没有细胞结构的微小生物-病毒

没有细胞结构的微小生物-病毒（通用10篇）

篇1：没有细胞结构的微小生物-病毒

第四章 一、教学目标：描述病毒特征及与人类的关系。运用资料，了解病毒与人类的关系。关注与病毒有关的疾病，认同利用病毒可以为人类造福。二、教学重点难点：重点：病毒的主要特征，与人类的关系难点：病毒的结构。三、教学过程：教学内容教师活动学生活动

导入：小学时打入我们体内的疫苗是毒性减弱的病毒，打入病毒可以使我们体内产生抵抗能力。

与身边事例联系，兴致浓

病毒是不具有细胞结构的生物让学生分组讨论1、病毒如何发现的?2、病毒的特点(形态，大小，有无细胞结构)?3、病毒的种类?4、病毒的结构和生活?5、病毒与人类的关系?(有利与有害)

学生小组讨论找出答案

病毒是如何发现的?介绍19世纪伊万诺夫斯基发现病毒的过程花叶病—汁液—细菌过滤器—感染正常叶片—正常叶患花叶草病毒

学生先介绍，教师总结

病毒的特点：病毒的形态是多种多样的，它的结构特点：1、有近似球形的多面体、杆形、蝌蚪形等。2、比细菌小得多，没有细胞结构。3、不能独立生活，寄生在其他生物的细胞内。

学生先介绍，教师总结病毒的种类1、动物病毒2、植物病毒3、细菌病毒(噬菌体)病毒的结构和生活结构简单，由蛋白质外壳和内部的遗传物质组成寄生在活细胞里，靠自己的遗传物质中的遗传信息，利用细胞内的物质，制造出新的病毒。离开了活细胞，通常变成结晶体病毒与人类的关系有害方面：1、部分病毒危害人类身体健康，如感冒病毒，乙肝病毒，非典病毒等2、危害人类的经济作物、家禽、家畜等。3、破坏人类使用微生物进行生产的产业，如味精业。有利方面：1、预防接种，制造病毒疫苗控制一些疾病2、利用 病毒的特性，人们用绿脓杆菌病毒防止烧伤病人伤 口受绿脓杆菌感染化脓3、利用病毒可制高效的生物农药教学反思：本课主要以教师提出问题，学生分组回答老师的问题，从而增进他们的小组合作性为主。从生活中学生是否打过疫苗入手，学生较具有兴趣。而且学生虽然很多都打过疫苗，但并不知道疫苗就是一种病毒，这个知识点跟他们的已有知识发生矛盾，所以学生有兴趣听课。然后让学生分组讨论问题，让他们每个人溶入到课堂中去，因为问题比较简单，在书本上也能找出答案，所以学生较易进入课堂状态。而讲到病毒的种类时，以禽流感病毒和sars为例，让学生判断是什么类型的病毒，学生兴致高，而且比较深刻。 对于小组中有的学生不能融入课堂中这个问题，我尝试让学生给自己小组起组名，让他们的集体观点更浓，利于小组合作的进行。

篇2：没有细胞结构的微小生物-病毒

病毒的主要特征;病毒的结构组成;病毒的生活. 四、课前准备

学生：课前通过各种渠道搜集有关病毒及病毒引起的疾病的资料. 教师：制作多媒体课件.

五、教学方法谈话法、讨论法 六、课时安排

篇3：没有细胞结构的微小生物-病毒

1 材料与方法

1.1 试验材料

狂犬病病毒Flury株 (LEP) , 由中国兽医药品监察所提供, 辽宁益康生物制品有限公司经乳鼠脑内和BHK-21细胞交叉传代固定后鉴定、保管;BHK-21细胞, 由中国兽医药品监察所提供, 辽宁益康生物制品有限公司繁殖、鉴定、保管;抗RV核蛋白单克隆荧光抗体, 由中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所提供。MEM培养基, 购自BD公司, 细胞培养液、生长维持液等按照常规方法配制;犊牛血清, 大连天娥检验试剂厂提供;细胞培养板, 购自瑞士Nunc公司。昆明系小鼠, 中国医科大学实验动物中心。

1.2 狂犬病病毒Flury株 (LEP) 在乳鼠脑内和BHK-21细胞上的交叉传代

1.2.1 Flury株在乳鼠脑内的传代。

以碘酊棉球消毒乳鼠头顶部, 然后以75%酒精棉球脱碘。用移液器吸取解冻并混匀的原始Flury株毒种30μL, 加入灭菌离心管中, 以0.25 m L注射器刚好吸进;制动后以注射器垂直刺入 (刺入点为以小鼠两眼连线为底边的等边三角形顶点处, 刺入深度以刚刺穿头骨且感觉有落空感时为宜) 。注入病毒液后退针, 置安静处继续饲养观察。注射后96 h内死亡的乳鼠于4%Na OH溶液浸泡2周后弃之。取96 h至7 d内发病死亡的乳鼠, 以碘酊彻底消毒脑部后, 无菌开颅取脑, -70℃冻存。注射后第8天, 将收集的全部鼠脑解冻, 加入约9倍体积的含10%犊牛血清的MEM培养基, 冰水浴匀浆, 匀浆充分后, 置无菌容器内混匀, 1 m L/支分装于无菌离心管内, 标明代次、时间等, 置于-70℃冻存。

1.2.2 Flury株乳鼠脑毒在BHK-21细胞上的传代。

取1.2.1制备的脑毒1 m L, 按照培养液1%体积接种长成良好单层的BHK-21细胞, 接种后置于37℃、5%CO2条件下培养, 培养72 h后将培养瓶放入-20℃以下冻融2次后, 将同一批次病毒液混合, 2 m L/支分装, 标明代次、时间等, 置于-70℃冻存。

1.2.3 交叉传代。

按照前述方法将Flury株病毒在乳鼠脑内和BHK-21细胞上交叉传代10次, 共计传代20代。

1.3 无菌检验, 支原体、外源病毒检验

按《中国兽药典》方法进行检验。

1.4 病毒含量测定

1.4.1 细胞半数感染量 (TCID50) 的测定。

对试验获得的各代脑毒、细胞毒分别测定TCID50。取形成良好细胞单层的BHK-21细胞, 以胰蛋白酶-EDTA溶液消化单层细胞, 弃去消化液, 以适量含5%犊牛血清的MEM对细胞进行稀释。调整细胞浓度至2×105个/m L, 接入96孔细胞培养板, 每孔0.1m L (2×104个细胞) , 37℃在5%CO2条件下培养过夜。次日, 弃去细胞培养液, 每孔接入用含2%犊牛血清的MEM进行10倍连续稀释的待测毒种悬液, 每个稀释度接种8孔, 每孔100μL, 并设不接种空白对照。继续培养72 h后, 弃细胞上清液, 以丙酮溶液固定孔内细胞30 min, 甩去丙酮后自然风干10 min, 加入工作浓度 (200~500倍稀释) 的抗RV核蛋白荧光抗体, 37℃温育1 h, 弃荧光抗体, 以p H值7.4~7.6的0.01 mol/L PBS洗液冲洗96孔板3次, 每次3 min。最后各孔内加入缓冲甘油, 于荧光显微镜下观察。观察到1个或1以上特异性荧光灶的孔记为“+”, 无特异性荧光灶孔记为“-“, 按Reed-Muench法计算毒种的TCID50值。

1.4.2 半数致死量 (LD50) 的测定。

取乳鼠脑与BHK-21细胞交叉传代中的4、8、12、16、20待细胞毒分别对3~5日龄乳鼠和11~13 g的小鼠进行LD50的测定。 (1) 3~5日龄乳鼠的LD50测定:取3~5日龄乳鼠80只随机分为8组, 每组10只 (一窝) 。取8只灭菌离心管按1~8标号后, 以p H值7.2的PBS对待测毒种作10倍连续稀释。参照1.2.1的操作进行各组小鼠脑内接种, 每只鼠30μL, 注射后饲养观察, 96 h之前死亡小鼠弃去不计, 记录96 h至10 d间小鼠死亡情况, 按Reed-Muench法计算毒种3~5日龄乳鼠的LD50值。 (2) 11~13 g的小鼠的LD50测定:取11~13 g的小鼠40只随机分为8组, 每组5只。取8只灭菌离心管按1~8标号后, 以p H值7.2的PBS对待测毒种作10倍连续稀释。参照1.2.1的操作进行各组小鼠脑内接种, 每只鼠30μl, 注射后饲养观察14 d, 按Reed-Muench法计算毒种11~13 g的小鼠的LD50值。

1.5 毒力测定

1.5.1 对犬的毒力。

取2、20代细胞毒原液, 每代毒种分别以1、5、10 m L剂量接种2月龄狂犬病抗体阴性的幼犬, 每组接种4条, 同时设对照犬4条。接种后按正常饲养观察3个月, 记录试验犬的发病情况。

1.5.2 对家兔的毒力。

取2、20代细胞毒原液, 每代毒种分别以0.5、1.0、2.0 m L剂量接种成年家兔, 每组接种4只, 同时设对照兔4只。接种后观察28 d, 记录试验兔有无狂犬病症状 (兴奋或抑郁脑炎症状) 。

2 结果与分析

2.1 交叉传代

将Flury株毒株经乳鼠脑内和BHK-21交叉传代10次后, 获得1、3、5、7、9、11、13、15、17、19代脑组织毒和2、4、6、8、10、12、14、16、18、20代细胞毒。将各代次毒种检验无菌且病毒含量≥10-6.5TCID50/0.1 m L的部分病毒液混合分装, 加入适量蔗糖脱脂奶保护剂进行冻干, 置-70℃保存。

2.2 无菌检验, 支原体、外源病毒检验

按《中国兽药典》方法检验结果表明, 无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染。

2.3 病毒含量测定

2.3.1 TCID50测定。

各代次毒种病毒含量均在10-6.0TCID50/0.1m L以下, 平均为10-6.75TCID50/0.1 m L。

2.3.2 LD50测定。

取4、8、12、16、20代细胞毒分别对3~5日龄乳鼠和11~13 g的小鼠进行LD50的测定 (表3) 。LD50平均值3~5日龄乳鼠为10-5.5/0.03 m L左右, 11~13 g小鼠为10-4.6/0.03 m L左右, 两者约相差一个数量级。

2.4 毒力测定

如表4、5所示, 该毒种对犬和家兔无致病性。

3 结论与讨论

狂犬病病毒Flury株 (LEP) 本身是一个优秀的疫苗毒株。该毒株在经过雏鸡、鸡胚的传代过程中, 对实验动物的致病力和嗜神经性已经大大降低, 但仍保持优秀的免疫原性。考虑到活疫苗存在的毒力强且Flury株本身对牛等动物存在不安全因素, 所以由Flury株制备的活疫苗只能应用于犬, 且宠物犬禁用。

通过将该病毒在乳鼠脑内和BHK-21细胞交叉传代, 进一步对该毒株进行固定, 使该毒株更加稳定, 同时也是为了恢复病毒长期在细胞上传代可能对免疫原性造成的影响。通过对交叉传代获得的各代次毒种进行TCID50测定 (平均为10-6.75/0.1 m L) , 4、8、12、16、20代细胞毒对11~13 g小鼠和3~5日龄乳鼠进行LD50测定 (平均分别为10-4.6/0.03m L和10-5.5/0.03 m L) , 对犬和家兔进行致病力测定。结果表明, 不同代次之间病毒滴度保持基本恒定, 对犬和家兔无致病性, 满足国家对Flury株 (LEP) 毒种的质量要求。

为更好的保证毒株的稳定性, 将交叉传代获得的17、19代脑组织毒和18、20代细胞毒作为狂犬病灭活疫苗研究的原始种子批 (1~4代) 。

参考文献

[1]王明俊.兽医生物制品学[M].北京:中国农业出版社, 2003:681-685.

[2]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[M].3版.北京:化学出版社会, 2005.

[3]郁惠忠.加强狂犬病的防控工作确保人民生命安康[J].畜牧与饲料科学, 2010 (1) :190-191.

[4]吴冉.我国狂犬病防控形势及防治对策[J].福建畜牧兽医, 2010 (1) :37-38.

篇4：没有细胞结构的微小生物-病毒

关键词 生物学教材 教材编排 生命的动力

中图分类号 G633.91 文献标识码 B

2004年，美国麦格劳-希尔出版了美国高中主流理科教材Biology：The Dynamics of life，该教材的中译本《生物：生命的动力》于2008年由浙江教育出版社出版（以下简称“美国教材”）。美国教材逻辑严谨，知识联系紧密，有利于中学生对生物学知识的建构与迁移。笔者立足于结构与功能观，研究美国教材“分子与细胞”章节关于细胞结构与功能内容编排的方式及特点，旨在为我国课堂教学提供参考性意见。

1 结构与功能观的概述

结构是系统内各成分之间相互联系、作用的方式，是系统的基本属性，又是系统具有整体性、功能性的依据。而功能是从系统外部反映系统的整体性，两者所要揭示的内容是不同的，但是两者又是相互联系，相互依存的。

一方面，结构决定着功能。结构是机体的组成成分，功能是机体组成成分相应的功效。另外，两者又是相互制约的，结构决定着功能，功能也对结构有限制作用，所以两者是一个相对范畴。根据结构与功能的联系，在科学研究中要重视探究系统的结构，依据结构的特点去了解系统，进而依据系统具有的结构来判断其具有的功能。

2 美国教材关于细胞的结构与功能内容的呈现

2.1 组成细胞的分子

系统的结构决定着系统的功能，认识系统得首先了解其结构。美国教材第13章“组成细胞的分子”以结构的层次性为衔接，以物质结构的有序性来组织内容，使知识逻辑化、网络化，易于学生对知识的建构与迁移。

如“组成细胞的分子”中第一节“原子及其相互作用”以分子结构的层次性为衔接来组织内容，以元素—原子—同位素—化合物和化学键—化学反应—混合物与溶液的逻辑顺序叙述，由简单到复杂，符合学生的认知规律。所有的物质都是由元素组成的，元素以原子的形式存在，原子的结构决定了其功能，也决定了各种化学元素的性质。所以教材尤其重视原子结构对内容的衔接，开始就以图文结合的方式分别展示了质子、中子、电子、电子能级的结构，并且在化学键、化合物、化学反应的内容中都有所体现。教材围绕着原子结构，试图让学生从微观角度理解原子中的各种微粒，了解这些粒子的结构与功能，为化合物、化学反应、生物大分子等结构与功能的学习奠定基础。

又如第三节对细胞中有机物的介绍，以碳在生物中的作用—分子链—碳水化合物的结构—脂类的结构—蛋白质的结构—核酸的结构为逻辑顺序呈现。因为所有的有机物都含有碳原子，所以教材首先介绍碳原子的结构，然后介绍碳原子的成键特点，包括单键、双键、三键，直链、支链或环状链知识，进而介绍分子链、多聚体的知识，对碳原子的结合方式以及分子链的学习有利于糖类、脂类、蛋白质、核酸的结构的认识。

可以看出，教材从原子的结构过渡到化学键、化学反应的知识，从碳原子的结构及分子链的知识过渡到生物大分子，知识逻辑严谨，内容衔接紧密，彰显了结构的层次性与有序性，既遵照了知识的逻辑性，也符合学生的认知规律。

2.2 真核细胞的结构

细胞器的结构多而复杂，而且其关联性不强，对学生来说比较抽象，在教材中如何呈现是一大难题。美国教材以细胞器所具有的功能将细胞器进行分类，巧妙地以细胞器功能的有序性来编排细胞器的结构。教材共分为7个小标题叙述真核细胞器的结构：细胞的边界、细胞核与细胞调控、组装运输和贮存、液泡与储存、溶酶体与循环再利用、能量转换器、用于支持和运动的细胞器。

教材首先介绍细胞的边界——细胞膜和细胞壁，“但是植物细胞、真菌、细菌和一些原生动物还有一层边界：细胞壁”，为细胞提供支持和保护；然后介绍细胞这个生命系统是如何运行的。细胞需要调控，相当于团队需要一个人来领导，细胞的“领导人”就是细胞核。教材根据细胞核指导蛋白质合成的基本程序相继介绍染色质、核仁、核糖体、细胞质四种细胞器；接着教材以一个问题“蛋白质合成的指令从细胞核输送到细胞质后，究竟发生了哪些变化呢？”引出组装和运输蛋白质：内质网-高尔基体；储存：液泡；循环再利用：溶酶体；接着叙述能量来源，“蛋白质的合成、修饰、运输和消化这些细胞活动都需要能量”，引出能量转换器：叶绿体和线粒体；最后介绍用于支持和运动的细胞器：细胞骨架-微管和微丝、中心粒、 纤毛和鞭毛。可以看出，教材以功能的有序性把繁杂的细胞器的内容知识进行了有效的整合，结构与功能联系紧密，逻辑清晰，易于学生对细胞器的整体把握，深刻体现了结构与功能相适应的生物学学科思想，值得我国学习与借鉴。

3 对我国高中生物课堂教学的启示

基于前面对美国教材关于细胞的结构与功能内容编排的分析，笔者对我国高中生物课堂教学有以下建议。

3.1 注重概念之间的联系

认知主义学习理论强调新知识的学习必须与学习者已有的认知结构有联结，建构主义强调知识的结构性。生物学是一门综合性很强的学科，知识概念多而抽象，如果在生物教学中不注重概念与概念之间的联系，将不利于学生系统、全面的掌握生物学知识，容易导致学生知识记忆的片段化，也不利于学生对结构与功能相统一思想的学习，难以落实我国高中生物新课程标准中要求学生初步形成结构与功能相统一的情感与态度价值观。所以，在中学生物课堂教学中教师不仅要重视学生对概念的理解，而且也要重视概念之间的联系，这样学生才能对抽象的概念有一个系统、全面的理解。

3.2 关注学生对知识的理解

篇5：没有细胞结构的微小生物-病毒

《没有细胞结构的微小生物-病毒》教学反思

病毒十分微小，通过事先让学生利用多媒体了解如口蹄疫、疯牛病、艾滋病及一些资料，既了解了相关知识又调动了学生学习病毒的积极性。引导学生利用图片和文字等资料查找有关病毒的信息，组织学生交流由病毒引起的动植物和人类的各种疾病，唤起学生探索病毒的奥秘兴趣。然后引导学生描述病毒的特征，经讨论分析认同病毒是生物。考虑到人类是在治疗各种人类疾病和动植物疾病的过程中逐渐认识病毒的，教学中从学生的.生活经验出发，先学习病毒与人类的关系，符合学生的认知规律。

由于病毒的形态结构和病毒的生活等内容比较抽象，积极引导学生的参与，激发学生的学习兴趣，开拓学生的视野。学生通过进行交流讨论，有利于进行自主性学习。

篇6：《没有细胞结构的微小生物教案》

教学目标：

1、描述病毒特征及与人类的关系。

2、运用资料，了解病毒与人类的关系。

3、关注与病毒有关的疾病，认同利用病毒可以为人类造福。

重点难点：

重点：病毒的主要特征，与人类的关系

难点：病毒的结构。

课前准备

学生：有关病毒及病毒引起的疾病的资料。

教学设计

学习内容学生活动教师活动病毒与人类的关系

举手，产生好奇心，集中精神思考，通过自己的体验自由发表看法。

能说出：预防“小儿麻痹”。

在教师的指导下确定：吃“糖丸”可预防“小儿麻痹”病。

疑问，关注本课内容，进入学习主题分组资料分析，讨论创设课堂气氛：小时候吃过“糖丸”的请举手。

提出疑问，了解学生认知：吃“糖丸”有什么用？（教师注意引导学生明确：吃“糖丸”为预防疾病，为后面学习“糖丸”是“减毒病毒”作铺垫。）

设疑，引入新课：

为什么“糖丸”能预防“小儿麻痹”？今天课上内容可以解答。

艾滋病： 症状、特征、传染途径

艾滋病的预防每组出代表，谈对病毒的认识，谈对艾滋病的认识。

听老师讲解，同时观察图片，对“艾滋病”给人类带来的危害有一定认识。将学生分组，组织学生分析自己收集来的资料。

让每组出代表，班上交流谈对病毒的认识，并引导，从中了解学生现有的水平。

鼓励学生提出疑问，将学生疑问总结性写在黑板上。

引导学生谈对“艾滋病”的认识。“艾滋病”由病毒引起，病毒给人类带来的危害。

提出疑问：艾滋病由什么引起的

举手回答：“艾滋病”由病毒引起，感受病毒给人类带来的危害。

出示图片：“艾滋病”病人，“艾滋病”预防宣传，“艾滋病”传播途径，“艾滋病”给人类带来危害的具体数据。（在让学生谈对病毒的认识过程中，不论涉及没涉及到“艾滋病”，教师都要引导学生谈到这一话题，并通过提问、引导，使学生对“艾滋病”的一些知识及其带来的危害有一定认识。）

鼓励其他学生回答，给予评价，同时大屏幕再次快速闪过图片：“艾滋病”病人，及“艾滋病”给人类带来危害的具体数据。（如学生回答不出，师解答：“艾滋病”由病毒引起，使学生确立：“世界绝症”致病源是病毒，感受病毒给人类带来的危害。）病毒的发现过程

疑问：病毒到底是个什么东西，与细菌一样吗？产生强烈的求知欲进入有目的的学习。

认真听，了解科学的研究方法。

分析得出：病毒比细菌小。明确本课学习目标，内容：学习本课可以对病毒有更深一步的认识，并对你们自己提出的疑问做出解答。

叙述：病毒的发现过程。

引导提问：病毒的发现过程说明病毒具有什么特征？

给予评价病毒特征：小，纳米计量，电子显微镜下才可见。列举一些自认为能代表病毒与细胞的大小关系的事物。

在教师的引导下得出比较接近的对比关系。

进一步认识病毒“小”的特征。

分析，解释原因：光学显微镜下观察不到 病毒。

能列举一定的根据说明病毒“小”的 特征。启发：病毒有多小？试着用类比的方法用身边熟悉的两个事物比较病毒与细胞的大小。

讲解：病毒对于细胞相当于篮球与一个摩天大厦。只有在电子显微镜下才能看到，要用纳米来计量大小。

实例说明：有一次，我的一个同学拿来一份鸡的血液，说可能这只鸡患有鸡瘟，想拿到学校的显微镜下查一查。老师马上说你一定查不到。向学生提出疑问：老师为什么这么说？

病毒形态

病毒结构： 蛋白质“外壳” 内部遗传物质

病毒的生活：生活 在活细胞内。

与病毒有关的疾病：流感，鸡瘟，口蹄疫，肝炎，烟草花叶“病”。

观察图片，识别几种病毒形态。

通过教师引导，分析得出结论：病毒没有细胞结构但又符合生物特征，是没有细胞结构的生物。

提出疑问：通过以上的学习，你判断病毒是生物还是非生物，为什么？（教师注意引导学生复习以前学过的生物特征及细胞结构的知识，让学生自己得出答案。）

病毒分类：植物病毒、动物病毒、细菌病毒——噬菌体 分析，得出结论：根据寄生的细胞不同，寄生在动物细胞内，称动物病毒；寄生在植物细胞内，称植物病毒。

提出疑问：大肠杆菌噬菌体寄生在大肠杆菌内叫什么病毒？（可以告诉学生大肠杆菌是一种寄生在肠内的细菌。）细菌病毒也称噬菌体。

提问：肝炎疫苗是用来防治病的，怎么会是病毒？

学生恍然大悟，对病毒有新的认识。认同病毒可以给人类带来益处。

篇7：没有细胞结构的微小生物-病毒

目前, 大多数实验是通过纯化HCV NS5B蛋白, 并且利用其可以在体外合成RNA的特性, 来筛选HCV RdRp的抑制剂[2—5]。虽然该种方法可以进行HCV RdRp抑制剂的高通量筛选, 但是HCV RNA在细胞中的复制是在非结构蛋白与宿主因子所形成的复制复合体中进行的[6,7], 所以纯化的NS5B蛋白并不能完整体现其在HCV复制复合体中的活性。因此, 本研究构建了含有HCV非结构区NS3-5B蛋白的真核表达载体p IRES2-EGFP-NS3-5b, 并将其转染至真核细胞中, 检测目的蛋白的表达。此载体可以在细胞中形成HCV复制复合体结构, 为NS5B活性的检测提供适合的微环境, 为进一步建立检测HCV RdRp活性的细胞系评价系统和动物模型评价系统奠定了实验和理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株及细胞

E.coil JM109菌株、p IRES2-EGFP真核表达载体和BHK-21细胞均为本室保存;p J6/JFH-1质粒由美国Rockefeller大学Charles M.Rice教授惠赠。

1.1.2 主要试剂

Prime STAR GXL DNA Polymerase、限制性内切酶、Wide Range DNA Marker (500~12 000) 均购自Ta KaRa公司;DNA凝胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒均购自天根公司;Lipofectamine 2000转染试剂和Nu PAGE Novex 4%~12%Bis-Tris预制胶购自Invitrogen公司;MEM细胞培养液购自Hyclone公司;胎牛血清购自天津四季青公司;抗HCV NS5B小鼠单克隆抗体为本室自制;抗HCV NS3/NS4小鼠单克隆抗体和抗β-actin小鼠单克隆抗体均购自Abcam公司;HRP标记的山羊抗小鼠Ig G购自北京鼎国生物技术有限公司。其余化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成

根据质粒p J6/JFH-1中HCV NS3到NS5b全长的基因序列 (以下标记为NS3-5b) (Gen Bank:AB114136.1) , 设计扩增引物。上游引物F (NS3-5b) 为:5’-GAAGATCTATGGCTCCCATCACTGCTTATG-3’, 在其5’端引入了Bgl II酶切位点;下游引物R (NS3-5b) 为:5’-CGGAATTCCTACCGAGCGGGGAG-TAGG-3’, 在其5’端引入了EcoRI酶切位点。所设计的引物均送与南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.2 重组p IRES2-EGFP-NS3-5b的构建

以质粒PJ6/JFH-1质粒为模板, PCR法扩增HCV NS3-5b序列。PCR反应体系为:5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL, d NTP Mixture 4μL, 上游引物F (NS3-5b) 1μL, 下游引物R (NS3-5b) 1μL, PJ6/JFH-1质粒1μL, Prime STAR GXL DNA Polymerase 1μL, dd H2O补足至50μL。反应条件为:预变性94℃5min;98℃10 s, 68℃7 min, 共30个循环;再于72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后, 回收纯化目的条带。

目的条带和载体p IERS2-EGFP分别经Bgl II和EcoRI双酶切并回收纯化后, 两者以摩尔比约为3∶1进行连接。连接产物转化JM109感受态细胞, 挑取阳性克隆并进行扩增, 然后提取质粒进行酶切鉴定, 鉴定正确的质粒送与南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析。阳性重组质粒命名为p IRES2-EGFP-NS3-5b。

1.2.3 细胞转染及荧光成像观察

BHK-21细胞培养于含10%胎牛血清的MEM培养液中, 待细胞生长状态良好时, 以2×105/孔的密度将其铺至24孔板。培养12 h~16 h后将重组质粒p IRES2-EGFP-NS3-5b以每孔1μg含量按照Lipofectamine 2000转染剂的说明, 转染BHK-21细胞, 培养24 h后进行荧光成像检测。

1.2.4 总蛋白提取及Western Blot检测

转染的BHK-21细胞培养48 h后, 通过细胞裂解液处理提取总蛋白。经BCA法测定蛋白总浓度后, 将每孔总蛋白上样量调整为40μg。样品经过Nu PAGE 4%~12%Bis-Tris预制胶分离后转移至经甲醛浸泡过的PVDF膜上, 用5%脱脂牛奶室温封闭4 h后, 加入与目的蛋白相对应的一抗, 4℃孵育过夜。其中一抗分别为:抗HCV NS5B小鼠单克隆抗体 (1∶320比例稀释) ;抗HCV NS3/NS4小鼠单克隆抗体 (1∶300比例稀释) ;抗β-actin小鼠单克隆抗体 (1∶1 500比例稀释) 。PBST溶液洗膜后, 加入HRP标记的山羊抗小鼠Ig G (1∶12 000比例稀释) , 室温孵育90 min后, 用ECL显色试剂进行显色, 最后通过Tanon4200成像系统照相。

2 结果

2.1 重组质粒p IRES2-EGFP-NS3-5b的酶切鉴定及序列分析

重组质粒分别经Bgl II、EcoRI单酶切以及Bgl II和EcoRI双酶切后, 1%琼脂糖凝胶电泳分离可见目的片段的大小与预期结果相一致, 如图1所示。其中单酶切所得片段大小约为11 315 bp (base pair, 指示DNA碱基数目) , 双酶切所得片段大小分别约为6 015 bp和5 300 bp。测序结果经Blast分析显示, 该重组质粒中目的片段基因序列与所报道的完全一致。

2.2 荧光成像观察报告基因的表达

重组质粒p IRES2-EGFP-NS3-5b转染BHK-21细胞后培养24 h, 荧光显微镜观察绿色荧光蛋白 (GFP) 的表达。如图2所示, 在转染重组质粒的BHK-21细胞中可以观察到绿色荧光, 表明目的蛋白NS3-5B得到了表达。

2.3 Western Blot检测HCV非结构蛋白NS3/4A和NS5B的表达

提取已转染重组质粒的BHK-21细胞总蛋白, 进行Western Blot检测。如图3所示, 在转染的细胞中分别检测到了NS3/4A和NS5B蛋白的表达, 而在未转染的细胞中未检测到相关蛋白的表达, 进一步证实目的蛋白NS3-5B得到了特异性表达。

3 讨论

丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus, HCV) 是引起慢性肝病的主要病原体之一, 为一条单正链RNA病毒, 属于黄病毒科, 肝炎病毒属[1]。目前, 全球约有1.3亿慢性HCV感染者[8], 其在感染后期可发展为肝硬化, 进而转化为肝细胞癌[9], 严重影响人类健康。

HCV非结构区NS3-5B蛋白是病毒RNA复制中所需的最少的病毒蛋白组分, 它们与宿主因子构成了定位在内质网膜上的具有活性的复制复合体, 为病毒RNA的复制提供了一个稳定的微环境[10,11]。HCV非结构蛋白NS3是一个多功能蛋白, 其N端的丝氨酸蛋白酶区可与NS4A以及Zn2+结合从而发挥蛋白酶活性, 水解下游四个非结构蛋白之间的链接[12], 其C末端的解旋酶活性在病毒的复制中也起到了重要作用[13]。非结构蛋白NS4B含有跨膜区段并且参与内质网结构的改变过程[14]。非结构蛋白NS5A为一个含有三个结构域的磷酸化蛋白, 在病毒RNA复制和病毒组装中发挥重要[15]。非结构蛋白NS5B其C末端定位在细胞膜上, 具有RNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp) 活性, 是病毒RNA合成过程中的关键酶, 是抗HCV治疗的理想靶点之一[8]。

目前, 主要通过放射性标记实验进行HCV RdRp抑制剂的筛选。其实验原理为:在含有引物和同位素标记的UTP溶液中, 体外纯化的NS5B蛋白可以将异源二聚体RNA作为模板, 合成新的RNA[5]。而新合成的RNA因含有放射性标记的核苷酸, 可以通过生物素-链亲和素 (streptavidin) 的链接, 被捕捉到链亲和素包被的圆球微粒的表面, 最后通过临近闪烁分析 (SPA) 技术检测产物的形成[16—18]。虽然纯化的NS5B蛋白具有聚合酶的活性, 但是并不能完整模拟NS5B蛋白在细胞中的有效活性, 因为HCV RNA的复制是在宿主细胞内质网膜中的复制复合体中进行的, NS5B蛋白发挥酶活性时还需要其它非结构蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A的辅助。

篇8：没有细胞结构的微小生物-病毒

关键词：坦布苏病毒；囊膜蛋白；二级结构；B细胞表位

中图分类号： S858.335.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0166-03

收稿日期：2013-09-13

基金项目：国家自然科学基金（编号：31172345）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（12）5048]。

作者简介：韩凯凯（1983—），男，河南新乡人，博士，助理研究员，主要从事家禽病毒分子生物学研究。E-mail：hankk0917@126.com。

通信作者：李银，博士，研究员，主要从事家禽疫病流行病学和防治相关的研究。E-mail：muziyin08@163.com。2010年春季以来，上海、浙江、江苏等地相继暴发了一种導致鸭鹅产蛋量急剧下降的新发疾病，发病鸭鹅主要表现为高热、运动障碍、食欲下降甚至废绝、产蛋下降甚至停止，死亡率可达 5%～10%[1]。其典型病理变化表现为鸭鹅的卵巢先发生出血、萎缩、破裂，患病后期出现神经症状，倒地震颤，最终衰竭死亡。该病传播迅速、波及面广，几乎席卷了整个水禽养殖密集地区，给我国鸭鹅养殖业造成了巨大损失[2]。目前已证实，引起该病的病原为坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）[3]。坦布苏病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）不分节段的单股正链 RNA 病毒，含有单一的开放读码框，编码 结 构 蛋 白（C、 PrM、E）和 非 结 构 蛋 白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5），其中E蛋白是坦布苏病毒的囊膜蛋白，由 500个氨基酸组成，在病毒的吸附、融合、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用[4]。测定E蛋白的晶体结构发现，它在空间上可以形成3个不同的结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区）。在乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位研究中，Kolaskar等认为，E蛋白的三维结构域Ⅲ（292～402 aa）集中许多抗原中和表位[5]。Seif等通过分段表达E蛋白，证明了中和表位存在于 E373-399位的27个氨基酸序列内[6]。Wu等研究发现，JEV的中和位点主要集中在EⅢ的E307-309、E327-333、E386-390这3个区域内[7]。由于该病毒的发现时间不长，其主要蛋白抗原表位研究尚未见报道。有学者提出，蛋白质的二级结构、亲水性、柔韧性、抗原性、表面可及性等特性与B细胞抗原的表位分布存在密切联系[8]。本试验首次应用生物信息技术对鹅坦布苏病毒（goose Tembusu virus，GTMUV）E蛋白基因推导的肽链进行蛋白质二级结构和B细胞表位的预测分析，旨在为坦布苏病毒E蛋白功能的研究、抗体的制备及分子疫苗的设计等提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

预测所使用的坦布苏病毒毒株来自鹅源JS804株，其病毒开放阅读框氨基酸序列由笔者所在实验室测定，共有500个氨基酸残基，GeneBank登录号为JF895923。

1.2试验方法

先用单参数对毒株E蛋白的结构及性质进行预测，再采用不同的参数对E蛋白的二级结构及B细胞表位进行综合预测和分析。

1.2.1GTMUV E蛋白二级结构预测应用DNAStar软件的protean模块进行二级结构预测。采用Chou-Fasman法从氨基酸残基的晶体结构来预测蛋白质的二级结构；用Garnier-Robson法计算特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性；用Karplus-Schultz法预测蛋白质骨架区的柔韧性。其中各参数的意义见相关文献[9-10]。

1.2.2GTMUV E蛋白B细胞抗原表位预测用DNA Star软件Protean程序预测B细胞抗原表位；用Kyte-Doolittle方法，同时依据氨基酸组成预测蛋白的亲水区和疏水区；用Emini方法预测特定区域于蛋白质表面的可及性；用Jameson-Wolf法预测蛋白的抗原指数，同时根据http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input网址中的Kolaskar-Tongaonkar法预测蛋白的平均抗原表位指数。结合蛋白的亲水性、表面可及性、柔韧性、抗原指数等对测定结果进行综合分析。综合预测结果，预测鹅坦布苏病毒E蛋白的潜在优势B细胞抗原表位，其中各参数的意义参考相关文献[11-13]。

2结果与分析

2.1GTMUV E蛋白的氨基酸序列

鹅坦布苏病毒E蛋白基因编码500个氨基酸，其理论分子量为54.38 kDa，理论等电点pI为7.32，存在跨膜区域。通过http：//prosite.expasy.org/scanprosite/在线服务器预测表明，该蛋白有N_糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点和N-豆蔻酰化位点。

2.2GTMUV E蛋白二级结构的预测

采用DNAStar软件的Chou-Fasman法、Garnier-Robson法以及Karplus-Schultz法对E蛋白的二级结构进行预测，结果见图1。

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Garnier-Robson法预测结果显示，E蛋白有14个α-螺旋，32个β-折叠区域。Chou-Fasman法预测结果显示，E蛋白有16个α-螺旋，23个β-折叠区域。2种方法预测出的α-螺旋均较β-折叠数量少；2种方法预测的α-螺旋共有12个，分别位于41～57、79～81、87～92、117～120、133～144、157～165、179～181、239～252、261～267、285～296、412～417、468～478区段上；2种方法预测的β-折叠区域共有20个，分别位于1～4、20～25、31～36、62～38、166～170、186～189、201～205、270～274、299～302、310～314、322～328、338～341、254～359、381～386、391～397、423～425、435～438、443～448、482～486、491～496区段上。同时发现，Garnier-Robson法预测的β-转角区域远远少于Chou-Fasman法，Gamier-Robson法预测的无规则卷曲分布区段相对集中，主要位于15～17、145～148、226～239、456～461区段上。

2.3柔韧性区域分析

利用Karplus-Schultz法预测E蛋白骨架区的柔韧性，由结果可知，E蛋白骨架区含有分布较均匀的柔韧性区域，肽链中具有较高表面可及性的区域主要在62～78、92～104、225～239、273～286、313～322、362～370和399～416区段上（图2）。由于这些蛋白肽段的柔韧性较大，发生扭曲、折叠的概率较高，因此形成表位的可能性较大，容易与抗体进行嵌合。

2.4E蛋白的B细胞抗原表位预測分析

2.4.1E蛋白的亲水性预测分析利用Kyte-Doolittle方法预测E蛋白的亲水性，结果显示，E蛋白具有较高的亲水性，亲水性区域的分布较均匀，主要分布在E蛋白肽链的36～45、60～104、119～137、147～165、174～199、207～251、275～309、310～320、391～405和475～483区段上（图3）。B细胞抗原表位多位于蛋白外侧，而亲水氨基酸残基多位于蛋白表面，因此该区段位于蛋白表面的可能性最大，作为抗原表位的概率也最高。

2.4.2E蛋白的表面可及性预测分析利用Emini方法进行E蛋白的表面可及性分析，结果表明，E蛋白肽链中具有较高表面可及性的区域在7～12、34～41、80～89、123～126、130～136、148～163、233～239、245～250、315～319、392～402和476～481区段上（图4）。由于这些区域可能位于蛋白分子表面，因此有可能形成表位。

2.4.3E蛋白的抗原指数及抗原表位指数预测分析应用DNAStar软件，采用Jameson-Wolf方法对E蛋白的抗原性进行预测。从图5的分析可见，E蛋白存在有多个潜在的抗原表位位点，具有较高抗原指数的区域在6～19、26～31、33～44、61～89、92～105、108～115、118～137、144～159、172～177、179～186、189～199、226～251、257～262、273～301、312～322、330～339、344～355、376～383、388～395、397～418和475～484区段上。Kolaskar-Tongaonkar法预测的E蛋白平均抗原表位指数为1. 027，详见图6。

2.5E蛋白B细胞抗原表位综合预测

通过对鹅坦布苏病毒E蛋白的二级结构、亲水性、柔韧性、抗原指数、表面可及性等参数分析显示，若抗原表位指数≥1.027，亲水性指数≥0，氨基酸的抗原表位可及性指数≥1，且区段内部或附近具有柔韧性结构，则这一区段为抗原表位的可能性较大。按照如上方法筛选表明，在E蛋白肽链的第35～41、80～89、148～159、245～251、314～320、392～402和475～482区段上，各种方案预测的结果基本一致，且在蛋白二级结构上含有较易形成抗原表位的转角和无规则卷曲结构。因此可以推测，E蛋白的B细胞抗原表位可能在以上区域内或附近。

3结论与讨论

B细胞识别蛋白抗原时，是以其表面的B细胞抗原受体（BCR）与蛋白抗原表位结合，此过程与抗原抗体的结合类似。作为B细胞的抗原表位，应位于或易于移动到蛋白抗原表面，有利于与B细胞抗原受体或抗体结合；同时还要有一定柔韧性，因为抗原与抗原受体或抗体的结合是一个相互嵌合的过程。因此，预测B细胞抗原表位时主要从蛋白质的二级结构、柔韧性、表面可及性和亲水性等几个方面入手。蛋白质二级结构与表位分布关系密切，在蛋白质结构中作为骨架起稳定作用的主要是α-螺旋和β-折叠，而决定蛋白质功能与抗原表位分布的则多是β-转角和无规则卷曲[14]。

由于螺旋区段和折叠区段的化学键能较高，主要维持蛋白的高级结构，且经常位于蛋白质内部，很难较好地与抗体嵌合，不易形成抗原表位；而转角区域和无规则卷曲区域的结构是比较松散的结构，易于发生扭曲、盘旋，并多位于蛋白质分子表面，有利于与抗体嵌合，成为抗原表位的可能性较大。蛋白质的柔韧性是指蛋白抗原构象不是刚性不变的，其多肽骨架有一定程度的活动性；亲水性分析结合二级结构预测已被广泛应用于抗原表位分析[15]。

本研究采用Chou-Fasman法和Garnier-Robson法预测鹅坦布苏病毒蛋白的二级结构，利用Karplus-Schulz法预测其柔性区域，利用Kyte-Doolittle方法预测E蛋白的亲水区和疏水区。结果显示，鹅坦布苏病毒E蛋白的二级结构较为复杂，且α-螺旋和β-折叠分布相对均匀，含有较多的转角和无规则卷曲等柔性区域，这些柔性区域的存在为抗原表位的确定提供了有力的证据。同时，与这些区域相对应的亲水性、柔韧性、抗原指数和表面可及性等参数也较高，因此预测这些区段应是潜在优势B细胞抗原表位所在区段。需要注意的是，一个蛋白质中某段氨基酸序列能否诱导体内产生抗体是多种复杂因素共同作用的结果。B细胞抗原表位，尤其是其构象表位，主要是通过三维立体结构来展现其抗原性，而生物信息学分析软件主要是对其二级结构进行预测，因此用于预测构象依赖型表位有一定的局限性。本试验的预测结果只能作为鉴定鹅坦布苏病毒E蛋白潜在表位的参考，预测结果正确与否还有待于科学研究证实。即便如此，通过生物信息学的方法对E蛋白进行预测，不仅可以了解坦布苏病毒E蛋白抗原的结构、功能、抗原抗体反应等有关免疫反应的诸多信息，而且对诊断试剂研发、药物制备和核酸疫苗设计等也具有指导意义。

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参考文献：

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[2]Huang X M，Han K K，Zhao D M，et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from geese in China[J]. Research in Veterinary Science，2013，94（3）：774-780.

[3]Yan P X，Zhao Y S，Zhang X，et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China[J]. Virology，2011，417（1）：1-8.

[4]朱丽萍，颜世敢. 鸭坦布苏病毒研究进展[J]. 中国预防兽医学报，2012，34（1）：79-82.

[5]Kolaskar A S，Kulkarni-Kale U. Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus[J]. Virology，1999，261（1）：31-42.

[6]Seif S A，Morita K，Matsuo S，et al. Finer mapping of neutralizing epitope（s） on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system[J]. Vaccine，1995，13（16）：1515-1521.

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[8]劉丽娜，潘渠，朱军民，等. 2-型猪链球菌保护性抗原RfeA的B细胞表位预测[J]. 成都医学院学报，2011，6（2）：133-135.

[9]Chou P Y，Fasman G D. Prediction of the secondary structure of protein comformation[M]. New York：Plenum Press，1990：549-586.

[10]Garnier J，Osguthorpe D J，Robson B. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. Journal of Molecular Biology，1978，120（1）：97-120.

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[14]Doolittle R F. The roots of bioinformatics in protein evolution[J]. PLOS Computational Biology，2010，6（7）：e1000875.

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篇9：没有细胞结构的微小生物-病毒

1材料与方法

1.1材料

人乳腺癌细胞系MCF7购自南京科诺生物有限公司,Hyclone胎牛血清、DMEM培养液购自TM公司(宝信生物科技有限公司分装),真核质粒p EZX-e GFP-mi R-21(广州复能基因有限公司),质粒抽提试剂盒及无内毒素质粒提取试剂盒(北京康为公司),胶回收试剂盒(Ta Ka Ra公司),兔PTEN Ig G(Abcam公司),抗兔抗体(Santa Cruz公司),0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,实验室配制),噻唑蓝(MTT)试剂盒(Sigma公司),膜联蛋白V(Annexin V)细胞凋亡检测试剂盒(凯基公司)。

1.2 MCF7细胞的培养与细胞瞬时转染

MCF7细胞于含10%胎牛血清,100 u/ml青霉素,100 g/L链霉素的DMEM培养基中,37℃、5%二氧化碳CO2孵箱内贴壁培养。细胞转染利用转染试剂Lipofectamine TM2 000,严格按说明书进行。实验分为3个组:1转染p EZX-e GFP-mi R-21组为实验组;2转染p EZX空载体组为阴性对照组;3未转染组为空白对照组。荧光显微镜于转染24 h内观察并估算转染效率。

1.3免疫组织化学染色

细胞爬片用4%多聚甲醛固定后,在3%过氧化氢- 甲醇溶液条件下,常温孵育10 min;10%山羊血清室温孵育10 min;滴加1∶200稀释的兔PTEN Ig G单抗后,37℃孵育1 h;滴加抗兔生物素化二抗50μl,37℃孵育30 min;滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液,37℃孵育30 min;滴加二氨基联苯胺(DAB) 显色液于镜下观察颜色控制时间3 min。复染、脱水、透明、封片。

1.4 MTI检测细胞增殖活性

将细胞分为3组,每组6孔,于转染后l、2、3、4、 5、6及7 d测量各组吸光度(A)值,比色时,每孔加MTT溶液(5 g/L)20μl,37℃,继续培养4 h,弃去孔内培养上清液,每孔加入150μl二甲基亚砜(DM- SO),振荡10 min,结晶充分溶解,以空白调零,选择570 nm波长,酶联免疫检测仪测定各孔的A570值, 比较各组细胞的增殖抑制率。

1.5流式细胞仪检测转染后细胞凋亡

按照凋亡试剂盒说明书,转染后48 h按说明书进行操作,检测转染后细胞凋亡。

1.6统计学方法

计量资料应用SPSS 17.0统计软件分析。两样本比较采用配对设计两两比较t检验,数据以均数±标准差(±s)表示。P <0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1 MCF7细胞转染结果

MCF7细胞中较大比例梭型细胞表达绿色荧光蛋白,转染效率(%)= 每高倍镜视野发荧光细胞数/ 同一视野细胞总数 ×100% ,24 h转染效率为(0.834±0.062)%,各组转染效率的差异无统计学意义(P >0.05)。

2.2免疫组织化学染色

镜下3组细胞的形态无明显差异,以细胞质呈棕褐色为阳性细胞,转染p EZX组和未转染组细胞质呈棕褐色(图1);转染p EZX-e GFP-mi R-21组结果为阴性(图2)。

2.3MTT法鉴定细胞增殖活性

结果显示转染组可以明显促进MCF7细胞的增殖。随着培养时间的延长,转染组和空质粒组的细胞数均有所增加,但转染组细胞增殖更快。见图3。

2.4细胞凋亡

空白对照组与空质粒对照组的凋亡率分别为(8.04±0.02)%和(9.41±0.53)%,而转染组的凋亡率为(3.14±0.24)%,与空质粒对照组、空白对照组凋亡率之间的差异均有统计学意义(P <0.05)。

3讨论

Mi RNA是一类具有高度保守性的非编码小分子RNA片段,能高效地调控癌基因和抑癌基因的表达,在肿瘤的发生发展中起着关键的调控作用[2,3]。 第10号染色体缺失的PTEN是目前发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,在恶性肿瘤细胞的增殖、分化、浸润和凋亡中起抑制作用[4,5]。研究表明在胆管癌细胞中抑制mi R-21表达后PTEN蛋白表达上升,揭示了mi R-21在活化磷酸肌醇3激酶(P13K)通路中的作用,PTEN表达增加引起PIP3水平上升并活化蛋白激酶B(Akt)/PKB通路,Akt/PKB通路活化可促进细胞增殖并抑制凋亡[6]。

本实验结果显示,转染mi R-21后MCF7细胞的分裂增殖能力增强,细胞凋亡减少。它提示mi R-21与乳腺癌的恶性程度可能有关,应用免疫组织化学技术检测瞬时转染后的细胞株,经免疫组织化学检测转染mi R-21的MCF7中PTEN明显降低, 与对照组差异有统计学意义,证实PTEN是mi R-21的重要靶蛋白,提示同胆管癌相似,在乳腺癌中, mi R-21可能也是通过作用于其靶蛋白PTEN,降低PTEN的表达,使PIP3水平降低,抑制蛋白激酶B (Akt)/PKB通路来调节细胞的增殖和凋亡能力的。 在乳腺癌中,mi RNA-21高表达可导致抑癌基因PTEN的失活或低表达,从而促进MCF7细胞的异常增殖,促进乳腺癌的发展。因此,mi RNA-21、PTEN可以作为评估乳腺癌预后的预警分子,同时也为乳腺癌进一步的靶向治疗提供位点。

摘要：目的 观察转染微小RNA-21(mi R-21)对MCF7细胞系中磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)表达及细胞凋亡的影响。方法 对MCF7细胞转染mi R-21,采用免疫组织化学法检测转染前后PTEN的表达;用噻唑蓝(MTT)比色法测转染mi R-21后MCF7细胞增殖;流式细胞术检测转染后MCF7细胞凋亡。结果 经免疫组织化学检测,转染组未见染色,对照组细胞胞质呈棕褐色,转染组PTEN的表达明显低于对照组,MTT法检测转染组细胞活力增加(P<0.05)。转染组的凋亡率为(3.14±0.24)%,空白组、空质粒组的凋亡率分别为(8.04±0.02)%、(9.41±0.53)%(P<0.05),转染组细胞凋亡率明显减少。结论 PTEN是mi R-21的靶基因之一,mi R-21的高表达可促进乳腺癌的发展。

篇10：书桌上的微小生物

“嗯，这就是我们家里的地板啊！”时光布偶不紧不慢地飞过来说道。小青吓了一大跳：“怎么可能？家里的地板明明是光光亮亮的啊！而且，我妈妈每天都要打扫的。”“呵呵，那只是扫掉了表面个子比较大的一层灰尘，但更多的灰尘，是人的肉眼看不到的。更别说用扫帚、拖把就能清扫干净啦！”

“嗨，我就说嘛。”小青叹了口气，“天天妈妈都催着我打扫房间，可是，扫来扫去，根本就扫不干净。有这个工夫，还不如多打会儿游戏呢！”时光布偶这下可不高兴了：“哼，还说呢！你跟我来看看吧！”说着，用手拉住小青的手，带着他飞到了前面的一处“沙漠”里。

饼干渣和蛋糕屑

“咦，那是什么东西啊？”小青一看到眼前这些古古怪怪的东西，就有点心里发毛。看吧，一块又厚又平的“大石头”横在了面前，好像在地理图册上看到过的那种被风化的岩石。不但形状是扁扁的，而且还一层摞一层，就像在地质公园里看到的岩石层一样。再看离这块“大石头”不太远的地方，还有一团黑乎乎的东西，有几层楼那么高，好像一座大山包。上面像蜂窝一样，布满了小孔，有的地方还粘着一个接一个的小圆球。在最高的“山顶”上，还嵌着几块白色透明的东西，方方正正的，正在闪光呢。“怎么回事？这些‘怪物’怎么会跑到我家里来啊？”小青奇怪地问。

“呵呵，怎么不记得了？这不都是你的‘杰作’吗？”时光布偶晃了晃脑袋，说道，“你啊，怎么也改不了边做作业边吃零食的习惯。结果，就把它们都带到这里来了。”

“我的零食？”小青更糊涂了。他想啊，想啊，最后终于想到了：“啊？你是说，它们是——”

“对啦！”时光布偶飞起来，先是敲了敲那块“大石头”，从上面掉下一大块白色的“石片”，正落在小青面前。“这，就是你写数学题时吃的梳打饼干。”他又飞到那座“山包”上，推下了一块“小圆球”，“这个呢，就是你复习课文时吃的那块巧克力蛋糕。喏，这白色的就是蛋糕里的白糖晶体。想起来了吗？”

天啊。小青还真没想到：自己平时掉下来的这点饼干渣、蛋糕屑，居然是这个样子的！可是再仔细瞧一瞧，可不是吗？梳打饼干是一层一层的，而蛋糕又松又软，里面有好多小孔。糖的晶体，在学校里老师已经用显微镜给大家看过了，就是这样像一块正方形的水晶石，又白又亮的。“哈哈，真是太有趣了！”

霉菌森林

“哼，你呀，先别高兴得太早！”时光布偶无可奈何地摇了摇头。他从巧克力蛋糕“山包”上飞下来，拽着小青的手，一直走到了“山包”的下面。“好好看看吧，这些东西总呆在书桌下面，可不是什么好玩的事情！”

小青凑过去一看，哎哟，这块“山包”的上面，已经长出了好多又粗又长的“草”。有的是白色的，有的是绿色的，还有的是黑色的。在“草叶”的顶端，还长着一束一束的小圆球，像火柴棍一样。“啊，这个我知道，老师在课堂上讲过，面包、点心和水果放的时间长了，就会长出霉菌来。这个就是霉菌吧？”小青的科学课学得还真不错呢！

“唉，你都知道是霉菌了，还不注意卫生。这些霉菌啊，可不简单呢！”时光布偶说着，拿出缩小机，向着自己和小青又照了一下。哎呀呀，这次他们变得更小了。小青抬头一看，霉菌已经变得又高又大，看上去不是“草”了，而像是好多飘来飘去的“丝带”。只是，这些“丝带”是由一个个绿色的小圆球串成的。它们的“身体”里都装满了好多液体，还在不停地流动着。而且，好像这些小圆球越变越多了！

“这就是霉菌的细胞吧？”小青问道。时光布偶点了点头，回答：“看到了吗？它们正在把从蛋糕屑上吸收来的营养物质加工成自己需要的养分，然后‘吃掉’，就可以继续生长了。和其他的细菌不一样，霉菌只会‘长’得越来越长，而不是越来越大，再分裂成更多的细菌。”

“这么说，再过几天，我的蛋糕屑就要变成‘霉菌森林’啦！”小青兴奋得有点过了头，一不小心，脚下踩空了。他一边向下掉，一边大喊起来：“不好了！时光布偶，快来救救我！”

头发和螨虫

小青向下落呀落，最后一下子掉进了一团软绵绵的东西里。“哎哟哟，这是哪里啊？”他手忙脚乱地四处乱抓，想让自己停下来。忽然，他不再向下掉了，好像背后被什么东西托住了。他小心地尝试着坐起来，发现自己躺在一根粗大的“树干”上，上面还有一片一片翘起来的“树皮”，一层层包裹着，像是鱼身上的鳞片。他站了起来，沿着这根“树干”走来走去，觉得挺有意思的，连害怕也忘掉了。这时，时光布偶也从上面飞了进来，他赶快抬头指给时光布偶看：“你看，这是什么树啊？”

时光布偶先是一愣，然后大笑起来：“哈哈，你怎么连自己掉的头发都不认识啦？”

“什么？这是我的头发？”小青都不敢相信自己的眼睛了。“头发都是光光亮亮的，一根一根的，怎么会有鳞片啊？”

“这个就是头发表层的毛鳞片。它能起到保护头发里面的细胞的作用。你刚才说头发光光亮亮的，就是毛鳞片的功劳。要是它被破坏了，头发就没有光泽啦！”时光布偶匆匆忙忙地解释了一下，拽起小青的手，说道：“我们得马上离开这里，这里很危险！”

“危险？”小青一点也摸不着头脑，“这儿到底是哪儿啊？怎么会有危险呢？”

“这里就是你书桌下面的灰团里啊！你平时不注意保持卫生，灰尘堆积在一起，就成了灰团。这灰团里可不止有头发，还有很多‘危险生物’呢！”时光布偶说着，指着下面给小青看，“你看，那里就有一只尘螨（mǎn）。”

小青顺着他的手指看过去：哇，真的有一只又圆又胖的大虫子，正在灰尘的纤维里爬来爬去。这只虫子模样也很奇怪，它没有头，只长着触角，在肚子上还长着好多条细细的腿，简直就像科幻电影里的外星怪兽一样。这一下可把小青吓坏了，他连忙抓住时光布偶，让他带着自己飞出了这团灰尘团。

“怎么样？还想继续探险吗？”时光布偶问小青。小青不好意思地回答：“先等一等，你还是把我先变回去吧。”“咦？”时光布偶正奇怪，只听小青接着说道：“我还是先回去打扫打扫房间，把这些‘客人’都请出去吧。”

“好啊！”时光布偶拿出缩小机，调到相反的“放大”功能，一按开关，小青就又回到自己的书桌前面了。正好，妈妈正在外面找他呢：“小青，快过年了，还不快扫扫地、擦擦桌子，干干净净过新年！”