链霉菌Da07210抗菌活性物质发酵优化分析

香蕉镰刀菌枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型 (Fusarium oxysporum f.sp. cubense, FOC) 引起的维管束坏死的系统性病害, 严重影响了香蕉的生产和发展[1]。目前, 尚未有效防治该病的方法[2]。国外关于香蕉枯萎病生物防治的研究主要集中于香蕉枯萎病拮抗菌的筛选及其室内盆栽防治试验。因此, 筛选FOC拮抗菌株, 开发新型农用抗生素对香蕉镰刀菌枯萎病的防治具有重要的意义。

大多数抗生素是由放线菌产生的。放线菌Da07210是从海南省鹦哥岭原始森林土壤中分离到得一株放线菌。通过多项分类, 确定菌株Da07210隶属链霉菌属 (Streptomyces) 。该菌株的发酵产物能抑制包括FOC在内的多种土传真菌病害的病原菌, 如辣椒疫霉菌 (Phytophthora capsici) 、立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani) 、瓜果腐霉菌 (Pythium aphanidermatum) 等。因此, Streptomyces sp.Da07210可以作为有潜在开发价值的抗生素产生菌。本文就其发酵条件进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

放线菌Da07210分离自海南省鹦哥岭原始森林土壤中。

1.1.2 测试菌株

古巴尖孢镰刀菌4号生理小种分离自海南省澄迈县发病蕉园。

1.1.3 培养基

用于抑菌活性测定指示菌培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基;斜面培养基:高氏一号合成培养基, 蒸馏水配制, p H7.2~7.4;种子培养基 (1 000 m L) :葡萄糖10.0g, 可溶性淀粉5.0 g, 酵母膏10.0 g, 大豆粉10.0 g, 磷酸二氢钾0.5 g, p H7.2。发酵基础培养基 (1 000 m L) :葡萄糖5.0 g, 大豆粉10.0 g, 磷酸二氢钾0.5 g, p H7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养

菌种活化:将保存的菌株Da07210接种于斜面培养基, 28 ℃培养5 d。种子液培养:挑取活化的菌种接入装有50 m L种子培养基的250 m L三角瓶中, 200 r/min、28 ℃下振荡培养3 d作为种子液;摇瓶培养:取10 m L种子液接入装有100 m L培养基的500 m L三角瓶中, 28 ℃、200r/min下恒温振荡培养4 d。发酵液离心收集上清用于抑菌活性测定和物理化学特性实验。

1.2.2 抗菌活性物质的生物测定

以古巴尖孢镰刀菌4号生理小种为指示菌, 用纸片扩散法进行抗菌活性物质的生物测定[3]。

1.2.3 发酵培养基优化

首先采用单因子试验, 对碳源、氮源进行优化, 然后在单因子试验的基础上用正交设计实验[4]对发酵培养基做进一步优化。

1.2.4 发酵培养条件优化

用经过优化的发酵培养基, 分别对不同发酵温度、p H值、接种量、摇瓶装量、摇床转速、种龄及发酵时间进行摇瓶发酵, 测定发酵液抑菌活性, 确定最佳发酵条件。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基优化

2.1.1 碳源的优化

在其他成分不变基础上, 改变碳源的种类, 分别以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉作为碳源进行单因素实验, 取0.5%、1.0%、1.5%这3个浓度水平, 每个处理重复3次, 测定发酵液抗菌活性。结果表明, 菌株Da07210以葡萄糖、甘油为碳源, 当2种碳源浓度达到1.0%时, 发酵液抑菌活性最好 (见表1) 。

注:“-”表示无活性。

2.1.2 氮源的优化

在氮源浓度一定 (1%) 的前提下, 分别添加大豆粉、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵为氮源进行单因素实验, 取0.5%、1.0%、1.5%和2.0%这4个浓度水平, 每个处理重复3次, 测定发酵液抑菌活性。菌株Da07210当大豆粉浓度为1.5%, 硫酸铵浓度为1.0%时, 抑菌圈直径达到最大值 (见表2) 。

注:“-”表示无活性。

2.1.3 碳氮源正交优化实验

根据单因素实验结果, 菌株Da07210以甘油、葡萄糖、硫酸铵、大豆粉作为碳氮源, 采用L9 (34) 正交表进行碳氮源配比优化实验, 每个处理重复3次。实验结果见表3。结果表明, 碳氮源对菌株Da07210合成活性物质的影响顺序为:葡萄糖>甘油>大豆粉>硫酸铵;最佳碳氮源浓度为:葡萄糖1.0%, 甘油1.0%, 大豆粉1.5%, 硫酸铵0.5%。

2.2 发酵条件优化

2.2.1 温度对产活性物质的影响

采用优化发酵培养基, 不改变其他发酵条件, 确定22、24、26、28、30 ℃5个温度水平, 每个处理重复3次, 测定发酵液抑菌圈活性。结果表明, 当在28 ℃培养时抑菌圈直径最大, 而温度过高或过低抑菌圈直径均减小。

2.2.2 起始p H对产活性物质的影响

采用优化发酵培养基, 将培养基初始p H值分别调节为4、5、6、7、8, 每个处理重复3次, 进行摇瓶发酵, 检测菌株Da07210抗菌效果。结果表明, p H值为7.0时发酵液的抑菌圈直径最大。

2.2.3 接种量对产活性物质的影响

在优化发酵培养基中, 分别按装液量的4%、6%、8%、10%、12%接入培养了48 h的种子液, 每个处理重复3次, 测定发酵液抑菌圈活性。结果表明, 菌株Da07210以8%的接种量最佳。

2.2.4 摇床转速对产活性物质的影响

采用优化发酵培养基, 摇床转速设定为50、100、150、200、250 r/min5个梯度, 接种量均为10%, 每个处理重复3次, 测定发酵液抑菌圈活性。实验结果表明, Da07210在转速为200~250 r/mi时, 活性最好且变化不明显。

2.2.5 种龄对产活性物质的影响

在优化发酵培养基中, 以10%的接种量分别接种培养时间为24、36、48、60、72 h的摇瓶种子, 每个处理重复3次, 进行摇瓶发酵, 测定发酵液抑菌圈活性。菌株Da07210种子液培养48 h, 接种后对应的发酵液抑菌圈直径最大。

2.2.6 发酵时间对产活性物质的影响

采用优化发酵培养基, 其他条件不变, 分别发酵48、72、96、120、144、168 h, 每个处理重复3次, 测定发酵液抑菌圈活性。菌株Da07210发酵至144 h时活性达到最大。

3 讨论

Streptomyces sp. Da07210的发酵产物对多种多种土传真菌病害的病原菌都有拮抗作用, 因此具有成为抗生素产生菌的开发潜力。本实验得到该菌株的最佳发酵培养基和发酵条件, 为Streptomyces sp. Da07210进一步的工业开发利用提供了数据基础。

摘要：链霉菌Da07210能产生对香蕉枯萎病病原菌有强烈抑制作用的活性物质。采用单因子实验和正交试验对其发酵条件进行优化。优化后的发酵培养基为:葡萄糖1.0%、甘油1.0%、大豆粉1.5%、硫酸铵0.5%。优化后的培养条件为:初始p H值7.0、培养温度28℃、种龄48 h、接种量8%、培养时间144 h、摇床转速200 r/min。

关键词：链霉菌,抗菌活性物质,发酵

参考文献

[1] Ploetz R C.Fusarium Wilt of Banana is Caused by Several Pathogens Referred to As Fusarium oxysporum f.sp.cubense[J].Phytopathology, 2006 (96) :653–656.

[2] Ploetz R C, Pegg K.Fusarium wilt.In Diseases of Banana[M].Abacáand Enset.Jones D R (Ed.) .Wallingford, UK:CAB International, 1999, 143-159.

[3] Hunfeld K P, Weigand J, Wichelhaus T A.In vitro Activity of Mezlocillin Meropenem Aztreonam, Vancomycin, Teicoplanin, Ribostamycin and Fusidic Acid Against Borrelia burgdorferi[J].International Journal of Antimicrobial Agents, 2001 (17) :203-208.

[4] 杜荣骞.生物统计学[M].第2版.北京:高等教育出版社, 2003:275.