方式,即固有表达及适应性免疫抵抗途径[10]。固有表达指肿瘤细胞的癌基因通路启动了PD-L1表达,这种情况下PD-L1往往在癌细胞呈弥漫性表达,如在脑胶质瘤中,PTEN基因缺失或沉默促进了癌细胞PD-L1表达上调[11]。癌细胞PD-L1表达上调的另一种机制是适应性免疫抵抗。具体而言,当T细胞识别肿瘤细胞特异性抗原时,来自TCR的信号可产生干扰素,与此同时T细胞上激活诱导的调节受体如PD-1的表达也被上调。干扰素可增强免疫应答,但又能诱导肿瘤细胞反应性高表达PD-L1,PD-L1使PD-1+T细胞耗竭和无能[3]。干扰素诱导的PD-L1表达有特征性表现,即PD-L1往往在肿瘤组织T细胞富集区,尤其肿瘤侵袭边缘局限表达或高表达[12]。

卵巢浆液性腺癌细胞PD-L1表达上调是固有表达还是适应性免疫抵抗?在我们的研究中,PD-L1高表达病例中卵巢浆液性腺癌细胞往往呈弥散性表达PD-L1,PD-L1局灶性高表达于肿瘤侵袭区域的现象并不常见;此外,癌细胞PD-L1表达水平与间质内的CD8+TILs数目无显著相关性,且与癌巢内的CD8+TILs数目呈现显著的负相关,而非局灶性共表达,上述研究结果提示,卵巢浆液性腺癌细胞PD-L1为固有表达的可能性较大,而驱动PD-L1表达上调的癌基因信号通路有待进一步研究。

3.2 卵巢浆液性腺癌组织局部免疫微环境状态与预后

T细胞是机体抗肿瘤免疫的核心执行者。对186例晚期卵巢癌冰冻切片的分析显示:癌巢内存在CD3+TILs的患者5年存活率为38%,而癌巢内缺乏CD3+TILs的患者5年存活率仅为4.5%。癌巢内T细胞是PFS及OS延长的独立预后因素[13]。Sato等[14]的研究进一步发现,上皮性卵巢癌癌巢内CD8+TILs高密度者较低密度者OS显著延长(55月vs 26月)。本研究中癌巢CD8+TILs低密度组患者的中位OS(43月)低于高密度组(64月),差异有统计学意义(P<0.05),说明高密度组患者生存期较长,且基于癌巢CD8+TILs数量及癌细胞PD-L1表达水平的不同免疫分型患者的生存时间分析显示,癌细胞PD-L1低表达癌巢CD8+TILs高密度组患者的预后较好。

目前临床上判断卵巢癌进展程度及预后的最常用指标是FIGO分期,但由于这种分期系统仅以肿瘤组织本身的特征来划分,没有考虑患者整体免疫状况,更没有分析肿瘤病灶组织的免疫特性,故对于术后肿瘤患者的生存预后尚不能提供很好的预测效果,即同样FIGO分期的卵巢癌患者可能预后迥异,因此急需在FIGO分期之外引入肿瘤分子分型、免疫评分等指标来评估预后。现已有一个国际机构开始在常规的临床工作中验证和推广免疫评分,其结果可能将使免疫评分整合到目前的肿瘤分期系统,即TNM-I(TNM-Immune)[15]。鉴于PD-L1及癌巢中CD8+TILs密度在卵巢浆液性腺癌微环境的重要作用,我们建议卵巢浆液性腺癌患者常规检测肿瘤细胞PD-L1表达水平及癌巢中CD8+TILs密度,这将为判断患者预后提供重要信息。

3.3 基于卵巢浆液性腺癌肿瘤组织免疫分型选择免疫治疗方法的选择策略

近来有学者提出基于T细胞浸润及PD-L1表达水平不同的肿瘤免疫分型学说[16]。Ⅰ型为肿瘤组织PD-L1+TILs+(即PD-L1高表达CD8+TILs高密度)提示肿瘤组织内一度存在活跃的抗肿瘤免疫应答,但之后因癌细胞产生适应性免疫抵抗而阻断了免疫应答;Ⅱ型为PD-L1-TILs-,提示为免疫忽略;Ⅲ型为PD-L1+TILs-,提示PD-L1为固有表达;Ⅳ型为PD-L1-TILs+,提示可能存在其他途径诱导了免疫耐受。基因突变、癌驱动基因及组织起源的不同,使得不同肿瘤的免疫分型构成比不同。对于Ⅰ型肿瘤,抗PD-1及PD-L1抗体治疗最有可能获得满意的疗效;对于肿瘤组织内缺乏T细胞的Ⅱ型及Ⅲ型肿瘤,必须采用联合的免疫治疗策略,如CTLA-4抗体联合PD-1及PD-L1抗体治疗。

根据以上肿瘤免疫分型学说,本研究中卵巢浆液性腺癌组织PD-L1高表达CD8+TILs高密度(免疫分型Ⅰ型)、PD-L1高表达CD8+TILs低密度(免疫分型Ⅲ型)、PD-L1低表达CD8+TILs高密度(免疫分型Ⅳ型)、PD-L1低表达CD8+TILs低密度(免疫分型Ⅱ型)的标本分别为36例(31.03%)、46例(39.66%)、22例(18.97%)、12例(10.34%)。尽管卵巢浆液性腺癌细胞PD-L1高表达的主要原因可能为癌基因信号通路激活的固有表达,但PD-L1高表达CD8+TILs高密度(Ⅰ型)患者仍然最有可能对抗PD-1/PD-L1免疫治疗产生疗效。本研究中Ⅰ型患者占比为31.03%,这部分人群最有望从抗PD-1/PD-L1免疫治疗得到获益。迄今已报道的抗PD-L1/PD-L1免疫治疗卵巢癌的临床试验为数尚不多。Hamanishi等[17]的研究中20位铂耐药卵巢癌患者给予PD-1单抗nivolumab,总的客观有效率为15%,其中2例患者获得长期的完全缓解,中位PFS为3.5个月,中位OS为20个月。在Keynote-028临床试验中,26个晚期卵巢癌患者纳入研究并给予PD-1单抗Pembrolizumab,其中51%患者癌细胞PD-L1表达阳性,客观有效率为11.5%,1位患者完全缓解,2位部分缓解,6位患者疾病稳定[18]。在PD-L1单抗的多中心临床试验中,17位患者为卵巢癌,其中1例获得部分缓解,3例疾病稳定[6]。基于抗PD-L1/PD-L1免疫治疗卵巢癌的临床试验结果,总的客观有效率并不十分理想,一部分原因可能为未根据肿瘤组织免疫分型入选患者。特异性募集免疫分型为Ⅰ型的卵巢癌患者行抗PD-1/PD-L1免疫治疗有望进一步提高疗效。

综上所述,卵巢浆液性腺癌肿瘤微环境免疫分型与患者预后密切相关,癌巢CD8+TILs高密度组患者的中位OS显著高于低密度组患者;癌细胞PD-L1低表达癌巢CD8+TILs高密度组患者的预后较好。重视卵巢癌肿瘤微环境的免疫分型有助于评估患者预后及募集合适患者实施抗PD-1/PD-L1免疫治疗。近年来免疫治疗日益成为恶性肿瘤的重要治疗手段,期待有更深入的基础研究和大规模临床试验探索抗PD-1/PD-L1免疫治疗在卵巢癌综合治疗中的价值。

摘要：目的:研究卵巢浆液性腺癌肿瘤微环境中CD8~+肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)密度及癌细胞程序性死亡配体-1(PD-L1)的表达情况与临床意义。方法:收集2004年7月至2010年12月于上海交通大学医学院附属仁济医院行肿瘤细胞减灭术的116例卵巢浆液性腺癌患者组织标本,免疫组化检测肿瘤组织CD8~+TILs密度及癌细胞PD-L1表达情况;Spearman相关性分析癌细胞PD-L1表达水平与癌巢及间质CD8~+TILs数目的关系;采用乘积极限法进行基于癌巢CD8~+TILs密度及肿瘤细胞PD-L1表达的单因素生存分析。结果:卵巢浆液性腺癌PD-L1高表达的比例为70.69%(82/116)。癌细胞PD-L1表达强度与癌巢内的CD8~+TILs数目呈显著负相关(P=0.024),而与间质内的CD8~+TILs数目无相关性(P=0.117)。癌巢CD8~+TILs高密度组患者的中位生存时间(64月)显著高于低密度组(43月),差异有统计学意义(P<0.05);乘积极限法的亚组分析显示肿瘤微环境中癌细胞PD-L1低表达癌巢CD8~+TILs高密度组患者的预后较好。结论:卵巢浆液性腺癌肿瘤微环境中癌巢CD8~+TILs密度及癌细胞PD-L1表达水平与患者预后密切相关,重视肿瘤微环境的免疫分型有助于评估患者预后及筛选合适患者实施抗PD-1/PD-L1免疫治疗。