原生质体制备（精选三篇）
原生质体制备 篇1
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株:
产苝醌类光敏剂丝状真菌AL18,菌寄生菌属(Hypomyces sp.),山东省生物信息工程技术中心保存。
1.1.2 试剂:
Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NH4Cl、NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、甘露醇、蔗糖为国产试剂纯;蜗牛酶、纤维素酶购自上海蓝季科技发展有限公司;β-巯基乙醇购自Amresco公司。
1.1.3 仪器与设备:
立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KBS;隔水式电热恒温培养箱WGP-500;电热鼓风干燥箱DL-101-2;全温振荡培养箱HZQ-F160;超净工作台ZHJH-1214;恒温磁力搅拌器78HW-1;冷冻离心机TGL-16G;低速台式离心机 TDL-4;电热恒温水浴锅HWS24;万能电热锅;数码显微镜Nikon YS100;电子天平GR-202。
1.1.4 培养基与渗透压稳定剂
斜面培养基:PDA培养基,121℃灭菌20min。
静膜培养基:马铃薯综合培养基,121℃灭菌20min。
发酵培养基:同静膜培养基。
再生培养基:在PDA培养基中添加0.6mol/L的蔗糖作为渗透压稳定剂,上层平板含0.8%琼脂,下层平板含2.0%琼脂。
渗透压稳定剂:用0.02mol/L磷酸盐缓冲液分别配制0.6mol/L的NH4Cl、NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、甘露醇、蔗糖作为渗透压稳定剂,0.22μm滤膜过滤除菌。
1.2 方法
1.2.1 菌丝体的培养:
将保藏菌种切成1~2cm2小块接种至斜面培养基,28℃培养3~5d。将长满斜面的菌苔划成3~4片,接种至装液量为70mL/250mL三角瓶的马铃薯综合培养基中,28℃静置培养6~7d。待静膜长满后用无菌剪刀将静膜剪成细碎的小块,按10%的接种量接种至装液量为40mL/250mL三角瓶的发酵培养基中,28℃、180r/min振荡培养48h。
1.2.2 原生质体的制备:
用无菌磁力搅拌棒在100r/min条件下搅拌菌丝体2h左右。吸取2mL菌液5 000r/min离心15min收集菌丝体,0.02mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗涤2次。加入5mL 0.3%β-巯基乙醇室温放置20min进行预处理,5 000r/min离心15min后弃上清,磷酸盐缓冲液洗涤2次。按每g湿菌体加入10mL用渗透压稳定剂配制的酶溶液,在酶解温度下进行一定时间的酶解后将酶解液用4层灭菌擦镜纸过滤,4 000r/min离心10min后小心去除上清液,再用渗透压稳定剂洗涤2次后即可得到纯化的原生质体,按酶解体积加入渗透压稳定剂重悬原生质体,梯度稀释后通过血球计数板计数计算原生质体的制备率。
1.2.3 原生质体的再生:
将制备的原生质体用渗透压稳定剂稀释后通过镜检计数并计算出0.1mL稀释液中的原生质体数C,吸取0.1mL原生质体稀释液涂布于再生平板上28℃培养3~4d,其再生菌落数记为A,对照用灭菌蒸馏水代替渗透压稳定剂,其再生菌落数记为B,原生质体的再生率= (A - B)/(C-B)×100%。
1.2.4 渗透压稳定剂对原生质体制备率和再生率的影响:
0.3%β-巯基乙醇预处理15min,磷酸盐缓冲液pH 6.2,7mg/mL纤维素酶,36℃酶解2h的条件下,比较了终浓度为0.6mol/L的渗透压稳定剂NH4Cl、NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、甘露醇、蔗糖对原生质体制备率的影响,以及用上述渗透压稳定剂制作再生培养基对原生质体再生率的影响。
1.2.5 酶的种类及配比对原生质体制备率的影响:
0.3%β-巯基乙醇预处理15min,0.6mol/L的MgSO4·7H2O作为渗透压稳定剂(pH 6.2),36℃酶解2h的条件下,比较了终浓度为10mg/mL的纤维素酶、蜗牛酶以及纤维素酶:蜗牛酶=1:1、1:4、2:3、3:2、4:1时对原生质体制备率的影响。
1.2.6 酶浓度对原生质体制备率和再生率的影响:
0.3%β-巯基乙醇预处理15min,0.6mol/L的MgSO4·7H2O作为渗透压稳定剂(pH 6.2),36℃酶解2h的条件下,比较了纤维素酶:蜗牛酶=2:3时酶的总浓度分别为7mg/mL、10mg/mL、15mg/mL和20mg/mL时对原生质体制备率和再生率的影响。
1.2.7 pH值对原生质体制备率的影响:
0.3%β-巯基乙醇预处理15min,0.6mol/L的MgSO4·7H2O作为渗透压稳定剂,纤维素酶:蜗牛酶=2:3,酶的总浓度为15mg/mL,36℃酶解2h的条件下,比较了0.02mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的pH值分别为5.8、6.2、6.6、7.0、7.4时对原生质体制备率的影响。
1.2.8 酶解温度对原生质体制备率和再生率的影响:
0.3%β-巯基乙醇预处理15min,0.6mol/L的MgSO4·7H2O作为渗透压稳定剂(pH 5.8),纤维素酶:蜗牛酶=2:3,酶的总浓度为15mg/mL,酶解2h的条件下,比较了酶解温度分别为28℃、32℃、36℃、40℃时对原生质体制备率和再生率的影响。
1.2.9 酶解时间对原生质体制备率和再生率的影响:
0.3%β-巯基乙醇预处理15min,0.6mol/L的MgSO4·7H2O作为渗透压稳定剂(pH 5.8),纤维素酶:蜗牛酶=2:3,酶的总浓度为15mg/mL的条件下,比较了36℃酶解2h、3h、4h、5h对原生质体制备率和再生率的影响。
2 结果与分析
2.1 渗透压稳定剂的种类对原生质体制备率和再生率的影响
渗透压稳定剂有助于维持原生质体的形态的稳定,对原生质体的形成和再生都有重要的影响。由于不同真菌的菌丝体所处的生理状态不同,对各种渗透压稳定剂的敏感性也不同。由图1可知,0.6mol/L的MgSO4·7H2O作为渗透压稳定剂获得的原生质体产量最高,达到6.26×106/mL,但最适合原生质体再生的渗透压稳定剂是0.6mol/L蔗糖,原生质体再生率可达4.3%(见图2)。蔗糖作渗透压稳定剂其之所以对丝状真菌原生质体再生有好的效果,一方面是由于蔗糖作为培养基中的碳源补充参与了细胞壁的合成;另一方面由于原生质体新壁的合成蔗糖不断消耗,渗透压降低,有利于原生质体结构和功能的修复,而MgSO4·7H2O 作为渗透压稳定剂会使高度液泡化的原生质体比例大大增加,降低原生质体活力,影响原生质体再生[13]。综上所述,在原生质体制备阶段,采用0.6mol/L的MgSO4·7H2O作为渗透压稳定剂,而再生培养基中添加0.6mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂更有利于原生质体的再生。
2.2 酶的种类及配比对原生质体制备率的影响:
真菌细胞壁成分结构复杂,选择合适的酶系统对原生质体制备率具有重要的影响。由图3可知,单独使用纤维素酶或蜗牛酶时的原生质体制备率相差不大,但两种酶混合使用的效果明显好于单个的酶。当混合酶系统中的纤维素酶:蜗牛酶=2:3时,原生质体产量最高可达5.4×106/mL。
2.3 酶浓度对原生质体制备率和再生率的影响
适宜的酶浓度是原生质体制备的一个重要因素。在酶浓度较低时,随着酶浓度的提高原生质体制备率也有所增加,但当酶浓度大于15mg/mL时,继续增加酶浓度反而降低了原生质体制备率(见图4)。造成这种情况的原因有两种,其一是由于酶液纯度较低,其中往往含有一些对原生质体有害的酶类(如过氧化物酶、核糖核酸酶等),随着酶浓度的增加,杂酶浓度也随之增加,进而影响了原生质体的活性;其二是由于酶液浓度过大,易使菌丝体发生凝集而难以原生质体化[14]。原生质体的再生率受酶浓度的影响也较大,10mg/mL时原生质的再生率最大,当继续增大酶浓度时原生质体的再生率明显降低(见图5)。因为最适合原生质体的制备和再生的酶浓度并不一致,按照原生质体制备率与再生率的乘积最大的原则,所以在后续实验中采用15mg/mL的酶浓度进行原生质体制备。
2.4 pH值对原生质体制备率的影响
缓冲体系的pH值是影响酶活的一个主要因素。因为我们采用的是一个复合酶的酶解系统,所以找到一个能使两种酶充分发挥效力的pH值范围就显得极为重要。从图6可知,较高的pH值不利于复合酶系统活性的发挥,相反偏酸的pH值有利于酶解的进行,在pH 5.8时原生质体的产量能达到14.5×106/mL。
2.5 酶解温度对原生质体制备率的影响
在一定范围内,提高酶解温度有利于加速酶促反应的进行(见图7),原生质体制备率从28℃时的7.6×106/mL提高到36℃时的13.5×106/mL。当超过最适酶解温度后,原生质体产量急剧降低至40℃时的7.1×106/mL,这可能是由于细胞壁酶解过于迅速,使细胞质膜受损导致原生质体的稳定性变差,原生质体更容易破裂。如图8所示,虽然原生质体的再生率随着酶解温度的升高逐渐降低,但考虑到在36℃时再生率与制备率的乘积最大,所以最终选择了36℃做为原生质体制备的酶解温度。
2.6 酶解时间对原生质体制备率的影响
由图9可知延长酶解时间对原生质体制备率的提高幅度较小,甚至在延长酶解时间至5h后出现原生质体制备率降低的现象。与此相反,延长酶解时间明显降低了原生质体的再生率,当酶解时间达到5h时,原生质体的再生率从3.2%降到了0.9%(见图10),说明由于脱壁过于彻底可能给原生质体造成了难以恢复的损伤,所以进行2h的酶解就是最佳的酶解时间,此时的原生质体的制备率和再生率的乘积最大,原生质体的制备率和再生率分别达到1.42×107/mL和3.2%,制备出的原生质体大小均匀,形态稳定分散性好 (见图11)。
3 讨论
采用单因素实验研究了影响产苝醌类光敏剂丝状真菌AL18原生质体制备和再生的条件。实验结果表明:渗透压稳定剂的种类、缓冲体系的pH值、酶的浓度、酶解温度是影响原生质体制备率的主要因素,合适渗透压稳定剂的种类及酶解温度和时间是提高原生质体的再生率的关键。与较高的原生质体制备率相比,丝状真菌AL18原生质体的再生率显得偏低。从现有报道来看,不同菌种的原生质体的再生率之间存在较大的差异,造成这种现象的可能原因有三个。其一,由于不同的菌种对各种渗透压稳定剂的反应各不相同,主要是由于各种渗透压稳定剂对不同菌种的原生质体的生理状况产生了不同的影响所致[15],所以应进一步筛选适合丝状真菌AL18原生质体再生的渗透压稳定剂。其二,菌体自身的生理状态也是导致原生质体再生率较低的一个原因。一般来说人们倾向于采用对数生长期或指数生长期的菌体进行原生质体的制备和再生,但也有学者认为菌龄大的菌丝多从侧面释放原生质体且体积大,由于一般都有核,更易于再生复原[16],因此选择合适菌龄的菌丝体制备原生质体是一个值得考虑的问题。其三,由于丝状真菌的细胞壁的结构和组成复杂且千差万别,在选择酶解体系时既要考虑原生质体的形成,又要兼顾原生质体的再生。所以选择一个合适的酶解系统,在较低的酶浓度下依然能保证原生质体制备率,降低因为酶浓度过高对原生质体再生造成的不利影响,可能是提高原生质体再生率的一个有效途径。
摘要：目的:为了建立起产苝醌类光敏剂丝状真菌AL18原生质体制备和再生体系。方法:采用单因素实验法研究了预处理方式、渗透压稳定剂和酶解条件对原生质体制备率和再生率的影响。结果:原生质体制备及再生的最佳条件是用0.3%的β-巯基乙醇预处理15 min,酶解液以0.6 mol/L的MgSO4·7H2O作为渗透压稳定剂,0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液pH值为5.8,纤维素酶:蜗牛酶=2:3,酶的总浓度为15mg/mL,36℃酶解2h;以0.6mol/L的蔗糖作为再生培养基的渗透压稳定剂。结论:原生质体的制备率和再生率可分别达到1.42×107/mL和3.2%。
原生质体制备和再生的影响因素 篇2
【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵
酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。
1.菌体菌龄对原生质体制备的影响
微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。
较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。
微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。
2.稳定剂对原生质体制备的影响
原生质体由于剥除了细胞壁，失去其特有的保护作用，细胞对外界环境变的十分敏感，尤其对渗透压。如果把它悬浮在蒸馏水或等渗溶液中，会吸水膨胀并破裂，所以必须在一定浓度的高渗溶液中进行酶解、破壁、才能形成和保持稳定的原生质体。
作为稳定剂的有无机盐和有机物，无机盐稳定剂包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2等；有机物中有糖和糖醇，如蔗糖、甘露醇、山梨醇等。无机盐利于原生质体制备，糖类更适于其再生，可能糖溶液黏度大，不利于酶和细胞的分散与作用，而盐对细胞壁降解有促进作用，故能提高制备率却不利于再生。酵母菌原生质体制备和再生时的稳定剂可选用无机盐或糖醇类化合物，无机盐类在促进原生质体再生方面不及糖和糖醇。其原因是：糖及糖醇是大分子物质，阻碍酶与细胞壁充分接触或者防碍原生质体释放，同时，其对原生质体又有保护作用。
各种稳定剂的pH值应保持在一定范围之内，这需要适宜的缓冲液配合使用，以保证酶活性和菌体本身活性维持在一个叫高的水平。稳定剂是一种高渗溶液，但是浓度也不能过高，否则会使原生质体皱缩，一般在0.3-1.0mol/L之间。
概言之，稳定剂的作用，不仅能防止原生质体的破裂，控制并达到最大的数量，而且对提高酶的活性，促进酶和底物的结合都具有相当的优越性。不同的稳定剂对原生质体的释放和保护作用是不同的，一般认为易于渗入质膜和易于被原生质体及菌体分解的物质不宜作为稳定剂。
3.酶解前的预处理对原生质体制备的影响
用酶类来水解细胞壁，首先要使得酶溶液渗透到细胞壁中，但是生物体都具有保护自身的一套严密的结构，不是任何物质都可以随意进入的。为此，在用酶类处理之前，最好根据细胞壁的不同结构和组成加入某些物质先行预处理，以抑制或阻止某一种细胞壁成分的合成，从而使酶易于渗入，提高酶对细胞壁的酶解效果。
适当预处理可在一定程度上破坏酵母菌细胞壁外层大分子高级结构，改善通透能力，促进细胞壁水解酶向内壁层扩散，提高原生质体制备效率，并缩短酶作用时间，降低酶液对形成的原生质体损伤，保持高活性，提高再生率和融合率。其作用主要是这些化合物能还原细胞壁中蛋白质的二硫键后，使分子链切开，酶分子易于渗入，促进细胞壁的水解，易于释放原生质体。
SH-化合物（如β-巯基乙醇）广泛运用于酵母菌中，效果很好。可是，酵母细胞脱壁前，做一些预处理可使原生质化率大大提高，但原生质体再生率会有所降低，这是因为其作用于膜蛋白，造成细胞损伤。酵母菌细胞壁外层由一蛋白鞘构成，预处理剂EDTA 或 EDTA加巯基乙醇能破坏这一结构，利于水解酶渗透进入内壁层并促进其对细胞壁的降解，因此适度预处理后能显著提高原生质体制备率；用EDTA处理细胞，一方面将细胞壁中部分不溶性蛋白质抽提出来，另一方面又通过EDTA与多种金属离子形成络合物，避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶的脱壁效果；用巯基乙醇处理对数期的细胞，以促进蛋白质中的二硫键断裂，松动细胞壁结构，使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加，同时抑制细胞壁的重新合成。至于经预处理后原生质体再生率略低于非处理，但从形成率和再生率双重因素考虑， 使用预处理再生总数高于非预处理。
4.酶系和酶的浓度对原生质体制备的影响
各种微生物由于细胞壁组成不同用于水解细胞壁的酶的种类也不同。而酵母菌的细胞壁组成主要为葡萄糖和几丁质。用于水解的酶类主要有蜗牛酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶等。最常用的是蜗牛酶，它是一种以纤维素酶为主的混合酶，适合水解酵母细胞壁中的多种组分。
制备酿酒酵母原生质体时，一般采用50μl EDTA和5μl巯基乙醇及1%纤维素酶高渗磷酸—甘露醇缓冲液预处理，原生质体的获得率达99%。但在蜗牛酶中复合加入纤维素酶能得到更理想的效果，加快细胞壁水解进程，缩短处理时间，增强所得原生质体活性，并提高再生率。
不同的微生物在制备原生质体时所需酶的种类和酶量均不同，适宜的酶浓度是影响原生质体形成与再生的重要因素，因为酶中往往含有对原生质体有害的酶类（如过氧化物酶、核糖核酸酶等），随着酶量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定程度时，必然会影响原生质体的活性，降低原生质体的再生率。
总之用于水解细胞壁的酶浓度要适当，酶量过低，作用不彻底，不利于原生质体形成，浓度过高，处理时间过长，会影响原生质体的数量和活性，致使再生率下降。
5.酶的作用温度、时间和作用pH值
同样的培养时间，不同的温度下生长的细胞，其生理状况是有差异的，会影响到原生质体的形成。如酶解温度过高或过低，都会影响酶的活性，使原生质体形成率下降。不同的酶具有各自不同的最适温度，这在水解细胞壁的时候是要首先考虑的。还要注意菌株生长的最适温度，以避免因温度不当而导致原生质体的活性降低，甚至破坏。确定酶解温度的时候以上两者均要兼顾。总的说来，酵母菌的温度要低些，多在38-30℃。
随着时间的增加，原生质体的形成率增加，可能是因为随着时间的增加，细胞壁的水解更为充分的原因。酶解时的最适pH值也随着酶的特性和菌种的特性而异。
6.总结
原生质体制备 篇3
目前, 聚β羟基丁酸酯主要以微生物发酵生产为主[6]。通常, 在自然环境中微生物能储备干燥菌体质量的5%~20%的PHB, 多年来人们一直在寻找提高PHB含量的方法, 在合适的实验条件如碳源过量、限制氮、磷等发酵条件下, PHB含量可以达到细胞干重的70%~80%。目前由于缺乏性能优良的高产菌株, 导致产量低, 成本高, 无法实现大规模工业化生产。因此, 筛选具有优良性状的高产菌株, 降低生产成本是当前迫切需要解决的问题。利用原生质体技术是菌种选育行之有效的方法之一, 方法简便, 效果好, 能在较短的时间内提高菌种的生产能力, 降低生产成本[7]。为此, 本文主要研究了聚β羟基丁酸酯产生菌S-05的生长情况和影响原生质体制备与再生的诸多因素, 为今后采用原生质体技术选育PHB高产菌株奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌种
假单胞菌 (Pseudomonas) , 编号为S-05。
1.2 培养基
1.2.1 斜面培养基
葡萄糖1.0%、蛋白胨0.7%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.1%、琼脂2.0%;
1.2.2 完全培养基
蔗糖2.5%、酵母膏0.5%、KH2PO40.2%、Na2HPO4.12H2O 0.2%, 在此基础上, 添加2.0%琼脂可制成固体培养基;
1.2.3 原生质体高渗再生培养基
在完全培养基的基础上添加0.5mol/L蔗糖、20mmol/LMg Cl2、上层琼脂0.6%, 下层琼脂2.0%, 配制成高渗双层再生培养基。
1.3 试剂与缓冲液
1.3.1 磷酸缓冲液
配制成0.1mol/Lp H6.0磷酸缓冲液;
1.3.2 高渗磷酸缓冲液
于上述磷酸缓冲液中加入0.8 mol/L甘露醇;
1.3.3 原生质体稳定液 (SMM)
0.5mol/L蔗糖、20mmol/LMg Cl2、0.02mol/L顺丁烯二酸用双蒸水配制, 调p H至6.5, 115℃高压灭菌20min;
1.3.4 溶菌酶
称取适量溶菌酶, 用SMM溶液配制成所需浓度, 用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养
将菌珠S-05移接于斜面培养基培养活化14~16h左右, 取一环接种于盛有100m L液体培养基的250m L三角瓶中, 32℃, 180r/min, 振荡培养。
1.4.2 出发菌株的生长曲线的测定
取新鲜活化斜面菌种一环接种于液体培养基中, 32℃恒温振荡培养, 每隔3h取样, 用浊度比色法测定OD620值, 并绘制生长曲线。
1.4.3 原生质体的制备
取上述培养菌液5m L于离心管中, 4000 r/min离心10min去掉培养基, 用高渗磷酸缓冲液离心洗涤2次后, 加入0.1 mol/LEDTA溶液预先处理, 离心洗涤后加适量酶液37℃静止作用 (随时镜检, 观察原生质体形成情况) 一定时间, 使之形成原生质体。然后4000 r/min离心10min, 除去酶液收集原生质体, 用高渗缓冲液洗涤2次后, 配制成原生质体高渗菌悬液。
1.4.4 原生质体形成与再生的测定和计算方法
将获得的原生质体用无菌水适当稀释, 涂布于完全培养基平板上, 32℃恒温培养后, 计数菌落, 为未形成原生质体的菌数。再用高渗液适当稀释, 培养于双层再生培养基平板上, 32℃恒温培养后, 计数菌落, 为形成的原生质体与未形成原生质体的菌数之和。分别计算原生质体形成率和再生率[7]。
2 结果与讨论
2.1 出发菌珠生长曲线的测定
将S-05菌株于液体培养基中32℃培养, 每隔3h取样, 用浊度比色法测得生长曲线, 其结果见图1。
从图1可以看出, S-05菌株从9h开始进入对数生长期, 对数生长期持续13h, 此时, 菌体的生理状态相对一致, 代谢活力旺盛。之后, 菌体细胞进入稳定期和衰亡期。
2.2 菌龄对原生质体形成的影响
本实验将S-05菌株培养至不同时期进行酶解, 测定各个时期的原生质体形成与再生情况, 其结果见表1。
由表1可知, 对于S-05菌采用预培养12h的菌体较好, 此时大部分菌体细胞正好处于对数期, 原生质体形成率与再生率较高, 分别为78.8%和19.5%。因此, S-05菌株制备原生质体的最适菌龄为12h。
2.3 溶菌酶浓度对原生质体形成与再生的影响:
将S-05菌株于32℃培养12h, 然后加入不同浓度的溶菌酶, 测定酶浓度对原生质体的形成率和再生率的影响见图2。
由图2可以看出, S-05菌株的原生质体形成率随酶浓度的增加而提高, 但再生率呈下降趋势。当酶浓度为4.0mg/m L时, S-05菌株原生质体的形成率和再生率分别为82%和18.5%, 原生质体形成率与再生率乘积也达到最大值。之后, 随着溶菌酶浓度增加, 原生质体形成率和再生率明显下降。因此, S-05菌株的酶解浓度应选择4.0mg/m L。
2.4 酶解时间对原生质体形成与再生的影响:
在32℃条件下分别培养12h, 加入4.0mg/m L溶菌酶, 在不同时间内测定其原生质体的形成率和再生率见图3。
由图3可知, S-05菌株原生质体形成率随酶解时间的延长而增加, 但再生率呈下降趋势。当S-05菌株酶解2h时, 原生质体形成率达到最大值, 其形成率和再生率分别为82.7%和19.3%。因此, S-05菌株的最适酶解时间为2h, 此时原生质体形成率与再生率乘积也达到最大值。
2.5 酶解温度对原生质体形成的影响:
S-05菌在32℃条件下培养12h, 加入适量的溶菌酶, 分别在不同的温度下酶解, 然后测其原生质体的形成率和再生率见图4。
由图4可知, 在低于最适酶解温度时, 随着温度的升高, 原生质体形成率不断提高;但高于最适酶解温度时, 原生质体的产量却明显减少, 原生质体的再生率也明显减少。当温度为37℃时, S-05菌株原生质体形成率与再生率的乘积相对处于最大值, 原生质体形成率和再生率分别为83.5%和20.3%。因此, 确定37℃为最佳酶解温度。
3 结束语
菌株S-05接种于液体培养基中, 32℃摇床振荡培养9 h左右细胞进入对数生长期, 对数生长期持续13h。此时对数生长期的菌体生理状态相对一致, 代谢活力旺盛, 菌体活性较高, 对酶的敏感性强, 易于原生质体化。菌株S-05原生质体形成的合适条件为:培养12 h的菌体用4mg/m L的溶菌酶在磷酸缓冲液 (PH6.0) 中, 37℃静止酶解2h, 原生质体形成率与再生率分别为83.5%和20.3%, 二者乘积达到最大值。
聚β-羟基丁酸酯 (PHB) 产生菌S-05原生质体的制备, 为生物育种和菌种的改良创造了条件, 可以用原生质体融合和诱变技术筛选具有聚β-羟基丁酸酯 (PHB) 产生菌生物学功能、遗传性能稳定的高产菌株, 为大规模工业化生产开辟新的途径。
摘要：本论述对聚β羟基丁酸酯产生菌S-05的生理特性以及影响原生质体形成与再生的条件进行分析。结果表明:聚β羟基丁酸酯产生菌S-05在32℃, 180r/min振荡培养9h后进入对数生长期;该菌株原生质体形成的合适条件为:培养12h的菌体用4mg/mL的溶菌酶在磷酸缓冲液 (pH6.0) 中37℃静止酶解2h, 原生质体形成率与再生率达到最大值, 分别为83.5%和20.3%。
关键词：聚β羟基丁酸酯,生长曲线,原生质体
参考文献
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