微生物絮凝剂产生菌

微生物絮凝剂产生菌（精选七篇）

微生物絮凝剂产生菌 篇1

笔者根据已有的研究成果和结论，针对性地从活性污泥中筛选、分离和培养能够用于实际生产的高效微生物絮凝剂产生菌，并对其培养条件进行初步研究，以期为后期的深入研究和规模化生产提供有益的基础数据。

一、材料与方法

㈠材料

第一，菌种。菌种分离原料为甘肃省兰州市某污水处理厂驯化成熟的活性污泥。

第二，试剂。琼脂粉、酵母膏、蛋白胨、80目过筛高岭土，其它试剂均为分析纯试剂。

第三，仪器。恒温冷冻摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、高速离心机、日立UV-1800紫外可见分光光度计、超声波细胞破碎仪。

第四，培养基。分离培养基位牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌，g/L)：牛肉膏3、蛋白陈20、NaCl 5.0、琼脂18、水1000mL, p H=7.2～7.4。发酵培养基为(GC液体培养基，g/L)：葡萄糖20、KH2PO42、K2HPO45、NaCl 0.l、 (NH4) 2SO40.2、尿素0.5、酵母膏0.5、水1000 mL, pH=8.0。以上培养基均在121℃灭菌20min备用。

㈡方法

第一，筛选基本流程。样品采集及预处理→增殖培养→选择培养(可重复多次)→菌株分离(平板涂布或划线分离)→菌落选取→初筛→菌株纯化→传代培养→复筛→絮凝剂产生菌。

第二，微生物絮凝菌的筛选方法。将一定量的活性污泥用无菌水稀释并进行富集培养，然后将富集菌液稀释10-5倍、10-6倍、10-7倍，在固体琼脂平板上涂布，待充分生长后挑取单菌落再次接种于平板培养基纯化，然后挑取单菌落分别接种于液体培养基中进行液态发酵。发酵温度30℃，摇床转速为120r/min，发酵时间72h。发酵完成后取发酵液测其絮凝活性，将具有良好絮凝活性的菌株作为复筛菌种。重复上述步骤，纯化后再进行发酵测定絮凝活性。

第三，絮凝剂产生菌培养条件的优化。采用单因素实验, 以发酵培养基的组成为基础，分别改变培养基中碳源种类、氮源种类、磷酸盐种类、无机盐种类、初始pH值、接种量、碳氮比、温度和磷酸盐种类及含量等条件, 测定发酵液的絮凝率，以获得最适宜的培养基组成。

第四，絮凝率(RF)测定方法[5]。在100mL量筒内加入0.4g高岭土，80mL蒸馏水、5mL1%CaCl2、2mL菌液上清液，混合，加蒸馏水至100mL，调pH值至7.0，摇匀，静置10min，在550nm下测定上清液的OD值，以加2mL蒸馏水的高岭土悬浊液作对照。数据均为三次平行测定的平均值。

絮凝率(用RF表示)计算公式为：

式中A为空白上清液的OD550值，B为样品上清液的OD550值。

二、结果与分析

㈠菌种分离结果

经初筛和复筛，从活性污泥中筛选得到6株菌种，其中3株絮凝率保持在80%以上的为出发菌株。本文以其中一株生长能力强、絮凝活性较高的M08号菌种为研究对象。

㈡不同碳源对菌体产絮凝剂的影响

将初始发酵培养基的葡萄糖用等量的其他碳源代替，分别以糊精、甘油、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖作为培养基的碳源，接种后调pH=8.0，置于120r/min、30℃下振荡培养72h后测定絮凝率。实验结果如图1所示。

由图1可以看出，不同碳源对M08菌株产絮凝剂的影响不同，糊精是该菌产絮凝剂的良好碳源，絮凝率可达93.2%，絮凝效果最好。分析认为，作为高分子物质，培养基中未利用完全的糊精可能也参与了絮凝过程，造成具有较高的絮凝率。以甘油和麦芽糖为碳源时的絮凝率均达到93%，与糊精的相差不大。而以蔗糖为碳源时则絮凝率较低。因此，从成本和絮凝效果分析，甘油为该菌产絮凝剂的最佳碳源。

㈢不同氮源对菌体产絮凝剂的影响

将同样的250 m L三角瓶装100 mL发酵培养液，在其他培养条件不变的情况下，将发酵培养液中的氮源分别用过硫酸铵、硫酸铵、硝酸钙、硝酸钠、蛋白胨、脲代替，接种后调pH8.0，置于120r/min、30℃下振荡培养72h后测定絮凝率，实验结果如图2所示。由图2可以看出，酵母膏为该菌株产絮凝剂的最佳氮源，絮凝率可达到91.2%。

㈣不同磷酸盐对菌体产絮凝剂的影响

磷酸盐是微生物生长所必需的成分，对微生物的生长、繁殖和代谢都有着非常重要的作用。改变发酵培养基中磷酸盐的种类和含量，置于120r/min、30℃下摇床培养72h后测定絮凝率，实验结果如图3所示。由图3可以看出，当在培养基中添加单一K2HPO4·3H2O的浓度为5g/L时，絮凝率达到最大值(97.4%)，效果优于复合磷酸盐。

注：10%、40%和70%分别代表占对照组(K2HPO4·3H2O5g/L+KH2PO42g/L)加入磷酸盐的百分数，K2HPO4代表K2HPO4·3H2O 5g/L, KH2PO4代表KH2PO42g/L。

㈤不同无机盐对菌体产絮凝剂的影响

改变发酵培养基中的无机盐, 分别以KH2PO4、K2HPO4、CH3COONa、CaCl2、NaCl、MgSO4、MnCO3代替，接种后，置于120r/min、30℃下摇床培养72h后测定絮凝率，实验结果如图4所示。由图4可以看出，无机盐阳离子对絮凝活性有不同的作用，添加无机盐的均比对照组具有较高的絮凝活性，差异性显著(P<0.05)。其中加入KH2PO4和K2HPO4时的絮凝活性均较高，絮凝率分别为93.3%和89.2%。分析认为，这主要和这两种磷酸盐同时能提供磷源、钾离子，并能对培养基pH值起缓冲作用有关。

(1:KH2PO4;2:K2HPO4;3:CH3COONa;4:CaCl2;5:NaCl;6:MgSO4;7:MnCO3)

㈥不同碳氮比对菌体产絮凝剂的影响

碳氮比也是影响絮凝剂产生的一个重要因素。合适的碳氮比可以使微生物按比例均匀的吸收营养物，不仅可以供给菌体大量繁殖，而且可以得到大量积累的代谢产物。实验中保持发酵培养基中葡萄糖的浓度不变，改变尿素浓度，使碳氮比分别为15、30和45，接种后，置于120r/min, 30℃下摇床培养72h后测定絮凝率。实验结果如图5所示。由图5可以看出，以碳氮比为15时，絮凝活性较高，且随着碳氮比的提高，絮凝活性不断下降。当碳氮比为15、葡萄糖为10g/L时絮凝率为最大(92.8%)。从图5中也可以看出，在贫营养条件低下，即低浓度的碳源和氮源时，絮凝率相对较高，说明在贫营养条件有利于絮凝剂的分泌代谢。

㈦不同起始pH值对菌体产絮凝剂的影响

将起始发酵培养液的pH值分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，接种后置于120r/min、30℃下摇床培养72h后测定絮凝率。实验结果如图6所示。

p H值对微生物的生长和代谢具有很大的影响。一方面，pH过高或过低都会引起微生物表面电荷的改变，从而不利于细胞对营养物质的吸收;另一方面，pH过高或过低会使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化，从而影响其生物活性。由图6可以看出，pH在6.0～8.0的范围之间，都有较高的絮凝活性，最佳pH在7.0左右，此时絮凝率达到88.12%。

㈧不同接种量对菌体产絮凝剂的影响

在发酵培养基中分别以1%、2%、3%、4%、5%、6%的接种量接入种子液，经摇床培养72h后，分别测定各组培养液的絮凝活性，实验结果如图7所示。由图7可以看出，接种量为3%时，絮凝率较高为86.4%，之后随着接种量的增大，絮凝率降低。因此，接种量也是影响M08产絮凝剂的一个因素。由于接种量过大，培养液中细菌的初始浓度高，生长初期细菌生长繁殖则会消耗大量的营养物质，导致絮凝剂的产量下降;而接种量过小，培养液中的细菌浓度低，使得培养周期延长。

㈨不同温度对菌体产絮凝剂的影响

分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃对该菌株进行培养，测絮凝效果，实验结果如图8所示。由图8可以看出，温度对微生物絮凝剂产生有明显的影响，在30℃左右是絮凝率达到最大达90.3%。温度过低，细胞本身生长受到抑制，酶促反应速度较慢，影响絮凝剂的产生。培养温度在35℃以上时，絮凝率逐渐下降，说明絮凝剂的代谢大幅度降低。

㈩M08菌絮凝剂活性分布

分别测定发酵液、发酵液经离心和细胞破碎处理去除菌细胞后的上清液、菌体悬浮液、细胞破碎上清液、细胞破碎悬浮液对高岭土悬浮液的絮凝效果，实验结果如图9所示。由图9可以看出，离心去除菌体上清液和不除菌体发酵液的絮凝活性较高，分别为89.6%和88%。而另外三种溶液的絮凝活性都较低，说明絮凝物质主要存在于发酵液中，是由微生物在发酵过程中产生并分泌到胞外。但同时可以看出，菌悬液也具有较好的絮凝活性(63.8%)。

(1：发酵液上清;2：发酵液;3：菌悬液;4：细胞破碎液上清;5：细胞破碎悬液)

三、结论

通过研究得出以下主要结果：一是经初筛和复筛，从活性泥中筛选得到具有较高絮凝活性的菌株M08。二是经单因素实验得出M08菌株对高岭土悬浊液的最佳絮凝条件为碳源为甘油、氮源为酵母膏、磷酸盐为K2HPO4·3H2O (5g/L) 、C/N比为15、葡萄糖为10g/L、pH值为6、接种量为3%(v/v)、培养温度为30℃、120r/min摇床培养72h后其发酵液对高岭土悬浊液的絮凝率高于90%。三是M08菌株的絮凝活性物主要分布在发酵液经离心后的上清液中，说明絮凝活性物质主要为分泌到胞外的代谢产物，同时菌体细胞也具有较高的絮凝活性。实验结果表明，该菌具有生产微生物絮凝剂的潜力。对M08菌株所产絮凝剂的提取、纯化和特性分析，及其絮凝机理研究工作正在进行中。

摘要：从活性污泥中分离得到6株产絮凝剂的菌株, 经复筛, 有3株絮凝活性保持在80%以上。研究了其中一株生长能力强、絮凝活性高的M08菌株的絮凝特性, 该菌种产絮凝剂的最佳条件为碳源为甘油、氮源为酵母膏、磷酸盐为K2HPO4·3H2O (5g/L) 、C/N比为15、起始pH值为6、接种量为3% (v/v) 、发酵温度为30℃。在此条件下以120r/min摇床培养72h, 其发酵液对高岭土悬浊液的絮凝率高于90%。活性分布表明, 该菌的絮凝有效成分主要为分泌到胞外的代谢产物。

关键词：微生物絮凝剂,筛选,培养条件,絮凝特性

参考文献

[1]宫小燕, 王竟, 周集体.絮凝剂产生菌的筛选及培养条件的优化[J].环境科学研究, 1999, ⑷.

[2]黄民生, 孙萍, 朱莉.微生物絮凝剂的研制及其絮凝条件[J].环境科学, 2000, [1].

[3]周礼, 张永奎, 陈晓, 等.一种高效微生物絮凝剂产生菌的筛选及培养基优化[J].环境科学学报, 2006, ⑷.

[4]胡勇有, 高健.微生物絮凝剂的研究与应用进展[J].环境科学进展, 1999, ⑷.

微生物絮凝剂产生菌的研究进展 篇2

微生物絮凝剂是一类新型絮凝剂.絮凝剂产生菌作为微生物絮凝剂的`一个科研重点已经得到广泛的研究.本文主要总结了微生物絮凝剂产生菌的一些研究进展,重点对絮凝剂产生菌的种类、筛选、培养条件、生物学机理等进行了阐述.此外还介绍了国内外几个新的研究方向,并就以后的研究趋势作了展望.

作 者：李旭 李小明 杨麒 赵志宏 曾光明 LI Xu LI Xiao-ming YANG Qi ZHAO Zhi-hong ZENG Guang-ming  作者单位：湖南大学环境科学与工程学院,湖南,长沙,410082 刊 名：生物技术  PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 16(2) 分类号：X703.5 Q935 关键词：微生物絮凝剂   絮凝剂产生菌   研究进展   培养条件   絮凝基因   代谢机理  

★ 虫草发酵培养基研究

★ 微生物菌剂强化处理炼油废水的中试研究

★ 复合型微生物絮凝剂与化学絮凝剂的复配及其应用

★ 海洋低温BS070623菌株选育及其发酵培养基优化(Ⅰ)

★ 广谱碳源产油酵母菌的筛选及培养基优化

★ 生物絮凝剂处理制革废水的试验研究

★ 环境微生物群落分析的T-RFLP技术及其优化措施

★ 我国农村金融结构优化问题研究

★ 微生物研究技术与方法课的设置与改革初探

微生物絮凝剂产生菌 篇3

本文首先从采集的土壤、活性污泥、河泥中筛选出1株具有较高絮凝活性的微生物絮凝剂产生菌, 通过单因素法考察pH值、培养时间、温度、摇床转速对其絮凝活性的影响, 进一步优化其培养条件, 提高其絮凝活性, 降低其应用成本, 从而使生物絮凝剂能更广泛地应用于污水处理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

由以下来源的样品筛选分离:公园的土壤 (命名为BJ) (弃去浮土, 采集距地面7～10cm左右的湿土) ;污水处理厂二沉池的活性污泥 (命名为RF) 和排放生活污水的护城河的河泥 (命名为KY) 。

1.1.2 试剂

NaCl (AR) , 广东汕头市西陇化工厂;高岭土 (CP) 、牛肉膏 (BR) 、酵母粉 (BR) 、 K2HPO4 (AR) 、蛋白胨 (BR) 、糊精 (AR) 、MgSO4·7H2O (AR) , 国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器

电热恒温箱, 上海阳光实验仪器有限公司;7200型分光光度计, 上海精密科学仪器有限公司;台式空气恒温摇床 , 北方同正生物技术发展公司;TDZ4B低速台式离心机, 上海安亭科学仪器厂。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 富集液体培养基 (g·L-1) :

牛肉膏3, 蛋白胨10, NaCl 5, 水1L[6]。

1.1.4.2 分离及保存培养基 (g·L-1) :

牛肉膏3, 蛋白胨10, NaCl 5, 琼脂20, 水1L[6]。

1.1.4.3 发酵培养基 (g·L-1) :

糊精20, K2HPO4 5, MgSO4·7H2O 0.2, NaCl 0.1, 酵母粉2, 水1L[7]。

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离纯化

1.2.1.1 富集

分别称取样品10g, 放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中, 振摇至样品与水混匀。用移液管吸取5mL稀释液至盛有25mL富集培养基的三角瓶中。置于30℃、150r/min的摇床中培养12h。

1.2.1.2 初筛

利用梯度稀释涂布平板法。将制成的10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的稀释溶液依次编号, 置于恒温培养箱30℃、2d。待菌落长出后, 接种黏稠、饱满、有荚膜的菌株[8], pH 7.0左右, 30℃、150r/min摇床培养72h。将菌液在5 000r/min下离心10min, 取上清液测其对高岭土悬液的絮凝率。

1.2.1.3 复筛

将初筛絮凝率在50%以上的菌种用接种针按接种量10%点种于分离培养基中。待菌落长出后, 将菌株接种到装有30mL的发酵培养基的150mL摇瓶中, 在30℃、150r/min、pH 7.0条件下培养72h, 所得培养液在5 000r/min下离心10min, 取上清液进行絮凝实验。将菌落接入斜面, 培养3d, 4℃保藏备用。

1.2.2 MBF絮凝活性的检测与计算

考虑到检测的快速性及低成本性, 检测指标采用OD660值计算其絮凝活性[9]。在100mL烧杯中, 按顺序加入0.25g高岭土, 2.5mL 10g/L的CaCl2溶液, 1mL待测样品的上清液, 然后加蒸馏水至50mL, 摇匀后静置30min, 用7200型分光光度计, 测其上层清液在660nm处的光密度。同时以加入空白培养液的高岭土悬浮液作为对照。按照公式计算菌株絮凝率:絮凝率 (絮凝活性) = (A-B) /A×100%[10]。A=对照上层清液的光密度值;B=样品上层清液的光密度值。

1.2.3 生长曲线的测定

在150mL三角瓶中装30mL发酵液, 在30℃、150r/min、pH 7.0条件下摇床培养[11]。每12h取样, 测定菌种的絮凝率, 同时测定菌体量 (用7200分光光度计测定, 以660nmOD值表示) 。

1.2.4 絮凝剂产生菌培养条件测定

将复筛出的菌株进一步发酵培养, 对影响菌生长量及絮凝活性的培养条件加以测定。考察培养温度、初始pH值、摇床转速对其产絮能力的影响。

2 结果与分析

2.1 菌种的筛选

用梯度稀释法从湿地公园土壤、活性污泥、护城河的河泥筛选到絮凝剂产生菌, 挑选黏稠、光滑、饱满、细胞具有荚膜的菌落。

初筛得到96株菌, 逐一进行絮凝活性测定。图1可知, 28株菌絮凝率在50%以上。

将这28株菌进行实验测定, 分别得出不同来源筛选出的菌种的絮凝率, 见表1。

RF-32为活性污泥中筛选出的菌种;菌种BJ-11来源是湿地土壤;KY-01筛选自河泥。表1可知, 絮凝率最高的菌株为RF-32, 选其做进一步试验。

2.2 生长曲线的测定

在实验过程中, 为及时了解菌种在培养过程中的生长情况, 需定时测定菌体量 (以660nm处的光密度值OD表示) 及絮凝效果, 以便适时地控制培养条件, 获得最佳培养物。

图5可知, 该菌在培养过程中生长曲线与絮凝活性曲线基本呈平行关系。发酵液的絮凝率随菌生长量的增加同步升高, 在菌生长稳定期 (48h) 达到最高絮凝率。以后随着培养时间的增加, 菌体生长到达极限值后开始下降, 絮凝活性虽有下降, 但幅度较小, 并有逐渐趋于稳定的趋势。这表明RF-32可能具有稳定的产絮能力, 引起絮凝的活性物质可能是由微生物发酵过程中生物合成的[12]。通过生长曲线的测定, 判定RF-32产絮凝剂的最佳培养时间为48h。

2.3 培养条件的优化

2.3.1 培养温度对絮凝率的影响

在150r/min、pH7.0条件下研究培养温度在24℃～36℃时对菌的生长及产絮凝剂的影响情况, 结果如图6所示。

由图3可知, RF-32产絮凝剂的最佳温度范围为28℃～32℃。培养温度为30℃时, 絮凝率最高。高温培养时菌株生长快, 对菌生长有利, 但絮凝活性降低。由此可见, 温度过高不利于絮凝剂的积累。而温度过低则使菌株生长速度降低, 酶活性下降, 代谢产物积累时间延长, 不利于絮凝剂的产生。

2.3.2 培养初始pH对絮凝率的影响

发酵液起始pH分别设计为5.5、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。将RF-32接入发酵培养基, 在150r/min、30℃振荡培养48h后取样测定其絮凝率, 选取最佳初始pH值, 结果见表2。

由图4可知, 当初始pH值为7.0时, RF-32生长旺盛且其絮凝活性达到最高值, 对高岭土悬浊液的絮凝率为78.3%。当pH值为5.5时, 菌种絮凝效果极差。pH值超过7.0, 絮凝率逐渐下降, 菌种生长较缓。综上可知, RF-32适合在中性环境中生长, 过酸过碱都会影响其生长和絮凝剂的生产。

2.3.3 摇床转速对絮凝率的影响

RF-32在30℃、初始pH 7.0的条件下, 分别以80r/min、100r/min、120r/min、130r/min、150r/min、170r/min摇瓶培养48h, 比较不同转速下的絮凝活性, 结果见表3。

由图5可知, 转速在80r/min～120r/min时, 絮凝效果逐渐上升, 转速在120r/min～170r/min时絮凝效果逐渐下降。其中摇床速度在80r/min时, 絮凝效果最差, 可能由于转速低导致培养液中的菌体聚集成团, 不利于菌体利用培养液的营养物质。摇床速度过高也不利于RF-32产絮凝剂, 表明过大的通气量不利于RF-32菌种产絮凝剂。因此, RF-32产絮凝剂的最佳摇床转速为120r/min。

2.4 最优培养条件下的絮凝活性

选用发酵培养基, 对RF-32按照初始pH7.0、温度30℃、摇床转速120r/min的条件进行培养48h, 平行测定3次 (标号1、2、3) , 测定方法按照1.2.2, 实验结果见表2。

由此可见, 在最优培养条件下, 菌株RF-32具有较强的絮凝能力。

3 讨论

从湿地公园土壤、活性污泥、护城河的河泥中筛选出1株对高岭土悬浊液有较高絮凝活性的菌株RF-32, 并对其培养条件进行了优化。生长曲线的测定结果显示, 菌株的絮凝活性与菌株生长量呈同步增长趋势, 并在一段时间后达到一稳定值, 最大细胞生长量与最高絮凝活性的时间均在48 h左右, 这与Kurane Ryuichiro等人[15]的研究结果相吻合, 他们的研究表明, 后期是生产絮凝剂的理想时间, 在这个时期, 细胞不断增殖, 同时产生絮凝物质, 继续延长培养时间, 细胞开始衰退, 不再产生新的絮凝物质, 此外, 还有不少学者持相同观点[3,5,16]。通过单因素法, 分别考察了培养时间、培养温度、发酵液初始pH值及摇床转速等因素对微生物絮凝活性的影响。研究发现, 低温不利于菌株生长, 而高温又不利于絮凝剂的累积, 因此最适培养温度为30℃;发酵液初始pH值过低, 絮凝效果较差, 而初始pH值过高, 菌株生长速率减缓, 因此发酵液的最适初始pH值为7.0;在较低的摇床转速条件下, 菌株容易聚集成团, 不利于吸收营养物质, 导致生长迟缓, 而过高的摇床转速则不利于絮凝剂的积累, 因此最适的摇床转速为120r/min。

微生物絮凝剂产生菌 篇4

从沈阳市浑河河水底泥中筛选出一株高效稳定的微生物絮凝剂产生菌BS-5.考察了碳源、氮源、培养时间、培养温度、初始pH值、摇床转速等因素对BS-5所产絮凝剂的影响.结果表明,可溶性淀粉是其良好的`碳源,NaNO3位最佳氮源,最适宜培养时间为32 h,培养温度为30℃,初始pH值为6～7,摇床转速为150 r/min.在此条件下,对高岭土悬浮液的絮凝效率可高达97.5%.和其他微生物产生菌培养基相比较,BS-5培养基组成成分简单,价格低廉,培养时间短,可以减少生产时间和生产费用,可解决微生物絮凝剂生产成本较高的问题.

作 者：李亮 董怡华 胡筱敏 张永利 LI Liang DONG Yi-hua HU Xiao-min ZHANG Yong-li 作者单位：李亮,胡筱敏,张永利,LI Liang,HU Xiao-min,ZHANG Yong-li(东北大学环境工程系,沈阳,110004)

董怡华,DONG Yi-hua(东北大学环境工程系,沈阳,110004;沈阳大学环境工程系,沈阳,110016)

微生物絮凝剂产生菌 篇5

根据不同的废水水质开发具有针对性的高效微生物絮凝剂, 既能明显提高絮凝效果, 又可大大降低絮凝剂投入量, 从而降低处理成本。因此, 微生物絮凝剂产生菌的培养条件优化、絮凝菌的筛选及在工业废水处理上的应用等是国内外研究的热点。微生物絮凝剂是微生物二次代谢的产物, 因此, 影响微生物絮凝剂合成的培养条件就会对微生物絮凝剂产生影响, 如培养基成分、培养基初始pH值、温度等[8]。笔者从土壤中筛选出一株絮凝剂产生菌并对影响絮凝活性的条件进行了研究, 取得了良好的效果。考察了碳源、氮源、培养时间、温度、培养基pH值对絮凝效果的影响, 并开展了菌株絮凝剂成分的初步研究, 为絮凝剂的进一步开发利用打下了良好基础。

1 材料与方法

1.1 生物絮凝剂产生菌菌源

从气田废水污染的土壤中分离筛选出一株高效絮凝剂产生菌, 作者命名为B—27, 经菌种鉴定为芽孢杆菌属, 该菌株由本课题组保藏。同时, 该菌产生的絮凝剂命名为MBF—27[9]。

1.2 培养基

筛选培养基:牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、ddH2O 1000ml, 琼脂15g/pH=7.5。

絮凝剂培养基:NH4NO3 0.2g、酵母膏0.5g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 1g、MgSO4.7H2O 0.2g、FeSO4 0.01g, 稀释1/5倍的废水1000ml。

发酵培养基:葡萄糖 20g, KH2PO4 2g、K2HPO4 5g、 (NH4) 2SO4 0.2g、NaCl 0.1g、尿素0.5g、酵母膏0.5g, MgSO4·7H2O 0.2g, ddH2O 1000ml, pH=7.0。

1.3 高效微生物絮凝菌的筛选方法

对所采集样品进行混合后采用筛选培养基富集培养, 预处理后稀释、划线分离;用接种环将各单一菌株接种到发酵培养液里进行发酵培养, 温度设定为35℃, 摇床转速为160rpm, 经过72h培养后, 通过测定各培养液的絮凝率再进行初筛, 对初筛获得的菌株进行发酵培养, 将絮凝率较高且稳定性较好的菌株作为复筛菌种, 得到一株高效微生物絮凝菌, 命名为B—27, 其絮凝剂粗品命名为MBF—27。

1.4 絮凝率的测定

在200 ml的烧杯中加入100ml的蒸馏水、0. 4g的高岭土、2ml的去菌体的发酵液以及5ml质量分数1%的CaCl2溶液, 混合, 搅拌 (200 rpm快搅1min, 80 rpm慢搅3min) , 静置10 min, 测定其上清液在波长550 nm 处的吸光度。同时, 以蒸馏水作对照。以不加含絮凝剂的上清液作对照实验, 并用以下公式计算其絮凝率:絮凝率= (A-B) /A×100%。式中, A为对照上清液在550 nm处的吸光度, B为样品上清液在550 nm处的吸光度。

1.5 絮凝剂产生菌培养条件的优化

以发酵培养基为基础, 采用单因素实验方法, 分别改变培养基中碳源种类、氮源种类、pH值、温度及培养时间, 将所得到的发酵液对高岭土悬浊液进行絮凝实验, 用絮凝率的大小比较判断最佳产絮凝剂的条件。

1.6 絮凝剂处理气田废水

取一定量的气田废水于容器中, 加入1ml的CaCl2 (1%) , 快速搅拌1min, 分别加入废水体积为1%的生物絮凝剂发酵液、0.1%的 FeCl3和0.1%的PAM, 快速搅拌20—60S, 慢速搅拌140s, 静置10min, 测量废水的色度和COD浓度。

1.7 分析方法

废水COD浓度的测定按照国标法[10]测定, 色度测定按照光密度法测定, 苯酚—硫酸法分析含糖量[11], 考马斯亮蓝—G250法分析蛋白质[12]含量, 红外光谱分析絮凝剂特征基团。

2 结果与讨论

2.1 菌种筛选

经分离、纯化, 从活性污泥中共分离得到30个菌株, 经初筛试验得到有絮凝活性的菌株5株, 再经复筛和传代培养, 通过测定絮凝率得到1株具有高稳定性的絮凝活性微生物, 命名为MBF—27。

2.2 碳源种类对絮凝活性的影响

将初始发酵培养基的葡萄糖用等量的其他碳源代替, 分别以可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、D-果糖作为培养基的碳源, 调pH=7.0置于160 rpm, 35℃条件下培养, 培养后测定、计算絮凝率, 并确定最佳碳源, 实验结果见表1。

2.3 氮源种类对絮凝活性的影响

将初始发酵培养基的酵母膏分别以牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵、尿素作为培养基的氮源, 调pH=7.0置于160 rpm, 35℃条件下培养, 培养后测定其絮凝率, 并确定最佳氮源, 实验结果见表2。从絮凝活性看, 不同种类的氮源对该菌株的絮凝活性影响是不同的, 以酵母膏为氮源的培养基所得絮凝效果最好, 说明该产絮凝剂菌对有机氮源利用较好。

2.4 培养基pH对微生物絮凝剂产生的影响

将同样的250 ml三角瓶装100 ml灭菌发酵培养液, pH分别调至2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0, 接种后置于160 rpm, 35℃条件下培养, 培养后测定絮凝率, 实验结果见图1。pH在6.0—7.0范围之间产生的絮凝剂都有较高絮凝活性, 最佳pH值在7.0左右, 此时MBF—27的絮凝率可达93.8%。

pH值不仅影响微生物细胞的带电状态、氧化还原电位、生物对营养物质的吸收和酶反应, 还会影响到絮凝剂的带电状态和氧化还原电位。这两个方面的共同影响使pH成为絮凝剂合成的一个重要因素[14]。pH值过高或过低都不利于细菌的生长和絮凝剂的产生, 以及絮凝过程的进行。过低或过高的pH值都会引起微生物表面电荷的改变而影响酶蛋白的电离度, 改变酶的结构和功能, 不利于细胞对营养物质的吸收;其次过高或过低的pH值会使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化, 从而影响其生物活性[13,14]。从图1可看出, 培养基的pH过高比pH过低时更不利于絮凝剂的产生。

2.5 培养温度对微生物絮凝剂产生的影响

培养温度是影响微生物生长和存活的重要因素之一, 它对生物活体的影响表现在两个方面:一方面随着温度的上升, 细胞中的生物化学反应速率也加快, 生长速率加快;另一方面, 细胞机体的主要组成如蛋白质、核酸都对温度较敏感, 随着温度的增高可能会遭到不可逆的破坏。因此, 在一定的温度范围内微生物机体的生长繁殖和代谢活动随着温度的上升而增加, 温度上升到一定的程度就会对畸体产生不利影响, 细胞活性急骤下降甚至死亡, 也不利于絮凝剂的产生[8]。我们分别设定在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃对菌种MBF—27进行培养, 测定絮凝效果见图2。

从图2可见, 该絮凝剂菌对不同温度都有较高的适应能力, 而在35℃时产絮凝剂活性达到最高, 絮凝率达到92.9%。当温度超过35℃时, 絮凝活性有所降低, 这是因为过高的温度会导致蛋白质和核酸遭到不可逆的破坏, 从而对菌体的生长产生不利影响, 影响到生物絮凝剂的产生。因此, 适宜的温度有利于絮凝剂的合成、生物的新陈代谢速度快, 产物合成也快。

2.6 培养时间对微生物絮凝剂产生的影响

将灭菌后的发酵液接种MBF—27产生菌后, 每12h取样一次测定其发酵液的絮凝率, 结果见图3。从图3可见, 在整个培养过程中从初始到72h之间, 随培养时间的延长发酵液絮凝活性增高, 在72h达到最高。随着培养时间的延长, 发酵液的絮凝活性下降。培养基被消耗, 絮凝剂产生菌进入停滞期, 菌体衰老, 絮凝剂产生量减小, 絮凝效果不佳。

2.7 MBF—27成分分析和结构表征

MBF—27的UV扫描结果见图4, 说明MBF—27几乎不含蛋白质和核酸 (蛋白质在280 nm有吸收峰, 核酸在260 nm有吸收峰) , 因此可定性判断MBF—27的有效成分不是蛋白质或核酸。同时, 采用考马斯亮蓝法测定MBF—27中蛋白质的质量分数为2.07%, 这与UV扫描结果基本相符合, 蛋白质含量很低。通过苯酚—浓硫酸方法测定MBF—27中多糖的质量分数为76.98%, 因此说明MBF—27的有效成分不是蛋白质而是多糖。MBF—27提纯后红外光谱扫描结果见图5。图5为一个典型的多糖红外光谱图, 该红外光谱图在1000—1200cm-1处有吸收峰, 这是所有已知糖类的特征峰;3412cm-1为一宽峰, 可判断在结构中有大量-OH存在;2979cm-1处的小峰是C-H伸缩振动的结果;1645cm-1的强吸收峰是糖中C-H变形振动的结果;1391cm-1为-COOH振动的结果;1080cm-1处的吸收峰是糖环中的C-O伸缩振动的结果, 进一步说明絮凝剂主要成分为多糖类物质。

2.8 MBF—27处理气田废水的性能

取100ml的气田废水于烧杯中, 加入1ml的1%CaCl2, 快速搅拌1min, 分别加入1ml生物絮凝剂发酵液、0.1%的 FeCl3和0.1%PAM, 200rpm快速搅拌20—60s, 80rpm慢速搅拌140s, 静置10min, 分别测量废水色度和COD浓度, 结果见表3。当气田废水的COD为430.5mg/L时, 生物絮凝剂MBF—27对气田废水COD和色度去除率分别达60.77%和86.1%, 优于传统的絮凝剂聚乙烯丙胺 (PAM) 和氯化铁盐 (FeCl3) 。

3 结论

微生物絮凝剂产生菌 篇6

微生物絮凝剂属天然高分子絮凝剂, 其化学成分主要为多糖、蛋白质、糖蛋白、纤维素和DNA等[7,8], 具有高效的絮凝沉淀性能、安全无毒和易于生物降解、对环境无二次污染等优点[9,10], 因此在污水处理、食品、酿造、化工等领域具有巨大的应用前景。近年来微生物絮凝剂已引起国内外学者的关注并进行了广泛的研究[11,12,13,14]。

由于土壤中具有微生物所需要的一切营养和微生物生长繁殖与生命活动的各种条件, 使微生物广泛分布。据报道, 1000m3土壤中微生物含量高达500—700kg, 因此土壤可谓是人类最丰富的“菌种资源库"。鉴于此, 本研究从甘肃省天水麦积山植物园采集了5份土样进行试验, 并获得产高活性絮凝剂的芽孢杆菌TS-1, 拟通过正交设计试验从碳源、氮源、温度、培养基pH值、通气量及培养时间等来考察该微生物产絮凝剂的适宜条件, 为利用微生物生产环保型微生物絮凝剂提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试土样采自甘肃天水麦积山植物园, 菌种分离培养基为牛肉膏蛋白胨培养基和高氏I号培养基[15]。筛选浅层发酵培养基为:①葡萄糖20g、牛肉膏4g、蛋白胨10g、NaCl 5g、pH7.2—7.4;②可溶性淀粉30g、K2HPO4 5g、KH2PO4 2g、酵母膏4g、KNO3 1g、NaCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、pH 7.5—8.5。正交实验培养基为碳源20g、氮源10g (尿素5g、大豆 100g) , KH2PO4 2g、K2HPO4 2g、NaCl 0.5g、 (NH4) 2SO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、水1000 mL、pH 5.0—9.0, 将发酵液于4000r/min离心15min, 取上清液作为絮凝剂样品, 试验水样用高岭土制成4‰的悬浊液。

1.2 主要仪器和设备

724微机型可见分光光度计 (上海光学仪器厂) 、HVE-50全自动高压蒸汽灭菌锅 (日本Hiragama) 、恒温生化培养箱 (上海医疗器械一厂) 、超净工作台 (苏净集团安泰公司) 、LDHZ-600冷冻恒温振荡器 (江苏太仓市实验设备厂) 、GL-20G-II冷冻离心机 (上海安亭科学仪器厂) 。

1.3 菌种的分离与筛选

采用常规的稀释涂布和划线法, 经多次划线分离直至获得纯菌株, 并对其编号。筛选分初筛和复筛两个步骤进行。初筛用250mL的三角瓶盛60mL培养基, 将已编号的纯菌株接入其中, 160r/min, 30℃培养68h, 对所得培养液进行絮凝活性的初步检测[16];在100mL量筒中加入4‰的高岭土悬浊液, 再加入1mL培养液, 轻摇, 经目测能使高岭土悬浊液絮凝成大颗粒的有絮凝活性的菌株。复筛是将初筛获得的有絮凝活性的菌株接种到盛有100mL培养基的250mL三角瓶中, 180r/min, 30℃, 培养68h, 然后测定培养液的絮凝活性;在150mL的烧杯中加入93mL 4‰的高岭土悬浊液, 5mL 1% (wt%) CaCl2溶液和2mL絮凝剂样品, 用磁力搅拌器快搅2min, 慢搅3min, 静置5min, 用分光光度计在550nm处测其上清液的吸光度;以未接种的培养基作空白参照, 絮凝效果以絮凝效率为测试标准。絮凝率E的计算公式为[17]:E= (A-B) /A×100%。式中, A为空白上清液在550nm处的吸光度;B为处理后水样上清液在550nm处的吸光度。

1.4 优化培养条件

正交实验设计:碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水是构成微生物营养的六大要素。此外, 微生物的生命活动要求有适宜的外界条件, 如温度、pH值等因素。对好氧微生物而论, 通气量也是一个重要的影响因素。各种微生物在生长代谢过程中对六大要素的成分和量的需求是不一致的, 因此每种菌在不同的培养基条件下产生的絮凝剂也是不一样的[18]。而正交实验设计对从错综复杂的各因素间找出主要因素, 分析各因素对指标影响的规律, 寻求新规律的探索性试验和力求缩短试验周期等是一种行之有效的科学试验方法[19]。本文为了获得利用所选菌株生产较为优质的微生物絮凝剂所需的最优化条件, 设计了六因素五水平正交实验 (表1) , 取复筛经多次传代培养后仍具很高絮凝活性的菌株进行培养条件优化实验, 考察碳源、氮源、温度、培养基pH值、通气量及培养时间对该菌产絮凝剂能力的影响。

优化培养条件下的重复验证性实验:在最优化培养条件下做重复验证性实验, 同时还通过将发酵液于4000r/min离心15min, 取上清液, 用10倍体积的冷无水乙醇沉淀, 洗涤、干燥后称重, 讨论该条件下的絮凝剂粗产量。

2 结果和讨论

2.1 菌种的分离和筛选

从土样中共分离到14株具有絮凝性能的细菌, 经复筛后得到5株絮凝活性较高的絮凝剂产生菌, 但其中1株经多次传代培养后絮凝性状仍很稳定, 初步鉴定为芽孢杆菌, 标记为TS-1, 作为产絮凝剂菌株进行后续工作。

2.2 正交实验结果

通过对表2数据的分析可知, 影响该菌生物合成絮凝剂的主次因素顺序为C>B>E>A>F>D, 即温度、氮源、培养基初始pH值为影响该菌生物合成絮凝剂的重要因素, 碳源为稳健因素, 培养时间为调节因素, 通气量为次要因素;絮凝剂产生的最优组合为A2B1C4D4E2F2, 即乳糖2%、蛋白胨1%、KH2PO4 0.2%、K2HPO4 0.2%、NaCl 0.05%、 (NH4) 2SO4 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、pH 6.0、34℃、180r/min、培养40h为菌株TS-1生物合成高活性絮凝剂的最优化条件。该培养条件与已报道的诸多芽孢杆菌的培养条件均不相同[1,20,21,22,23], 因此可初步断定TS-1为芽孢杆菌属产絮凝剂菌株的新种。在最优化培养条件下做重复验证性实验, 实验结果见表 3。重复验证性实验结果表明, 在由计算得出的最优化条件下, 该菌生物合成絮凝剂的粗产量为0.937g/L、絮凝率为91.3%, 絮凝效果与16号试验基本相同。

在正交试验中, 4、6、12、16、21号实验分别用不同碳源对该菌进行培养, 菌体生长良好, 培养液浑浊且有不同程度的粘性, 说明这5种物质均可作为该菌生长的营养碳源, 同时也支持了碳源为菌株TS-1生物合成高活性絮凝剂的稳健因素这一计算结论。

实验还发现, 当以可溶性淀粉为碳源时, 培养液粘性最大, 用此培养液中的絮凝剂样品对高岭土悬浊液进行絮凝时形成的絮体比其他样品的大, 而且沉降时间最短。与此相比, 用其他几种碳源所生产的絮凝剂虽然也具有很好的絮凝作用, 但形成的絮体较小, 沉降时间比较长;以可溶性淀粉为碳源时, 絮凝剂粗产量为1.5g/L。又因为通气量为影响菌株TS-1生物合成絮凝剂的次要因素, 所以可考虑生产成本与产量, 在大量絮凝剂生产过程中可将正交试验中的16号进行改良 (相关工作将另文报道) 。

3 结论

微生物絮凝剂产生菌 篇7

目前,对新疆泽普油田微生物的研究尚属空白。本研究基于生理生化实验、排油圈法和溶血实验,采集泽普油田油井中的油水混合液和回注污水样进行生理生化性能检测、过富集培养和平板分离,筛选出生物表面活性剂产生菌,这将为原油的开采和运输提供又一种良好的驱油剂成为可能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原油采集

用无菌取样瓶采集油井中的油水混合液或回注的污水样。三种油都采于泽普油田化工厂。1#油是经油水分离排除的混合物,黏度近似水,黄褐色;2#油是处理过的废水和原油混合物,黏度较稠,褐色;3#油是未处理的废水和原油混合物,较稠,黑色(见表1)。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 细菌富集培养基(g/l):

(NH4)2SO4 1,KCl 0.11,NaCl 0.11,FeSO4 2.8×10-5,KH2PO4 0.34,K2HPO4 0.44,MgSO4 0.05,酵母膏0.05,微量元素溶液0.5ml,正烷烃2ml。28 ℃振荡培养3~5d。

1.1.2.2 酵母和霉菌富集培养基(g/l):

(NH4)2SO4 0.6, KH2PO4 0.3, Na2HPO4 0.2, MgSO4 0.08, FeSO4 0.001,CaCl2 0.01,酵母膏0.05,微量元素溶0.5ml,正烷烃4ml。微量元素溶液(g/l) ZnSO4 0.029,CaCl2 0.024,CuSO4 0.025, MgSO4 0.017。

1.1.2.3 血平板培养基(g/l):

牛肉膏0.3,蛋白胨1,酵母膏0.01,NaCl 0.5,琼脂1.8,羊血5。利用生物表面活性剂能够溶血的特性,将富集培养液用划线分离的方法接种于血平板上,28℃培养1~2d,挑选溶血的单菌落作进一步的研究。

1.1.2.4 斜面培养基(g/l):

蛋白胨1,葡萄糖2,酵母膏0.01,pH 5.6。从血平板上挑选的单菌落接于斜面培养基上,28℃培养1~2d。

1.1.2.5 发酵培养液(g/l):

牛肉膏3.0,蛋白胨10.0,NaCl

1.1.3 主要仪器设备:

振荡器、数码显微镜(华舜公司)、NDJ-1型黏度计(深圳市三诺电子仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 增菌培养:

将三种不同地方采集的原油在无菌条件下接种于细菌富集培养基和酵母和霉菌富集培养基中,28℃振荡培养3~5d。进行摇瓶油降解实验[2]。

1.2.2 菌种纯化:

将增菌培养的菌种接种于血平板上,28℃培养1~2d。

1.2.3 分离筛选:

在血平板上挑选出特殊菌落分别接种于斜面培养基和发酵培养液中。斜面培养基在恒温箱中培养1~2d。发酵培养液在摇床上振荡培养1~2d。

1.2.4 摇瓶培养:

将斜面培养的菌种接于摇瓶培养液中,28℃振荡培养3~5d(培养基为酵母液)。

1.2.5 形态学和生理生化特征分析:

简单染色后进行细胞形态的观察,同时进行革兰氏染色、需氧性、氧化酶、明胶液化、淀粉水解、硝酸盐还原、丙酸盐利用和葡萄糖发酵等生理生化特征的分析。

1.2.6 原油黏度的测定:

采用黏度计测定原油的黏度。选用相同的转子、转速分别测三种原油样,根据得出的偏转角度和系数求得黏度η(mP.s)。即:η=k·a(k-系数,a-偏转角度读数)。

1.2.7 检测分离筛选菌种产生的生物表面活性剂性能

1.2.7.2 溶血实验:利用基本培养基配制血平板接种,同时用新鲜羊血检测生物表面活性剂产生菌株的产生情况并镜检。以红细胞溶解与否判断生物表面活性剂的有无。

1.2.7.3 排油圈法:取一培养皿加水,水面上加2滴原油形成油膜,在油膜中心加摇瓶发酵液,中心油膜被挤向四周形成一圆圈,圆圈直径与表面活性剂含量和活性成正比[2],说明此液中含有的菌种已排油,有降解菌产生。直径大于3cm的菌株保留,进行张力测定。

1.2.7.4 表面张力测定:利用金属环法测定上清液的表面张力,仪器为型界面张力仪。

2 结果与分析

2.1 增菌培养:

观察到瓶壁内已长满黄色菌种。将各瓶中的菌种进行简单染色,在显微镜下观察到3#原油产生的菌种最多,2#原油次之,1#原油最少。此外,在3#原油中还观察到存在有大量的弧菌。

2.2 菌落和生理生化特征:

增菌培养的菌种在血平板培养基培养后,观察到有7种形态特征不同的菌种(见表2的菌落形态特征)。结合其他生理生化特征,初步推测1#和4#菌可能隶属于地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis),3#、5#和7#菌可能隶属于铜绿假单胞菌属(Pseudomonas aeruginosa),2#可能隶属枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis),6#隶属于芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)。

2.3 分离筛选:

经过培养后观察到斜面培养基中有菌种的产生,发酵液通过排油圈法的测定证明该油田中存在生物表面活性剂产生菌。

2.4 原油黏度的测定

将1#、2#、3#原油用黏度计测定其黏度,3#原油的黏度最大(750m2/s),是另外两种原油的近700多倍(见表4)。

测定三种原油的黏度对本实验有很重要的意义。结果表明,3#原油的黏度最大,2#次之,黏度最小的为1#。根据发酵液菌种排油圈能力的大小可以看出,含有3#油的任何一个发酵液其排油圈能力均大。此外,增菌培养的染色结果表明,3#油样存在较多的菌种,并且还有弧菌。通过观察,进一步推测出油样黏度的大小与所含菌的多少存在一定的关系,该数据将为今后同类实验的进行提供取样依据。

2.5 检测分离筛选菌种的原油降解性能

2.5.1 溶血实验:

通过血平板和新鲜羊血溶血实验,结果表明,3种原油的9个样品均不同程度地溶血,这说明每个样品中均有生物表面活性剂产生菌株。血平板实验的缺陷是,如果血平板制不好,则不易发现溶血圈,会直接影响到实验结果的观察。因此,本研究在血平板的基础上还将新鲜的羊血1滴滴于凹薄片上,沾取少量增菌培养的菌液涂抹在血液中并于显微镜下观察(此步骤要迅速,因为羊血在一定的时间内会凝固)。两种方法表明,各待测液均可溶血,说明增菌培养液中有生物表面活性剂产生菌产生。

2.5.2 排油圈法:

每个发酵液样品都取3个培养皿,分别放入3种不同的原油各2滴,观察到每个样品中心油膜都被挤向四周形成一圆圈。3#原油所有样品的排油圈能力最强,1#原油样品该能力普遍偏低(见表4)。排油圈法是检测表面活性剂的主要方法之一。该方法操作简单,结果准确。从9个样品的排油能力来看,3#油的排油能力大于1#和2#,说明3#样中的生物表面活性剂性能强。

2.5.3 表面张力测定

排油圈实验表明,1#样点的6~9#样品和2#样点的1~5#样品的油圈直径小于3cm,其他样品的油圈直径均大于3cm。而且,3#样点的原油表面张力均大(见表5)。

3 讨论

本研究在泽普油田尚没有人研究。因此,这将推动该地区微生物的研究开发,将为该油田的生物开采方式提供初步数据。

好氧菌虽然具有产生表面活性剂的能力,但是就其对提高油类回收这一实际而言,还存在某些不足。针对大多数储油罐都是绝氧的特点,研究者们提出好氧菌培养不适合于用生化方式提高油类回收效率的看法,并开始研究厌氧菌的生物表面活性剂的生产情况。Javaheri等报道地衣芽孢杆菌JF-2(从一个油井中分离出来)在严格绝氧的条件下能产生多种大大降低基表面张力(<30mN/m)的物质,对JF-2来说,无氧生长和有氧生长的细胞均能产生生物表面活性剂,而且两种情况下产生的生物表面活性剂被证明是相同的[7]。

在分离筛选表面活性剂产生菌的过程中,生物表面活性剂产量的检测非常重要。目前,表面活性剂的检测方法主要有液滴坍塌法、排油圈法和血平板法。血平板法的缺点是,如果血平板制作不好则不易发现溶血圈,这将直接影响到实验结果的观察。另外,该方法也不能用于需要烃类物质才产生表面活性剂的微生物的筛选,因为烃类物质能与血红细胞发生反应,而影响筛选结果,而且溶血活性也可能与微生物存在溶血酶有关,而不是因为微生物产生生物表面活性剂[8]。因此,生物表面活性剂的检测方法的选择也是未来研究的一个重点。

近年来,随着人们对环境保护意识的增强,环境治理力度的加大,生物表面活性剂的开发和应用倍受重视,在石油开采、环境治理、食品工业、造纸工业、生物医药等领域应用越来越广泛,而且逐渐向其它领域渗透[9]。但是目前,生物表面活性剂只有少数产品走向市场,大多数品种处于实验研究阶段,还没有进行大规模的工业化生产,这主要是由于它的生产成本较高。因此,为了开发生物表面活性剂的应用潜力,决定生物表面活性剂生产成本的主要因素有原料、发酵工艺和下游技术等,均可降低其生产成本是当前研发的热点和主要目标。

摘要：目的:对泽普油田的9个原油样品进行生物表面活性剂产生菌株的筛选。方法:富集培养、血平板分离、摇瓶培养和排油圈测定。结果:7个样品都可溶血和排油圈,即有表面活性剂产生。结论:泽普油田有生物表面活性剂产生菌株,而且该产品具有重要的开发价值。

关键词：生物表面活性剂,菌种筛选,排油圈,血平板分离

参考文献

[1]马歌丽,彭新榜,马翠卿,等.表面活性剂及其应用[J].中国生物工程杂志,2003,23(5):42-45.

[2]Benjamas Thanomsub,Wanna Pumeechockchai,Anirut Limtrakull.Chemi-cal structures and biological activities of rhamnolipids produced by Pseudomonasaeruginosa B189 isolated from milk factory waste[J].Bioresource Technolo-gy,2006,97(18):2457-2461.

[3]Eliora Z Ron,Eugene Rosenberg.Biosurfactants and oil bioremediation[J].Current Opinon in Biotechnology,2003,13(3):249-252.

[4]Makkar R S,Rockne K J.Comparison of synthetic surfactants and biosurfac-tants in enhancing biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons[J].En-viron Toxicol Chem,2003,22(10):2280-2292.

[5]Prabhu Y,P S.Biodegradation of phenanthrene byPseudomonassp.strainPP2:novel metabolic pathway,role of biosurfactant and cell surface hydropho-bicity in hydrocarbon assimilation[J].Appl Microbiol Biotechnol,2003,61(4):342-351.

[6]Mulligan CN.Environmental applications for biosurfactants[J].Enviro-mental Pollution,2005,133(2):183-198.

[7]Javaheri M,Jenneman G E,Mclnerney M J,et al.Anaerobic production of abiosurfactant byBacillus licheniformisJF-2[J].Appl Environ Microbiol,1985,50(3):698-700.

[8]LI Peijun,GUO Shuhai,SUN Tieheng,et al.Bioremediation Techniques ofCrude Oil Contaminated Soils[J].Chinese Journal ofApp lied Ecology,2002,13(11):1455-1458.