沼气发酵残留物

沼气发酵残留物（精选六篇）

沼气发酵残留物 篇1

1 材料与方法

1.1 时间

测试于2014 年9 月~2015 年6 月进行。

1.2 测试材料

1.2.1 供试温室

400 米2标准日光温室。

1.2.2 供试沼气发酵残留物沼渣、沼液, 发酵原料为鲜牛粪, 经测定, 其主要理化性质见表1。

1.2.3 供试蔬菜

黄瓜, 其品种是日光温室专用的津绿3 号, 其性能为抗弱光能力强, 抗低温, 而且适合日光温室越冬和冬春茬栽培。

1.3 测试方案和管理

1.3.1 测试处理

本测试设2个组:

组1, 施用沼肥;

组2, 施用普通化肥。

每个组的地区尺寸为6.3m×1.8m, 每组均种植两垄黄瓜, 测试区的布置见图1。每组黄瓜均于2014 年9月30 日播种, 10 月25 日跟黑籽南瓜进行嫁接, 并使用营养钵育苗, 11 月20 日进行定值, 方向为南北向, 栽植方式为宽窄行, 宽行为80cm, 窄行为50cm。株距为30cm, 每垄种20 株。

1.3.2 两组施肥设计方案

黄瓜每成长为100kg产量对氮、五氧化二磷、氧化钾的需求量分别为0.4kg、0.35kg、0.6kg。两组均按照这一标准并尽可能遵照使施入的主要养分含量相似的原则来施肥。其中1/3 的养分由基肥施入, 其余养分由后期追肥和喷施施入。

基肥:黄瓜在定植前, 组1 施20kg沼渣作基肥;组2 施0.9kg的磷酸二铵 (氮、五氧化二磷的含量分别是16% 和20%) , 0.15kg的尿素 (氮的含量为46%) 和0.6kg氯化钾 (氧化钾的含量为50%) 作基肥。

追肥:2015 年1 月15 日进行追肥, 同期同量灌水, 组l把沼液和水按一比一的配比来耦合灌溉, 每次灌施沼液和水各40kg;组2 每次随水冲施相当量化肥, 0.18kg磷酸二铵、0.03:尿素和0.10kg氯化钾。2015 年3 月前每20d浇灌一次, 3 到4 月每15d浇灌一次, 之后每7d浇灌一次。两组方案如下: 处理1 于1 月20 日、2 月10日、3 月1 日、3 月15 日、3 月31 日、4 月10 日、4 月18 日、4 月27 日、5 月4 日、5 月12 日分别耦合灌施沼液与水各40kg;处理2 同期每次灌水80kg, 并随水冲施0.18kg磷酸二铵、0.03kg尿素、0.10kg氯化钾。

叶面喷施:两处理均是每15d喷施一次, 处理l将沼液与水按l:1 的比例进行耦合叶面喷施, 每次喷施沼液与水各5kg;处理2 同期喷施溶有0.05kg硫酸钾复合肥 (N、P205、K20 的含量分别为15%、15%、15%) 的水溶液10kg。

1.4 测定试验及方法

1.4.1 所用主要仪器

WFZ754型紫外可见分光光度仪

FTY—Ⅱ型多功能土壤分析仪

1.4.2 测定试验及方法

1.4.2.1土壤及厌氧发酵残留物理化性质测定

含水率:100℃~105℃烘干称量法

有机质:水合热—光电比色法

容重:环刀法

全氮:过硫酸钾氧化—紫外分光光度法

腐殖酸:焦磷酸钠浸提, 重铬酸钾氧化比色法

全磷:钼锑钪分光光度法

速效磷:Na HCO3浸提—钼锑钪比色法

速效钾:四苯硼钠比浊法

氨态氮:不用硝普钠的靛酚兰比色法

p H:电位法

1.4.2.2 黄瓜的生育性状指标测定

叶绿素:丙酮—乙醇比色法

病虫害情况:观察法

长势:观察法

1.4.2.3 黄瓜产值和产量的测定

记录每次的采摘量, 汇总后得到测试区的总产量, 然后记录销售情况。

1.4.2.4黄瓜品质的测定

还原糖:碘量法

干物质:100 ~ 105℃恒重法

可溶性蛋白质:考马斯亮蓝G-250法

固形物:折光仪法

Vc:2, 6—二氯酚靛酚法

2结果与分析

2.1 对土壤肥效的测试

两组在黄瓜定植前 (2014 年10 月7 日) 和生育后期 (2015 年5 月21 日) 先后取0 ~ 20cm土壤层的土样风干, 然后过lmm筛进行土壤肥效指标测定, 结果见表2。

2 处理土壤理化性质在栽培前基本相同, 经过一个生长期的培养后, 差异较显著。与处理2 相比, 处理1 的土壤含水率高11.38%, 容重低6.38%, p H值高5.01%;有机质、氨态氮、速效磷、速效钾的含量分别增加31.68%、28.67%、26.26%、12.63%。土壤理化性质测定结果表明, 沼气发酵残留物可以改善土壤结构, 提高土壤保水保肥和通透能力, 降低土壤的酸化板结, 能够有效提高土壤肥力。土壤有机质有利于土壤微生物的活动和土壤团粒的形成, 代表着土壤供肥的潜在能力及稳定性, 处理1 的土壤有机质含量显著提高, 这和沼气发酵残留物中富含有机质和腐殖酸有着直接的关系。施用沼气发酵残留物, 不但可以为当季的作物提供很好的土壤环境, 并且具有很强的持续性。

2.2 对生育性状、产值和产量的测试

通过观察黄瓜的生长期得出这样的结论:施用了沼气发酵残留物的黄瓜, 茎秆粗壮, 发育敦实, 长势较好, 叶色浓绿。在2015 年4 月23 日对两组黄瓜都随机观察50 片叶子, 组1 的虫害和霜霉病发生率比组2 相对要低20% 和25%。叶片表面的叶绿素含量的测定结果说明, 组1 的叶绿素含量比组2 的高9.17%。沼气发酵残留物的施用, 改善了黄瓜的生育性状、减轻了病虫害, 而且提高了叶片的叶绿素含量, 可能是与沼液和沼渣中丰富的营养元素和沼液中大量的生长素、赤霉素、维生素等“生物活性物质”的综合调控作用有关。

两组黄瓜的结瓜量和销售情况的记录统计结果说明, 施用沼气发酵残留物。单株结果量多, 果实重, 瓜条长, 弯曲率少, 商品形状好。处理1 与处理2 相比, 测试区前期 (2015 年4 月1 日前) 约增产19.83%, 总产量增加16.36%, 每400m2收益增加2952 元, 增收26.94%。

两处理黄瓜生育性状及产量、产值记录统计结果见表3。

2.3 对黄瓜品质的影响

2015 年4 月22 日对两处理随机取样进行黄瓜品质测定, 结果见表4。

由黄瓜营养成分测定结果可知, 处理1 的黄瓜, 干物质、固形物、还原糖、Vc、可溶性蛋白质的含量分别比对照高5.12%、4.08%、29.19%、 20.88 %、10.90%。这表明沼气发酵残留物的施用能改善黄瓜的品质, 尤其可以明显提高黄瓜的还原糖和维生素C含量。

3结论

3.1 对温室黄瓜施用沼气发酵残留物

可以提高土壤的通透性和保水保肥能力, 能改善土壤的理化性质, 也可能显著提高土壤的有机质含量, 还能缓解土壤的板结酸化。与施用沼气发酵残留物的土壤有机质含量可以比传统的方式提高30.97%。

3.2 施用沼气发酵残留物可以改善黄瓜的生育性状

降低病虫害, 且提高叶片的叶绿素含量, 黄瓜总产量提高16.29%, 每组温室可提高收入2890 元。

3.3 施用沼气发酵残留物可以提高黄瓜的品质

尤其可以明显地提高还原糖和维生素C的含量, 它们相应提高了29.21% 和20.79%。

摘要：为了更好地推广和普及沼肥的应用, 进行了对比黄瓜施予沼肥和化肥的实验。结果表明:在土壤肥效方面, 沼肥可为当季作物提供较好的土壤环境, 而且具有较强的持续性;在产量方面, 施予沼肥的测试区总产量增加16.36%, 增收26.94%;在果实品质方面, 施用沼肥可以改善黄瓜的品质, 尤其能显著提高黄瓜的还原糖和Vc含量。

关键词：沼肥,肥效,产量,产值,果实品质

参考文献

[1]边义浅谈沼液、沼渣综合利用的新思路[J].农业工程技术·新能源产业, 2013 (5) .

沼气池发酵管理六法 篇2

“三结合”沼气池从启动开始，可陆续向池内进料，当累计进料量达到池容的85%～95%时，开始出料。添加新料时，切忌加大用水量，以免降低发酵浓度，影响产气效果。

二、注意检查发酵液的酸碱度。配料不当或突然变换添加原料都会影响发酵液的酸碱度，如一次投入大量青草、绿肥或蚕沙，会使发酵液变酸，造成产气量下降或气体中甲烷含量减少。发酵液偏酸时加入适量的草木灰、氨水或石灰水等调节；偏碱时加入适量的青草、蚕沙等原料加以调节。

三、适当搅拌。设有抽吸式出料器的污泥回流沼气池，每天定时抽拉活塞10分钟左右，使池内料液巡回流动。无搅拌装置的沼气池，可用长柄竹木器从进、出料口伸入池内来回搅动，每天一次，每次20～30下。在冬季，无论回流、搅拌，均宜选择晴天进行，以免降低池温，使产气量下降。如果浮料结壳严重，应打开活动盖，破坏结壳层。

四、检查是否漏气。当采用正确的发酵、管理方法后，沼气池的产气量依然明显下降时，应认真检查沼气导气管和池盖连接处、输气管和开关等是否漏气，发现问题要及时修补或更换。

五、大换料。采用人畜粪、尿等流体、半流体原料发酵的沼气池，平时小进小出，3年左右应大换料一次，采用猪牛栏粪（稻草垫料）原料发酵的沼气池，每年一般在春季或秋季用肥时大换料1～2次。换料时注意：

1.在寒冬季节（气温、池温在10℃以下），若无保温设施，不宜大换料，否则启动不好，影响产气效果。

2.要先备料、后出池，不备料、不出池，做到随出随进。

3.“三结合”沼气池在换料前一个月应停止人畜粪便流入池内，为大换料准备原料，也防止寄生虫和病原菌入池。

4.大出料时，要留10%以上的池底活性污泥或30%的发酵液做重新投料启动的接种物。

5.换料后要对池内外结构进行一次检查，若发现裂缝应及时修复；未刷密封涂料的池子，可用20千克左右的浓水泥浆进行一次保护性粉刷。

六、安全发酵。

1.严禁向沼气池投放剧毒农药、各种杀菌剂以及对沼气发酵过程有影响的抑制剂，以免使正常发酵遭到破坏，甚至停止产气。如出现此种情况，应将池内发酵液全部清除，并用清水冲洗干净，重新投料启动。

2.禁止将电石（CaC2）入池，以免杀死池内沼气微生物和引起爆炸事故。

3.勿将某些农副产品如菜籽饼（油饼）、棉籽饼、骨粉及过磷酸钙等入池，以免产生有毒气体。

4.严防雨水和地沟水流入沼气池内，防止淹没气箱，冲淡料液浓度，降低池温，影响产气。

（作者联系地址：辽宁省抚顺市新抚区南花园街道湖边社区1委16组53栋2单元303号 邮编：113008）

沼气发酵残留物 篇3

1 材料与方法

1.1 试验概况

小白菜栽培试验在嘉鱼县新街镇乡名堂合作社蔬菜大棚内进行, 小白菜品种为上海青。供试土壤为砂壤土, 土壤的理化性质:含水率17.6%, 有机质3.12%, 总氮0.05%, 总磷0.06%, 总钾1.53%, 速效钾0.2%, 土壤肥力中等。供试沼渣营养成分指标:p H值7.3, 总氮1.12 g/kg, 全磷0.47 g/kg, 全钾0.76 g/kg, 有机质39%。供试肥料:测土配方肥 (由县土肥站根据全县测土数据将氮、磷、钾肥按一定比例混合而成) ;沼渣有机肥 (由养猪场沼气池发酵1个月后正常产气所产生的沼渣经好氧堆制而成) ;三元复合肥 (在市场上购买品牌产品, 氮、磷、钾含量≥45%) 。根据肥料元素平衡原理, 将沼渣有机肥与无机肥按不同比例配制成A肥 (沼渣95%+测土配方肥5%) 、B肥 (沼渣95%+三元复合肥5%) 、C肥 (沼渣有机肥) 。

1.2 试验设计

试验共设4个处理, 分别为小区施用A肥15 kg (A) ;小区施用B肥15 kg (B) ;小区施用C肥15 kg (C) ;不施肥作为对照 (CK) 。每个处理重复3次, 随机区组排列[1,2,3]。小区面积为10 m2。

1.3 试验过程

试验于2015年9月17日定植小白菜, 9月21日小白菜基本成活, 2015年11月7日收获并测定小白菜品质和产量。将土壤翻耕后, 在试验前将供试肥料作为基肥一次性均匀地施入到土壤中。在大棚内对小白菜进行育苗, 待其长至3叶1心时定植到小区中。移栽结束后对每个小区浇灌等量的水, 保持土壤湿润, 以供作物吸收水分。小白菜生长过程中, 不定期浇水, 保持土壤湿润。10月1日 (即小白菜成活第10天) 使用浓度为0.3%的尿素溶液对小白菜进行追肥。

1.4 测量内容与方法

在小白菜生长过程中测量其最大叶宽度、叶片数和株重, 在小白菜生长过程中观察叶绿素的感官指标, 在小白菜收获时称量其株重, 并计算单位面积产量, 同时测量小白菜中VC含量[4,5,6]。

2 结果与分析

2.1 复混肥配方对小白菜生长指标的影响

2.1.1 复混肥对小白菜叶片数、最大叶宽度和株高的影响。由表1可知, 处理A叶片数、叶宽和株高3项数值都是最高的, 与CK差异极显著, 与处理C差异显著。处理B的叶片数和叶宽与处理A差异不大;但处理B的株高比处理A较低, 两者差异明显。处理B与处理C两者差异不大。CK小白菜叶片数量、叶宽数和株高较低, 与处理A及处理B差异极显著, 与处理C差异显著, 其中叶宽差异极显著, 这主要因为施肥不足阻碍小白菜叶片的生长发育。根据小白菜叶片数、叶宽和株高指标, 处理A和处理B更适合于小白菜的生长。

2.1.2 复混肥对小白菜叶绿素含量的影响。

试验结果表明, 在小白菜不同的生长阶段, 不同的施肥配方对小白菜叶绿素的影响不同, 处理A、B的叶色为深绿, 处理C的叶色为浓绿, CK的叶色为淡绿。本试验没有测定各处理的叶绿素含量数据, 为了更好地研究不同施肥配方对小白菜叶绿素含量的影响, 需要从小白菜生长初期开始了解, 因此需要深一步的研究。

2.1.3 复混肥对小白菜产量的影响。

由表2可知, 处理A小白菜产量最高, 其次是处理B和处理C, CK产量最低, 所有施肥处理小白菜产量高于不施肥处理, 施肥与不施肥产量差异显著, 处理B与处理C产量差异不显著, 小白菜株重与产量呈正相关。

2.2 复混肥配方对小白菜品质的影响

各处理中小白菜VC含量高低依次为处理C>处理A>处理B>CK, CK VC含量最低, 为151 mg/100 g, 处理A、B、C的VC含量分别比CK高出14.57%、11.92%、23.84%。VC含量最高的是处理C, 处理A与处理B的VC含量比较接近, 差异不大。

3 结论与讨论

根据小白菜叶片、叶宽和株高指标分析, 95%沼渣+5%测土配方肥、95%沼渣+5%三元复合肥的施肥处理更适合小白菜的生长, 与不施肥处理产量差异显著。根据小白菜株重知, 施肥处理有利于作物的生长, 这也就是传统蔬菜种植过程中, 为了追求产量必须施用大量化肥的原因。从叶绿素含量来看, 小白菜施肥配方可以选择施用沼渣有机肥处理, 全沼渣有机肥处理效果最好, 95%沼渣+5%测土配方肥处理优于95%沼渣+5%三元复合肥处理。总的而言, 95%沼渣+5%测土配方肥处理最适合小白生长指标的变化, 95%沼渣+5%三元复合肥处理也可供于选择。

施用沼渣有机肥不利于小白菜叶片数、株高增加, 但利于小白菜叶绿素和VC含量的产生。95%沼渣+5%测土配方肥产量最高, VC含量低于施用沼渣有机肥。95%沼渣+5%三元复合肥处理在各项指标上均差于95%沼渣+5%测土配方肥处理, 而不施肥处理的产量、叶绿素及VC指标最低, 效果最差。

参考文献

[1]丁成章, 林银卿, 单既亮, 等.生物复混肥对小白菜产量、品质及土壤肥力的影响[J].广东农业科学, 2010 (3) :97-98.

[2]赵丽, 周林爱, 邱江平.沼渣理化性质及对无公害蔬菜营养成分的影响[J].浙江农业科学, 2005 (2) :103.

[3]王远远, 沈飞, 刘荣厚, 等.沼肥对小白菜产量及品质的影响[J].可再生能源, 2007, 25 (5) :42-43.

[4]熊汉琴.上海青小白菜施沼肥效果研究[J].陕西农业科学, 2011 (5) :88-89.

[5]黄惠珠.沼肥营养成分与污染物分析研究[J].福建农业学报, 2010, 25 (1) :86-89.

沼气发酵残留物 篇4

1 沼气发酵的菌种

沼气发酵菌种的质量、数量以及组成是沼气使用的关键因素。沼气细菌在沼气池生长繁殖需要充足的营养成分, 如氮、碳、水、无机盐、生长素等, 通过发酵反应充分产生沼气。沼气发酵的菌种根据原料的组成成分可以分为富含氮元素的原料以及富含碳元素的原料, 它们都可以产生大量的甲烷菌群[2]。富含氮元素的原料主要包括人、牲畜、家禽的粪便, 此类原料经过肠胃消化系统的处理, 形成分子化合物, 颗粒细小, 含水量较高, 易于形成厌氧发酵, 可以省去预处理, 此类菌种的特点就是发酵时间短, 产气快, 产气持续稳定。富含碳元素的原料主要是来自农作物的剩余物, 如秸秆、秕壳、杂草等, 其中还有丰富的纤维素、半纤维、木质素以及果胶等物质。但是由于这类原料体重轻、质量小, 容易漂浮, 含水分少, 需要进行预处理, 与含氮元素的原料相比产气速度较慢, 发酵时间较长。发酵原料中的氮元素作为细胞质组成的重要元素, 与提供生命活动能量的碳元素相比, 发酵消耗速度慢25倍左右, 为了使沼气池中有合理的氮碳搭配, 使其原料既能够使用较长时间, 同时还能充分发挥原料的作用, 应该使氮与碳的配比在1∶25左右。因此, 沼气发酵的菌种不仅是放置足量的原料, 还要有合适的配比, 才能做到资源的优化使用。除了上述沼气发酵的菌种外, 还有有机垃圾、生活污水、废渣和污泥、水生植物等原料, 水生植物由于繁殖速度较快, 产量高, 易形成厌氧发酵分解, 也是非常好的菌源材料。由于沼气发酵与含水量有非常重要的关系, 因此还可以分为固体原料、浆液态原料、有机废水等[3]。

2 沼气发酵原料浓度

农村沼气池单位面积每天所承受的有机物数量即为沼气池的负荷, 主要由厌氧活性污泥的数量和活性决定, 其体现方式就是发酵原料的浓度, 而沼气发酵浓度则是沼气池产气的根本保证。沼气池发酵原料浓度主要受发酵原料的种类、元素组成、工艺目标、发酵装置以及工艺流程等综合因素的影响, 发酵浓度的改变能够改变沼气池的产气率和使用率以及产气数量等。由于原料的分解发酵需要大量的水, 所以原料的浓度一定要掌握准确。只有沼气池中的原料达到一定浓度后, 才能正常产气。浓度过低, 水分过多, 产气量减少, 沼气池利用率低;浓度过高, 水分过少, 原料不容易发酵分解, 甲烷菌过多, 造成有机酸的大量积累, 阻碍了细菌的产生。实地调研表明, 张庄寨镇海青行政村海青自然村的王明星、王其坤、李世民3户在2012年4月同时建成沼气池。王明星是养殖户, 养殖有种猪、育肥猪、仔猪近200头, 每天冲刷猪舍的污水 (渣) 达800 kg, 其将养猪场的冲刷液 (渣) 投入沼气池中;王其坤养殖5头育肥猪, 按照技术人员的指导, 使用正常料液比例进行投料;李世民购买4 t猪粪全部投入沼气池内。结果发现, 王明星的沼气产气速度快, 只用10 d的时间便能用沼气做饭, 但产气量少, 产气断断续续不能正常使用;王其坤的沼气池投料后14 d开始产气使用, 产气率高而且稳定, 日常使用有较大的结余;李世民的沼气池投料后长时间无法使用, 经过排查发现, 李世民的沼气池发酵原料投放太多, 浓度偏高, 产气速度快但产气量少。经技术人员正确指导后, 其抽出大量料液, 投入了经过发酵的猪粪, 抽出1.5 t猪粪, 又注入1 t水, 使料液浓度在8%左右。经过15 d后, 王明星和李世民2家的沼气池产气趋于稳定, 并可以持续正常地使用。实践证明原料浓度过高或过低都不利于沼气的发酵分解。

沼气发酵原料的浓度除受外部料水影响外, 还受原料自身含水量影响。同时发酵的浓度还受季节、温度等因素的影响, 温度越高所需原料浓度越低, 发酵速度也越快, 因此应随着季节和温度的变化调整投料的数量和种类, 夏季一般保持在5%~7%, 冬季保持在8%~10%较为适宜。由于原料投入沼气池后, 会产生自然沉淀形成分层, 为保证原有的发酵浓度、原料的均匀分布, 应持续搅拌, 从而促进沼气产量的均匀和持久, 促进原料的充分使用[4]。

参考文献

[1]李祥志.沼气发酵菌种与发酵原料浓度[J].安徽农学通报, 2008, 14 (16) :125.

[2]周宪龙, 李强, 黄涛, 等.不同发酵原料对户用沼气产气量的影响[J].农学学报, 2012, 2 (12) :57-61.

[3]傅继宁.沼气发酵影响因素和调控技术[J].中国农业信息, 2012 (21) :116-117.

秸秆沼气发酵工艺技术 篇5

农业部规划设计研究院农村能源环保所以“十一五科技支撑计划项目”为依托, 优化集成了“秸秆一体化两相厌氧发酵”工艺技术。他们已在天津静海县四党口村建立了一座1200立方米大型发酵罐的集中供气示范工程, 产气率比一般沼气发酵罐高20%;年产沼气54万立方米, 能满足1000户农民作饭所用;一年可以消化2000吨青贮秸秆。该技术前不久通过了专家鉴定。专家认为, 该项技术解决了秸秆沼气发酵的难题, 拓宽了沼气发酵原料的来源, 开辟了秸秆综合利用的新途径, 创新点突出, 达到国内领先水平, 推广应用前景广阔。

我国每年有2亿吨左右秸秆未被及时处理, 造成大气污染和资源浪费。秸秆含有大量有机物, 可通过厌氧发酵产生沼气, 但由于秸秆的木质纤维素含量高、流动性差, 以秸秆为原料的沼气工程存在进出料困难、产气不稳定及发酵速度慢、效率低等问题。“秸秆一体化两相厌氧发酵工艺技术”的主要创新点首先在预处理技术上, 它是在秸秆发酵前的预处理过程中引入畜牧业的青贮技术, 既解决了秸秆的保存及消化问题, 又能促进其后期发酵;在进料方式上, 该技术通过优化设计饲料行业敞开式的气动输送设备, 实现了大粒径物料的密闭输送;“秸秆一体化两相厌氧发酵工艺技术”的“厌氧消化反应器”结构也是创新点, 它在同一发酵罐中将产酸和产甲烷分开在不同区域, 使产酸和产甲烷的菌种分别达到最佳的发酵效果, 增强了不同菌种间的互补和协同作用, 提高了产气效率;此后又将沼液回流至集料池与进料混合, 实现了物料的多次接种, 进一步提高了产气效率。

沼气发酵菌株的分离与性质分析 篇6

关键词：甲烷菌,分离方法,沼气

沼气是生物质能的重要组成部分,开发利用沼气资源对促进可再生能源发展,保持绿色生态环境有着重要作用。沼气发酵是一种多菌种协作发酵过程,由多种产甲烷细菌与非产甲烷细菌混合共同完成。其发酵过程是一个产甲烷细菌和非产甲烷细菌相互作用,相互制约的动态平衡过程。其中重要的功能菌株——甲烷菌是一种厌氧菌群,氧气的存在对其生长繁殖有着重要的危害作用,因此,长期以来在对甲烷菌进行分离纯化的过程中都需要严格的厌氧操作技术和复杂的实验设备,其分离纯化工作长期以来都制约着沼气的开发利用。作者课题组在长期从事沼气相关科研的过程中采用了两种方法,一种为传统的Hungate滚管法,一种为经过反复研究总结的方法,暂且叫包埋产气法。为更多实验室开展对甲烷菌的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

试验菌株分自黑龙江省科学院微生物研究所在研的沼气产气菌群。

1.1.2 培养基

氯化铵0.1%;氯化镁0.01%;磷酸氢二钾0.04%;酵母提取物0.2%;蛋白胨0.2%;半胱氨酸0.05%;甲酸钠0.5%;乙酸钠0.5%;甲醇0.35%。

培养基A:上述培养基中加入琼脂糖1.5%;培养基B:上述培养基中加入琼脂糖0.5%。

1.1.3 仪器

AC2-4S1生物安全柜(ESCO BIOTECH 新加坡);DHP-9162恒温培养箱(上海一恒科技有限公司);JD100厌氧发酵罐(常州三环生物工程成套设备有限公司);TE2000倒置荧光显微镜(尼康);GC-14气相色谱仪;厌氧操作培养箱。

1.2 方法

1.2.1 Hungate滚管分离法

1.2.1.1 滚管接种

取10支盛有4.5ml无氧固体培养基的试管,加热融化后置于50℃水浴内,用无菌注射器取0.2ml样品稀释液接种,缓慢摇匀,避免气泡产生,立即平放入冰水中迅速滚动,使凝固的琼脂培养基均匀地贴附于管壁上。整个过程中要注意防止空气进入滚管,置于35℃培养箱中培养。

1.2.1.2 挑取菌落

首先准备挑菌落所用的弯头毛细管。将普通滴管的细头端在火焰上拉成毛细管,另一端塞上棉花并套上橡胶滴头。高压蒸汽灭菌后待用。挑菌步骤要求严格无氧,因此必须在厌氧操作箱中内进行。毛细管吸取菌落,吹至液体培养基内,盖紧管口。重复2～3遍直至得到纯培养物。

1.2.2 厌氧包埋产气法

1.2.2.1 底层斜面的制备

将培养基A融化后取8mL加入试管中,120℃灭菌20min;摆成长度约6～8cm的斜面,凝固后备用。

1.2.2.2 表层覆盖培养基的制备

将培养基B置于三角瓶中120℃灭菌20min,灭菌后培养基未凝固前使用,若培养基凝固,则使用微波炉加热至完全融化,置于50℃水浴中备用。

1.2.2.3 沼气发酵物的稀释及接种

取中温沼气发酵沼液,置于在厌氧操作箱中用无菌水连续稀释到10-1至10-7数量级,用接种环沾取各浓度稀释液于斜面培养基A上划线。划线结束后,立即将培养基B倒入试管中,使培养基B完全覆盖培养基A斜面,竖直放置,待培养基B凝固,置于培养箱中培养。

1.2.2.4 菌株纯化培养

待各试管中产生气泡后,选取气泡分布均匀、独立的试管,于厌氧操作箱中将气泡上层培养基取出,并迅速用接种环刮取气泡内壁菌落于斜面培养基A上划线,立即将培养基B倒入试管中,使培养基B完全覆盖培养基A斜面,竖直放置,待培养基B凝固,置于培养箱中培养。

1.2.3 分离菌株验证

1.2.3.1 涂片观察

纯产甲烷菌培养物染色结果应该均匀,细胞形态应统一,如果是杆菌,则菌体粗细程度应相等,镜检中不应观察到杂菌。

1.2.3.2 荧光菌体观察

用注射器取对数生长期的菌液,涂布于干净的载玻片上,直接加盖玻片,用落射式荧光显微镜高倍镜1 600×观察。在用420nm波长光照射下,视野中的所有菌体均应发出黄绿色荧光,证明其含有辅酶F420。

1.2.3.3 丰富培养基生长试验

产甲烷菌不能利用复杂有机物作为碳源底物,可依此来检测产甲烷菌中是否含有镜检无法发现的数量极少的杂菌。将少量菌液接种于无菌无氧的细菌液体培养基中,37℃摇床培养3d,如无生长状况出现,则视为纯甲烷菌培养物。

1.2.4 分离菌种性质测定

1.2.4.1 碳源底物测定

配制含有甲烷菌可能利用的不同碳源底物的液体培养基。将待测产甲烷菌对数期菌液以4 %的接种量同时接入各底物利用培养基,置于35℃静置培养1w以上,以色谱法测定生长。

1.2.4.2 最适生长温度试验

将同一种菌相同接种量的液体培养基同时放置于不同培养温度下静置培养,1w后用色谱法同时测定各瓶内的CH4产量。

1.2.4.3 最适生长pH和pH范围测定

在不同pH值的培养基中,通过比较比生长率的测定,以确定pH范围和最适生长pH。在生长过程中或生长后测定pH,以确保pH值保持在有效范围内变化。

1.2.4.4 抗生素敏感试验

选取了有代表性的6种常用抗生素,加至配好的无菌乙酸钠液体培养基中,接种及生长测定同上。

1.2.4.5 生长速率测定

以比浊度法测定产甲烷菌在液体培养基内的生长速率。将菌液以 1 %的接种量接入250ml甲烷菌培养基中。静置培养, 每隔24h取样1ml,用分光光度计在600nm处测量OD值。直至1w后生长速率明显降低。以OD值和菌体生物量的关系求得生长速率。

1.2.4.6 产气量的测定

将待测产甲烷菌对数期菌液以1 %的接种量同时接入液体培养基10ml,置于静置培养3d以上,测定沼气产量。

2 结果

2.1 厌氧包埋产气法

由1.2.2中方法接种后,经过中温培养,培养基中产生气泡,后期部分气泡相通后使培养基断裂分层。结果见图1。

2.2 菌株纯度测定

由1.2.3.1中方法对分离菌株的纯培养物进行镜检,结果见图2。

2.3 分离菌株细胞形态及生理生化条件

分离菌种的细胞形态及生理生化条件结果见表1。

2.4 抗生素敏感试验

所得结果如表2所示(+代表对抗生素敏感,-代表对抗生素耐受)。

2.5 分离菌株生长率测定

由1.2.4.5方法对分离菌种进行培养和测定,结果见表3、图2。

2.6 产气量的测定结果

由1.2.4.6方法进行培养和测定,产气结果见表4、图3、4

3 讨论

对于包括甲烷菌在内的厌氧菌分离,目前国内普遍使用的方法是亨盖特滚管系列分离方法。这些方法的优点在于分离步骤严谨、分离菌株特异性强、适用菌种广等,但同时也存在着实验设备要求较高、操作相对繁琐等不足,这样就制约了一些实验设备不足的科研单位开展对甲烷菌的研究工作。在最初尝试使用双层斜面法纯化培养甲烷菌时,双层培养基琼脂使用相同的1.5%用量,随着菌落增长并产气,培养基断裂并分层,不易判断菌株位置。随后更换使用下层1.5%,上层0.5%的琼脂用量,这样既保证了下层培养基的支撑力,又获得了较松软的容纳气泡空间,培养后得到了相互独立且大小比较均一的气泡,便于获取菌株进行纯化。本文中使用的厌氧包埋产气法在对甲烷菌的分离操作中,同样能够达到菌株分离及纯化的目的,为甲烷菌的分离纯化提出了一条新的思路。与此同时,该方法在尝试初期也存在着诸多不足之处,希望专家提出建议以备我们在今后的科研工作中继续完善。

参考文献

[1]中国科学院微生物研究所《菌种保藏手册》编著组.菌种保藏手册[M].北京:科学出版社,1990:238-239.

[2]龚革,王修垣.九株嗜热产甲烷菌的特性[J].微生物学报,1997,37(5):378-384.

[3]陈光胜,东秀珠,苏京军,等.厌氧降解丁酸共培养物中产氢产乙酸细菌与产甲烷细菌的分离与再组合[J].微生物学报,1995,35(6):442-449.

[4]石万良,钟传奇,唐兵,等.极端嗜盐古生菌(Natrinema sp.)R6—5胞外嗜盐蛋白酶的纯化和性质研究[J].微生物学报,2007,47(1):161-163.

[5]刘晓风,徐恒,邓字,等.一株产甲烷菌的生物学特性及系统发育分析[J].四川大学学报,2006,43(3):661-665.

[6]杨秀山,田沈.固定化甲烷八叠球菌研究[J].中国环境科学,1997,17(3):265-271.

[7]刘亭亭,曹靖瑜.产甲烷菌的分离及其生长条件研究[J].黑龙江水专学报,2007,34(4):120-122.