分类及标记

分类及标记（精选六篇）

分类及标记 篇1

1 分子标记的优越性及主要方法

DNA分子标记技术主要是基于由单碱基突变和易位、插入、缺失、倒位或转座等导致的DNA序列变异来研究多态性。其优越性包括:不受环境及基因是否表达的限制;遍及整个基因组, 数量极大;对生物体无不良影响;多数表现为共显性, 可分辨所有的基因型。

自1980年Botstein首次利用RFLP标记作为遗传标记开始, 迄今已开发出了一系列的分子标记方法。用于遗传多样性研究的可分为四大类: (1) 基于Sourthern杂交的DNA标记, 如RFLP等; (2) 基于PCR的DNA标记, 如SSR等; (3) 基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记, 如AFLP等; (4) 基于单核苷酸多态性的DNA标记, 如SNP等。

2 分子标记在辣椒种质资源研究上的应用

2.1 RFLP标记的应用及评价

RFLP (restriction fragment length polymorphism) 是Grodzicker等发明的分子标记技术, 其检测和显示通过不同的探针与酶组合来实现。用已克隆的DNA片段作探针与Southern印迹后酶切DNA样品分子杂交, 经放射自显影或非同位素显色来揭示供试样品间的多态性。

Tanksley (1988) 、Prince (1993) 等构建辣椒分子遗传图谱时, RFLP标记技术在辣椒中得以应用。在国内, 中国农科院蔬菜花卉研究所的张玉玺等曾采用RFLP技术对辣椒种质资源分类展开过研究。

RFLP标记具有数量大、稳定遗传、重复性好、共显性等优点。作为第一代分子标记深受重视并广泛应用。但其操作过程较繁琐, 需要对探针进行同位素标记, 即使应用非放射性Southern杂交技术也较为耗时费力。

2.2 RAPD标记的应用及评价

RAPD (random amplified polymorphic DNA) 是建立在PCR基础上可对整个未知序列基因组进行多态性检测的分子技术, 由Welsh等和Wil-liams等发明。

雷进生从100条随机引物中筛选出19条用于RAPD标记, 通过聚类分析把67份辣椒种质材料划分为4类[1]。马艳青等利用RAPD技术, 对来自不同生态类型的辣椒种质资源亲缘关系进行研究, 聚类结果表明, DNA分子水平上辣椒亲缘关系与传统方法研究结论基本一致[2]。陈学军用23条RAPD引物共扩增出209条带, 证实:C.annuum与C.frutescens、C.chinense亲缘关系较近, 而与C.pubescens、C.baccatum亲缘关系较远[3], 与细胞学研究结果一致。蒋向辉等运用形态标记与RAPD标记对7份朝天椒种质资源进行遗传多样性分析, 两种方法聚类分析结果相似[4]。

RAPD标记操作简便, 避免了RFLP技术繁琐的Southern杂交操作以及放射性同位素给人带来的危害;可同时检测多个基因位点, 且可检测RFLP标记不能检测的重复序列区域。不足之处为:一般表现为显性遗传, 所提供的信息量不完整且重复性较差。RAPD标记在早期运用较多, 现已逐渐被取代。

2.3 SSR标记的应用及评价

SSR (Simple Sequence Repeat) 最早由Litt等人在1989年建立。罗玉娣等利用27对SSR引物对33个辣椒材料进行遗传多样性分析, 聚类结果显示, 辣椒果实类型一致的种质资源基本都聚在一起, 即它们之间的亲缘关系较近[5], 这与周晶的研究结果一致。白占兵等人从150对辣椒SSR引物中筛选出多态性较好的引物116对, 初步建立了基于SSR分子标记技术的辣椒种子纯度鉴定体系。中国农科院蔬菜花卉研究所辣椒育种课题组Huang等利用生物信息学的方法新开发出辣椒的SSR引物400多对[6]。

由于SSR技术可揭示完整遗传信息, 呈现共显性遗传、结果稳定可靠、重复性好、简便易行, 且数量极为丰富, 分布于整个基因组;多态性高, 等位位点多, 因此信息含量极为丰富;这些优点使其成为理想的分子标记并取代RFLP而成为被广泛应用的第二代DNA分子标记。其不足在于引物开发较复杂, 引物的设计需要建立、筛选基因组文库和克隆测序等一系列实验, 较费时费力。

2.4 SRAP标记的应用及评价

SRAP (Sequence-related Amplified Polymorphism) 2001年由加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士开发。杜晓华用SRAP和SSR标记技术分析10份尖椒自交系的遗传差异, 结果显示SRAP技术有较高的位点和多态性检测能力, 分别是SSR的10倍和5倍[7]。张素勤等用表型和SRAP分析对贵州主栽辣椒品种进行研究以探讨其亲缘关系和多样性分布。聚类结果表明, 地理分布相近的基本被聚在一起[8]。许先松等人采用形态学标记与SRAP技术, 分别对49和72份辣椒资源的遗传多样性及亲缘关系进行分析。结果表明, 形态学标记与SRAP分子标记结果有较大的出入, 证实SRAP作为分子标记的结果不受环境影响, 所揭示的种质资源遗传多样性更为丰富[9]。

SRAP标记多态性高、简便、稳定, 在基因组中分布均匀、中等产率、引物通用, 且其正向引物可以与反向引物两两配对组合, 它对开放阅读框进行扩增, 可应用于不同作物的遗传图谱构建、图位克隆、基因组和基因定位等。该技术在分子标记辅助育种中是最有可能被大规模进行实际应用的一种技术, 在遗传育种有着广泛的应用前景。

2.5 AFLP技术的应用及评价

AFLP (Amplified frgmenilent length polymorphism) 是一种通过对DNA限制性片段的选择性扩增来检测多态性的一种DNA指纹技术。1993年由荷兰Zabeau等人发展起来, 并获欧洲专利局专利。

宋晓丽用AFLP分子标记与表型性状对辣椒12个品种聚类分析结果显示, 两种分析结果达到显著性正相关[10]。刘科伟等建立了经优化的适合于辣椒的AFLP分子标记技术体系。贺洁等人对22份朝天椒材料利用AFLP技术进行遗传多样性分析。结果显示, 9对AFLP引物扩增出97条为多态性条带, 22份材料被聚成三大类[11]。

该技术可靠性高且灵敏, 不需要Southern杂交、不需要预知DNA的序列信息, 多态性很少、待测样品较少时能达到理想效果。但对酶切用的DNA模板质量要求高, 工作量大, 操作难度较高, 步骤复杂, 费用高, 加上该技术已申请专利, 使其广泛应用受到限制。

2.6 ISSR标记的应用评价

ISSR (inter simple sequence repe (下转第32页) (上接第16页) at) 是Zietkeiwitcz等于1994年在SSR基础上发展起来的一种标记。

陈学军等用RAPD、ISSR分子标记及28个表型性状数据对辣椒属5个栽培种的13份材料进行了分析, 结果显示, 与RAPD相比ISSR标记检测到的遗传离散度、有效等位基因数和遗传分化系数等参数都较大, 说明ISSR有更高的多态性检测效率, 且适合亲缘关系较近的种群间遗传多样性分析[12,12]。

ISSR标记在保留SSR检测技术优点的同时, 克服了其开发困难的不足。在亲缘关系分析、遗传多样性研究、基因定位等方面得到较多应用。其引物种特异性不强, 可在不同的物种间通用;ISSR可获得几倍于RAPD的信息量, 精确度可与RFLP相媲美, 检测也更方便, 是较有发展前途的分子标记。

2.6 其它方法

SCAR标记 (sequence-characterizedamplified region) , SCAR标记由于所用引物较长及引物序列与模板DNA完全互补, 因此, 可在严谨条件下进行扩增, 结果稳定性好, 可重复性强。它们在分子标记辅助育种方面发挥重大作用

STS标记 (sequence-tagged site) , 是指长度200～500bp的序列已知的单拷贝序列, 可用STS位点两端的一对长约20bp的特异引物进行专一性扩增。由于STS在基因组中出现一次, 在染色体上位置固定, 所以可作为界定基因组中染色体片段位置的位标。STS在人类基因组计划、水稻基因组计划的遗传图绘制中发挥较大作用。

3 讨论

不同标记方法尤其是分子标记与表型标记间相结合的研究方式逐渐成为研究者的共识, 其研究结果相互印证增强了说服力, 并为普通辣椒育种者提供直观便捷且科学的依据。

小班数学：按标记分类(庄颜超) 篇2

庄颜超

教学目标：

1.引导幼儿继续练习按照颜色标记、形状标记对物体进行分类。

2.体验数学游戏的乐趣。教学准备：

教具：多媒体课件

学具：幼儿操作材料人手一份 教学过程：

一、观看多媒体课件，集体活动：

师：请小朋友看看图片上有什么呀？

师：现在我们要把这些玩具宝宝送回家，请你看看应该把玩具宝宝送到哪个家里去呢？你是怎么知道这个家是这个玩具宝宝的呢？

（根据每个分类盒上的标记，把玩具送到相应的分类盒里）

一、小组活动

1、第一、二、三组，按颜色分类，送玩具回家。

师；今天，我们来玩送玩具回家的游戏。分类盒就是玩具的家，这些玩具应该回到哪个家里去，让我们先看看分类盒上的标记，然后按照标记把玩具宝宝送回家。送的时候还要说：XX玩具我送你回XX标记的家。玩具都送回家了，再说说，这是XX标记，放的是XX玩具。

（教师边讲解边示范游戏的过程，并且边送玩具回家，边讲述。）

2、第四、五、六组，按形状分类，送玩具回家。

师：请小朋友看看，这个玩具宝宝我们是按什么来给它分类的呢？你是怎么知道按形状来分类的？（分类盒上有形状的标记）

师：小朋友在按形状分类送玩具宝宝回家的时候也要说：XX玩具我送你回XX标记的家。玩具送回家了，再说说XX标记，放的是XX玩具。

（幼儿根据自己每组不同的内容进行操作。）

3、幼儿进行游戏时，教师提醒幼儿按照标记正确进行分类。指导幼儿整理好游戏材料，将物品一样一样地放回原处。

三、活动评价。

1、出示课件二

师：看看有什么？（出示形状标记和方格）这是片片的家，谁会把片片送回家，边送边说：XX片片送你回XX标记的家。

2、教师与幼儿共同检查

师：他送得对吗？他是怎么样的？（引导幼儿讲述操作结果）师：他送得对，说得也很清楚，你们都是这样做的吗？做对的小朋友把手举起来！教学反思：

《纲要》中指出：教育活动内容的组织应充分考虑幼儿的学习特点和认识规律，各领域的内容要有机联系，相互渗透，注重综合性、趣味性、活动性，寓教育于生活、游戏之中。小班幼儿在绘画是喜欢边画边说，因此，我把它移用到数学教学中来，要求小朋友在分类的时候：“边说边做“，使幼儿能手口一致的点数，培养幼儿对数和

分类及标记 篇3

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究所用材料为来自国内外的125份普通甘蓝型油菜材料[1],用于建立SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions)分子标记体系鉴别自交不亲和S单倍型。其中甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300作为母本[2],其他124份甘蓝型油菜作为父本。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取和PCR扩增。

选取苗期的油菜鲜嫩叶片0.1~0.2g,用CTAB小量法提取DNA。把DNA浓度调至50ng/μL左右,以此为模版进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系是:100ng模板DNA,各50ng正向和反向特异引物,1×PCR缓冲液,1 U Taq酶,0.15mmo L/L d NTPs和2.0mmo L/L Mg2+,加dd H2O至总体积20μL。先用双亲做温度梯度试验,确定适宜的退火温度和时间。将扩增得到的产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.2.2 PCR扩增产物片段回收、克隆、测序。

取30μL PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测,在紫外灯管下用刀片切下目标带,然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit试剂盒(上海生物工程技术服务有限公司)回收。将回收的片段进行T-A克隆,然后每个片段选3个阳性单克隆菌样送至南京金思特科技有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 SCAR分子标记

张幸果利用分子标记方法对来自国内外的125份甘蓝型油菜的S单倍型进行了基因型的分类,将甘蓝型油菜分为11种基因型[1]。其中并发展了一个CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)分子标记用于区分ISLGa和ISLGb,但因为CAPS分子标记酶切时间太长,不利于简单、快速检测,因此本试验尝试发展SCAR分子标记。

对ISLGa、ISLGb片段测序,其长度分别为1 336、1 345bp,ISLGb与ISLGa的1 336bp相比,具有3个片段的插入,长度分别为6、3、3bp以及1个3bp片段的缺失。在6bp的插入处设计1条引物ISLGb-L(5′TCCTGCCCTTTCGATGTATTT3′),与PS15[3]构成引物对,为特异扩增ISLGb的分子标记ISLGb。并且该标记引物ISLGb-L+PS15在3个材料(Profit、Maskot、Puma)中均扩增出大小为1 265bp的单一亮带,其退火温度为60℃。另选取基因型为ISLGa的3份材料用此引物扩增,未发现扩增产物(见图1)。

注:1~3为基因型为ISLGa的材料;4为Profit;5为Maskot;6为Puma。

2.2 多重PCR分子标记

多重PCR(multiplex PCR)又称多重引物PCR或复合PCR,是指在同一PCR反应体系中加入2对或2对以上的引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR反应相对于1对引物的常规PCR具有高效性、节约性的特点。试验根据已经得到的SCAR分子标记,将它们进行组合,再根据PCR产物的长度和丰度,调整引物的浓度和PCR循环中延伸的时间。经过多次反复试验,2对引物组合成功发展。

2.2.1 以分子标记ISLG(PS5+PS15)[3]和SP110(SP11-L+SP11-R′)[4]组成的双重PCR对125份材料中分别被ISLGb和SP11a[5]标记的24份材料进行扩增。其PCR反应体系:100ng DNA为模板,10×PCR buffer 3μL,2mmo L/L Mg Cl2,0.24mmo L/L d NTPs,1.0U Taq DNA聚合酶0.4μL(均购自MBI Fermentas,Lithuania公司),引物PS5+PS15(扩增的片段为1340bp左右)各0.44μmo L/L,引物SP11-L+SP11-R′(扩增的片段为300bp左右)各0.36μmo L/L,dd H2O补充至终体积25μL。热循环参数为:94℃3min;94℃30s,53℃60s,65℃90s,33个循环;65℃10min,1个循环;4℃保存。水平胶检测表明,这个多重PCR标记能成功区分3种基因型(见图2)。

注:1为IISLGb标记的材料;2为SP11a标记的材料。

2.2.2 以分子标记ISLGb(ISLGb-L+PS15)与SP11a(SP11-L+SP11-R)组成的双重PCR对125份材料中被ISLG标记的89份材料进行扩增。其PCR反应体系:100ng DNA为模板,10×PCR buffer 3μL,2mmo L/L Mg Cl2,0.24 mmo L/L d NTPs,1.0U Taq DNA聚合酶0.4μL(均购自MBI Fermentas,Lithuania公司),SCAR引物ISLGb(扩增的片段为1 250bp左右)各0.40μmo L/L,SCAR引物SP11a(扩增的片段为430bp左右)各0.40μmo L/L,dd H2O补充至终体积25μL。热循环参数为:94℃3min;94℃30s,59℃60s,65℃90s,33个循环;65℃10min,1个循环;4℃保存。所得到基因型结果见图3。

通过整合上述分子标记,得到了1套SCAR分子标记体系(见表1)。包括2个多重PCR分子标记:(1)ISLG(PS5+PS15)和SP110(SP11-L+SP11-R')用于鉴别ISLG和IISP11b;(2)ISLGb(ISLGb-L+PS15)与SP11a(SP11-L+SP11-R)用于鉴别ISLGb和IISP11。还有1个单PCR分子标记:SRKa(S40-5+S60-2)用于鉴别IISRKa[1]。

注:+表示目标片段扩增;-表示无扩增。

3 结论与讨论

随着现代分子生物学的发展以及S单倍的鉴定,很多S位点连锁的分子标记被相继发展出来,利用分子标记技术来判断自交不亲和性将会更加准确[6]。最初得到的SLG6的c DNA克隆后,人们便将它或其片段作为探针,同时对多种不同的S单倍型的全基因组DNA进行RFLP分析获得了可以准确推断出各种S单倍型的RFLP标记,从而初步建立了一种用DNA分子标记快速测定S单倍型的方法。

本研究基于前人的研究成果,首先发展了1个SCAR分子标记ISLGb用于区分ISLGa和ISLGb,接着组合了2对多重PCR分子标记并对它们进行了重复验证,发现这些结果与张幸果[1]的是一致的。最后,建立和完善了1套用于区分甘蓝型油菜S单倍型的SCAR分子标记体系。这套标记体系由2个多重PCR和1个单PCR标记组成:(1)ISLG(PS5+PS15)和SP110(SP11-L+SP11-R')用于鉴别ISLG和IISP11b;(2)ISLGb(ISLGb-L+PS15)与SP11a(SP11-L+SP11-R)用于鉴别ISLGb和IISP11;(3)SRKa(S40-5+S60-2)用于鉴别IISRKa。后来尝试发展区别IISLGa和IISLGb的SCAR分子标记,但由于两者的核苷酸序列的相似性高达99%,未能成功发展,目前只能通过CAPS分子标记区分IISLGa和IISLGb[5]。

摘要：根据克隆到的ISLGa片段与ISLGb片段核苷酸序列之间的差异,发展了1个SCAR分子标记ISLGb(ISLGb-L+PS15),其引物只在具有ISLGb基因型的3个材料中扩增,并且均得到了大小为1265bp的单一亮带。通过与已有的相关分子标记整合得到了1套SCAR分子标记体系。包括2个多重PCR分子标记:①ISLG(PS5+PS15)和SP110(SP11-L+SP11-R')用于鉴别ISLG和IISP11b;②ISLGb(ISLGb-L+PS15)与SP11a(SP11-L+SP11-R)用于鉴别ISLGb和IISP11。还包括1个单PCR分子标记:SRKa(S40-5+S60-2)用于鉴别IISRKa。

关键词：SCAR分子标记,甘蓝型油菜,S单倍型,分类

参考文献

[1]马朝芝,傅廷栋,杨光圣,等.甘蓝型油菜双低自交不亲和系的选育[J].华中农业大学学报,1998(3):211-213.

[2]张幸果.甘蓝型油菜自交不亲和初步研究[D].武汉:华中农业大学,2007.

[3]NISHIO T,KUSABA M,WATANABE M,et al.Registration of S alleles in Brassica campestris L by the restriction fragment sizes of SLGs[J].Theor Appl Genet,1996(92):388-394.

[4]TANG J Y,ZHANG J F,MA C Z,et al.CAPS and SCAR markers linked to maintenance of self-incompatibility developed from SP11in Brassica napus L[J].Molecular Breeding,2009,24(3):245-254.

[5]ZHANG X G,MA C Z,TANG J Y,et al.Distribution of S haplotypes and its relationship with restorer-maintainers of self-incompatibility in cultivated Brassica napus[J].Theor Appl Genet,2008(117):171-179.

分类及标记 篇4

关键词：EST,SSR,分子标记,开发,应用

1 EST的概述

表达序列标签 (Experssed sequenee Tags EST) , 是将m RNA反转录成c DNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建成c DNA文库后, 大规模随机挑选c DNA克隆, 对其5’或3’端进行单向单次测序后所获得序列, 其长度约为150~500 bp。与基因数据库中已知序列比较, 可获得一些与生物生长、发育、代谢、繁殖和衰老死亡等一系列生理生化过程认识的相关信息[1]。因此EST技术是发现新基因的好方法, 逐渐引起了世界各著名实验室的重视, 并相继开展了不同物种的EST计划。到2010年3月5日为止, db EST已收录64 996 006条EST序列, 分别来自1 071个物种, 其中人和小鼠的最多。柔嫩艾美尔球虫的EST为35 009条, 而且每年都在增加, 说明EST技术越来越多地用于柔嫩艾美尔球虫的研究。Gen Bank已登陆的一些寄生虫的EST数目, 见表1。

2 SSR的概述

简单重复序列 (SSR, simple sequenee Reapts) , 也称作微卫星DNA (Mierosatellite DNA) 是指一类由几个 (多为1~6个) 碱基组成的基元串联重复而成的DNA序列, 如 (AT) n、 (GCA) n、 (AATC) n等重复, 它广泛而均匀地分布于真核生物基因组中。人们对微卫星DNA在人类、动物以及植物中的发生与分布做了大量的研究。Litt等在心肌肌动蛋白的基因扩增了一种2核苷酸重复, 创造了“微卫星” (Mierosatellite) 这个名称。所谓的“简单重复序列” (simple sequenee Reapts, 简称SSR) 或“简单串联重复”是上述命名的连续。SSR具有高度变异性 (SSR突变频率约为10-2~10-3座位/配子/世代) , 对于引起这种变异的机理有滑动学说, 不均等交换机理, 重组假说这几种假说, 真正引起变异的原因尚在研究中。

SSR两端的序列多是相对保守的单拷贝序列, 人们常常根据其两端的序列设计特异引物进行扩增, 根据扩增产物长短的变化而显示不同基因型的个体在每个SSR位点上的多态性。SSR根据序列来源一般分为基因组g SSR (genomic SSR) 和EST-SSR (e SSR) 两种。

3 EST-SSR的概述

EST-SSR是利用已有的EST序列通过电子筛选鉴别SSR, 然后用PCR检测。利用EST开发SSR避免了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤, 充分利用了现有数据, 降低了开发成本。由于EST-SSR的保守性较好, 在不同物种间通用性好, 可作为校正远亲物种间基因组连锁图谱与比较作图的方法, 在这两方面有较高的利用价值。EST-SSR具有较高的信息量, 例如一个EST标记被发现与一个遗传性状连锁, 那么这个EST可能就是直接影响这个性状的基因的一个表达片段。EST-SSR最大的优点是开发简单、快捷、费用低。美国NCBA公共数据库db EST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/db E-ST/index.html) 提供了不同物种的大量EST序列, 可免费下载, 许多软件可用来直接从EST中快捷的筛选出标记, 由此可见开发的费用与其他分子标记比起要低很多, 也可以减少一定的工作量。

4 EST-SSR标记的开发

4.1 EST数据的获得和预处理

EST数据库提供大量的EST数据, 从网上直接下载即可, 避免了先前由于建库和测序而耗时、费用大等缺点。在开发标记之前应去除可信度低的数据, 如:从数据库中直接获取的EST中包含的一些低质量片段 (<100bp) 和带有少量载体序列及末端存在poly A/T尾巴”的序列。这些数据会影响相关信息的分析。现在很多软件都可以用来除“尾巴”和屏蔽载体序列, 如:EST-trimrner、DNAstar、cross-mateh (www.phrap.org) 等。

4.2 EST序列的拼接和聚类

建库时测序获得的EST多是用随机或鸟枪法测序会产生了很多的冗余EST。毕竟, 数据库中的EST是由不同的研究者登记的, 他们都是在做同一个东西就会导致同一表达基因的EST重复出现。冗余的数据会让我们在分析中出现很多的错误。因此, 在鉴别和利用EST-SSR标记时, 要使用无冗余的EST数据库。只有无冗余的EST数据库的SSR的频率才能更真实的反映了SSR在基因组转录部分的密度。目前, 通常用Tig Assembler、staden Package和Phrap等进行拼接和聚类来去除这些冗余的EST, 从而获得无冗余的EST。

4.3 SSR的筛选鉴定

搜索SSR的软件很多, 常用的有MISA、SSRIT、TRF、Sputink、macroSSRSEARCH、Repeat Masker等。这些软件各有特点, 他们筛选的标准也就不同, MISA、SSRIT、Repeat Masker都不能搜索单核苷酸, 而TRF可以, 有的人也用word。所以当把同一组EST序列输入进不同的搜索工具研究, 由于许多参数的设定不一样, 同一物种得到的结果常存在很大的差别。当搜索出SSR后, 为充分合理地使用EST资源、准确了解和评估某EST中SSR出现情况。

4.4 用于EST-SSR标记的引物设计

首先选取需要的含SSR的序列进行引物设计, 应尽量选择那些重复次数较多的SSR, 从而提高其检测的效率。此外, 由于编码区较为保守, 应尽量使用在不同材料间的变异较大的3’或5’端UTR内的SSR。现在最常用的引物设计软件有Primer3、Primers、OLI-GO。在设计引物时, 要严格遵守引物设计原则, 对GC含量、退火温度Tm、引物长度、产物长度这些重要的参数要限定标准, 最终使设计的每对引物能够和目标区域特异性地结合。

4.5 PCR检测EST-SSR引物的有效性

引物设计好后, 通常是通过PCR来检验其有效性。在优化Mg离子浓度、退火温度、模板量、引物浓度等条件后, 可建立起合适的EST-SSR标记的PCR反应体系。为能准确检测出这些多态性, 多数研究EST-SSR标记的实验都采用分辨率较高的聚丙烯酞胺凝胶电泳来分离, 因为SSR的多态性多数是由于重复次数的变异产生。而高浓度 (>3%) 的琼脂糖凝胶电泳只能较为粗略地检测差异大于10 bp的片段, 一般只用于建立标记的研究。

5 EST技术在动物寄生虫研究的应用

目前EST技术已经在具有顶复合器的原生动物包括恶性疟原虫、柔嫩艾美尔球虫、刚地弓形体、小隐孢子虫和犬新孢子虫中得到应用。这些寄生虫都是细胞内寄生, 随着它们复杂的生活史, 虫体发育为不同的阶段, 有些阶段又与宿主密切相关。通过获得不同发育阶段的EST是简便易行的方法, 既可以用这种方法获得这些发育阶段基因表达谱的情况, 又可以鉴别差异表达的基因[2]。

在球虫研究中, Wan等[3]首次用柔嫩艾美尔球虫的裂殖子构建了c DNA文库, 经过测序得到491条EST序列, 经过生物信息学分析, 共有47.4%的EST序列与核糖体蛋白、代谢相关的酶有同源性匹配。还有14.3%的序列与柔嫩艾美尔球虫的已知基因能够同源匹配, 但有50%的序列没有任何同源性匹配, 得到的结果表明了EST策略是发现新基因的好方法。后来又有Li等[5]通过对包括柔嫩艾美尔球虫在内的5种原虫的基因组和表达序列标签 (EST) 数据分析, 认为EST技术提供了一种筛选抗药性产生的靶分子以及可以作为疫苗的候选抗原的方法。Ng[4]等从子孢子构建的c DNA文库中随机挑取了1 100个克隆, 共得到556条EST序列, 其中27.3%的序列与已知序列具有同源性匹配, 而72.7%的序列由于与数据库中的序列没有同源性匹配被鉴定为新基因。由此可见, EST技术对开发新基因具有重要的意义。Klotz[6]采用电子克隆的方法对柔嫩艾美尔球虫数据库中12 187条ESTs序列进行延伸, 通过Blast X比对, 共拼接出2 881个重叠群 (contig) 。通过对N端氨基酸序列的同源分析, 51个重叠群与具顶复合器的寄生虫有同源匹配。通过功能分析和定位, 筛选出了具顶复合器寄生虫的分泌蛋白、分泌酶、转运子和信号蛋白。王建民[7]利用柔嫩艾美尔球虫敏感株和抗马杜霉素株 (由敏感株诱导) 的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子构建混合c DNA文库, 测序获得了2 806条3’端高质量的表达序列标签 (ESTs) 。通过生物信息学分析, EST序列拼接出1 424个假定独立转录本 (TUTs) 冗余度为49.3%。从c DNA文库中筛选出大量的低丰度表达基因, 约占TUT总数的91.5%, 且功能未知基因约占TUT总数的83.6%。在功能注释基因中, 编码MIC2蛋白、BT1家族蛋白和核糖体蛋白等入侵和发育相关的基因高丰度表达。

6 SSR在动物寄生虫研究中的应用

目前SSR技术已经用于研究宿主与寄生虫的相互关系、寄生虫虫株鉴定及分类等。寄生虫在与宿主在共同进化的过程中, 逐渐形成了明显的宿主特异性, 即使同一宿主的不同种或株对某些寄生虫的易感性也存在有差异[8~11]。流行病学调查研究表明人类存在对曼氏血吸虫易感/拮抗基因 (SM1。为定位SM1, Marquet等利用平均分布于人染色体上的246个微卫星标记, 采用多重PCR对巴西11个家庭的142名相关成员进行微卫星等位基因不平衡分析, 发现高频等位基因不平衡区位于染色体5q31-q33。该区域可能存在若干重要的抗Sm感染的候选基因, 参与调节机体对病原体的免疫反应。微卫星DNA作为第二代遗传标志, 由于其高度多态性、分布广, 按孟德尔共显性方式遗传等优点, 非常适用于寄生虫的虫种鉴别和分类学以及系统发育的研究。Lanzaro.G.G等应用微卫星DNA分析了西非冈比亚按蚊种群的基因结构的复杂性[12]。Njagu.Z等利用微卫星DNA探针鉴定了在睡眠病流行区肯尼亚维多利亚湖陆地的巨蜥体内自然感染的锥虫为布氏锥虫[13]。Solano.P等通过分析微卫星DNA多态性及蝇翅大小分析了来自西非布基纳法索和塞纳加尔两地的须舌蝇的种间差异, 微卫星位点的分析可以区分出来自同一地貌仅间隔数千米的须舌蝇种群间的差异。对舌蝇种群间差异的进一步研究有助于研究采采蝇遗传差异与传播人类以及动物锥虫病动力学之间的关系[16]。

7 EST-SSR在动物及动物寄生虫中的应用

目前许多物种都利用EST-SSR来开发SSR, 该技术经常被用于植物的一些相关研究中, 近年来在动物中也开始广泛的应用。

赵传志[15]对山羊的EST资源进行了SSR分析, 山羊EST-SSR一共有59种重复基元, 其中出现最多的是AC/GT, 占所有EST-SSR的21.15%。表明山羊EST-SSR出现频率高、种类丰富, 而且58%的含有SSR的EST编码已知功能的蛋白, 具有较高的应用价值。高焕[16]利用本实验室建的中国明对虾c DNA文库测序所得的EST进行SSR分析, 结果表明重复拷贝数目和等位基因数目呈一定相关 (相关系数0.121) , 但相关性不显著 (P=0.621) 。

在我国斑点叉尾鲴种质资源的研究中运用EST-SSR对福建和湖北的1984年群体 (P1984) 、福建与辽宁的1997年群体 (P1997) 、湖南的2004年群体 (P2004) 和福建的1984年与1997年群体杂交的F1代群体 (P8497) 等4个斑点叉尾鲴 (Ictalurus punctatus) 养殖群体的遗传多样性进行分析得出群体间的多态性差异不显著, 且各群体的遗传多样性处于中等水平[17]。同年, 吕慎金等[18]利用10对绵羊微卫星引物分析了中国地方山羊品种的遗传多样性。

分类及标记 篇5

语气副词“毕竟”经过演变, 语法化程度很高。在实际应用中, 其话语功能在人际交际、语篇功能等方面都有体现。我们认为其是话语标记, 在语篇中具有主观化的表达功能。我们以“毕竟”所出现语言片段的语义结构模式和“毕竟”在实现衔接性方面的语篇功能作为分析研究的重点。

一、“毕竟”是话语标记语

目前, 学界对话语标记还没有一个严格的定义, 普遍的看法是:狭义的话语标记语是指在互动言语交际中从不同层面上帮助构建持续性互动行为的自然语言表达式;广义的话语标记语是指书面交际和口语交际中表示话语结构及连贯关系、语用关系等的所有表达式 (鞠玉梅, 2009:41) 。根据普遍的看法, 我们认为“毕竟”是符合作为话语标记的要求的。

我们先来看三个在实际运用中的例子:

(1) 好莱坞毕竟是个国际性的影城, 有一流的演员和导演, 我在这里学到了许多东西。 (《人民日报》, 1993)

(2) 然而现实毕竟是现实, 它需要商业社会中似乎是无情却合理的东西。 (顾向东, 《黄金梦里有黑洞》, 《作家文摘》, 1997)

(3) A:现在搞什么的都有假的, 什么英语等级证书、计算机证书都有给办的, 太过分了。这么多都可以搞假的, 我们还那么努力学什么学啊, 直接拿钱买得了。

B:你何必管他们那些, 搞那些的毕竟是少数, 而且都是些没本事的人。现在这个时代, 是凭能力上的, 你自己把本事学到手, 还怕竞争不过那些搞歪门邪道的人。

A:说的也是。

以上的例子都说明“毕竟”是可以作为话语标记而存在于实际运用中的。

1.“毕竟”是一个单独的词, 在实际交际中 (书面、口语) 使用频率很高, 有普遍的使用认可度。

2. 在交际中, “毕竟”的作用是辅助交际的, 起到的作用是引导和帮助受话者对表达者话语意义或者意图的理解, 也就是起到了保持话语连贯性的作用。在句法上是具有可分离性的 (谢雨珂、谢因平, 2009) 。

在上述3个例子中, “毕竟”是完全可以去掉的, 并不影响句子的实际表达意义, 但是加上“毕竟”就起到提起受话者注意的作用, 引导受话者关注“毕竟”标记带来的说话者希望受话者重点了解的部分。比如在 (1) 中, 说话者是想让受话者重点了解好莱坞作为影城的国际性, 拥有世界一流的人力和物力资源。在 (2) 中, 写作者是想让读者认识到现实是不同于想象的, 是有很多不尽人意的地方。

3. 虽然话语标记是否有概念语义的问题尚在争论中, 但是就普遍承认的程序语义, 我们认为“毕竟”是一个具体典型。所谓程序语义就是指语义的程序表征, 是指如何提取、运算概念表征 (概念表征具有逻辑属性, 存在一定的逻辑关系。能够用来描述或部分描述事件状态, 具有真假可言) 的程序, 在交际过程中起限制或指导作用。

而这种程序表征在“毕竟”的使用中是存在的, 比如在例子 (3) 中, B针对A的烦恼, 给出了自己的想法去劝慰A在对待社会上存在的不正之风要保持良好和积极的心态。B在表达自己的看法的时候, 认为A所说的搞歪门邪道的人的数量比较少, 这时B就采用“毕竟”来强调他的这种观点。而且引导A去按B的想法认为搞歪门邪道的人都是没有本事的人。经过“毕竟”的引导, 使B的想法非常明确突出, 而显得有说服力, 最后A同意了B的说法。这个时候, “毕竟”在实际语言交际中的程序性特征就体现了出来。

4.“毕竟”作为话语标记是具有多功能性的, 是可以发挥多种功能的, 保证了在大量的实际语言交际中的使用需求。 (也有研究者认为话语标记是一个相对封闭的功能类, 主要是针对其自身的造词能力, 即不能组合为更大的语篇单位。) 比如:“毕竟”在实际实用中, 会起到强调、缓和、预设等功能, (在下文“毕竟”话语标记功能分析中具体分析。) 而同时它的这些功能也可以用“到底”、“究竟”、“总归是”等来实现。

因此, “毕竟”是完全的话语标记语, 存在于实际语言交际中。

二、话语标记“毕竟”的语义解释及句法分布

关于“毕竟”的语义主要有以下几种看法: (1) 表示追根究底所得的结论;究竟;终归;到底。这以《现代汉语词典》、《现代汉语八百词》为代表。 (2) 强调某种事情现象到最后还是发生了出现了, 句尾总有表示新情况出现的语气词“了”。以《现代汉语虚词例释》、《现代汉语常用虚词词典》为代表。 (3) 《虚词解析词典》认为“毕竟”带有转折的语气或加强语气的作用。 (4) 表示强调。

以上几种看法都有合理性, 但有的需待进一步探讨。首先“究竟”、“终归”、“到底”与“毕竟”语义不完全相同, 用其解释“毕竟”, 有时会造成语句意义的不通。将“毕竟”赋予表示时间的用法则过于抽象。通过对“毕竟”在文学作品、报刊杂志中用法的考察得出, “毕竟”没有实在意义, 在句子中起强调的作用, 表示强调结论或原因 (董付兰, 2002) 。

“毕竟”一词具有情态意义。情态, 是句中命题之外的成分, 也是句中的非事实性成分, 是说话人主观态度的语法化, 也是说话人对句子命题和情景的观点和态度。表达情态的手段很多, 可以通过各种句类、句型, 也可通过个别词语。语气副词“毕竟”带有很强的主观性, 它表示的是说话人自我的观点、认识, 体现了说话人对谈及的情况所持的强调态度 (李静, 2009) 。

语篇是“使用中的语言” (Halliday, 1978) , 这个概念的价值集中体现为:可通过语义上的相互关联来表达连贯、相对完整的意义。而语篇功能则是一束潜在的各种语义选择, 通过语篇功能我们可创造或复制出较大大、表达较连贯的、完整的语篇, 从而清晰地表情达意。连贯性是“使得语篇能结合为一体的可能性的总汇, 是人们进行口头或书面表达时可支配的潜在性的聚合” (Halliday&Hasan, 1976) , 遵循这一观点, 我们探讨“毕竟”的语义结构模式和在实现连贯性方面所体现的语篇功能问题。

祖人植、任雪梅 (1997:39) 通过对大量语料的分析 (北京大学语料库CCL语料库检索系统) , 发现“毕竟”所出现的语段的意义成分是一致的, 而且意义成分之间在语义结构上也存在着共性, 共有两种类型。各意义部分在出现顺序上有一定的灵活性, 但它们之间的语义关系并无不同。祖人植、任雪梅 (1997) 归纳出了其基本语义结构的典型模式。

两种模式的语段只是在“毕竟”出现的具体位置和综合的语义构成方面体现出不同。因此, 只需根据表达重点的变化而对它们进行相互交换。

“毕竟”的典型语义结构模式和信息表达, 如下图所示:

三、“毕竟”的语篇功能

1.“毕竟”具有连贯性语篇的复制功能

借助语篇的衔接性, 我们可创造或复制出较大的、具有连贯性的语篇。我们注意到, 当语篇的前后语境完整并有适当的连接词时, “毕竟”的衔接性功能并不显著, 故在a类句中即使省略, 信息表达也不会受到大的影响;b类句中情况则不同, 由于A/B的隐含, “毕竟”省略与否在大多数情况下信息表达会受到影响;而在b'类句中, “毕竟”显得极为重要, 一旦省略则所表达的信息完全不同。

因此, 我们对“毕竟”脱离语境后的情况进行考察。发现:和一般的衔接功能只是潜在的性质不同, “毕竟”脱离语境后, 它赋予一个一般的陈述句以完全不同的内涵;一个陈述句一旦使用了“毕竟”, 则它就会自动强制性地要求按模式I或模式II的语义结构模式复制出自己独特的连贯性语篇。试比较:

a.她是个女人。a.他是个人。

b.她毕竟是个女人。b.他毕竟是个人。

我认为, “毕竟”这种自动强制按自己特有的句法语义结构模式的功能是“毕竟”所独有的内在语篇功能。

2.“毕竟”句表达的双重信息

“毕竟”句表达两重信息, “毕竟”的语篇功能主要在由第一重信息“对C的确定”到第二重信息“C具有某种属性”, 并要求与相应的预设信息参照, 进而得出推断在信息中得以体现。

语篇的衔接功能可能体现为两方面:其一, 和语言内在的一致性相关, 是语言内部的;其二, 与外在的情景发生关系, 是外部世界的。

有时, “毕竟”句的信息表达也会受到外部世界知识的影响, 特别是文化背景知识。“我毕竟是个女人”这句话出自一个有强烈女权意识的人之口与出自一个具有浓厚男尊女卑思想的人之口, 含义是大相径庭的。

3.“毕竟”的词汇意义与语篇功能

综上, “毕竟”的词汇意义和语篇功能是相辅相成的, 词汇意义是语篇功能的基础, 而词汇意义只有通过语篇功能才能在情景中得到体现, 二者共同构成“毕竟”的意义。具体如下:

话语标记语“毕竟”强调语气, 通过强调某一情况而表明说话人的某种判断、观点或结论。主要用途有二:其一, 用于因果转折二重复合句, 表示原因, 带有解释性语气。典型句式为:

(虽然) A+[ (但是) B+ (因为) 毕竟C], 或简化为:B+ (因为) 毕竟C

其二, 用于转折因果二重复合句, 表示反对, 带有辩驳或反驳的语气。典型句式为:

[ (虽然) A+ (但是) 毕竟C]+ (因此) B, 或简化为: (虽然) A+ (但是) 毕竟C。

四、结语

本文以语气副词“毕竟”为研究对象, 从共时的层面分析其可以作为话语标记的理由:“毕竟”有普遍的使用认可度;在句法上是具有可分离性;具有典型的程序语义特征;在交际中, 起到了保持话语连贯性的作用, 保证了在大量的实际语言交际中的使用需求。并结合具体语言事实分析了作为话语标记的“毕竟”所在语段的语义结构模式和句法分布, 进一步考察了其在实现衔接性方面的语篇功能, 发现:“毕竟”一词具有情态意义, 通过语义上的相互关联来表达连贯、相对完整的意义。“毕竟”所出现的语段的意义成分是一致的, 而且意义成分之间在语义结构上也存在着共性, 共有两种类型, 具有连贯性语篇的复制功能和表达双重信息功能。

参考文献

[1]Halliday, M.A.K., Hasan, R.Cohesion in English.London:Longman, 1976.

[2]Halliday, M.A.K.Language as Social Semiotic:TheSocial Interpretation of Language and Meaning.London:Arnold, 1978.

[3]鲍克怡.虚词解析词典[M].上海:上海教育出版社, 1988.

[4]北京大学语料库.CCL语料库检索系统[OL].http://ccl.pku.edu.cn:8080/ccl_corpus/index.jsp.

[5]董付兰.“毕竟”的语义语篇分析[J].首都师范大学学报 (社会科学版) , 2002, (3) :67-71.

[6]黄大网.话语标记研究综述.福建外语[J].2001, (1) :5-12.

[7]鞠玉梅.话语分析, 曲阜师范大学外国语学院研究生课程讲义[M].曲阜, 2009:47.

[8]李静.解析语气副词“毕竟”[J].安徽文学, 2009.6.

[9]吕叔湘.现代汉语八百词[M].北京:商务印书馆, 1999.

[10]谢雨珂, 谢因平.“毕竟”作为现代汉语话语标记语的功能研究[J].中国商界, 2009, (1) .

分类及标记 篇6

肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程,导致肿瘤发生、侵袭和转移的根本机制目前尚不明确;且肿瘤的异质性使不同个体对治疗反应迥异,因此充分挖掘隐藏在肿瘤微环境中的信息,将有助于全面认识肿瘤的行为[3]。分子成像技术是一门新兴的交叉学科,其中荧光标记的分子探针光学是目前研究的热点,尤其是量子点(quantum dots,QDs)标记分子探针技术在细胞分子成像及定量检测分析方面有显著优势,表现出很高的特异性、灵敏性、实时性和安全性等,能对肿瘤特异性标志物实现原位、实时、定量、高灵敏度的成像,在分子层面研究对象的变化及特点,克服传统的基因、蛋白质组学的缺陷,为肿瘤分子分型提供有效的技术手段[4,5]。

本文结合量子点标记技术和脂质体技术,合成出高荧光效率的量子点纳米颗粒,并且将其与紫杉醇封装在脂质体中,得到了包封率高、稳定性好、标记荧光强度高的药物脂质体。

1 材料和方法

1.1 实验材料

硒粉、氧化镉、油酸、丙烯酸(90wt%)、脑磷脂:Aldrich公司生产,分析纯;氯仿、甲醇、丙酮、液体石蜡、二环已基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等:均购自于国药集团化学试剂有限公司,分析纯。紫杉醇原料药(98.13wt%):上海Desano化学制药有限公司,分析纯。L-α-脑磷脂(MW=750 Dalton)、聚丙烯酸(MW=2,000 Dalton):Sigma公司生产,分析纯。实验用水为去离子水。JY292Ⅱ型超声波机:宁波新芝科学仪器研究所;RE252型旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;PHS-2C型精密温度控制系统:上海雷磁仪器厂;SHZ288型台式水浴恒温振荡器;江苏太仓实验设备厂;LDJ9600型振动样品磁强计:LDJ公司;486紫外检测器高效液相色谱仪:Waters公司;JEM-2000EX型透射电镜:JEOL公司;MS2000型激光粒度仪:马尔文公司;JSM6360LA扫描电镜:JEOL;LS55荧光光谱仪:PE公司。

1.2 紫杉醇药物荧光标记脂质纳米粒的制备

油溶性Cd Se(PL:512 nm)量子点的制备参照文献[6]合成,简单制备过程如下:在25 m L三口烧瓶中加入2.5mmol的Cd O、5 mmol的油酸、11 m L液体石蜡中,氮气气氛下加热至150℃并排气30 min,形成Cd O前驱体。在100m L三口烧瓶中加入1 mmol的Se粉、50 m L的液体石蜡中,缓慢升温至260℃。将Cd O前驱体迅速注入到Se前驱体中并保持体系温度稳定,反应5 min后将体系骤冷。所得到的Cd Se纳米晶用甲醇和正己烷多次纯化,蒸干去除溶剂即可。

水溶性Cd Se/Zn S量子点的制备[7,8]:在500 m L圆底烧瓶中加入170 m L DMF、2 g聚丙烯酸、1.03 mg的DCC、0.58mg的NHS,维持温度0℃搅拌24 h,氮气保护下过滤。将滤液用分子截留量1 000Dalton的纤维素膜水透析除去未反应的DCC等。在-20℃下冻干24 h,取190 mg产品溶解于100 m L的DMF中。在250 m L圆底烧瓶中加入30 m L氯仿/甲醇混合物(9:1,v/v),56 mg脑磷脂。于35℃下加入上述的聚丙烯酸溶液,反应12 h后于50℃减压蒸馏24 h去除有机物。加入甲醇,搅拌分散后离心,取沉淀物,于50℃下干燥24 h得到分子量3 300 Dalton的聚合物。

以脂质体与紫杉醇的比率、转速、操作温度为主要考察因子,以包封率为指标,做三水平的正交试验:

得到脂质体制备的最佳条件:称取Cd Se量子点,紫杉醇100 mg,磷脂2 800 mg,上述聚合物1 500 mg,溶于100 m L的氯仿/甲醇混合物(9:1 v/v),参考文献[8,9,10]控制量子点的浓度在0.062×10-3mg/mol脂质体左右以避免脂质体对量子点荧光的淬灭。混合物恒温减压旋转蒸发,控制真空度为0.1 Pa,温度35℃,旋转蒸发仪转速为120 r/min;在圆底烧瓶上形成均匀的薄膜。然后在60℃下加入25 m L PBS(p H7.4),室温条件下将瓶壁上的干膜完全洗脱下来为止并且搅拌水化1 h;将粗混悬液依次通过0.8、0.45μm,得最终的脂质体混悬液。将所得混悬液于-50℃预冻6 h后自由升温至室温,25℃下真空干燥24 h即可。

1.3 样品表征

采用透射电镜和扫描电镜检测量子点和脂质体的大小和形貌。荧光光谱仪和倒置荧光显微镜(DP70照相系统)检测量子点以及脂质体的荧光性质,Malvern zetasizer 3 000粒径/电位分析仪进行粒径测定。

2 结果

2.1 形貌及粒度表征

对所得到的油溶性Cd Se量子点(a)和包裹有量子点和药物的脂质体做透射电镜(b)的表征。脂质体表征时将浓度控制在1 g/L左右,采用磷钨酸负染法染色[11]。图1(a)中可以看出油溶性Cd Se量子点尺寸分布均一,分散性良好,粒径约为2.8 nm。图1(b)为包裹有量子点和药物的脂质体的电镜照片,可以看出脂质体具有良好的分散性,大小仍然比较均一,平均粒度为253 nm。

对脂质体做扫描电镜的表征,表征结果表明冻干法得到的脂质体呈均一的球状,其状态特征优于文献[7,8,9]的结果。

用激光散射粒度分析仪测定纳米粒的平均粒径和分布,测试角为173°,测试温度为25℃,其中平均粒径采用数量分布(number distribution)的结果,油溶性颗粒的平均粒径在2~3 nm,粒度分布均匀。脂质体的粒度分布稍宽,主要在(253±70.32)nm。

2.2 荧光性质表征

油溶性量子点以及脂质体的荧光发射光谱检测如图4所示,激发波长为400 nm,扫描范围400~650 nm,同时以罗丹明B的乙醇溶液为标准(97%)溶液计算得到产品的量子产率[12,13],计算结果约为83%,与文献报道类似。图中曲线(a)为油溶性量子点,曲线(b)是包裹后脂质体,对比可以发现包裹前后荧光峰位和半峰宽基本上没有发生变化,最大荧光吸收峰与油溶性量子点一样均为512 nm,并且与量子点的荧光峰未发生干涉。这也充分说明了荧光脂质体的荧光光学特性主要是来自于包裹的Cd Se量子点,量子点在脂质体中的含量和分散状态直接决定了其荧光性能。另外,脂质体包裹后量子点的荧光最大发射峰没有发生明显的红移现象,根据荧光发射光谱理论,在包裹过程中说明量子点本身没有发生团聚。

图5是量子点与荧光纳米脂质体的荧光显微照片,图中的标尺为20 nm,可以看出包裹前的量子点显示出强烈的荧光特性和均一的分散性。荧光标记的脂质体同样显示出优良的荧光性质,图中的标尺为500 nm,脂质体的分散性良好、粒度均一,没有大量的团聚发生,因此很好的达到了荧光标记的效果。

2.3 包封率测定

包封率按文献[14,15]采用离心方法测定,由于脂质体的粒径较大,因此采用超速离心法来测定。紫杉醇脂质体溶液经超速离心取沉淀后测定游离紫杉醇含量,流动相为甲醇-乙腈-水(4:3:3),C18色谱柱,6 mm×250 mm,流速为1.0m L/min,检测波长为227 nm。对多批次的紫杉醇脂质体包封率的测定结果见表2,其包封率均高于95%。

本文中使用具有特殊荧光特性量子点作为脂质体的标记物,参考文献[7,8]报道用脂质体包裹量子点的包封率在50%左右,可以充分满足标记的需要,因此此处未对量子点的包封率做出研究。在试验中对脂质体的表征均使用水性溶液,其表现出优良的荧光特性,而油溶性量子点在未经表面处理的情况下暴露在水溶液中会很快被淬灭,也说明了量子点是被包裹进脂质体中而非吸附在脂质体的表面。

3 结语