分子信标

分子信标（精选三篇）

分子信标 篇1

1 分子信标的结构和原理

分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链,一般含有25~35个核苷酸。在结构上,分子信标大体上可以分为3部分(图1):(1)环状区:一般由15~30个核苷酸组成,可以与靶分子特异结合;(2)茎杆区:一般由5~8个碱基对组成,在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离;(3)荧光基团和淬灭基团:荧光基团一般连接在探针的5'端,淬灭基团一般连接在探针的3'端。

根据弗尔斯特理论,中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方呈反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。自由状态时,发夹结构的两个末端靠近,使荧光分子与猝灭分子靠近(约为7~10 nm)。此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发,荧光几乎完全被猝灭,荧光本底极低。图2为分子信标的工作原理,当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时,信标茎杆互补区被拉开,荧光分子和猝灭分子距离增大,信标分子的荧光几乎100%恢复,且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。

2 分子信标技术在传染病检测中的应用

目前,分子信标技术已经开始成功地运用于各种传染病病原体的核酸检测中。利用分子信标在密闭环境里对PCR产物进行检测,对于以PCR技术为基础的疾病自然非常重要。与其他核酸检测方法相比,分子信标无需固定化探针,可以进行液相杂交检测,闭管操作,可有效减少交叉污染;并具有实时、高灵敏度、高特异性的特点[7]。

2.1 细菌性传染病

近年来应用分子信标技术进行细菌性传染病病原体检测的研究日渐增多,涉及结核分枝杆菌、肠道沙门菌、李斯特菌、葡萄球菌和霍乱弧菌等致病菌。

2.1.1 结核病

早期诊断对结核病的防治意义重大,目前痰涂片镜检和集菌培养仍是我国结核病诊断的金标准,灵敏度低、特异性差、耗时长等问题常导致结核病治疗被延迟或者不恰当抗结核治疗[8]。借助分子信标技术高灵敏性、特异性好的优点,有望为结核病的辅助诊断和鉴别诊断提供新的途径。

Haldar等[9]2007年建立了使用两种分子信标探针的荧光定量PCR法检测结核分枝杆菌,并对痰涂片检测结果阴性的标本进行检测,证实该法在结核早期诊断中是痰涂片的重要补充。Yu等[10]也证实双分子信标方法可用于结核分枝杆菌的快速检测。Chakravorty等[11]建立单链DNA结构(环)的分子信标PCR检测法,用以确定利福平耐药决定区(RRDR)的突变,研究表明,该法易于使用,并且非常适合于高通量应用,可大大简化临床实验室利福平耐药性检测工作。为了评估采用分子信标方法检测耐多药结核病(MDR TB)的临床影响,Ritu等[12]回顾性分析了2004—2007年美国加州127例耐多药结核病患者,进行分子信标检测和对诊断治疗的关联性,结果表明,使用分子信标测定的耐多药结核病患者的诊断和治疗时间都明显较短,尤其适合用于结核病发病率较低的地区。我国也有不少学者研究认为,分子信标荧光定量PCR法检测临床样本中结核分枝杆菌具有快速、敏感和特异性高的特点,可为结核病的临床诊断提供一种快速、准确的病原学诊断手段,具有重要的临床意义[13~15]。

2.1.2 霍乱

在我国霍乱为甲类传染病,因传播快、发病急、流行面广等原因而备受关注。扈庆华等[16]根据霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctx A)设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标-实时PCR检测食物中的霍乱弧菌,改良分子信标将分子信标的臂部分也作为靶识别序列,比分子信标更短,而且由于臂序列不再悬空,因而与靶序列的结合更趋紧密,更易设计且成功率更高,同时对扩增条件要求不严。研究表明该方法快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。

Fykse等[17]以霍乱弧菌的ctx A、TCP、tox R、hly A和gro EL等基因作为靶序列,设计多种引物和分子信标探针,建立核酸依赖性扩增检测(NASBA)法,应用于水中微量霍乱弧菌的检测,证实具有较高的灵敏性和特异性,提示NASBA可以检测各种环境水样中的霍乱弧菌,而且方法快速(包括核酸抽提约只需3h),具有很好的应用前景。

2.1.3 沙门菌感染

沙门菌是引起食物中毒最常见的致病菌,我国目前沙门菌检测和分型仍以传统培养和血清分型为“金标准”方法,操作烦琐,费时,灵敏度低,且需购买整套昂贵的沙门菌诊断血清,不适于沙门菌的快速检测。万成松等[18]在PCR反应体系中加入分子信标探针对沙门菌inv A基因PCR产物进行荧光检测,结果实验菌株PCR产物的荧光分子信标检测与琼脂糖电泳分析结果一致,特异性符合率为100%,表明分子信标探针技术可以准确、快速、简便进行沙门菌inv A基因检测。林一曼等[19]设计引物和改良分子信标探针,建立实时荧光PCR检测方法,从菌株的核酸提取到检测仅需1.5 h,从样品处理到检测仅需1 d时间,用71株常见血清型的沙门菌评价灵敏度和特异性,该法的DNA最低检出限为10 fg/反应体系,菌液最低检出限为20 CFU/反应体系,特异度为100%。表明所建立的实时PCR检测方法快速,灵敏度高,特异性强,可用于食品及食物中毒标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断。

Patel等[20]应用分子信标探针的实时PCR检测肉类原料和成品中的沙门菌,并进行比较和评估,认为该方法可提高实时监测效率,值得推荐。Hadjinicolaou等[21]采用快速分子信标为探针的两步多重实时PCR检测取代传统、费力的沙门菌血清分型方法。结果该法能够正确识别所有的44株沙门菌,所有的21个样品肠炎沙门菌和所有17个样品鼠伤寒沙门菌,实验过的特异性和敏感性为100%;且该测定法可以节省大量时间,被认为是快速、准确地从临床和环境样品中检测沙门菌的两种主要血清型的好方法。有学者通过分子信标为基础的定量聚合酶链反应,检测水库环境水和沉积物中伤寒沙门菌,以期为预防和控制伤寒疫情奠定基础[22]。

2.1.4 其他细菌性传染病

由于许多疾病是由致病性细菌感染引起的,准确、快速检测致病菌,及时采取控制和治疗措施,可降低社会影响和经济成本。Cao等[23]设计了分子信标-纳米颗粒的混合纳米探针,以提高传染病致病性细菌检测效率和灵敏度,结果表明,该混合探针具有在医学和生物学应用的巨大潜力。Ram等[24]设计以产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的STX2基因为靶序列的分子信标实时荧光定量PCR检测方法,检测水样中STEC,以早期快速鉴定病原体,可为腹泻疫情的判断和控制提供参考。李乐等[25]利用特殊荧光小分子2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶(ATM-ND)染料特异性嵌入缺失DNA位点的独特分子信标设计,将不同浓度黄色葡萄球菌DNA与分子信标探针杂交,观察荧光强度的变化,并选择标准菌株DNA对该探针进行特异性验证。研究表明,该探针在金黄色葡萄球菌DNA的识别上具有一定的特异性。王周平等[26]基于分子信标识别和荧光纳米粒子探针技术建立了均相体系中李斯特菌目标DNA的高灵敏检测新方法,采用该方法进行食品样品中单核细胞增生李斯特菌的检测,结果与国标法一致。

2.2 病毒性传染病

病毒大多容易发生变异,传播途径更易实现,而且很多病毒性传染病目前尚缺乏特效治疗药物,当前病毒性传染病严重威胁人类的健康,是重大的公共卫生问题,因此早期确诊对传染病的预防控制尤为重要。

2.2.1 流感

Muradrasoli等[27]以流感病毒的核蛋白基因为靶基因,应用分子信标技术,设计一种可同时检测区分流感甲、乙和丙3种亚型的三重实时荧光定量PCR方法。用该方法和传统的免疫荧光(IF)法检测71例呼吸道感染患者的鼻咽抽取液样本,并进行比较,结果新方法检出30例甲型流感,11例乙型流感,而IF发现28例甲型流感,10例乙型流感,两种方法均未检出丙型流感。认为新建立的方法比IF更灵敏,具有较好的应用前景。扈庆华等[28]根据SARS病毒聚合酶基因l b的阅读开放框架结构的保守序列,自行设计一对引物和探针,采用改良分子信标-实时荧光PCR技术建立双片段双色荧光PCR技术快速检测SARS(严重急性呼吸综合征)病毒的方法,并与传统细胞培养方法进行比较研究。认为改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒方法灵敏度高、特异性强,可用于SARS的临床早期诊断和动物溯源。

2.2.2 艾滋病(AIDS)

AIDS防治工作的一个重要组成部分为人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的实验室诊断。Mc Clernon等[29]对实时的核酸序列为基础的NASBA法与分子信标技术结合用于检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的结果进行评估,定量检测结果与3种市面上常用试剂盒的检测结果比较,有较高的符合率。认为该法可用于临床HIV-1及重组病毒的检测。不少研究者在HIV-1 pol基因和丙型肝炎病毒(HCV)基因组的5'NCR的保守区进行于引物和分子信标设计,建立同时检测HCV和HIV-1的分子信标多重实时PCR测定法。结果表明,该法有较好的灵敏性和特异性,可用于血液筛查检测HIV-1/HCV合并感染,是种快速且相对便宜的筛选方法[30,31]。希腊学者于2009—2010年之间使用分子信标为基础的实时荧光定量PCR方法,检测患者的HIV-1 DNA水平,研究其与抗病毒治疗的效果,取得较好进展[32]。

2.2.3 虫媒传染病

Lee等[33]基于分子信标技术开发了一种经济的、高通量的核酸扩增检测(NAT)筛查方法,适用于从单个供血者的血浆样品进行西尼罗河病毒(WNV)筛查检测。改良分子信标使用FAM和VIC两种荧光进行标记,并实现在单管检测,研究测定西尼罗病毒的灵敏度(95%可信限)为3.79~16.3 copies/ml,同时具有较好的特异性。克里米亚-刚果出血热(CCHF)是近几年在印度的新兴的重要人畜共患病,为防止进一步的传播和用于控制感染的即时检测,Kamboj等[34]首次以分子信标技术为平台,建立克里米亚-刚果出血热(CCHF)的快速实时荧光定量PCR检测方法,检测灵敏度可达7.6 copies/反应。研究表明该方法快速、敏感、特异,用于CCHF的诊断具有较好的成本效益。

2.3 其他传染病

不少机会性致病真菌,可感染免疫力低下的人群而致病,这种罕见的人类病原真菌的临床检测目前依靠形态学的诊断,易误诊。Chan等[35]基于真菌的18S核糖体RNA基因设计特异性引物和分子信标探针,优化实时定量PCR法,检测和量化微量的真菌感染,为真菌感染的临床诊断提供了一种新的途径。还有学者通过设计分子信标探针,建立一种可同时检测莱姆病、巴贝斯虫病和无形体病3种蜱传疾病病原体的实时多重PCR检测方法,可检测人体血液中微量的病原体,方法具有较高的敏感性和特异性,认为该方法可用于莱姆病、巴贝斯虫病和无形体病的早期诊断[36]。

分子信标是近几年发展的一种新型检测技术,因其独特的设计,并具有灵敏度高、特异结合性好等优点,被广泛应用于生物学和生物分析领域。随着分子信标的不断发展和新型分子信标的出现,以及与其他先进技术的结合,相信分子信标在人类传染病的诊断、治疗及其他不同的领域将发挥更大的作用。

基于分子信标的逻辑门的计算模型 篇2

摘 要：基于DNA计算的布尔电路的模拟是DNA计算研究中的一个非常具有应用前景的潜在的研究方向。利用分子信标和三链核酸分子的高度特异性及稳定性，提出了一个逻辑与、逻辑或门的DNA计算模型。基于分子信标的二种状态，将逻辑门的信息处理过程分为计算和输出二个子过程，从而使得这种基于DNA分子的逻辑门具有重复可用性，为构建基于DNA分子的大规模集成电路奠定了基础。

关键词：DNA计算；逻辑门；分子信标；三链核酸

中图分类号：TP18文献标识码：A文章编号：1672-1098(2008)01-0065-05

收稿日期：2007-08-13

基金项目：国家自然科学基金资助项目(60403002，30570431)；中国博士后科学基金资助项目(2004036130)；浙江省自然科学基金资助项目(Y106654，Y405553);安徽省教育厅自然科学基金资助项目(2006kj068A,KJ2007B173);安徽省优秀人才基金，教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目(NCET-06-0555);国家863高技术研究发展计划项目基金资助项目(2006AA01Z104)

作者简介：刘文斌(1969-)，男，陕西西安人，副教授，博士，主要从事生物信息学及DNA计算的研究。

A Computing Algorithm for Logical Gates Based on

Molecular Beacon

LIU Wen-bing1,ZHU Xiang-ou1,YIN Zhi-xiang2

(1．College of Computer Science and Engineering, Wenzhou University, WenzhouZhejiang 325027, China；2．School of Science, Anhui University of Science and Technology, Huainan Anhui 232001, China)

Abstract:Boolean Circuit simulation based on DNA computation is one of the potential development direction in DNA computation. An algorithm of DNA computation for logic “AND ” and “OR” gates based on Molecular Beacon technique and big speciality and stability of Triple Helix Nucleic Acid molecule. On the basis of both states of Molecular Beacon, information processing of logic gates is divided into two subprocess, computing and output, which makes logic gates reusable. It makes possible to construct VLSI based on DNA computation.

Key words:DNA computation; Logic gate ; Molecular Beacon; Triple Helix Nucleic Acid

DNA计算是近年来出现的一种新的方式［1］。人们在研究NP－完全问题的DNA计算模型的同时，也在开始探索新的潜在的应用，构建基于DNA的布尔电路就是其中一个研究方向。1996年，Ogihara等首次提出了基于DNA的布尔电路的模拟，并且给出了逻辑电路的DNA实现方法［2］。随后，文献［3-4］提出一种改进的逻辑与非门的DNA计算模型，并说明了如何通过这种逻辑门实现二个阶矩阵的传递闭包的计算。文献［5］提出了另一个逻辑与非门的DNA计算模型。所有这些计算模型都存在二个缺点：①由于限制性内切酶的作用，执行运算后的逻辑门也随之水解，因此不能重复利用；②这些逻辑门的DNA模型都是基于试管方式的，不利于在芯片上实现大规模的布尔逻辑电路。在文献［6］提出的“鞭子”PCR（Whiplash PCR）方法的基础上，文献［7］提出了应用这种“鞭子”PCR来实现布尔电路的思想。尽管在理论上是可行的，但是随着计算过程的进行，单链DNA分子的长度不断增加，这种“鞭子”PCR能否按照设定的程序执行就很难确定了。2004年，文献［8］提出了一个基于吡啶二聚物的诱导发夹结构的逻辑“与非”门的DNA计算模型，克服了以往每次执行完特定运算后逻辑不能重复使用的缺点。本文通过二次诱导“发夹”的形成过程来分别完成逻辑与非门的计算和输出过程，该模型具有简单、可靠性高的优点，且容易结合现在的生物芯片技术构建基于DNA的大规模集成电路。

1 布尔电路

在可计算性理论中，布尔电路与图灵机是相等价的并行计算模型［9］。一个有玭个输入m个输出的限定型布尔电路实际上可以看作一个有向无圈图G，其中包含二类节点：入度为1的n个输入节点；入度为2出度为1的m个逻辑门节点。有向边代表了电路中信息的传输方向。因此，一个有n个输入m个输出布尔电路实际上就是计算如下的布尔函数

f(X璶)∶＜0.1＞n→＜0.1＞m（1）

常见的逻辑门主要有：与门（AND）、或门（OR）、与非门（NAND）、异或门（XOR）等。逻辑门的完全基就是一个能够表示任何一个布尔电路的最少的逻辑门的集合。常见的或门（OR）和与门（AND）就是一个完全基，即Ω=｛∨，∧｝。数学上已经证明，任何一个布尔电路都可以在多项式时间转化为一个标准的层状结构（即每层为单一的一种逻辑门）［10］(见图1)。衡量布尔电路规模通常的二个指标为：逻辑门的层数和总数。

图1 布尔函数玣(x1,x2,x3,x4)=(x1∨x2)∧(x3∨x4)的

布尔电路2 分子信标及三链核酸

2.1 分子信标

“发夹”结构是一种在单链分子DNA或RNA分子中经常出现的二级结构，当DNA分子或RNA分子上存在相互互补的序列时，在适当的条件下它们就会杂交从而形成“发夹”结构。 分子信标是一种特定的“发夹”结构，主要由二部分组成：环部（Loop）和径杆（Stem）部分。当径杆部分解链后“发夹”就会打开从而变成单链分子(见图2)。通常有二种方法打开“发夹”结构：（1）加热或加入尿素（Urea）等碱性试剂；（2）如果存在一个和环部序列互补的DNA分子，并且它们杂交后的氢键结合力远大于径部杂交的结合力，环部杂交后产生的张力就会破坏径杆部分的氢键结合力使得径杆部分解链。因此通过设计适当的环部序列和径杆序列的长度，GC含量就可以对“发夹”的形成与打开进行有效的控制。尽管在DNA计算中我们希望尽量避免“发夹”结构的产生，但是通过精心设计的发夹结构却有很多特殊的应用（如文献［11］的可满足问题的计算模）。此外，由于“发夹”具有结构简单，易于控制等优点，已经广泛的应用于生物传感器和分子的自组装等方面［12-13］。

图2 “发夹”的闭合与打开示意图

在通常情况下，DNA分子中是AT相互配对，GC相互配对。但是，在吡啶二聚物（Naphthyridine Dimmer）分子出现的情况下，也可以实现二个GG之间配对。原因是吡啶二聚物的二臂上分别有三个氢键结合位，它们可以分别和鸟嘌呤（Guanine）上的三个氢键结合，从而使得G－G配对［14］。利用这种性质，E. Smith等在镀金的表面设计了一种通过吡啶二聚物分子诱导形成的“发夹”结构的分子信标［15］。其环部序列长度为16bp，径部序列为

5′-AAAGGGTTTGGGT-3′

3′-TTTGGGAAAGGGA-5′

其中包含二组－GGG－序列。当在表面上加入吡啶二聚物时，在它的作用下这6对G-G相互配对，从而大大增强了径部序列的结合力，于是和环部杂交的序列解链，“发夹”结构形成。当从表面上清除掉吡啶二聚物时，“发夹”结构就会打开。由于吡啶二聚物可以很容易的从表面上清洗掉，所以“发夹”闭合与打开非常容易控制。这种“发夹”的开与关和通常电子电路中的开关非常相似。因此，通过分子信标模拟逻辑门具有很大的优势。

2.2 三链核酸

1957年，文献［16］首次提出了三链核酸的概念，即某些基因中包含特定的同聚嘌呤或嘧啶序列，在适当条件下由三链形成寡核苷酸占据在双链大沟处，通过与双链碱基特异性产生Hoogsteen 或反Hoogsteen 氢键而连接，从而形成三螺旋结构即三链DNA。1963 年和1964 年，文献［17-18］分别报道了质子化poly(rC)和poly(rG)•poly(rC)双螺旋能发生相互作用而形成三螺旋RNA。1987 年，Mirkin［19］等在一种酸性质粒中发现了一种三螺旋DNA，为三链DNA 可能在体内存在提供了强有力的证据。由于期间发生C→C+质子转化，故此他将这种结构称为H-DNA。三螺旋DNA的研究有助于深入理解细胞过程，揭示某些基因疾病的形成机理，为建立新的基因疗法提供全新的思路。长期以来, 对三链核酸的研究是与探索其潜在的生物学功能联系在一起的。目前在体内和体外环境形成三链已不是一件困难的事。

一般来讲，要形成三链核酸，寡聚脱氧核苷酸（ODN）的长度应不少于10个核苷酸，根据条件的不同对寡聚脱氧核苷酸长度的要求也有变化。文献［20］发现在大肠杆菌RecA蛋白及ATPγS的存在下, 寡聚脱氧核苷酸要形成平行三螺旋, 识别其同源双螺旋DNA，至少要有15个核苷酸, 但其中只要有8个是同源序列就够了。如同源序列含有26个核苷酸, 即使除去RecA蛋白, 它们之间仍能保持彼此结合的状态［21］。2004年，文献［22］发现寡聚脱氧核苷酸在RecA蛋白及ATPγS的存在下，与线性双螺旋DNA可形成稳定的三链结构。在形成的过程中，首先寡聚脱氧核苷酸在ATPγS的存在下与RecA蛋白结合，然后在目标双螺旋DNA上寻找同源序列，这一过程非常迅速并且不打开DNA双链。同源的双链找到后，寡聚脱氧核苷酸在RecA蛋白的介导下与目标双螺旋DNA形成三链DNA（见图3）。经证实由RecA蛋白介导形成的三链DNA是相当稳定的［23］。

3 逻辑与门和或门的计算模型

为了克服文献［2-5,8,9］中与非门计算模型的缺点，将逻辑门的工作过程分为二个过程：计算过程和输出过程。在计算过程中逻辑门对其输入进行计算，计算结果是通过分子信标的状态，即是“发夹”结构还是线性结构；输出过程是通过加入特定的输出单链分子形成三链核酸DNA分子，来判断并输出最终的输出结果。

图3 RecA蛋白介导下三链DNA的形成过程3.1 逻辑门的编码方法

表示逻辑门的DNA分子的5端固定在固体表面上，主要由二部分组成：表示变量玿1,x2的序列和在其二边的长度为k的径杆序列s和s，s和s将在适当的条件下形成“发夹”的部分。逻辑门的二个输入变量x1,x2分别用长度为2l的DNA序列表示。我们约定输出变量珃的编码由变量x1后半部分和x2的前半部分的补序列构成。为了将表示逻辑门的DNA序列和固体表面隔开，与非门的DNA分子的5端有一段隔开序列（见图4）。

图4 固定在表面上的DNA逻辑门的示意图径杆部分的作用主要是对输入执行计算功能，对于序列玸和s的编码要求为：①具有一定数量的－GGG－序列对，使得只有在吡啶二聚物（Naphthyridine Dimmer）存在的条件下，它们才有可能互补杂交；②对于逻辑与门，径杆部分杂交时的结合力要大于环部任意长度为2l的序列杂交时的结合力， 而小于长度为4l的序列杂交时的结合力； ③对于逻辑或门， 径杆部分杂交时的结合力要小于环部任意长度为2l的序列杂交时的结合力。

3.2 算法步骤

（1） 将编码逻辑门的DNA分子固定在经过化学修饰的固体表面（见图5）。

（2） 当输入变量玿璱(i=1,2)为“1”时，在表面加入表示与其互补序列的DNA分子，它们就会和逻辑门上的对应序列杂交；而输入为“0”时则不加入任何分子。同时，加入DNA连接酶，当二个输入同时为“1”时它会将二个输入序列连接起来（见图5中的与门）。杂交反应完成后用缓冲液清洗干净表面。

图5 DNA逻辑与门、或门的四种输入情况示意图（3） 在表面上加入吡啶二聚物分子。对于与门，除第一种情况之外其它三种输入都会形成“发夹”结构；而对于或门，除前三种输入情况保持部分双链不变外，最后一种情况形成“发夹”结构。到此为止，二种DNA逻辑门的计算过程就已经完成。计算结果为“1” 为线性双链分子，结果为“0”的形成“发夹”结构（见图6）。

对于或门为了方便结果输出，在表面同时加入与二个输入变量互补序列的DNA分子及DNA连接酶，这时，第一、第四种输入情况的分子不会有变化，而第二、第三种输入情况的DNA分子会变成和第一种输入情况相同。

图6 诱导“发夹”结构的形成（即计算过程）（4） 清洗表面残余物及吡啶二聚物分子，“发夹”结构就会打开变成单链DAN分子（见图7）。

图7 “发夹”结构打开示意图（5） 在表面上重新加入吡啶二聚物分子，只有单链状态的逻辑门的状态会恢复“发夹”状（见图8)。图8 单链状态恢复“发夹”状态示意图（6） 将输出序列珃与RecA蛋白，ATPγS混合，在适宜的条件下哺育，使RecA蛋白包裹输出序列形成RecA蛋白-珃复合体。当这些RecA蛋白-珃复合体加到表面后会与线性状态的双链DNA分子在特定的位置形成稳定的三链DNA结构（见图7）。此时，所有输出为“1”的逻辑门都会形成三链核酸DNA分子。

（7） 通过降低盐浓度的梯度解离三链DNA结构，输出分子被洗脱下来，对其进行脱蛋白、纯化等处理就可以做为下一级与逻辑门的输入或者整个布尔电路的一个输出。同时，由于清洗“发夹”结构径杆部分的吡啶二聚物分子也会被清除，从而打开“发夹”结构。

（8） 对表面加热或者加入尿素等碱性溶剂， 解链的在计算过程中形成的双链DNA分子。 最后， 清洗干净表面后就可以在下一次逻辑计算中重新使用。

4 结论

本文给出了一个基于诱导“发夹”型的逻辑与门、或门的DNA计算模型，和现有的计算模型相比，优点如下：①由于逻辑门的整个处理过程分为计算过程和输出过程，因此，在完成每次逻辑计算后与非门可以重复使用；②这种诱导“发夹”对DNA分子间杂交反应具有很高的特异性，因此，大大提高了DNA逻辑门计算过程的可靠性；③三链核酸分子具有很高的稳定性和特异性，从而保证了输出过程具有很高的可靠性；④逻辑门的计算过程及结果输出只需二次发夹结构的形成就可完成，因此操作非常方便；最后，因为这种诱导“发夹”型的DNA逻辑门的计算模型是基于表面方式的，因此随着生物芯片技术的飞速发展，构建这种基于DNA逻辑门的计算芯片将成为可能。

参考文献：

［1］ ADLEMAN L.Molecular computations to combinatorial problems［J］.Science,1994,266:1 021-1 024.

［2］ OGIHARA M,RAY A.Simulating Boolean circuits on a DNA computer［J］.Algorithmica,1999,25:239-250.

［3］ AMOS M,DUNNE P E,GIBBONS A.DNA Simulation of Boolean Circuits［M］.Proceedings of the Third Annual Conference,July 22-25,1998,University of Wisconsin,Madison,Wisconsin,San Francisco,CA：679-683.

［4］ DUNNE P E,AMOS M,GIBBONS A.Boolean Tra-

nsitive Closure in DNA.In Computing with Bio-Molecules:Theory and Experiments［R］.George Paun (Ed.),Springer-Verlag,Singapore,1998.

［5］ MULAWKA J J,WASIEWICZ P,PLUCIENNICZ-

AK A.Another Logical Molecular NAND Gate System［M］.Seventh International Conference on Microelectronics for Neural,Fuzzy and Bio-Inspired Systems,Granada,Spain 1999：340-346.

［6］ HAGIYA M,ARITA M,KIGA D, et al.Towards Parallel Evaluation and Learning of Boolean u-Formulas with Molecules［M］.DNA Based Computers III,DIMACS Series in Discrete Mathematics and Theoretical Computer Science, 1999：57-72.

［7］ WINFREE E.algorithmic self-assembly of dna［R］.Ph.D thesis,California Institute of Technology,1998.

［8］ LIU W B.A new DNA computing model for the NAND gate based on induced hairpin formation［J］.BioSystems,2004,77:87-92.

［9］ DUNNE P E.The Complexity of Boolean Networks［R］.Academic Press,1998.

［10］ HARRISON M A.Introduction to switching and automata theory［R］.McGraw-Hill,1965.

［11］ CUKRAS A R,FAULHAMMER D,LIPTON R J,et al.Chess games:A model for RNA-based computation［J］.Biosystems,1999,52:35-45.

［12］ NAKATANI K,SANDO S,SAITO I.Improved Selectivity for the Binding of Naphthyridine Dimer to Guanine-Guanine Mismatch［J］.Bioorg.Med.Chem.Soc.2001(9):2 381-2 385.

［13］ NAKATANI K,SANDO S,SAITO I.Scanning of guanine-guanine mismatches in DNA by synthetic ligands using surface plasmon resonance assay.Nat［J］.biotechnol.2001,19:51-55.

［14］ NAKATAN K,SANDO I S,SAITO I.Recognition of Guanine-Guanine Mismatches by Dimeric Form of 2-Amino-1,8-naphthyridine［J］.J.Am.Chem.Soc.2001,123:12 650-12 657.

［15］ SMITH E A,KYO M,KUMASAWA H.Chemically Induced Hairpin Formation in DNA Monolayers［J］.J.Am.Chem.Soc.2002,124:6 810-6 811.

［16］ FELSENFELD G.Formation of a three-stranded polynucleotide molecule［J］.J Am Chem Soc,1957,79 (7):2 023-2 024.

［17］ LIPSETT M V.Complex Formation Between Polycytidydic Acid and Guanine Oligonucleotides［J］.J.Biol.Chem.,1964,239:1 256-1 259.

［18］ HOWARD F B,FRAZIER J,LIPSETT M N.Infrared Demonstrated of Two-and Three-Strand Helix Formation Between Poly and Guanosine Mononucleotides and Oligonucleotides［J］.Biochem.Biophys.Res.Commun.,1964(17):93-102.

［19］ MIRKIN S M,LYAMICHER V I,DRUSHLYAK E.DNA Hform requires a homopurine-homepyrimidine mirror repeat［J］.Nature,1987,330 (6147):495-497.

［20］ HSIEH P,CAMERINI O.Pairing of homologous DNA sequences by proteins:evidence for three-stranded DNA［J］. Genes Dev, 1990(4): 1 951-

1 963.

［21］ 孙雪光,曹恩华.三链核酸稳定性和生物学功能的研究进展［J］.生物化学与生物物理进展,1998,25(4):319-324.

［22］ SHIGEMORI Y, OISHI M. Specific cleavage of

DNA molecules at RecA-mediated triple-stranded structure［J］.Nucleic Acids Research,2004,32(15):4 563-4 575.

［23］ RAO B J, DUTREIX M, RADDING C M. Stable

three-stranded DNA made by RecA protein［J］. Pro Natl Acad Sci USA, 1991, 88 (8): 2 984-2 988.

［24］ GUARNIERI F,FLISS M,BANCROFT C.Making DNA add［J］,Science,1996, 273(12):220-223.

［25］ BERARD Y,ALLEN P,MILLS J R,et al.DNA implementation of addition in which the input strands are seperated from the operater strands［J］.Biosystem,1999,52:165-174.

［26］ HUG H,SCHULER R.DNA-based parallel computation of simplearithmetic［M］.7th international Workshop on DNA-Based Computers,Tampa,U.S.A.,2001：159-166.

分子信标 篇3

这两种设备大体上说在射频通路的实现上和监控信号的解调方法上基本一样, 但在调制信号的产生、基准时钟产生、内部信号的监控和外场信号各种参数的处理上, 4000型全向信标基本上是经过数模转换和模数转换后由微处理器处理, 而VRB-51D型则大部分利用模拟的方法进行处理的。

1、信号的产生

VRB-51D型是采用皮尔斯晶振电路, 产生的频率是工作频率的一半, 经倍频器得到工作频率。这种产生频率的方法频率稳定度较高, 但频率改变较难。

4000型全向信标则是用晶振作为参考频率, 用压控震荡器作为工作频率产生器。用参考频率与工作频率比较得到控制电压, 去控制VCO震荡器的偏压从而控制震荡频率, 完成锁频。用这种方法即得到了工作频率的稳定度较高, 又可以通过微处理器控制V C O震荡器的偏压从而控制震荡频率, 为方便的选择通道打好了基础。

对于上下边带信号的产生, 这两种设备所使用的方法基本上是一样的。将载波信号与压控震荡器所产生的信号进行混频, 与±9960Hz参考信号进行比较, 得到控制电压控制边带VCO震荡器, 从而锁相, 得到相位相差90度的边带信号。

在其他射频通道中, 如调制载波、功放、锁相环、A G C控制、定向偶合器和双联开关等, 这两种设备的实现方法基本一致。

2、调制信号的产生

VRB-51D采用模拟的方式。在RPG基准相位产生器中分频基准时钟产生30Hz基准相位信号, 通过移位寄存器产生键控的莫尔斯识别码, 都送到C M P组件中。识别码在C M P中被1 0 2 0 H z信号调制, 混合30Hz基准信号和话音信号去调制载波。此外, CMP组件还有保护发射机的功能, 如不平衡保护、反向功率保护和正向功率保护等。当出现上述三种异常情况之一时切断信源, 保护发射机。

4000型全向信标的调制信号的产生是由MSG-C和MSG-S组件来完成的。他们由内嵌式微处理器80C186来管理控制, 产生调制信号。处理器和信号是以公用的时钟为时钟基准。30Hz基准信号、1020Hz键控信号等调治信号的参数以数据的方式保存在80C186的内存中。微处理器分时处理各种参数, 并把他们送到并行的数模转换器形成需要的模拟信号, 去调制载波和边带波。

M S G-C和M S G-S组件通过内部传感器和C C P控制偶合器得到载波的幅度相位等信号并将通过模数转换器转换成数据, 放入内存中, 通过微处理器与已知的正确门限比较, 从而修整控制信号控制移相器A G C电路等来达到控制载波相位幅度的目的。微处理器处理一种数据的周期大概为一毫秒, 周期短, 信号的稳定型也就比较好。

此外, 这两个组件还能与LCSU单元的微处理器交换发射机数据和控制命令并执行等功能。

3、监控信号的处理

在对监控信号的处理上, VRB-51D和4000型全向信标在对接收到的外场信号进行解调的过程在原理上基本是一致的, 都是将监控天线接收到的射频信号进行A G C放大, 然后解调出9 9 6 0 H z、30Hz AM、30Hz FM、1020Hz键控识别信号。并转换成直流电平。

但在处理解调后的信号时, V R B-5 1 D采用模拟的方式将30Hz AM、9960Hz的调制信号等信号的直流电平与载波电平相比较得到他们的调制度告警。测试9960Hz信号电平是否有长时间空闲来判断是否有缺口告警。通过振荡电路检测键控信号是否长时间无变化来判断是否有空码或连码。检测方位信号比较3 0 H z F M和3 0 H z A M信号的相位差并通过计数器记数得到方位信息。

而4000型全向信标则是将以上各种信号进行模数转换得到各信号具体数值并送到M S P的嵌入式微处理器中处理并将数据存入内存。处理器经过与内存中的预设门限参数相比较, 得到告警信息。如果有告警, 通过接口将数据传到LCSU单元控制换机或关台等工作。

在遥控单元中, VRB-51D只能设备状态和一些简单的开关机、监控旁路等信号。而4000型全向信通过LCSU和RCSU单元的内置MORDEN, 不但能传输定性的状态信息, 还能传输大量的各种详细的信号参数, 可以通过智能终端将数据显示、保存或打印出来。还可以通过终端对设备进行控制调试等。

在天线开关控制方面, VRB51-D通过两个ADS奇偶天线分配开关来分配边带信号, 24个天线一组, 每1/60秒交换上下边带, 共48个边带天线。而全向信标-4000型则是采用10个ASM组件, 每5个一组, 共50个边带天线。

从整体上来说, 4000型全向信标的各种信号参数值通过内部传感器获得, 并通过嵌入式处理器对各种信号进行数据处理。在智能终端上就可以对设备进行调试和数据采集等工作, 操作起来更方便, 更有利于网络化和集中监控。系统的集成度更大, 元件各通用化。但设计安装整个系统较复杂, 对工作人员的计算机知识要求较高, 尤其是通讯接口的调试。

而VRB-51D大部分是采用模拟系统, 集成度较底。虽然在CTL单元中也有微处理器, 但只能做定性的设备控制信号显示等简单工作。各种信号的具体数值都要用仪表测试才能得出, 作记录比较烦琐。

参考文献

[1]《高频电子线路》.北京电子工业出版社, 2000.