促红细胞生成素受体

促红细胞生成素受体（精选八篇）

促红细胞生成素受体 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

本次研究选取在2009年9月~2011年9月于我科行手术治疗获取的原发食道鳞状细胞癌及癌旁正常组织的手术标本共48例,其中男性33例,女性15例,年龄38~77岁,平均(55.49±8.13)岁。根据国际抗癌联盟(UICC)2009年肿瘤TNM分期标准,本次研究患者I期9例,II期23例,III期16例;经过临床病理检查,均为所有患者病理类型均为鳞状细胞癌,对照则选取28例癌旁正常食道组织,所得手术标本经过10%甲醛溶液固定,制成厚度为4μm的石蜡切片;所有患者均未接受术前化疗与放疗。

鼠抗人EPO-R免疫组化m Ab均购自美国Santa Cruz公司,DAB显色试剂盒购自北京博奥森生物科技有限公司;检测MVD时所用的兔抗人FVIII相关抗原m Ab均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

对EPO及EPO-R染色均采用免疫组织化学DAB显色法。将制成的石蜡切片常规脱蜡,于3mL/L过氧化氢去离子水溶液中浸泡15 min以灭活内源性过氧化物酶;于pH值6.0的枸橼酸钠抗晕修复液中煮沸3次,每次6 min进行抗原修复;自然冷却后滴加山羊血清静置30 min进行抗原封闭,滴加一抗在4℃孵育过夜;常温静置30 min,PBS冲洗,按照DAB显色试剂盒说明进行显色;脱水透明后采用加拿大树胶封闭。

1.3 染色结果观察

观察过程在Olympus Stream图像分析系统中进行,首先选用低倍镜(×40)找到染色较为明显的区域,再选用高倍镜(×200)随机选择6个不同视野观察后运用Olympus Stream图像分析系统自带软件采集并记录光密度值(IOD)值,IOD值越高,表示该染色强度越高,蛋白表达水平越高。MVD结果判定方法参照Weidner法,观察时视临近微血管、肿瘤细胞而分级清楚的细胞或细胞簇均为一个血管,先选用低倍镜(×40)观察FVIII阳性染色的血管,再选用高倍镜(×200)由两名病理科医师对5个视野微血管数量进行计数,取其计数平均值作为MVD值。

1.4 统计学分析

本研究所得数据均录入SPSS 14.0软件中进行分析处理,分析EPO-R与TNM临床分期之间的关系时,采用秩和检验;采用线性回归分析对EPO-R与MVD之间的关系进行分析,均以P<0.05视为差异有显著性。

2 结果

2.1 EPO-R表达情况及与TNM分期间的关系

EPO-R阳性蛋白染色后呈现棕黄色,多数表达于细胞膜上(详见附图);与正常组相比,EPO-R表达水平显著增高,且差异有显著性(P<0.05);随着TNM分期级别的升高以及肿瘤分化程度的降低,患者肿瘤组织EPO-R的表达水平显著升高,且差异有显著性(P<0.05)。详见附表。

注:1)与癌旁正常组织相比,差异具有显著性;2)与I期相比,差异具有显著性;3)与II期相比,差异具有显著性;4)与低分化相比,差异具有显著性;5)与中分化相比,差异具有显著性。

A:EPO-R在食道癌组织中的表达,免疫组织化学DAB显色;B:EPO-R在食道癌癌旁正常组织中的表达,免疫组织化学DAB显色

2.2 EPO-R与MVD之间的关系

患者MVD平均值为(29.31±5.54),EPO-R平均IOD值为(6423.78±355.41),线性回归分析显示,MVD与EPO-R水平之间呈现正相关,相关系数r=0.3795,t=5.416,P<0.02。

3 讨论

EPO是属于糖蛋白激素的一种,是细胞因子超家族的成员之一,与其配体EOP-R结合后,在胎儿肝脏及人类肾脏中红细胞形成的过程中起到关键的作用[3]。在造血组织中,EPO通过与其位于细胞表面的特异性配体EPO-R结合,并激活下游信号转导通路而发挥生物学功能[4]。该信号转到通路主要包括位于细胞质中酪氨酸激酶Jak2以及Jak2的下游分子Stat5活化等过程,此外,还与PI3K以及MEK/MAPK等转导通路有关[5]。研究发现,EPO-R还在许多非造血组织细胞中表达,包括肝脏间质细胞、神经元、巨噬细胞、肾脏血管内皮细胞以及平滑肌细胞中均有表达[6],参与组织器官发育、生理性血管生成、肉芽组织对创伤的修复以及促进神经祖细胞的生成分化等生物学过程[7]。

目前有许多研究发现EPO-R在肿瘤细胞系及肿瘤组织中存在表达,肿瘤细胞系或肿瘤组织中可能存在通过内分泌途径激活EPO、EPO-R信号转导通路的某些机制[8]。有研究显示EPO-R在如刺激肿瘤新生血管生成等肿瘤微环境的形成中发挥生物效应[9];肿瘤细胞表面的EPO/EPO-R复合体所激活的信号转导过程与肺癌、肝癌、胰腺癌及膀胱癌等多种肿瘤细胞的生成、增殖以及凋亡和其对放疗、化疗的敏感性有关[10]。还有研究显示,在动物实验中应用EPO-R特异性拮抗剂或药理浓度的Jak2及Stat5特异性拮抗剂可以不同程度的抑制大鼠乳腺癌进展的延迟[11]。本次研究发现,食道癌患者肿瘤组织内EPO-R呈现高表达,以上研究均说明EPO-R参与了食道癌发生、发展及侵袭转移的过程。本次研究还发现,随着食道癌患者临床TNM分期的提高,肿瘤分化程度的降低,EPO-R的表达亦逐渐显著增高,说明EPO-R的检测具有评估肿瘤严重程度的潜在价值。

促红细胞生成素受体 篇2

【关键词】养血饮；促红细胞生成素；肾性贫血

【中国分类号】R692.5【文献标识码】A【文章编号】1004-5511（2012）06-0136-02

一、引言

肾性贫血一般是指由慢性肾衰竭而导致的贫血现象。在临床中会出现肾功能衰竭的一些指标变化，其中主要的表现就是贫血。肾性贫血的发病原因各不相同，而且病情会产生一些迁延，治疗的疗程比较长，病情的好转比较缓慢，这些都导致了治疗肾性贫血的重要性和必要性。红细胞数、血红蛋白、红细胞压积(HcT)都是贫血的指标因素， 对于诊断、治疗以及康复过程中判断肾性贫血有非常重要的临床意义和价值。同时，肾性严重的贫血不仅会加速病者的器官功能，还会加快肾衰，为了延缓此进程，只有通过不断的改善肾性贫血的现象，才能延缓肾衰的过程 。目前，在改善肾性贫血的临床治疗中，促红细胞生成素得到了普遍的应用，对于改善病者的贫血有很大帮助，可以有效的消除病者贫血的广泛应用，改善了部分患者的贫血。但是在临床中人们慢慢发现，虽然有合理的促红细胞生成素合理，并且有充足的铁剂，还是会有一些病者反映治疗效果不理想。更有甚者产生了抗红细胞生长素抗体，或者是医源性纯红细胞再生障碍等严重的问题。随着中医药在肾性贫血治疗中逐渐产生的良好疗效， 已经得到了国内外的普遍认可和重视。中医药早肾性贫血治疗中，除了可以有效的提高红细胞压积外，还能有效的改善肾功能。因此，如果把二者相结合，通过中药养血饮配合促红细胞生成素来治疗肾性贫血，是非常值得探讨的并且有很大价值的。

二、临床资料

观病肾性贫血的病例有35例，都是来自于某医院肾病内科的门诊和住院患者，所有患者都符合相关的病例纳入标准、中西医诊断标准以及排除标准，并且采取随机选择的方式，把使用促红细胞生成素治疗者为对照组，病例例数为35例，使用养血饮配合促红细胞生成素治疗者为实验组，病例例数也是35例。并且对治疗前两组之间病人年龄、性别、病情、病程、原发疾病、治疗时间、慢性肾功能衰竭程度以及贫血程度等进行了科学的比较，经统计学分析，均无显著性差异(P>0.05)，两组间具有均衡可比性。

三、治疗方法

3.1 治疗方案:实验组和对照组都使用促红细胞生成素应用益比奥(沈阳三生公司出，2000U／支)，100u／kg／周。同时，试验组加服養血饮(吉林省力源药业股份有限公司产品)，每次1支，3次，d，两组均连续观察12周，其它治疗都相同。

3.2 观察指标: 安全性观测一般包括：一般体检项目检查、血、尿常规检查、肝、肾功能检查、心电图以及可能出现的不良反应等。主要的相关症状包括：头晕、心悸、乏力、头痛、皮肤瘙痒、恶心呕吐、气短懒言、形寒肢冷、口舌咽干、耳鸣目眩，等。相关的检查包括：尿常规、血常规、肾脏B超检查、肾功能检查以及每天的水液出入量。

3.3 疗效判定标准: 无效：积分变化<30％的症状；有效：积分变化30％——70%的症状；显效：积分变化>70％的症状；临床痊愈：积分变化>95％的症状。其中，证候积分计算按尼莫地平法：即计算指数n=［(治疗前积分一治疗后积分)二治疗前积分］×100％

3.4 统计方法：用Ridit分析等级资料，用差方检验计数资料，用t检验计量资料。

四、治疗结果

4.1 整体分析: 通过对两组临床治疗的检测分析得出，试验组无效4(11.4％)、有效14(40．0％)、显效16(45.7％)、临床治愈1(2.9％)，整体效率是88.6％；对照组无效8(22.9％)、有效15(42.9％)、显效11(31.4％)、临床治愈1(2.9％)，整体效率是77.1％。同时，对两组进行统计学分析，U=1.101，p>0．05，没有显著性差异，表示试验组与对照组的治疗疗效相当。但是整体观察，试验组的整体效率高于对照组，表明试验组的疗效比对照组略有优势。

4.2 体征分析:养血饮配合促红细胞生成素来治疗肾性贫血的过程中，通过治疗前后的观察发现，试验组治疗后在眩晕耳鸣(P<0.01)、神疲乏力(P<0.01)、心悸(P<0.01)、皮肤苍白(P<0.01)、恶心呕吐(P<0.01)、心悸(P<0.01)、头痛(P<0.05)、心悸(P<0.01)等现象中都有改善，特别是眩晕耳鸣、皮肤苍白、恶心呕吐等现象有了比较明显的好转。不仅如此，试验组在眩晕耳鸣(P<0.05)、心悸(P<0.01)以及皮肤苍白(P<0.05)等现象的治疗改善效果上比对照组略有优势，并且具有统计学意义。也就是说，总之，养血饮配合促红细胞生成素对肾性贫血的体征有一定的缓和和改善作用。

4.3 血红蛋白、血红细胞的分析:对治疗前后两组病例的血红细胞用t检验方法进行统计学分析，得出试验组和对照组都有显著性差异，表明两组对血红细胞都有一定的治疗作用，而且试验组(P<0.01)比对照组(P<0.05)的治疗效果更好一些。同样，对治疗前后两组血红蛋白的比较，用t检验方法进行统计学分析，得出试验组与对照组在治疗前后都有显著性差异(P<0.05)，但是试验组与对照组之间没有显著性差异(P>0.05)，表明两组对血红蛋白都有治疗作用，但是两个组在治疗效果上没有显著性差异。

4.4 试验组贫血程度分析:通过用Ridit分析法对试验组的疗效和贫血程度之间的关系进行统计学处理，发现 =1.36，大于 0.05(2)，P中度组>轻度组，这表明贫血程度越重，疗效效果越不好；反之，贫血程度越轻，治疗效果越明显。

五、讨论

近几年来，肾性贫血有比较高的发病率，而且治疗成效不是很明显，是内科比较难治疗的疾病之一。近年来，促红细胞生成素在治疗肾性贫血中发挥的一定的功效，但是仍然存在一些问题。鉴于养血饮具有补气养血的功效，因此，本研究就进行了养血饮和促红细胞生成素相配合使用来治疗肾性贫血的临床研究。通过研究发现，养血饮配合促红细胞生成素的试验组在整体治疗效率、体征、血红细胞等方面都比只使用促红细胞生成素的对照组效果更好。试验组的整体效率是88.6％，而对照组的整体效率是77.1％；试验组在眩晕耳鸣(P<0.05)、心悸(P<0.01)以及皮肤苍白(P<0.05)等现象的治疗改善效果上比对照组略有优势，并且具有统计学意义；血红细胞的比较中试验组(P<0.01)比对照组(P<0.05)的治疗效果更好一些。同时发现，肾性贫血程度越轻，治疗效果越明显。本研究把中医和西医的治疗方法相结合，结果发现治疗效果有一定的提高，中西医的结合对于肾性贫血的治疗有一定的改善作用，这对以后肾性贫血的治疗有一定的参考价值和意义。

参考文献

［1］叶任高主编．内科学［M］．第五版.北京：人民卫生出版社，2002．

［2］陈东河．补血生髓丸治疗肾性贫血56例［J］．天津中医，2000，17(3)．

［3］陈宇基.中西医结合治疗肾性贫血32例观察［J］．实用中医内科杂志，2002，16(3).

促红细胞生成素的制备 篇3

关键词：SQL,组合查询,查询方式,查询设计

1 促红细胞生成素的基本知识

1) 中文名称:促红细胞生成素

2) 英文名称:

a.e rythropoie tin;

b.e rythroge nin;

c.EPO

3) 别名:

a.促血红细胞生长素;

b.红细胞生成素;

c.重组人红细胞生成素。

4) 性质:人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质, 能够促进红细胞生成。服用红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度 (即增加血液中红细胞百分比) 。

5) 定义:在哺乳动物肾脏和肝脏产生的一种分子质量为46kDa的糖蛋白细胞因子。能刺激幼稚红细胞的增生, 血红蛋白化和红细胞的成熟。

6) 基本概念:细胞因子的一种, 在骨髓造血微环境下促进红细胞的生成。分类上是集落刺激因子。

2 促红细胞生成素的发现发展历程

1) 20世纪50年代初发现肾脏可以分泌一种激素, 可促进红细胞生长, 因此被命名为促红细胞生成素 (EPO) 。

2) 1985年科学家应用基因重组技术, 开发出重组促人红细胞生成素 (rhEPO) 。

3) 1989年FDA美国安进 (Am ge n) 公司基因工程药物Epoge n上市申请, 成为一种重磅炸弹药物。

4) 2001年FDA批准安进 (Am ge n) 公司第二代促红细胞生成素新产品Arnesp用于治疗恶性贫血症。

5) 2002年初Arne s p正式上市。Arne s p是一种“高糖基化”促红素产品, 其促进红细胞生成的能力大大优于第一代促红细胞生成素产品。

3 促红细胞生成素目前国内外生产的企业状况

3.1 国外

1) 美国安进公司:是全球最大的生物制药企业之一, 在全球医药企业50强排名第21位。主要涉足的领域有人类基因组, 癌症, 神经科学和小分子化学等。该公司最为成功的两个生物技术制药促红细胞生成素 (EPO和G-CSF) , 不仅造福了无数血液透析患者和癌症化疗患者, 也为公司带来了巨额的利润。

2) 美国强生:成立于1886年, 是世界上规模大、产品多元化的医疗卫生保健品及消费者护理产品公司。强生医药产品:敏感及流行性/非流行性感冒、慢性支气管炎、消化系统治疗、头皮健康治疗、皮肤症状治疗、心理治疗、疼痛症状缓解、骨骼治疗、癌症治疗。

3.2 国内

1) 沈阳三生制药有限责任公司:成立于1993年, 经营范围是:生物工程产品和生化药品的研究、开发、生产和销售以及对售后产品进行技术服务。其主要产品有:益比奥 (EPO) 、英路因、因特芬、特比澳。

2) 麒麟鲲鹏 (中国) 生物药业有限公司:是由日本麒麟啤酒株式会社和上海鲲鹏投资发展有限公司于1998年6月合资成立的高技术生物制药企业。公司选址于上海浦东新区张江高科技园区内, 是中国国内规模最大的高科技生物制药公司之一。其该公司产品:利血宝注射液 (重组人从红素生成液) 、惠尔血 (重组人粒细胞刺激因子注射液) 和白舒非 (白消安注射液) 在同类产品中一直保持着领先地位。

目前, 生产促红细胞生成素最具实力的公司是美国安进公司, 促红细胞生成素为该公司的“龙头产品”。

4 促红细胞生成素的药理作用

由165个氨基酸分子组成, 分子量约为3400, 其生物学活性和免疫反应性与天然内源性红细胞生成素相同。能刺激红细胞生成, 在骨髓中能直接作用于红细胞的柑细胞, 刺激其红细胞视细胞集落形成。刺激红系原始细胞分裂、分化及成熟, 其作用与剂量成正比。对血小板、单核细胞计数包有稳定增加, 能改善血小板功能, 改善止血障碍。

5 促红细胞生成素的临床应用

1) EPO治疗肾性贫血:主要原理是通过调控红细胞系祖细胞的增生、分化和成熟。一般慢性肾功能不全贫血是由于肾脏合成EPO功能缺陷所致, 如临床上无炎症、细菌感染、缺铁等情况, 可用单用EPO进行干预治疗。

2) EPO对慢性肾功能不全维持性血透患者左心室结构与功能的影响:肾脏替代疗法的发展使尿毒症患者存活率明显提高, 但心血管并发症发生率仍相当高, 是尿毒症死亡的主要原因。EPO能有效纠正贫血, 并通过改善心脏高排量、高动力状态, 有利于左心室肥厚逆转和左室舒张功能改善。

3) EPO可改善血透患者氨基酸代谢:一般维持性血透患者普遍存在贫血或氨基酸代谢的异常, 可通过使用EPO改善患者贫血程度和血浆氨基酸谱。

4) EPO可改善慢性肾功能不全患者红细胞免疫:慢性肾功能不全患者红细胞免疫功能普遍低于正常人, 可通过EPO治疗提高患者的红细胞免疫功能并改善贫血症状。

6 促红细胞生成素的不良反应

1) 一般反应:少数病人用药前期可出现头痛、低热、乏力等, 个别病人可出现肌肉疼痛、关节疼痛等, 绝大多数不良反应经对症处理后可以好转。

2) 过敏反应:极少数患者用药后可能出现皮疹或荨麻疹等过敏反应, 包括过敏性休克。

3) 心脑血管系统:血压升高、原有的高血压恶化和因高血压脑病而有头痛、意识障碍、痉挛发生, 甚至可引起脑出血。

4) 血液系统:随着红细胞压积增高, 血液粘度可明显增高, 因此应注意防止血栓形成。

5) 肝脏:偶有GOT及GPT的上升。

6) 胃肠:有时会有恶心、呕吐、食欲不振、腹泻的情况发生。

7 促红细胞生成素的制备路线

通过内源基因活化制备促红细胞生成素:采用堆积床生物反应器, 用无血清培养基培养分泌重组人促红细胞生成素 (rh EPO) 的工程细胞株ZK9703。所收集的上清, 采用阴离子交换层析—反相层析—分子筛层析三步纯化工艺路线, 分别用Q-Sepharose XL-C4-S-200 (方法) 和DEAESepharose FF-Source-S-200 (方法) 纯化3批产品, 所得EPO纯度98%以上, 体外比活性大于1.3×105IU/mg。纯化过程的EPO体外活性回收率分别为23.56%和28.57%。此纯化方法工艺纯化日程短, 分离效果好。

8 促红细胞生成素的工艺路线

工艺要点:采用Bellco公司转瓶机, 用无血清培养基培养分泌RhEPO的工程细胞株CHO EPO-2。所收集的上清液预处理后经染料亲和层析—离子交换层析—分子筛层析纯化后, 所得EPO纯度达99%以上, 比活性大于1.5×105IU/mg, 整个纯化全过程的EPO体内活性回收率为45%。所纯化的EPO分子量为37kD。分析表明, 所纯化的EPO可与抗EPO的单克隆抗体特异性结合。该工艺纯化路线简单, 重复性好, 生产成本低, 产品活性高, 适合大规模生产重组人促红细胞生成素。

9 结语

在体育方面用途为兴奋剂, 增加训练耐力和训练负荷, 属于国际奥委会规定的违禁药物。在2008年北京奥运会中第一例的兴奋剂检查呈阳性的西班牙自行车选手玛丽亚·莫里诺, 就是被发现使用使用促红细胞生成素 (EPO) , 国际奥委会于2008年8月11日宣布取消其参赛资格。促红细胞生成素是增强红细胞的生成的体液性因子, 分力量在6万到7万之间, 属于糖蛋白的一种, 现已证明血和尿中都有存在。

未分化的干细胞分化成红细胞系干细胞 (erythropoietinrespons ive ce ll) , 促红细胞生成素在此发挥作用, 使之变为前成红细胞。对进一步再成熟为成红血细胞、网织红细胞, 血红蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促进作用。一般在贫血和低氧状态时, 根据身体组织对氧的需要, 促红细胞生成素的供给量将增加, 但在肾脏贫血时其含量则非常低。其生成器官和机制虽尚未清楚, 可是作为某肾脏因子 (renalerythropoie tic factor) 与血浆的基质反应产生肾小球的说法是有力的。此外, 起着相当于促红细胞生成素作用的因子中, 促进白细胞生成的有colony s tim ulating factor, 促进血小板生成的为促血小板生成素, 包括促红细胞生成素在内, 统称为造血促进因子。

参考文献

[1]全篇部分文字:自百度百科.

[2]企业状况:该公司网站.

[3]药理作用: (生命科学研究) , 2001.

[4]临床应用:国产与进口促红细胞生成素治疗长期血透肾衰贫血疗效观察.中国医科大学学报, 1999.

[5]不良反应:三生制药益比奥药物说明书.

[6]制备路线: (生命科学研究) , 2001.

促红细胞生成素受体 篇4

1 材料与方法

1.1 临床资料

本组26例, 均为年龄40～55岁患者, 其中男性20例, 女性6例, 所有患者均符合原发性肺癌诊断。各例均有不同程度贫血, Hb≤90g/L, 均排除由造血原料缺乏和失血引起的贫血。

1.2 治疗方法

对26例患者采用每次10000单位, 皮下注射, 每周2次, 连续8周, 观察治疗前后血红蛋白 (Hb) 、红细胞比容 (HCT) 、网织红细胞百分数 (RET%) 。

1.3 观察指标

治疗过长中观察患者贫血症状、血压变化, 每周复查血常规、网织红细胞比例1次, 每月复查血清铁蛋白、叶酸、维生素B12如有造血原料缺乏及时补充, 本组病例观察期间未输注红细胞, 同时观察药物副作用。

1.4 统计学处理

本组计量资料均采用自身对照t检验, 以P<0.05为有显著性差异, P<0.01为有极显著性差异。

2 结果

治疗前后观察血红蛋白、红细胞比容、网织红细胞百分数定量指标, 见表1。

治疗后53% (17/26) 血红蛋白上升20g/L或Hb≥100g/L, 所有指标治疗前后均有极显著性差异 (P<0.01) , 其余病例上升程度未达到上述指标, 但均有不同程度提高。

促红素治疗者中严密监测患者血压、血清GOT或GPT值、血钾变化, 注意有无皮疹、恶心、呕吐、眩晕、头痛、发热等副作用, 未发现任何不良反应, 其中10例血压轻度增高, 均为治疗前伴有高血压患者, 经增加降压药物用量而控制。

3 讨论

原发性肝癌贫血病因大多为综合性的, 且这种贫血多为轻-中度贫血。原发性肝癌贫血往往更加重肝癌患者纳差、乏力等症状, 加重细胞乏氧, 使病人的生活质量降低。肿瘤性贫血还能影响放疗或化疗治疗效果, 导致放疗或化疗延迟或剂量降低。

这种疾病继发的贫血与缺铁性贫血有所不同。研究表明, 肺癌患者由于细胞免疫系统被刺激后引起机体细胞因子介导的复杂而广泛的反应, 造成炎症细胞因子增多, 例如TNF, 导致红系造血抑制, TNF-α对红细胞生成具有负调节作用, 在骨髓培养基可减少红细胞集落形成单位的生成, 表现为促红细胞生成素产生减少及骨髓对促红素反应迟钝, 而应用应用促红素治疗肿瘤贫血的效果与疾病的严重程度及循环中细胞因子的数量相关, 常需要大剂量促红素才能克服细胞因子的影响, 维持红细胞集落形成单位的生成。

本组观察了促红素在26例原发性肝癌贫血治疗中的临床症状的均有不同程度改善与否, 治疗8周后血红蛋白、红细胞比容、网织红细胞百分数等客观指标均有较显著上升, 疗效达到53%, 说明应用促红素治疗原发性肝癌不仅能提高生活质量。而且在安全性观察中, 未发现1例血压明显升高, 未发现心脑血管意外等不良反应。但仍提醒我们在患者中监测血压、血粘稠度变化, 防止高血压、心脑血管意外发生。

摘要：目的观察促红细胞生成素治疗原发性肝癌贫血的临床效果。方法对26例原发性肝癌采用每次10000单位, 皮下注射, 每周2次, 连续8周观察治疗前后血红蛋白 (Hb) 、红细胞比容 (HCT) 、网织红细胞百分数 (RET%) , 同时观察药物的不良反应。结果治疗8周后, 26例可评价患者, 其中17例Hb上升20g/L或Hb≥100g/L, HCT、RET%也有极明显上升 (P<0.01) 。未见促红细胞生成素的明显副作用。结论促红细胞生成素原发性肝癌性贫血患者Hb水平, 在原发性肝癌患者中安全使用。

关键词：原发性肝癌,促红细胞生成素/治疗应用,贫血

参考文献

[1]Zamai L, Secchiero P, Pierpaoli S, et al.TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) as a negative regulator of normal human erythropoiesis[J].Blood, 2000, 95 (12) , 3716～3724.

[2]Papadaki HA, Kritiko HD, Valatas V, et al.Anemia of chronic dis-ease in rheumatoid arthritis is associated with increased apoptosis of bone marrow erythroid cells:improvement following anti-tu-mor necrosis factor-alpha antibody therapy[J].Blood, 2002, 100 (2) , 474～482.

促红细胞生成素受体 篇5

1 EPO及其受体

人类的EPO基因位于第7号染色体长臂22区, 是由肾皮质近曲小管管周细胞分泌的由165个氨基酸组成的糖蛋白, 相对分子质量约为34000。EPO在体内不能储存, 贫血及缺氧时肾脏合成和分泌的EPO迅速增加, 以促进红细胞生成。EPO的受体 (EPOR) 是由507个氨基酸组成, 相对分子质量为62000, 基因位于19p24, 长约5～6.5kb, 为无酪氨酸激酶活性的细胞因子受体超家族的一员。主要借助细胞内的非受体型酪氨酸蛋白激酶 (JAK) 完成信号转导, 发挥多种生物学作用。

2 EPO在心肌梗死中的保护作用

2.1 抗细胞凋亡

凋亡也称为“程序性细胞死亡”, 在各种损伤中占重要地位。研究显示, EPO是一种抗凋亡因子, 介导多种细胞抗凋亡作用, 从而发挥细胞保护作用。唐汉博[3]等在研究促红细胞生成素预防阿霉素诱导的心肌细胞凋亡的实验中发现, 不同浓度EPO预处理的心肌细胞活力较模型对照组显著增高, 细胞凋亡率显著降低。其机制可能与调节凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax有关。孙瑜[4]等通过建造大鼠心肌梗死模型发现rHu-EPO治疗组在梗死后24 h即可显著降低凋亡指数, 表明rHu-EPO在心肌梗死早期就发挥了抑制凋亡作用, 且这种作用在梗死后2周时仍然显著。

2.2 抗炎作用

炎症反应时致炎因子作用于机体后, 可引发组织细胞的损坏, 使局部组织细胞显现变性、坏死。研究表明EPO在炎症反应时能减少许多致炎因子的释放、减轻炎性细胞的浸润, 从而发挥抗炎作用。有报道EPO在心肌损伤中抑制NF-kB, AP-1等核转录因子活化及其调节的TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎性细胞因子表达上调, 减轻中性粒细胞浸润, 具有显著的抗炎作用[5,6]。秦川[7]等在观察促红细胞生成素预处理在大鼠心肌缺氧复氧损伤中的抗炎作用得到结论为:EPO预处理在心肌缺氧复氧损伤中具有抑制NF-kB活化及炎性细胞因子TNF-α表达的抗炎作用;这一作用可能与NF-kB激活的负反馈机制有关。

2.3 抗氧化作用

氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用, 并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。研究发现, 超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化氢酶等抗氧化酶在EPO的作用下活性显著增强, 其抗氧化能力明显提高。

2.4 促血管生成作用

EPO可以诱导基质金属蛋白酶 (MMP) 产生、增殖和血管形成, 这些作用可能与EPO诱导血管形成有关。EPO和血管内皮生长因子 (VEGF) 具有相同的血管生成能力[8]。在心肌梗死时, EPO可动员内皮祖细胞, 进而增加梗死周围毛细血管密度[9], 保护心肌细胞。

2.5 降低心肌梗死面积

在体兔模型于缺血前12h、缺血开始时或再灌注开始时静脉给予rhEPO, 在为期3d的再灌注结束时用氯化三苯四唑染色, 检测心肌梗死的情况, 给药组的白色梗死区域明显小于对照组[10]。齐帅等[11]在观察血清促红细胞生成素 (EPO) 在急性心肌梗死 (AMI) 患者血清中的变化发现:内源性EPO水平高者AMI面积减少, 且两者呈负相关。

3 EPO在心肌梗死中的作用机制

EPO生物学效应的发挥依赖于EPO-EPOR信号传导机制, 经过一系列激酶和信号传导发挥具体效应。EPO-EPOR信号传导机制的经典伦认为, EPO效应的产生依赖于EPO和EPOR结合后诱导蛋白酪氨酸激酶磷酸化, 磷酸化后的蛋白酪氨酸激酶通过以下三种不同的途径进一步激活并产生相应的生物学效应:①信号传导子及转录激活子通路;②磷脂酰肌醇3激酶通路;③核因子kB通路。

EPO在心肌梗死时发挥抗凋亡、抗炎等作用, 提高心肌细胞存活率, 减小心肌梗死面积, 保护心脏功能。其作用机制较复杂, 可能EPO与其受体结合后激活Jak2、P13K/Akt、MEK-ERK、PKC、P38MAPK等信号传导途径[12]相关。EPO可通过升高GATA-4磷酸化水平降低心肌细胞凋亡, 进而减轻心肌缺血-再灌注的损伤[13]。EPO可代偿性的通过上调鸟苷酸环化酶-线粒体ATP敏感钾离子通道 (KATP) 途径, 发挥心肌细胞保护作用, 缩小梗死面积[14]。EPO可刺激机体内皮细胞, 使得NO合成增加[15], 通过NO途径发挥心脏保护作用。有新的研究结果表明, 在心肌缺血再灌注时, 当用NF-kB活化的抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸 (PDTC) 预处理后, 心肌缺血再灌注损伤心肌组织NF-kB表达显著减少, 而EPOR表达进一步增强, 提示在心肌缺血再灌注损伤时EPOR表达升高, 抑制NF-kB介导的炎症反应可促进EPOR表达的上调[16]。刘王宓等[17]研究结果显示, EPO可以通过上调血管内皮细胞因子 (VEGF) 的表达来促进血管新生, 改善心肌缺血缺氧状况, 从而使缺氧诱导因子 (HIF) 表达下降, 并由此改善心功能。

4 EPO在心肌梗死中的临床研究

目前, EPO在临床疾病治疗中的应用日益广泛, 包括肾性贫血, 充血性心力衰竭等。但在心肌梗死的临床应用研究相对较少。NAMIUCHI等[18]研究了101例心肌梗死后12h内行PCI治疗的患者, 结果显示, 高水平内源性EPO能预测急性心肌梗死患者在PCI术后更小的梗死面积, 在急性期rh-EPO治疗可能减轻ACS患者心肌细胞损伤, 改善病人远期预后。郭海鹏等[19]在探讨重组型促红细胞生成素 (rh-EPO) 对改善急性心肌梗死 (AMI) 患者心功能的作用时发现:接受 (rh-EPO) 治疗的24例心梗患者中 (方法:rh-EPO2000U/次, 每周3次, 共治疗4周) , 心肌梗死面积程度明显减轻, 心功能在一定程度上得到改善。提示在心梗发病后适当的时间内给予EPO的治疗对于改善病情, 缩短住院天数, 改善病人远期预后是有帮助的。

5 问题与展望

EPO可通过活化多种胞内信号传导通路, 增加心肌细胞及内皮细胞抗凋亡、抗炎的能力, 可减少心肌梗死后梗死面积、防治心室重构等, 从而发挥其心肌保护作用。目前EPO的作用机制仍有一些尚不明确, 其治疗心血管疾病也尚需大量的临床试验, 另外, 随着EPO在许多疾病治疗中的应用, 其不良反应也越来越受关注, 长期应用EPO会产生高血压、血栓形成、栓塞及肌痛等不良反应。相信随着研究的不断深入, 特别是EPO作用的分子机制的阐明, 相信对心血管疾病的治疗会产生积极影响, 在心血管疾病的临床治疗中发挥越来越大的作用。

摘要：促红细胞生成素 (erythropoietin, EPO) 是一种造血细胞生长因子, 主要用于治疗多种原因所致的贫血。近年研究发现促红细胞生成素除促进造血作用以外, 还有组织、器官的保护作用, 尤其对心血管系统的细胞保护作用引起了广泛的关注。在心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病中具有抗凋亡、抗炎、抗氧化应激、促进血管生成等作用, 从而为心血管疾病的治疗提供了广阔的前景。

促红细胞生成素受体 篇6

关键词：心肌梗死,红细胞生成素,贫血

促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是一种主要由肾脏分泌的糖蛋白。以往认为EPO在体内的主要作用是与红系祖细胞膜表面特异性EPO受体(EPO receptor,EPO-R)结合从而刺激其增殖与分化,临床上也仅用于慢性贫血的治疗,特别是慢性终末期肾病性贫血和慢性心力衰竭伴贫血或慢性贫血伴心力衰竭的患者。新近研究认为EPO是细胞生长因子超家族成员之一,广泛分布于人体各个系统,具有潜在的细胞保护作用,广泛应用于神经系统和心血管系统疾病的细胞保护[1]。EPO的心肌保护作用为临床心肌梗死的预防和治疗提供了新的思路和方法。现就EPO在急性心肌梗死的研究进展综述如下。

1 EPO的产生与分子结构

EPO最初是由胎儿肝细胞产生,出生以后主要由肾脏产生。EPO产生与分泌的过程中,在多肽链的氨基端切掉由27个氨基酸残基组成的疏水性分泌引导肽,成为由166个氨基酸残基组成的肽链。在成熟EPO与重组EPO(recombinant hu-man EPO,rhEPO)中,羧基端166位的精氨酸也被切除掉,这样,循环中的EPO是由165个氨基酸残基组成[1]。糖类约占EPO总分子质量的40%,总共有4条糖链,3条侧链通过N连接,1条通过O连接,N连接糖基化位点分别位于24、38和83位的天冬酰胺残基,而O连接的糖基化位点位于126位的丝氨酸残基。糖链对于EPO的生物活性是必须的,其可以稳定EPO的结构,避免氧自由基对EPO结构的损伤。此外,这些糖链对于EPO的产生、分泌、成熟与代谢也发挥着重要的作用[2]。

2 EPO在急性心肌梗死中的作用

2.1 抗细胞凋亡

研究认为EPO是一种抗凋亡因子,介导抗细胞凋亡作用,并发挥组织器官保护作用。EPO与红系祖细胞膜表面EPO-R结合后,EPO-R所包含的p66长链变成二聚体,细胞面的EPO-R被激活,从而维持线粒体膜电位的稳定性,减少细胞色素C的释放,抑制凋亡蛋白酶激活因子的表达和Caspase1、3、8、9的激活,诱发相关的细胞反应,使抗凋亡基因如Bcl-2、Bcl-xl上调[3]。因此认为,EPO在缺血缺氧应激时可以提高细胞的生存能力,抑制细胞的凋亡,使尽可能多的细胞存活,维护组织器官的功能。Calvillo等[4]在培养的大鼠心肌细胞缺氧损伤实验中发现,加入rhEPO(100 ng/ml)的细胞凋亡率降低50%,从而证实EPO对体外培养的心肌细胞具有抗心肌细胞凋亡的作用。Parsa等[5]在家兔心肌梗死前24 h用EPO预处理,其心肌梗死6 h的心肌组织Tunel分析发现,与对照组比较,EPO预处理组Tunel阳性细胞明显减少[(13.8±2.0)% 和(29.3±3.3)% ],而假手术组没有Tunel阳性细胞发现。研究结果表明,EPO可以抑制损伤后心肌细胞凋亡的增加。Tadaa等[6]将EPO-R基因敲除大鼠左冠脉结扎30 min后复流,由此观察内源性EPO-R对受损心肌的保护作用。复流24 h后,与野生型大鼠组相比,EPO-R基因敲除组大鼠的心肌细胞凋亡蛋白酶-3的活性和Tunel染色阳性细胞数量增加,心肌梗死面积较大。缺血再灌注21 d后,相比野生型心肌梗死大鼠,EPO-R基因敲除心肌梗死组大鼠的左室舒张末期直径增加、左室缩短分数减少。该项研究表明,内源性EPO-R对心肌缺血再灌注后的受损心肌具有重要的保护作用。

2.2 抗氧化与抗炎作用

氧化应激是引起各种损伤的重要因素,目前很多研究提示EPO可以上调抗氧化酶的表达以及下调氧自由基的产生发挥其抗氧化的作用。Sakanaka等[7]研究认为EPO能通过增强超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶的活性及下调氧自由基的产生发挥其抗氧化作用。激活EPO-R可介导很多蛋白酶磷酸化,包括糖原合成酶激酶,糖原合成酶激酶的磷酸化可以抑制线粒体的通透性,对抗氧化应激导致的细胞凋亡。2007年,Ohori等[8]通过大鼠缺血模型实验表明,EPO虽不能改变线粒体内糖原合成酶激酶总量,但是可以增加糖原合成酶激酶磷酸化的比率(增加到55%),并认为EPO通过线粒体内9位色氨酸磷酸化进而抑制糖原合成酶激酶活性,从而发挥对抗氧化应激,抑制细胞凋亡作用。炎症反应参与了外源性和内源性引起的各种损伤,缺血再灌注损伤可激活核因子-κB(NF-κB)和转录因子活化蛋白-1(AP-1),启动肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-6等重要炎性因子的基因转录,诱导严重的炎症反应。NF-κB是促炎症反应的关键调节因子,可调控TNF-α、IL-6等炎症因子的基因表达。心肌梗死时,TNF-α是心肌缺血再灌注时触发细胞因子级联反应和启动炎性反应的上游因子,TNF-α和IL-6等因子可抑制心肌收缩功能,促进中性粒细胞的迁移、黏附、浸润和活化,直接决定心肌损伤的程度[9]。研究表明EPO在炎症反应时,是一种保护性细胞因子,能减少许多致炎因子的释放、减轻炎性细胞的浸润,以及抑制NF-κB家族成员的活性,发挥重要的抗炎作用。Villa等[10]报道EPO能显著减少脑梗死区内的致炎因子,如干扰素-γ(IFN-γ)、TNF-α、IL-6等的释放,减轻炎性细胞如星形细胞及小胶质的浸润。在大鼠缺血再灌模型中,心肌缺血再灌注前24 h快速滴注rhEPO可以显著减少中性粒细胞浸润,减弱由于缺血再灌注引起的NF-κB和AP-1的活性,并减少TNF-α、IL-6及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的产生,进而降低炎症反应,其机制可能与EPO诱导的NF-κB激活后的负反馈有关[11]。

2.3 促血管生成作用

EPO还具有促进内皮细胞有丝分裂及化学趋向性作用,并可诱导基质金属蛋白酶-2的产生、增殖和促血管形成。Jaquet等[12]通过培养小块成人心肌组织,比较EPO和血管内皮生长因子(VEGF)的血管生成作用,发现EPO和VEGF具有同等的血管生成能力,表明EPO在血管生成过程中具有重要的作用。Heeschen等[13]研究证实,EPO-R基因敲除的小鼠模型中,心肌不能形成有序的相互连接的血管网,而是形成扩张的相互独立的血管团,由此认为EPO与EPO-R结合具有促进新生血管形成的作用。Vander Meer等[14]在大鼠急性心肌梗死后注射EPO,9周后监测结果发现大鼠心功能改善伴随毛细血管密度的增加,毛细血管心肌细胞比例增加,且部分逆转β肌球蛋白重链。Hirata等[15]在结扎狗的冠状动脉后静脉给予EPO(1 000 iu/kg),结果发现,EPO组循环中的CD34-阳性单核细胞数明显、缺血周围的血管密度和缺血周围心肌的血流灌注,相比较对照组明显增高。因此,急性心肌梗死后给予EPO可能通过动员循环中的内皮祖细胞的机制,发挥促进新生血管形成的作用。Fabrice等[16]的实验研究中,给予心肌梗死大鼠两种不同剂量的EPO(0.75 μg/kg和1.5 μg/kg)发现,虽然两组不同剂量的EPO都能够改善心功能和减少梗死面积,但只有1.5 μg/kg组EPO可动员血液中内皮祖细胞并发挥增加梗死周围毛细血管密度的作用。因此认为只有当给予的EPO剂量能够动员血液内皮祖细胞时,EPO才能够发挥增加梗死周围毛细血管密度的作用。

2.4 促进心肌细胞增殖

通过对敲除了EPO和EPOR基因的小鼠进行观察发现,其出现心室发育不良,更加证明了EPO对心脏组织的作用,这种缺陷显然与低氧状态无关,可能是由于心室部位心肌细胞增殖数量减少所致[17]。这些发现表明,EPO及其受体至少在胚胎期能够刺激心肌细胞增殖。因此,EPO可能既能抗心肌凋亡,又能促进心肌细胞增殖,从而缩小梗死面积。

2.5 EPO对急性心肌梗死保护作用可能的机制

Xu等[18]研究rhEPO对心肌缺血再灌注损伤大鼠模型的影响,结果显示缺血再灌注损伤诱导的心肌梗死面积明显减小,大鼠心肌热休克蛋白表达增加,NF-κB表达减少。Bullard等[19]采用PI3K抑制剂渥曼青霉素和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME阻断EPO介导的保护,发现渥曼青霉素不能阻止EPO的保护作用,L-NAME能够阻止。慢性EPO治疗减少心肌梗死面积可能是由于NO依赖的方式。Miki等[20]发现JAK2磷酸化被EPO减弱,Akt磷酸化在梗死后组没有发现。Hanlon等[21]在EPO治疗之前或与EPO同时灌注PI3K抑制剂LY294002或渥曼青霉素,减弱了EPO诱导的PI3K底物Akt的磷酸化,对EPO诱导的心脏保护作用明显抑制。实验显示EPO介导在缺血之前或缺血中的蛋白激酶C信号途径激活是EPO缺血再灌注损伤过程中的心脏保护作用必须的。

3 EPO对急性心肌梗死动物模型的保护作用

EPO可以减少心肌梗死面积,提高左心室功能。Parsa等[5]在结扎成年兔冠状动脉后立即腹腔注射rhEPO 5 000 U/kg,观察3 d,以微量测压计检测基础和β肾上腺素刺激后的心脏功能发现,EPO组兔左心室收缩峰压和左心室舒张功能较对照组明显改善,心肌梗死面积明显减少;原位末端标记法(TUNEL)染色证实心肌梗死后6 h,EPO组兔左心室心肌细胞凋亡率较对照组明显降低。Calvillo等[4]采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立心脏缺血再灌注损伤动物模型,经腹腔给予rhEPO 5 000 U/kg,缺血30 min,并于损伤后每隔24 h重复给药直至损伤后7 d,结果发现EPO的应用有助于维持心脏的功能,减少心肌细胞凋亡,抑制其肥厚性改变。Vander Meer等[14]在体外大鼠心脏缺血再灌注模型上发现,给予EPO处理后,再灌注期心肌细胞损伤比对照组减少56%,心肌细胞凋亡减少15%,左心室功能明显改善,冠状动脉血流显著增加。

4 EPO对急性心肌梗死患者的保护作用

Namiuchi等[22]研究了101例初次心肌梗死后12 h内成功接受直接经皮冠状动脉介入治疗的患者血清EPO水平与心肌酶释放和心肌梗死面积的关系。结果显示肌酸激酶峰值和肌酸激酶释放曲线在EPO水平高的一组明显降低。绝对的血清EPO水平和经皮冠状动脉介入治疗后心肌梗死溶栓试验分级,心肌梗死前心绞痛,是肌酸激酶释放的独立预测因素。EPO可能在潜在的抗缺血再灌注损伤中发挥保护作用。在两周后测量左心室舒张末压,左心室舒张末期容量指数与左心射血分数(LVEF)在高EPO组有改善的趋势,这证明在缺血急性期EPO可以减少心肌细胞的损伤,改善心肌梗死的长期预后。

5 EPO的有效剂量、时间窗和安全性

整体来讲,EPO在动物中对心肌缺血再灌注损伤具有显著的保护作用;EPO的给药时间在缺血前、缺血后或再灌注后均能产生心肌保护作用;EPO的使用剂量尚不一致,目前的实验剂量主要是参考EPO神经保护作用研究所采用的剂量;单次给药足以产生明显的心肌保护作用,且作用持续时间较长;对严重的心肌损伤,如永久性心肌缺血也具有肯定的保护效应。Xu等[18]提前24 h于腹腔注射EPO 3 000 U/kg预处理大鼠,结扎冠状动脉左前降支建立心肌缺血再灌注损伤模型,缺血30 min,再灌注2 h,观察损伤后心肌梗死面积发现,EPO预处理可明显减轻缺血再灌注损伤后的心肌梗死。Moon等[23]在永久性结扎冠状动脉导致的心肌梗死大鼠中,心肌梗死后立即单次注射rhEPO 150 U/kg和3 000 U/kg的效果相同;在心肌梗死后24 h导致凋亡细胞核减少2倍,4周时心肌梗死面积减少2倍。减少了左心室的扩张和LVEF的下降。心肌梗死后4、8和12 h给药3 000 U/kg效果相近,但是24 h给药无效。150 U/kg在心肌梗死后4 h给药有效,但是8 h以后给药无效。因此,在大鼠心肌梗死后心肌缺血发生4 h内给予150 U/kg的rhEPO,较高剂量可以延迟到12 h,可明显减少细胞死亡、心肌梗死面积、心肌重构和心脏功能下降。Hirata等[15]结扎犬左前降支90 min后单次静脉注射EPO,观察再灌注6 h后心肌梗死面积,高剂量(1 000 U/kg)组明显缩小,低剂量(100 U/kg)组轻度缩小,并呈剂量依赖。高剂量的单次EPO注射明显减少再灌注时心室颤动的发生率,低剂量不行。目前关于EPO临床应用预防和治疗心肌梗死的报道很少。Lipsic对22例初次发生心肌梗死的患者在直接经皮冠状动脉介入治疗前注射负荷剂量300 μg的长效EPO,30 d的随访中没有不良反应发生。Shin等[24]报道2例急性心肌梗死患者在治疗的第2天给予接近于10倍正常给药剂量的EPO 318 000 U,给药后第2天出现丙氨酸氨基转移酶和血红蛋白水平轻度升高,3个月后恢复正常。

6 EPO治疗的不良反应

EPO治疗虽然有明显的益处,但是它也有不良反应。高血压是EPO最常见的不良反应,原因可能与所研究患者年龄较大有关,也可能原来就存在明显的或隐性的心血管疾病。另外,在EPO的治疗过程中,没出现EPO抗体及其反应的表现。个别报道有深静脉血栓发生,这可能与血粘度增加有关。也有发热、腹泻及水肿病例的报道,但发生的机率较小。其防治对策有避免血细胞比容、血红蛋白过高和增加降压药物剂量。这些不良反应均无生命危险,通过调整治疗或停药可以改善。从总体来看,EPO是安全有效的。

促红细胞生成素受体 篇7

1 材料与方法

1.1 人牙髓细胞的分离培养

收集因正畸需要拔除的健康、完整、无龋损的离体前磨牙,无菌条件下劈开牙冠,取出牙髓组织,立即用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍,剪成1 mm×1 mm的碎块;将组织块以0.5 cm间距平铺于培养瓶瓶底,并加入DMEM培养液,置37℃、5%CO2培养箱中常规培养。待组织细胞贴壁后,每隔2~3 d换1次液;当细胞铺满瓶底达80%以上时,胰蛋白酶消化,按1∶2进行传代培养。

1.2 人牙髓细胞的鉴定

24孔板内预先放置消毒处理过的细胞爬片,取生长良好的3~5代人牙髓细胞,以1×105/孔的密度接种于24孔板,置于37℃培养箱中常规培养。待细胞长满后,去除培养液,4%多聚甲醛固定10 min,PBS洗涤。根据SP免疫组化染色试剂盒说明书进行波形丝蛋白和角蛋白免疫组织化学染色。DAB显色后,苏木精复染,蒸馏水冲洗,中性树胶封片,照相。

1.3 EPO浓度确定

取第3~5代人牙髓细胞以1×103个/孔的密度接种于96孔板。将细胞随机分成2组,实验组中加入含不同浓度EPO(5、10、15、20 U/ml)的DMEM培养基,对照组中加入不含EPO的DMEM培养基。置于37℃培养箱中常规培养24 h后,每孔分别加入10μl CCK8试剂,继续培养4 h,测定450 nm吸光度。

1.4 EPO对人牙髓细胞增殖的影响

根据上述实验的结果,我们选择浓度为20 U/ml的EPO进行后续的实验。将牙髓细胞以1×103个/孔的密度接种于96孔板,待细胞贴壁后,实验组中加入20 U/ml的EPO,对照组不加入EPO,常规培养1、3、5、7 d。分别于各时间点,加入CCK8试剂后继续培养4 h,测定450 nm吸光度并绘制生长曲线。

1.5 碱性磷酸酶活性的测定

为了诱导牙髓细胞分化,实验中需配置成骨诱导培养基(含0.1 mol/L地塞米松、10 mol/Lβ-甘油磷酸钠、50 mg/ml维生素C的DMEM)。取3~5代人牙髓细胞以1×103/孔的密度接种于96孔板,将细胞分为3组:对照组,矿化组及EPO组。对照组中只有普通DMEM培养基,矿化组中加入成骨诱导培养基,EPO组中加入含20 U/ml EPO的成骨诱导培养基,分别培养7 d和14 d。于相应的时间点提取各组细胞,按碱性磷酸酶检测试剂盒说明书进行相应处理,检测各孔420 nm波长处的吸光度值。

1.6 Real-time PCR

取人牙髓细胞细胞以1.5×105个/孔的密度接种于6孔板,实验分组同前,即空白组,矿化组和EPO组,培养14 d。利用TRIzol提取细胞总RNA,根据逆转录试剂盒的说明,对细胞总RNA定量,逆转录成c DNA后,进行荧光定量Real-time PCR反应(ABI7500系统),分析目的基因的表达。实验中所用引物及其序列见表1。

1.7 茜素红染色

取人牙髓细胞以1.5×105个/孔的密度接种于6孔板,实验分为空白组,矿化组和EPO组,分别培养7d和14 d。培养结束后,各组细胞用4%多聚甲醛溶液固定30 min后,PBS洗3次,茜素红染色10 min,蒸馏水清洗,显微镜观察、照相。

1.8 统计学分析

实验结果采用SPSS 13.0统计软件,配对t检验进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人牙髓细胞的培养与鉴定

贴壁的人牙髓细胞为大部分为长梭形,细胞体积较小,胞核清晰(图1A、B)。波形丝蛋白在牙髓细胞内呈阳性表达(图1D),可见细胞膜呈棕黄色;角蛋白染色阴性(图1C),仅见苏木精复染的胞核,表明无上皮细胞混杂。

2.2 EPO的有效浓度

EPO对人牙髓细胞活性的影响表现为剂量依赖效应。与对照组相比,当EPO的浓度为20 U/ml时,牙髓细胞表现出最大的细胞活性(P<0.05)(图2)。

2.3 EPO对人牙髓细胞增殖的影响

CCK8增殖实验的结果表明,在加入EPO后的第1、3、5天和第7天,加入EPO刺激的实验组细胞增殖速率明显高于不含EPO的对照组(图3)。

2.4 EPO对人牙髓细胞成牙本质分化的影响

为了研究EPO对牙髓细胞成牙本质向分化的影响,我们进行了碱性磷酸酶活性测定,茜素红染色以及成牙本质向分化相关mRNA的检测。碱性磷酸酶活性测定的结果显示,在培养的第14天,EPO组的牙髓细胞的碱性磷酸酶活性比矿化组的高(P<0.05)。在培养的第7天和第14天,与对照组比较,EPO组和矿化组牙髓细胞具有较高的碱性磷酸酶活性(P<0.05)(图4)。通过茜素红染色的结果,可以发现在培养的第7天以及第14天,EPO组的红色钙结节染色比矿化组染色较深,而对照组几乎没有染色(图5)。Real-time PCR结果显示,培养14 d后,与矿化组相比,EPO组的DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2等成牙本质相关基因的表达均上调(P<0.05);同样,与对照组相比,矿化组中这些mRNA水平也相对较高(P<0.05)(图6)。

A:低倍镜下牙髓细胞形态;B:高倍镜下牙髓细胞形态;C:角蛋白免疫组织化学染色;D:波形蛋白免疫组织化学染色A:Morphology of h DPCs under low magnification;B:Morphology of h DPCs at high magnification;C:Keratin immunohistochemistry;D:Vimentin immunohistochemistry

图2 EPO的最有效浓度(*:与0 U/ml比较,P<0.05)Fig 2 Determination of the most effective EPO concentration(*:vs 0 U/ml,P<0.05)

3 讨论

促红细胞生成素(EPO)是一类唾液酸糖蛋白激素,属于细胞因子家族[5],主要由胎儿肝脏及成人肾脏合成。EPO作为造血调控因子,早已有研究证实它能促进红系祖细胞增殖、分化成熟[6],也有研究报道EPO对神经干细胞有保护及促分化为神经元的作用[7,8],并且EPO能促进骨髓间充质干细胞的迁移、增殖和分化[3,9]。

图4 EPO对牙髓细胞ALP活性的影响(*:与对照组比较,P<0.05;#:与矿化组比较,P<0.05)Fig 4 Effects of EPO on the ALP activity of h DPCs(*:vs control,P<0.05;#:vs mineralization group,P<0.05)

多数学者认为,牙髓组织中含有一些具有自我增殖和分化潜力的间充质干细胞,当牙髓组织受到龋病以及磨耗等刺激时,牙髓组织中的间充质细胞向受损部位迁移,并增殖、分化为成牙本质细胞,形成修复性牙本质,从而实现机体的自我修复和保护[10]。国内学者研究发现正常的牙髓组织中只有EPO受体的表达,而在炎症牙髓组织中EPO及其受体均为高表达[4]。这提示EPO与牙髓的炎症密切相关。本实验利用促红细胞生成素刺激人牙髓细胞,结果发现EPO能显著促进人牙髓细胞的增殖。

ALP活性水平是成骨细胞及成牙本质细胞分化成熟的早期标志物之一,茜素红染色可以显示出胞外基质中钙沉积的多少[11]。本实验中,在培养的第7天和第14天,EPO处理后的人牙髓细胞比矿化组和对照组表现出更高的碱性磷酸酶活性,形成的钙结节也较多。这表明EPO能够促进牙髓细胞的矿化。

图6 EPO对牙髓细胞成牙本质向分化相关基因mRNA表达的影响(*:与对照组比较,P<0.05;#:与矿化组比较,P<0.05)Fig 6 Effects of EPO on mRNA expression of odontogenic differentiation related genes in h DPCs(*:vs control group,P<0.05;#:vs mineralization group,P<0.05)

本实验中,选择DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2作为牙髓细胞成牙本质向分化的标志基因。DSPP,即牙本质涎磷蛋白,被认为是牙本质特异性蛋白,在修复性牙本质的矿化过程中起着非常重要的调控作用,可作为检测牙髓细胞向成牙本质细胞分化的指标之一。OCN,即骨钙素,是在矿化过程中由成骨细胞和成牙本质细胞产生,在骨和牙本质形成的过程中可以调节晶体的生长[12]。OSTERIX和RUNX2是成骨或成牙本质向分化过程中重要的转录因子[13,14]。本实验中观察到加入EPO后,这些mRNA的表达水平均有不同程度的上调,这些结果在基因水平上说明了EPO能够促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化。

综上所述,EPO能促进人牙髓细胞增殖和向成牙本质细胞分化,但分子调控机制有待进一步研究。

摘要：目的:探讨促红细胞生成素(EPO)对体外培养的人牙髓细胞(h DPCs)增殖和成骨分化的影响。方法:体外培养鉴定人牙髓细胞。使用EPO对在成骨诱导培养基中培养的牙髓细胞进行刺激,CCK-8检测EPO对牙髓细胞增殖的影响;20 U/ml EPO培养hDPCs 7 d和14 d,采用碱性磷酸酶活性(ALP)检测和茜素红染色观察EPO对牙髓细胞矿化的影响;利用Real-time PCR检测加入EPO后牙髓细胞成牙本质向分化相关基因的表达情况。结果:EPO以时间和剂量依赖性方式促进牙髓细胞的增殖;20 U/ml的EPO后作用,牙髓细胞碱性磷酸酶活性显著提高(P<0.05),钙结节形成明显增多;成牙本质向分化相关基因DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2的表达明显上调(P<0.05)。结论:EPO能促进人牙髓细胞的增殖和分化。

促红细胞生成素受体 篇8

1 资料和方法

1.1 病例选择

2006年1月至2006年6月在我科接受血透治疗的尿毒症合并肾性贫血的患者30例。男17例,女13例,平均年龄(46±26.5)岁。

1.1.1 病例选择标准

①终末期尿毒症,血肌酐(Scr)≥707 umol/L,肌酐清除率(Ccr)≤10 ml/min;②60 g/L≤血红蛋白(Hb)≤90 g/L,血红细胞压积(Hct)≤30 Vol%。试验前2周内及试验期内未使用其他rHuEPO制剂,且2周内无输血史。

1.1.2 排除标准

①感染和炎症;②慢性活动性出血;③骨髓病变;④溶血性贫血;⑤严重继发性甲状旁腺功能亢进症及药物难以控制的高血压。

1.1.3 剔除标准

①未完成疗程者;②治疗过程中输血者;③治疗中出现严重不良反应者。

1.2 分组及给药方法

将入选病例随机分为2组,其中实验组15例,采用益比奥1万u/支,每周1次,皮下注射;对照组15例,采用益比奥3 000 u/支,每周3次,皮下注射。(两种剂型益比奥均为沈阳三生制药股份有限公司生产)。两组治疗期间常规服用速力菲100 mg 3次/d,叶酸10 mg 3次/d。Hb目标值110～120 g/L,Hct目标值33%～36%。治疗过程中每4周为一观察单位,如每月Hb上升多于25 g/L,Hct>8%,或已超过目标值,则实验组每两周皮下注射1万u益比奥,对照组3 000 u益比奥每周用量减少25%,疗程12周。

1.3 观察指标

治疗前及后4、8、12周随访患者,记录贫血症状评价指标:食欲、心悸、气短、乏力,精神状况、社会活动能力。测量血压、脉搏,监测Hb、Hct、网织红细胞计数,外周血白细胞、血小板计数。治疗前及治疗后每月化验肝酶谱、胆红素、胆固醇、三酰甘油、血糖、血肌酐、电解质。整个过程随时记录患者出现的各种不良反应。

1.4 疗效判断标准

显效:治疗后Hct≥30%,上升幅度≥5%,Hb≥100 g/L,或较治疗前升高≥30 g/L。有效:治疗后3%≤Hct上升幅度<5%,Hb较治疗前升高≥15 g/L,贫血症状改善。无效:Hct上升幅度<3%,Hb较治疗前升高<15 g/L,贫血症状无明显改善。

1.5 统计学方法

结果以$(\overline{x}\pm s)$表示,组间比较用t检验。

2 结果

2.1 治疗结果

入选病例无中途退出,两组之间年龄、性别、给药途径等比较无明显差异。试验组益比奥每周总剂量1万u ,对照组益比奥每周总剂量9 000 u。实验组15例,Hct上升2.4%～15.1%,平均10.6%,显效10例(66.7%),有效4例(26.7%),无效1例(6.6%),总有效率93.4%。对照组15例,Hct上升2.3%～15.4%,平均10.5%,显效9例(60.0%),有效5例(33.3%),无效1例(6.7%),总有效率93.3%。两组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表Ⅰ。肝酶谱、胆红素、胆固醇、三酰甘油、血糖、血肌酐、钾、钠、氯、钙、Plt,WBC无明显变化,两组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

注:与治疗前相比:*P<0.05; **P<0.01

注:以上为血透前采血所测检验值

2.2 不良反应

两组病例中均未出现过敏、血管栓塞,肝功能损害及肾功能恶化等不良反应。试验组出现3例高血压,发生率20.0%;对照组出现2例高血压,发生率13.3%,均未出现难以控制的高血压。

3 讨论

维持性血液透析患者心血管并发症所致的死亡原因直接与贫血有关,与Hct为33%～36%的患者相比,Hct<27%的患者死亡率要高2倍[3]。红细胞生成素是1948年Bonsdor与Jalsvisto首先发现的,它对红细胞生成有特异性刺激作用,①促进骨髓原始血细胞向原始红细胞分化;②促进骨髓红细胞的生成以及血红蛋白的合成;③促使骨髓网织红细胞释放入血。人类重组促红细胞生成素(rHuEPO)已成为治疗肾性贫血的首选药物和标准替代治疗,不仅改善贫血,也解决了因反复输血而带来的众多问题,如肝炎感染,HLA致敏等。rHuEPO也能促进淋巴细胞和巨核细胞系增生,提高多形核白细胞吞噬功能,增强机体免疫力[4]。

在Epo治疗期间发生高血压,或血压升高是最常见的不良反应,发生率约20%～30%,本试验组病例为20%。Epo治疗后新发的高血压或高血压恶化,与血管壁反应性增加有关,并与红细胞总数增加所致的血流动力学变化有关。为控制rHuEPO相关高血压,需调整降压药,如有细胞外容量扩张的证据,需加强超滤。除非高血压难以控制,并且进行性加重,否则无需停药或终止rHuEPO治疗。

现行的rHuEPO给药方式多采用皮下注射,与经静脉途径方式相比可减少rHuEPO用量[5]。药代动力学显示益比奥皮下注射后2 h后血药浓度显著升高,18 h可达最高血药浓度,96 h后仍能保持血中浓度在内源性促红细胞生成素水平之上,每周1次皮下注射1万u可保持有效的血浓度。顾勇等采用大剂量EPO每周1次用药治疗肾性贫血,能使患者血红蛋白维持在理想水平,且具有较高安全性[6]。本组观察提示,实验组及对照组治疗前后Hb,Hct均有显著上升,BUN,Scr无显著变化,EPO治疗肾性贫血效果显著且可能有延缓肾损害的作用[7]。与3 000 IU益比奥每周3次皮下注射给法相比,1万u益比奥每周1次皮下注射,减少注射次数及注射疼痛感,患者依从性好,疗效无明显差别,两种方法均安全有效,无严重不良反应。

摘要：目的对比观察重组人红细胞生成素(益比奥)1万u每周1次及3000u每周3次皮下注射的疗效。方法将尿毒症合并肾性贫血的维持性血液透析患者30例分为两组。益比奥1万u实验组15例,3000u对照组15例。治疗期间监测血常规、血脂、肝肾功能、电解质、血压等指标及患者出现的各种不良反应。结果实验组与对照组总有效率均为90%,治疗前后白细胞、血小板、血脂、肝肾功能、电解质无明显变化。结论大剂量益比奥每周1次皮下注射治疗肾性贫血安全可靠,疗效确切,患者依从性好,不良反应发生率两组相似。

关键词：尿毒症,维持性血透患者,贫血,重组人红细胞生成素

参考文献

[1]Vanrenterghem Y,Barany P,Johannes FE et al.Randomized trial of darbepoetin alfa for treatment of renal anemia at a reduced dose frequency compared with rHuEPO in dialysis patients.Kid Int,2002,62(21):2167-2175.

[2]NKF-K/DOQI Clinical Practice Guidelines for Anemia of Chronic Kidney Disease:Update2000.Am J Kidney Dis,2001,37(Suppl1):S182.

[3]Ma JZ,Ebben J,Xiz H,Collins AJ.Hematocritlevel and associated-mortality in hemodialysis patients.J Am Soc Nephrol,1999;10:610-9.

[4]苏颖,李学旺,余学清,等.红细胞生成素治疗肾性贫血的多中心临床研究.中华肾脏病杂志,2001,17(5):341-342.

[5]Kaufman JS,Reda DJ,Fye CL,et al.Subcutaneous compared with intravenous epoetin in patients receiving hemodialysis.Department of Veterans Affairs Cooperatives Study Group on erythropoietin in hemodialysis patients.NEng J Med,1998,339(9):578.

[6]顾勇,施雪枫.大剂量重组促红细胞生成素治疗血透患者贫血的疗效与安全性.中国临床药学杂志,2004;13(2):69-72.