药物测定（精选九篇）
药物测定 篇1
1 离子注入修饰电极研究的必要性及其特点
离子注入是在高真空(10-4~10-5Pa)和较低的温度下进行的,注入离子以高速进入样品表面,不受化学结合力、扩散系数及固溶度等因数的限制,可形成一般冶金工艺无法得到的合金相,也可得到过饱和的固溶体、亚稳态合金及非晶态表面结构。在与靶物质原子激烈碰撞的过程中,注入离子使固体中局部状态发生急骤的变化,出现了一系列物理过程,如超固溶度、能量沉积、热钉扎、反冲效应和增强扩散等。这些都是传统固态理论所不能解决的问题[1]。使得离子注入修饰电极具有其它电极所不具有的特点,因此对其进行研究对促进固态理论的发展以及开发新型电极具有重大意义。
离子注入修饰电极用于化学物质的测定具有如下特点:(1)可按人们的意愿和需要,将不同的离子注入到不同的基体表面,制成具有某种电催化活性的修饰电极;(2)被注入的表面由于造成缺陷、偏析和位错等微观结构的变化,形成众多的活性中心,因而其催化活性比原基体电极高;(3)由于该技术能在金属或非金属表面形成一薄层二元或多元的稳态、亚稳态晶形或非晶形合金,而且注入的元素不受相律和化学平衡的限制,注入的浓度和深度又可精确控制,所得的表面牢固均匀,耐磨耐蚀,所以离子注入修饰电极比一般化学修饰电极具有较高的稳定性和重现性[1]。
由于离子注入修饰电极具有上述特点,因此非常适合药物研究,特别是微量、痕量药物的检测。
2 离子注入修饰电极的制备方法
制备离子注入修饰电极一般选择玻碳(Glasscarbon,GC)和碳纤维(Carbon fiber,CF)作为基体材料,它们被广泛用作电极材料[2],且具有低渗透性、良好的抗腐蚀性和氧化时的高稳定性,因此非常适合进行离子注入。王静、胡劲波等[1]制备Co2+注入修饰电极的方法为:将玻碳、碳纤维依次用丙酮、NaOH、HNO3和蒸馏水超声洗涤后晾干备用。离子注入采用金属蒸汽弧(MEVVA)源注入机。离子注入能量为40keV,注入Co2+纯度高于99.9%,注入剂量为5×1017cm-2,注入束流量强度为1mA。用铜粉导电胶将细铜棒粘于玻碳基体未注离子的一面,经室温24h晾干后,用粘接胶将注入面以外的玻碳表面全部涂抹,再经室温2h晾干后,用聚四氟乙烯带粘于玻碳的Cu棒缠绕,电极制作过程完成,即可使用。并且在制作过程中,要保证基体体与导线接触良好。
3 离子注入修饰电极在抗生素测定中的应用
痢特灵(Furazolidone),学名呋喃唑酮,它是一种抗菌药物,广泛用于治疗动物的痢疾和肠炎。前人证明痢特灵是一种诱变致癌剂,因此各发达国家严格控制动物性食品中痢特灵的残留量。测定痢特灵的传统方法是依靠液—液萃取,步骤繁琐耗时,目前以气相色谱和液相色谱为主。赵敏、胡劲波等[3]利用Ni-C离子注入修饰电极对痢特灵进行了测定,得到了满意的结果,建立了一种新的定量测定方法。痢特灵在0.1mol·L-1盐酸中,用注入镍的玻碳电极作为工作电极进行伏安测定,形成一良好的还原峰,峰电位Ep=-0.34V(vs.SCE)峰电流与痢特灵浓度在1.0×10-5~1.0×10-4mol·L-1范围内成线性关系,检测限为5.0×10-6mol·L-1,用于片剂测定,得到满意的结果。并且用循环伏安法研究了该物质的电化学行为及其反应机理, 认为痢特灵的电极反应过程属于准可逆过程。
灰黄霉素(Griseofulvin,Gr) 是抗生素类药物,为白色或类白色的微细粉末,无臭,味微苦,不溶于水,能有效地抑制各种皮肤癣菌,如小孢子菌属、毛发癣菌等,对红色发癣菌、黄癣菌和迭瓦癣菌的抗菌作用极强。Gr的测定已报道的有高效液相色谱法[4,5,6]、气相色谱-质谱联用技术[7]、光谱法[8,9,10]、纸色谱和薄层色谱法等[11]。尚军、邵娜等[12]文建立了用线性扫描伏安法在Co2+注入修饰电极上测定Gr的新方法,峰电流与Gr浓度在5.0×10-19 ~1.1×10-6mol·L-1范围内成线性关系,检测限可达2×10-9mol·L-1。用线性扫描和循环伏安法等手段探讨了体系的伏安行为,结果表明电极反应为具有吸附性的不可逆过程。
氯霉素(Chloromycetin)为广谱抑菌剂,通过脂溶性可弥散进入细菌细胞内,主要作用于细菌70s核糖体的50s亚基,抑制转肽酶,使肽链的增长受阻,抑制了肽链的形成,从而阻止蛋白质的合成。测定氯霉素的方法有分光光度法、色谱法、悬汞电极伏安法、极谱法、Ni/GC离子注入修饰电极伏安法和Pt/GC离子注入修饰电极伏安法的报道。胡劲波、尚军等[13]Pt/GC离子注入修饰电极伏安法研究氯霉素的伏安行为,并建立一种新的简单而快速的测定氯霉素的方法。氯霉素在浓度为0.1mol·L-1的NaOH溶液中,Pt/GC离子注入修饰电极上有一还原峰,峰电位为-0.80V(vs,SCE)。氯霉素的浓度在1.0×10-5~1.0×10-1mol·L-1范围内与峰电流成正比。检测限为5.0×10-6mol·L-1已用于氯霉素眼药水的测定。用线性扫描和循环伏安法研究体系的性质。实验表明,是注入的Pt催化了氯霉素的还原,体系属准可逆过程。康金国、刘国艳等[14]采用聚乙烯亚胺-纳米金修饰玻碳电极检测牛乳样品中氯霉素残留量,利用Au-colloid-PEI修饰电极进行氯霉素的电化学检测时,在-0.41V处氯霉素的还原峰电流值极显著提高。运用这种修饰电极检测氯霉素的线性范围为5.26×10-8~3.71×10-5mol·L-1,检测限达到3.56×10-9mol·L-1。虽然纳米金修饰玻碳电极法的检测限比Pt/GC离子注入修饰电极法的低,但是纳米金修饰玻碳电极法的线性范围不如Pt/GC离子注入修饰电极法宽,所以Pt/GC离子注入修饰电极法在氯霉素检测中具有一定的优势。
抗生素种类繁多,结构复杂,检测方法多样,与传统检测方法,如分光光度法(紫外、可见、荧光等)和色谱法(HPLC、GC、TLC、毛细管电泳等)相比,电化学手段的应用仍远远不够,特别是采用离子注入修饰电极的测定方法更少,因此,有必要继续开创离子注入修饰电极测定抗生素含量的新方法。
4 离子注入修饰电极在抗肿瘤药物测定中的应用
米托蒽醌(Mitomantrone,MX)为蒽醌衍生物类抗癌药。该化合物对乳腺癌、急性白血病、恶性淋巴瘤、消化道癌及其它实体瘤有效。目前MX的测定有免疫法[15,16]、色谱法[17]、分光光度法[18,19]和电化学方法等。胡劲波、李启隆[20]研究了MX在镍离子注入修饰电极上的伏安行为。实验表明,在0.1mol·L-1NH3-NH4Cl缓冲溶液(pH 9.5)中,米托蒽醒在镍离子注入修饰电极上有一灵敏的伏安还原峰,峰电位为-0.85 V(vs.SCE)。峰电流与米托蒽醌的浓度在9.04×10-8~9.04×10-7mol·L-1和9.04×10-7~7.2×10-6mol·L-1之间呈线性关系。检测限为1.8×10-8mol·L-1。研究了其伏安行为,并将该波用于尿样的测定。结果表明,还原过程为具有吸附性和催化性的准可逆过程。AES(俄歇电子能谱)和XPS(X射线电子能谱)实验表明,Ni已注入到玻碳电极的表面,使电催化活性提高。
阿霉素(Adriamycin,ADM)属于蒽环类抗肿瘤药,抗癌谱较广,对多种肿瘤抑制率高于正定霉素,而毒性略低。关于ADM电化学分析方法的测定,主要有Sternson等[21]用微分脉冲极谱(DPP)法测定血浆中的ADM;Baldwin[22]用循环伏安法和微分脉冲极谱法研究了ADM在碳糊电极上的电化学行为;Rao等[23]用直流安培电化学法(DC)、DPP、循环伏安法(CV)研究了ADM在pH=7.1的磷酸盐缓冲溶液中汞电极上的电化学性质;谭学才等[24]用单扫示波极谱法和吸附伏安法研究了ADM在HAc-NaAc缓冲溶液中汞电极上的电化学行为及反应机理,并用于尿样的测定;冯敏、何品刚等[25]利用循环伏安、紫外可见光谱电化学,荧光光谱电化学、圆二色光谱电化学等方法研究了ADM在石墨电极上的电化学行为;孙延一,吴康兵等[26]研究了ADM在多壁碳纳米管膜电极上的电化学行为。胡劲波、支瑶等[27]研究了ADM在钴离子注入修饰电极上的电化学行。ADM在0.1mol·L-1 HAc-NaAc (pH 4.62)缓冲溶液中用注入钴的修饰玻碳电极为工作电极进行伏安测定,得到一良好的还原峰,Ep=-0.522V(vs.SCE)。峰电流与ADM浓度在1.4×10-7~1.4×10-6mol·L-1和1.4×10-6~5.6×10-5mol·L-1范围内呈线性关系。检测限为5.0×10-8mol·L-1并用于尿样的测定,得到满意的结果。用线性扫描和循环伏安法研究了体系的电化学行为及电极反应机理,电极反应属准可逆过程,用AES和XPS等表面分析技术检测了注入电极表面的元素组成、价态和深度分布,对离子注入电极的催化性质进行探讨。
氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX) 为合成的抗叶酸代谢药,是目前临床上常用的较好的广谱抗癌药物,对急性淋巴细胞白血病、绒毛膜上皮癌、转移性骨肉瘤、恶性淋巴瘤、乳腺癌、睾丸肿瘤、脑癌和肺癌等均有疗效。MTX的测定方法主要有色谱法[28]、流动注射化学发光法[29]和电化学方法[30]等。Huang等用高效液相色谱法对生物蛋白质药物试剂中遗留的MTX进行了测定,检测限为25 mg·L-1;刘澄凡等用高阶导数卷积极谱法,在Britton-robinson缓冲溶液中研究了MTX的测定,检测限为1.8×10-8mol·L-1;Arturro等用相敏交流极谱法,在pH=2.2的Britton-robinson缓冲溶液中研究了血清中MTX的检测应用,检测限为3.0×10-7mol·L-1。孙自杰、胡劲波等[31]研究了MTX在Co/GC离子注入修饰电极上电化学行为。MTX在0.1mol·L-1 HAc-NaAc (pH 4.96)缓冲溶液中,用Co/GC离子注入修饰电极进行伏安测定,得到一良好的还原峰。峰电位为0.95V(vs.SCE)峰电流与MTX的浓度在2.2×10-7~8.8×10-6mol·L-1范围内呈线性关系。检测限为1.1×10-8mol·L-1,建立了测定MTX的新方法,可用于实际样品的测定。回收率在98.9%~106.2%之间。并用线性扫描和循环伏安法研究了体系的电化学行为及电极反应机理,实验表明,MTX的还原为不可逆吸附过程,并伴随两个电子和两个氢离子参与电极反应。用AES和XPS等表面分析技术对Co离子注入修饰电极的表面元素组成及深度分布等进行测定。表明Co离子确被注入到玻碳表面,扫速对催化效率的影响实验证明体系存在催化作用。
博莱霉素(Bleomycin,BLM) 属于抗肿瘤抗生素类,适用于皮肤癌,头颈部癌,食道癌,肺癌,恶性淋巴瘤,网状细胞肉瘤,何杰金氏病,子宫颈癌,恶性胸水。MTX的测定方法主要有色谱法[32]、微生物检定法[33]、切割DNA反应测定法[34],极谱法[35]等。胡劲波、黄清泉等[36]研究了BLM与DNA在镍离子注入修饰电极上的相互作用。BLM在0.1mol·L-1 HAc-NaAc缓冲溶液(pH 4.62)中,在Ni/GC离子注入修饰电极上有一灵敏的还原峰,峰电位为-1.16V(vs.SCE),峰电流与BLM浓度有关用线性扫描和循环伏安法研究体系的行为表明,体系为具有加速作用的不可逆过程是注入的Ni加速BLM的还原。引入DNA后,BLM的峰电位为-1.15 V(vs.SCE),与未加入DNA前几乎完全一致,只使峰电流降低,形成一种非电活性的结合物,求得该结合物的结合比为BLM:DNA=3:1,结合常数为β=3.16×1016。用线性扫描和循环伏安法,并辅以紫外可见光谱法等手段研究表明,电极过程仍为不可逆过程,与未加入DNA时一样,加入DNA后,BLM的峰电流降低,据此,可用于DNA的测定,回收率在96.8%~103.9%之间。
离子注入修饰电极在抗肿瘤药物测定中的应用多见于西药,而抗肿瘤中药有效成分的测定未见报道。
上述表明,在所有采用离子注入修饰电极的电分析手段中,注入到电极中的离子起催化剂的作用,加速或阻碍化学反应的进行。并且在一定范围内峰电流与药物浓度成正比,这是定量的依据。在电化学反应过程中,如果氧化还原对的其中一态在某平衡中被化学结合,和没有被结合相比,波形发生变化,例如,峰电流降低或升高,这是化学结合后氧化态或还原态的自由能降低或升高所引起的,BLM与DNA在镍离子注入修饰电极上的相互作用就是这样的一个例子。该原理可用于DNA、酶、抗体等的测定。
5 前景展望
目前,离子注入修饰电极在药物研究中的应用还不如其它电极广泛,仅在抗生素测定和抗肿瘤药物的测定中应用较多。然而与其它电极相比,离子注入修饰电极具有无可比拟的稳定性和重现性,因此如何将离子注入技术结合日益更新包括各种电化学分析技术的现代仪器分析手段,研制出更为精确,简便的电极,并用之进行更为系统和深入的药物研究,将是未来药物分析的重要任务。
摘要：离子注入是一成熟的材料表面改性技术,可按人们的意愿和需要,将不同的离子注入不同的基体电极表面,制成具有催化活性强、稳定性高、重现性好等特点的修饰电极。阐述了离子注入修饰电极的特点和研究意义,综述了离子注入修饰电极在抗生素测定和抗肿瘤药物测定中的应用。
药物测定 篇2
高效液相色谱-串联质谱测定鸡肉中氟喹诺酮类药物残留的研究
目的`:建立鸡肉中培氟沙星、单诺沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、沙拉沙星、环丙沙星、恩诺沙星和司帕沙星等9种氟喹诺酮类药物残留的高效液相色谱-串联质谱检测方法.方法:样品经磷酸盐缓冲液提取后,用Waters Oasis (R) MAX小柱进行净化、提取,Cloversil-C18柱(150mm×4.6 mm i.d,5μm)分离;柱温:30℃;流动相:甲醇/乙腈/0.2%甲酸(15/15/70,v/v/v);通过电喷雾电离离子化在多离子监测(MRM)模式下测定.结果:各氟喹诺酮在0.05～50.0 μg/kg范围内均呈良好的线性关系,相关系数>0.998,回收率在89.0%～110.0%之间,相对标准偏差(RSD)在2.8%～9.1%之间,检出限均为0.05 μg/ks.结论:所建方法简便、快速、干扰少、特异性强,是鸡肉中9种氟喹喏酮残留检测的理想方法.
作 者：陈晓红 姚浔平李小平Chen Xiao-hong Yao Xun-ping Li Xiao-ping 作者单位：浙江省宁波市疾病预防控制中心,浙江宁波,315010刊 名：中国卫生检验杂志 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF HEALTH LABORATORY TECHNOLOGY年，卷(期)：18(7)分类号：O657.63关键词：鸡肉 氟喹诺酮 高效液相色谱-串联质谱
药物测定 篇3
关键词 液相色谱-串联质谱；硝基呋喃类药物；水产品
中图分类号：TS254.7；O657.63 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2016）06--02
硝基呋喃类药物是一种综合型的光谱抗生素，具有预防畜禽胃肠道疾病的发生作用，经常用作饲料添加剂。这种药物带有慢性毒性，长期使用对动物产生一定的毒素，引起癌变、畸形等。这种药物在动物体内半衰期短，代谢速度快，可以长时间的残留与代谢，并伴有毒性，因此，对其进行检测，是为了更好地监控其在水产品中的残留情况。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
液相色谱-串联质谱，震荡器、离心机、氮吹仪。乙腈，甲醇，乙酸乙酯，正己烷均为色谱纯；50 mmol/L 2-硝基苯甲醛；0.125 mol/L盐酸溶液；1 mol/L氢氧化钾溶液；1 mol/L磷酸氢二钾溶液。硝基呋喃及同位素内标标准溶液：分别准确称取10 mg的AOZ、SEM、AHD、AMOZ、AMOZ-D5、AOZ-D4、AHD-D3、SEM-13C15标准品（纯度>98.0%），用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，各组分浓度均为100 ?g/mL。
1.2 样品前处理
提取粉碎鱼肉2.00 g放在50 mL的离心管里，并加入150 ?g的内标混合工作液，加入适量的盐酸溶液均匀的摇晃30 s，再使用5 mL的0.125 mol/L盐酸溶液进行洗涤匀浆刀，与盐酸溶液一起放入离心管里。再加入2-肖基苯甲醛，摇晃半分钟后放于摇床中进行反应。将离心管中的上清液倒入另一个离心管中进入调试环节，保持pH数值在7～7.5。加入7 mL的乙酸乙酯进行分离，并要重复上述步骤，最后使用氮吹仪进行吹干处理，使用乙腈和乙酸水溶液对残渣进行溶解，并加入正己烷进行脱脂，将得到的下层溶液在12 000 r/min下进行离心10 min后，经过0.2 ?m滤膜的过滤，最后使用液相色谱-串联质谱进行测定[1]。
1.3 液相色谱一串联质谱测定
首先是液相色谱的条件：色谱柱100 mm×2.0 mm，粒度5 ?m，流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样量20 ?L。流动相梯度洗脱见表1所示。其次是质谱条件：使用ESI的接口方式，雾化器6 mL/min，气帘气8 mL/min，加热温度450 ℃，碰撞气5 mL/min，使用5 000 V的电离电压，采用多反应选择离子的监测方法作为扫描方式。
2 结果与分析
2.1 样品前处理
硝基呋喃类药物的特点是代谢速度很快，与蛋白质结合在一起，呈现出结合状态的模式依附于动物的体中，当遇到适合的酸度条件时，会产生释放作用，代谢物的特点是小的分子化合物，分子的数值要保持在75～201，很难在质谱仪中产生特性的离子碎片，定性定量也非常的困难。本次试验使用的是衍生化试剂的柱前衍生方法，同时进行酸水解与衍生化。当衍生环节完成以后，会加大了代谢物的分子的质量，一般在208～335范围内，在合理的电压作用下，可以产生2个以上的特征性离子碎片峰。
2.2 质谱条件优化
开启ESI模式进行电离子活动，使用Q1开始扫描来确定每一组分母离子与子离子，将自动与手动结合在一起对代谢物进行离子化合物的分离与优化，并要对各种成分进行严格的检测活动，包括灵敏度，如果灵敏度不相同，那么得到的离子源条件会出现严重的偏重问题。
2.3 pH值对硝基呋喃代谢物提取效率的影响
如表2所示，是样品提取液pH数值对检测结果的影响表。通过这些数据可以分析出，4种代谢物的提取效率都受到pH数值的影响，直接决定了试验结果的准确性，并且严重的影响了每一组的保留时间，因此，采用这种方法进行试验，对pH数值有非常高的要求，在进行提取液pH数值的调试过程中，要在间隔半分钟以后重新测定，保证pH数值在7～7.5的范围中。
2.4 标准工作曲线及检出限
参照样品前处理条件，按照色譜与质谱的测度条件对AOZ、SEM、AHD、AMOZ的标准混合工作液进行测定，如图1所示，是对硝基呋喃代谢物的快速检测图样。表4表示的是回归方程、相关系数。依据仪器信噪比提供的数据，并参考了有关硝基呋喃代谢物检测的数据资料，得出这种方法的检出限是0.5 ?g/kg。
图1 硝基呋喃代谢物的快速检测
2.5 加标回收和精密度试验
在不含有硝基呋喃类代谢物残留物质的烤鳗身上进行添加抗生素药物的回收与精密度的试验，按照使用的方法分别加入了0.5、0.75、1.0 ?g/kg的抗生素溶液，根据实验提供的数据可以有效的分析出4种代谢物质回收率的平均数值在88.8%～111.0%，小于或等于标准偏差的15%。
2.6 试验中应注意问题
在进行硝基呋喃类代谢物在水产品中残留的试验时，要注意，硝基呋喃类代谢物在光合作用下，会进行分解反应，因此，在进行试验的过程中，要注意避光。此外，试验使用的样品不同，得到的试验结果也不相同，例如：使用面包虾与虾仁进行检测的时候，得到的SEM结果是不同的。试验使用的仪器设备、环境都会对试验的结果带来一定的影响，干扰检测的结果。
3 结语
本文使用柱前衍生的方法，检测出4种硝基呋喃类代谢物都是具有非常好的质谱特征的化合物，增加了检测物质的定性与定量。使用同位素内标检测、定量、测试的方法，是为了更好地提升试验使用方法的回收率与精密度，根据三离子确证的原则，增强了使用方法的可靠性，保障了试验样品技术的正确性。
参考文献
[1]王璟，杨楠，赵晶，等.液相色谱-串联质谱法检测水产品中硝基呋喃类代谢物[J].中国卫生检验杂志，2008（6）：978-980.
药物测定 篇4
关键词：氨茶碱,血药浓度
氨茶碱是茶碱和乙二胺的复盐,在临床上广泛应用于治疗急、慢性气管炎、支气管哮喘等疾病[1]。但如果血药浓度过高将引起恶心、呕吐、激动、失眠、心律失常,甚至猝死[2],由于氨茶碱血药浓度与临床效果、副作用及毒性相关性极强,即使患者服用相同剂量的氨茶碱,血药浓度的个体差异仍相当大,因此必需进行血药浓度的监测[3]。目前测定氨茶碱血药浓度的方法包括高效液相色谱法、荧光偏振法、均相酶免疫法和紫外分光光度法等[4,5]。我们应用紫外分光光度法对临床36例应用氨茶碱的患者进行血药浓度监测,实验证明,该方法操作简单,结果可靠,适用于临床。
1 材料与方法
1.1 实验对象
所有患者均为2005年9月～2006年12月于中国医科大学附属第二医院呼吸科和老年病科收治的住院患者,年龄21～102岁,平均67岁,其中男23例,女13例。其中单纯支气管哮喘患者6例,支气管哮喘合并呼吸衰竭患者7例,慢性气管炎急性发作患者11例,慢性气管炎合并呼吸衰竭患者15例,肺癌患者8例。患者体重40～99 kg,平均68.2kg。所有患者均未合用巴比妥类、利福平、苯妥英钠、西米替丁、复方新诺明、红霉素等对氨茶碱血药浓度有影响的药物。患者静脉应用氨茶碱注射液3 d后,于当日用药1 h内对侧手臂采血。
1.2 实验材料
实验材料:紫外/可见分光光度仪(日本岛津公司UV160A)、高效液相色谱仪(美国Waters公司)、色谱柱为YWG80-5μ硅胶柱(青岛海洋华工厂)、氨茶碱注射液(0.25 g/2 m L,上海信谊药业有限公司)、氯仿和异丙醇及氢氧化钠等均为AR级。
1.3 血液样品预处理
抽取患者静脉血液2 m L,离心分离血清,吸取0.5 m L置离心管中,加0.1 mol/L盐酸溶液0.2 m L,精密加入氯仿∶异丙醇(95∶5)溶液5 m L振摇混合,离心(2 500 r/min)10 min,吸取下层氯仿液4.0m L置另一离心管中,加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液4.0 m L,振摇均匀,离心(2 500 r/min)10 min,吸取上层碱液3 m L供测定用。
1.4 实验方法
1.4.1 氨茶碱标准液的配制
将氨茶碱储备液用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液稀释于10 m L容量瓶中,得到浓度为0.5μg/μL的氨茶碱标准溶液。
1.4.2 测定条件的选择[6]
取空白血清及含氨茶碱15μg/μL的血清各0.5 m L按上述方法操作,将提取液在分光光度计上扫描绘制图谱,在274 nm处,氨茶碱有最大吸收,空白血清提取液也有吸收,故选取274 nm波长下检测氨茶碱浓度,同时去除空白血清的影响。
注:A-空白血清(blank serum)B-氨茶碱(aminophyllamine)C-氨茶碱+血清(aminophyllamine with serum)
1.4.3 标准曲线制备
(1)氨茶碱标准曲线:取氨茶碱标准液5.0,10.0,15.0,20.0,30.0和50.0μL于10m L容量瓶中,用0.1 mol/L氢氧化钠溶液定容至10m L,测定各准备液的274 nm处吸收值,得标准曲线方程为:A=0.0497C,r=0.9999,线性范围2.4～21μg/m L。(2)氨茶碱在血清中标准曲线的制备:取氨茶碱标准液5.0,10.0,15.0,20.0,25.0和30.0μL加入空白血清0.5 m L中混匀,使其终浓度为0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.0μg/m L,以0.1 mol/L氢氧化钠4 m L加蒸馏水2 m L为参比,测定274 nm处吸收值,得标准曲线方程为:A=0.0404C+0.004,r=0.9997,线性范围0.4～29μg/m L。
1.4.4 提取回收率测试
取空白血清加入氨茶碱标准液,终浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.0μg/m L,重复6次,将所测得的△A代入氨茶碱在血清中的标准曲线,换算成浓度C,与标示浓度相比较,得各浓度的提取回收率。
1.4.5 氨茶碱血药浓度结果
测得血清样品的△A,从标准曲线上得相应的血药浓度C(μg/m L),C×10即为紫外分光光度法检测氨茶碱的血药浓度。
2 结果
紫外分光光度法检测氨茶碱血药浓度结果,见表2。疗效判断标准为:有效:呼吸困难及喘息缓解,听诊哮鸣音减弱或消失。无效:呼吸困难及喘息不缓解,听诊哮鸣音无变化甚至加重。副作用:患者出现恶心、呕吐或心律失常。
3 讨论
目前,测定氨茶碱的方法包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光偏振免疫法、克隆化酶供体免疫分析法等[4,5,7],但有些方法仪器价格昂贵,样品的测定成本高,且需用有机溶媒提取,在基层单位的应用受到限制。我们采用紫外分光光度法直接进样,缩短了分析时间,且该方法所用仪器较便宜,试剂价格低廉,因而适合在基层医院临床广泛应用。
多种药物能够影响氨茶碱的代谢,使其半衰期延长或缩短,本实验在筛选患者时已经尽量避免了这些药物的影响。同时由于大环内酯类、喹诺酮类、西咪替丁等可通过肝药酶诱导使氨茶碱代谢加快[8,9],从而使氨茶碱血药水平升高,当这些药物与氨茶碱合用时,尤其应注意监测血药浓度避免引起中毒。氨茶碱的半衰期为(9.0±2.1)h[10],本实验在3 d以后早上空腹测定血药浓度,从理论上已基本达到稳态谷浓度,而且又可以避免食物对茶碱血药浓度的影响。
本组实验结果表明,支气管哮喘患者氨茶碱的血药浓度低于正常有效治疗范围,无副反应发生。慢性气管炎急性发作患者氨茶碱的血药浓度在有效治疗范围,有1例发生副反应。而支气管哮喘合并呼吸衰竭的患者氨茶碱血药浓度在有效治疗范围上限,慢性气管炎合并呼吸衰竭患者氨茶碱血药浓度高于有效治疗范围,二者氨茶碱副反应的发生率均较高。说明在重症喘息性疾病氨茶碱的应用剂量加大,同时副反应的发生率也随之增加。而机体在缺氧的情况下容易使氨茶碱半衰期延长出现中毒的表现。同时实验结果表明重症患者的年龄普遍偏大,老年人氨茶碱半衰期比正常人长,加之心肺代偿不足,病人氨茶碱清除率显著降低,半衰期延长,因此老年重症患者及长期用药患者应格外注意氨茶碱血药浓度监测,以防中毒。肺癌患者氨茶碱的血药浓度在有效治疗范围内,有4例患者无效,2例有副反应发生。可能是由于有一部分肺癌患者病变部位在大气道,因而氨茶碱的平喘效果不明显;晚期肺癌患者一般存在低氧血症,氨茶碱半衰期延长较容易出现中毒,说明应用氨茶碱改善肺癌患者的喘息症状应兼顾其副反应的发生,慎重使用。以便及时作出调整氨茶碱的给药方案。
氨茶碱的血药浓度监测,对于氨茶碱治疗效果不理想的的患者,可以及时调整给药方案,大大提高临床疗效对于防治不良反应的发生也有重要作用。
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药物测定 篇5
本研究拟建立一高效液相色谱法,用于牛奶中的十种磺胺类药物残留筛查。
1实验部分
1. 1仪器与试剂
Agilent 1100液相色谱系统,配备UV检测器,美国Agilent公司。
磺胺嘧啶,磺胺噻唑,磺胺甲嘧啶,磺胺二甲嘧啶,磺胺甲唑,磺胺间甲氧嘧啶,磺胺多辛,磺胺异唑,磺胺间二甲氧嘧啶,磺胺喹啉对照品( 纯度均’ 99. 0% ) ,均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
牛奶样品购自市场。
1. 2标准溶液配制
精密称取适量十种磺胺类药物对照品,用甲醇溶解并定容,分别配制成400 μg/m L的标准储备液,避光条件下-4 ℃保存。
用甲醇配制成10种物质浓度均为0. 10,0. 20,0. 40,1. 0, 2. 0 μg / m L的系列混合标准工作溶液。
1. 3样品处理
称取牛奶样品1. 0 g置于10 m L带塞离心管中,加入5% 高氯酸溶液1. 0 m L,涡流混合1 min,超声5 min,离心5 min ( ×8000 g) ,分取上层有机相,经0. 22 μm滤膜过滤,待HPLC分析。
1. 4色谱条件
色谱柱: HC-C18柱,250 mm × 4. 6 mm I. D. ,5 μm粒径,美国Agilent公司; 流动相: 甲醇-2%冰乙酸溶液,梯度洗脱; 流速: 1. 0 m L / min; 进样量: 10 μL; 柱温: 30 ℃ ; 检测波长: 270 nm。
2结果与讨论
2. 1色谱条件的选择
磺胺类药物含伯胺基和磺酰胺基,呈两性,可溶于酸碱两性溶液中,大部分药物p Ka在5 ~ 8范围内。流动相一般为酸性改性剂与甲醇或乙腈按一定比例组合。本文选择甲醇-冰乙酸体系为流动相,色谱柱选择C18长柱。等度洗脱无法实现十种磺胺类药物的分离,经试验发现含2% 的冰乙酸溶液比1% 的溶液峰型尖锐,分离度较好。最终采用甲醇-2% 冰乙酸体系作为流动相,梯度洗脱,在不断尝试调整梯度条件后,实现了十种化合物的分离。
磺胺类药物的紫外最大吸收波长在254 ~ 280 nm之间均有文献报道,在270 nm下十种磺胺类药物响应相近,且无明显干扰,因此选择270 nm为检测波长。
本文所建立的方法,10种化合物出峰时间相对集中,分离较好,基线平稳,在相对较短的时间内实现了十种化合物的分离分析。十种种化合物标准色谱图见图1。
2. 2样品前处理条件的优化
文献中多用液液萃取法［2］,或液液萃取之后进行固相萃取净化［3］的方式处理牛奶样品。处理过程繁琐且耗费有机试剂。 牛奶的主要基质为蛋白质,本文尝试用沉淀蛋白法对样品进行预处理。
分别考察了甲醇、乙腈、5% 高氯酸溶液做为蛋白沉淀剂的效果。取一定量的混合标准溶液经氮吹吹干后,加入1. 0 g样品,涡旋混合溶解,分别加入三种蛋白沉淀剂,经涡旋混合、超声、离心后,过滤进样分析。发现加标样品经甲醇和乙腈沉淀蛋白后,提取率相近,5% 高氯酸溶液做为沉淀剂沉淀效果较好,离心后上清液较为清澈,回收率高。因此选择5% 高氯酸溶液进行沉淀蛋白的方式进行样品预处理。考察了5% 高氯酸溶液加入量分别为1. 0 m L和2. 0 m L时的回收率,回收率随沉淀蛋白剂的增加变化不明显,因此5% 高氯酸溶液的加入量选择1. 0 m L。
2. 3线性范围、定量限和回收率
按1. 4项下对混合标准工作溶液进行分析,以浓度( y) 对峰面积( x) 进行线性回归,十种磺胺类化合物的线性范围为0. 10 ~ 2. 0 μg / m L,取空白牛奶样品,分别进行了十种化合物在3个浓度水平( 0. 20,0. 40,1. 0 μg/m L) 的添加回收实验, 线性方程、相关系数和回收率结果见表2。
图2为空白添加色谱图。由图2结果可见,样品经5% 高氯酸溶液沉淀蛋白后,空白样品在10种化合物在十种化合物出峰处无明显干扰,净化效果良好。10种化合物0. 10 ~ 2. 0 μg/m L浓度范围内线性关系良好,相关系数为0. 9921 ~ 0. 9999。添加水平为0. 20,0. 40,1. 0 μg/m L时,平均回收率为81. 6% ~ 105% ,回收率稳定,满足定量分析需要。
2. 4样品测定
应用本文建立的方法对市场上购买的15个牛奶样品进行分析检测,未发现有磺胺类抗生素药物残留。实际样品色谱图见图3。
3结论
本文建立了高效液相色谱法测定牛奶中十种磺胺类药物残留,样品经5% 高氯酸溶液沉淀蛋白,经度洗脱,30 min完成进样分析。前处理操作简单快捷,使用化学试剂较少,回收率稳定,适用于牛奶中磺胺类药物的快速筛查。
摘要：建立了高效液相色谱法同时测定牛奶中十种磺胺类药物残留量。样品用5%高氯酸溶液进行沉淀蛋白,经HC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分离,甲醇-2%乙酸流动相体系梯度洗脱,用紫外检测器进行检测,检测波长为270 nm,外标法定量。结果表明:10种化合物在0.10~2.0μg/m L浓度范围内线性关系良好,相关系数为0.9921~0.9999。添加水平为0.20,0.40,1.0μg/m L时,平均回收率为81.6%~105%。方法预处理简单,适用于牛奶中磺胺类抗生素药物快速筛查。
药物测定 篇6
近年, 我国鸡白痢在蛋鸡群和肉鸡的父母代感染有上升势头, 部分地区鸡白痢沙门菌阳性率甚至高于70%。目前, 国内控制鸡白痢的主要措施是定期进行鸡群检疫, 淘汰阳性鸡, 净化培育无白痢鸡群。采用抗菌药物进行预防和控制也是控制乃至净化本病的手段之一, 但盲目使用抗菌药物, 不仅不能达到治疗效果, 而且会使致病性菌株产生广泛的耐药性, 导致无药可治, 或用药效果差。耐药菌株如果危及人类, 其后果将不堪设想。由于各地用药情况不同, 鸡白痢的耐药谱存在差异, 经常监控野毒株药敏变化情况, 指导临床准确用药, 提高药物作用效果, 减少耐药菌株的出现, 是一项需要持之以恒的工作。
笔者于2005—2010年对珠三角地区16个种鸡场鸡白痢进行了大量病料的分离鉴定, 获得68株鸡白痢沙门菌, 藉此进行了药物敏感性分析。现将有关结果报道如下, 以便为临床合理选择药物、有效防治鸡白痢提供参考。
1 材料
1.1 菌株来源
从2005年7月份至2010年4月份, 笔者对珠三角部分地区共16个种鸡场鸡白痢病鸡病料作分离培养与鉴定, 共获得68株鸡白痢沙门菌, 具体病料来源、细菌分离时间等情况见表1。
1.2 主要试剂
MHA培养基为北京陆桥技术有限责任公司产品, LB肉汤为广东环凯生物技术有限公司产品, 18种药敏纸片为杭州天和试剂有限公司产品。
2 方法
菌株按照国外常用的Kirby-Bauer法 (简称K-B法) 进行药敏试验。在无菌条件下将鉴定为沙门菌的纯培养物接种于缓冲蛋白胨水中, 置于37℃温箱中培养24 h, 稀释菌液至0.5标准麦氏比浊管, 用灭菌棉签蘸取稀释过的菌液并挤去多余的液体, 在MHA平板上均匀涂布, 盖上平板, 放置于室温下数分钟, 至培养基的表面无明显液体, 用无菌小镊子夹取药敏纸片平贴于琼脂平板表面, 然后翻转倒置于37℃恒温箱培养24 h, 测量抑菌环直径并判定结果, 所有菌株均做两个重复。试验共选取18种药物纸片, 纸片名称、含药量及判断标准见表2。
3 结果
3.1 68株分离菌对不同药物的敏感情况
68株分离菌的药敏试验结果显示, 头孢他啶、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素和头孢噻肟的抑菌作用较强, 菌株对其敏感率分别为96%、94%、87%和81%;而菌株对利福平、磺胺异唑、罗红霉素、氨苄青霉素、四环素和萘啶酸有较强的耐药性, 耐药率分别为100%、100%、94%、87%、85%、85%, 具体情况见表3。
3.2 菌株多重耐药性情况
68株分离菌中大部分显示多重耐药, 其中最少也有四重耐药, 最多的可对15种药物同时耐药, 而对6~9种药物有耐药的菌株占了78%, 具体情况见表4。
3.3 不同区域菌株的耐药情况
来源于不同地区的试验菌株对供试药物的敏感顺序虽略有不同, 但大体情况相近, 最敏感药物均为头孢他啶, 对利福平、磺胺异唑完全耐药。
4 讨论
潘志明等[1]对1962—1998年间分离保存的325株鸡白痢沙门菌进行药物敏感性测定, 结果表明20世纪70年代以四耐、五耐菌株居多, 80年代以五耐、六耐、七耐菌株占大多数, 90年代仅七耐以上菌株比率就接近90%, 据此认为该30余年中, 鸡白痢沙门菌菌株的多重耐药性呈逐步上升趋势。本试验对近5年来68株分离株作药敏试验, 大部分显示多重耐药, 其中最少也有四重耐药, 最多的对15种药物同时耐药, 同时对6~9种药物有耐药的菌株占了78%, 故笔者认为鸡白痢沙门菌菌株多重耐药性的上升趋势仍在进一步加速。
值得注意的一种倾向是, 以往由于临床中养殖场用药的差异等因素, 使得各地区、各养殖场鸡白痢沙门菌的耐药谱呈现很大差异[2], 而从本次试验看, 来源于不同地区的试验菌株对供试药物的敏感顺序虽略有不同, 但大体情况相近, 提示耐药菌株可能在沿着某些渠道扩散、平衡, 或者由于广大地区临床用药都处于高度频繁状态, 各地、各场敏感药物的启用及其耐药菌株的产生速度已经逐步趋于同步化, 这是不得不予以警惕的。
试验还表明, 以珠三角部分地区分离的68株沙门菌作药敏试验, 显示分离株对头孢他啶、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素和头孢噻肟均较敏感, 可能有三方面原因:其一是部分药物属于限用、禁用药, 如庆大霉素、氯霉素等;其二是部分药物较少使用;尚有一种原因可能是某些药物抗耐药能力较强, 如卡那霉素等。在药物学上, 后一种情况是值得研究与发掘的。
另外尚应当注意, 即使经药敏试验筛选出了一些敏感药物用于临床鸡白痢的防控, 表面上效果并不见得理想, 此时一要考虑是否为混合感染大肠杆菌等其他病原, 二要注意药物体外与体内作用环境不同等问题, 在实际用药选择上应作更科学、全面的考虑。
参考文献
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药物测定 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本与试剂
猪肉:市售;磺胺“十五合一”ELISA检测试剂盒:北京勤邦生物技术有限公司生产,其中包括包被有偶联抗原的96孔酶标板,浓度分别为0、1、3、9、27、81μg/L的磺胺嘧啶标准液,酶标二抗,抗体工作液,底物液A液和B液,终止液,20×浓缩洗涤液,2×浓缩复溶液;磺胺类药物标准品:纯度≥99%,美国Sigma公司生产;乙腈、正己烷、氢氧化钠:分析纯,北京化学试剂公司生产。
1.1.2 仪器与设备
8010S匀浆机,2000SBL电子天平,KS-Ⅱ振荡器,Anke GL-20G-Ⅱ高速离心机,DSY-Ⅲ氮吹仪,QL-901漩涡混合器,微量移液器(单道20~200μL、100~1000μL,多道50~300μL):MK3酶标仪,Acquity液相色谱串联质谱仪(配有电喷雾离子源)。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理
称取2.0 g±0.05 g匀浆后的样本至50 m L聚苯乙烯离心管中,加入8 m L乙腈-Na OH(0.1mol/L)溶液,立即用振荡器振荡5min,以4000r/min室温(20~25℃)下离心5 min后,取2 m L上清液至10 m L干净玻璃试管中,于50~60℃水浴氮气流下吹干;加入1 m L正己烷,用漩涡混合器涡动30 s溶解干燥残留物,再加入0.5m L复溶液工作液,涡动30s后转入2 m L离心管中,4 000 r/min室温(20~25℃)下离心5 min;除去上层正己烷相,取下层水相50μL用于分析。
1.2.2检测步骤
取出所需数量的微孔板,记录标准品和样品的位置;加入标准品、待测样品溶液50μL到对应的微孔中,然后加入抗体工作液50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30 min;倒出孔内液体,用洗涤工作液(250μL/孔)充分洗涤4~5次,每次间隔10 s,用吸水纸拍干;再加入酶标二抗100μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30 min,重复洗板步骤;加入底物液A液和B液各50μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15 min;加入终止液50μL/孔,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450 nm处测定每孔的吸光度。
1.2.3 结果计算
式中,A为标准品或样品溶液的吸光度;A0为空白液(浓度为0μg/L标准溶液)的吸光度。
以标准品百分吸光率为纵坐标,磺胺类药物标准品浓度的对数为横坐标,绘制标准曲线。将样品的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样品所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样品中磺胺类药物的实际浓度。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
按照1.2.2步骤,分别测定0、1、3、9、27、81μg/L磺胺甲恶唑标准液的吸光度,建立标准曲线如图1所示。其中IC50值为4.6μg/L,标准曲线R2=0.998 7。
2.2 检测限
对20份空白猪肉样本进行检测,从标准曲线上查出对应于各百分吸光率的浓度,以20份样本磺胺类药物浓度的平均值(x軃)和标准差(s)来表示检测限(MDL),即MDL=x軃+3 s,结果获得该方法对猪肉样本的检测限为1.5μg/kg。
2.3 准确度和精密度
ELISA测定的准确度用回收率表示,精密度用变异系数表示。以市售空白猪肉样本为试验材料,向其中分别添加15种磺胺类药物标准品,添加浓度为100、200μg/kg,计算回收率及精密度。结果表明所添加磺胺类药物的回收率范围在76.1%~101.7%,变异系数为4.6%~11.9%,数据结果显示试剂盒重复性较好。
2.4 特异性试剂盒特异性用交叉反应率表示:
式中,X为引起50%抑制的磺胺甲恶唑的浓度;Y为引起50%抑制的其他磺胺类药物的浓度。
由表1可知,该试剂盒特异性良好,可用于检测猪肉样本中磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲噻二唑、磺胺喹恶啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯酰、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺(二甲基)异恶唑和酞酰磺噻唑15种磺胺类药物的多残留。
2.5 与LC-MS/MS作比对试验
随机抽取50份猪肉样本,分别用仪器方法与试剂盒方法检测,仪器方法参考“GB/T 21316-2007动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定:液相色谱-串联质谱法”(该标准方法对动物组织中磺胺类药物的检测定量限为50μg/kg)。结果筛选出4份阳性样本(浓度大于50μg/kg),比对结果见表2。
由表2可知,ELISA法和LC-MS/MS法测定的结果基本一致,符合度基本达到100%,适用于猪肉样本中磺胺类药物多残留的检测。
3 结论
本研究采用酶联免疫法对猪肉中的磺胺类药物残留进行了检测,灵敏度为1μg/L,对猪肉样本的最低检测限为1.5μg/kg;以100、200μg/kg磺胺类药物添加的猪肉样本,其平均回收率为76.1%~101.7%,变异系数为4.6%~11.9%;与液相色谱-串联质谱法相比,检测结果虽一致,但耗时短(75 min)、样本前处理简单、仪器设备投资少、成本低,适合对大量猪肉样本中磺胺类药物多残留的快速检测,有利于我国畜禽养殖户、食品企业、政府监管部门等开展磺胺检测工作。但目前酶联免疫法筛选的检测限不统一,结果判定较困难,还可能存在假阳性问题,因此对于阳性样本,需要用LC-MS/MS、GC-MS等仪器方法作进一步确证。■
参考文献
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药物测定 篇8
关键词：紫外分光光度法,血药浓度,美沙拉嗪
美沙拉嗪 (5-ASA) 是治疗溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis, UC) 和节段性回肠炎 (克罗氏病, crohn's disease, CD) 的主要药物之一[1]。目前美沙拉嗪血药浓度测定方法基本是采用高效液相色谱法 (HPLC) , 但是HPLC法测定5-ASA血药浓度的方法前处理复杂, 对仪器要求较高, 而一些体外药物代谢动力学实验, 如血浆蛋白结合率测定、离体 (或在体) 肠吸收实验等采用HPLC法进行药物浓度测定非常不便。作者采用UV法, 以5%三氯乙酸 (TCA) 沉淀蛋白后建立了测定犬血浆中5-ASA浓度的方法。该方法具有专属性强、血浆用量少、准确、快捷方便等特点, 适用于一些体外药物代谢动力学试验中5-ASA药物浓度的测定。
1 材料与方法
1.1 材料
UV-2550紫外分光光度计 (日本岛津) ;XS205Dualrange电子天平 (瑞士METTLER, 精度十万分之一) ;Vortex Genie2涡旋振荡器 (美国Scientific Industries公司) ;ANKE TGL-16G台式离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;5-ASA对照品 (上海金锦乐股份有限公司, 纯度>98%) , 犬血浆 (北京平睿生物科技有限公司) , 三氯乙酸 (天津大茂化学试剂厂, 纯度>99%) , 其他试剂均为分析纯, 实验用水为双蒸水。
1.2 方法
1.2.1 美沙拉嗪系列标准溶液配制
1.2.1. 1 p H7.4磷酸盐缓冲液 (PBS缓冲液) 的配制
精密称取磷酸氢二钾14.11 g, 磷酸二氢钾2.59 g, 氯化钠1.99 g, 定容至1000 ml即得。
1.2.1. 2 系列标准溶液配制
精密称取5-ASA对照品160mg, 置于100 ml量瓶中, 用PBS缓冲液稀释至刻度, 得质量浓度为1.60 mg/ml的标准贮备液。分别用PBS缓冲液稀释配制成0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/ml的标准系列溶液, 冷藏保存。
1.2.2 血浆样品处理
精密吸取血浆样品800µl, 置5 ml离心管中, 加入PBS缓冲液, 旋涡混合30 s后加入蛋白沉淀剂 (5%三氯乙酸溶液) 800µl, 旋混1 min, 10000 r/min离心15 min, 取上清液, 经0.45µm微孔滤膜过滤后取续滤液, 即得。
1.2.3 方法专属性及测定波长的选择
取空白血浆、含药 (5-ASA) 血浆分别经“1.2.2”项方法处理后对其进行紫外光谱全扫描, 结果见图1。光谱对比表明血浆中内源性物质在检测波长303 nm处无干扰, 专属性良好, 因此选择303 nm作为测定波长。
(A含药血浆;B空白血浆)
1.2.4 标准曲线的制备
精密吸取空白血浆800µl, 置5 ml离心管中, 分别加入“1.2.1”项下制备的不同质量浓度的5-ASA系列标准溶液80µl, 旋涡混合30 s, 得到含5-ASA浓度分别为40、60、80、100、120、140、160µg/ml的血浆样品。按“1.2.2”项下方法处理;同时取空白血浆800µl, 加入80µl PBS缓冲液, 同法处理作为空白;按照UV法[1], 在303 nm波长处测定吸光度, 以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。
1.2.5 方法回收率与精密度
分别于800µl的空白血浆中加入低、中、高3种浓度 (600、1000、1400µg/ml) 的5-ASA对照品溶液80µl, 混匀, 得低、中、高3种不同浓度美沙拉嗪的血浆样品, 按“1.2.4”项下方法处理并测定, 将5-ASA的吸光度值代入标准曲线计算5-ASA血药浓度, 以测得值与加入值之比计算方法回收率。以1 d内测得的5-ASA浓度计算日内精密度, 以1周内5次测定的5-ASA浓度计算日间精密度。
1.3 统计学方法
采用DAS2.0药物代谢动力学软件进行统计分析。相关结果比较采用回归分析。
2 结果
2.1 标准曲线方程
标准曲线试验数据如表1所示, 回归方程为:Y=0.0051X+0.0277, 相关系数r=0.9997, 美沙拉嗪在40~160µg/ml范围内线性关系良好。
2.2 回收率及日内精密度
回收率及日内精密度试验结果如表2所示。低、中、高3种质量浓度的平均方法回收率分别为 (97.16±2.37) %、 (98.92±1.84) %、 (98.41±2.29) % (n=6) 。低、中、高3种质量浓度的日内RSD分别为2.17%、1.75%、2.21%。
2.3 日间精密度试验
1周内连续5个工作日测定所得日间精密度, 结果如表3所示。低、中、高3种质量浓度的日间RSD分别为1.88%、1.68%、1.63%。
3 讨论
本试验选取5%三氯乙酸溶液直接沉淀蛋白的方法测定5-ASA血药浓度。该方法简化了样品预处理过程, 可在短时间内处理大批样品, 具有简便迅速, 蛋白清除完全, 灵敏度及回收率高的特点。由于三氯乙酸的酸性较大, 加入后使5-ASA吸收波长蓝移, 其最大吸收波长由330 nm变为303 nm。测定过程中作者采用空白血浆按含药血浆相同方法进行处理作为空白对照, 能有效去除血浆中内源性物质对测定的干扰[3]。本试验所得标准曲线线性范围为40~160µg/ml, 基本能够满足大部分体外药物代谢动力学试验的测定需要。
参考文献
[1]刘伟.溃疡性结肠炎的药物治疗现状与前景.国外医学 (消化系疾病分册) , 2003, 23 (5) :261-263.
[2]国家药典委员会.中国药典 (二部) .北京:中国医药科技出版社, 2010:30-31.
药物测定 篇9
关键词：SPE-HPLC,苯巴比妥,苯妥英钠,卡马西平,血药浓度
癫痫是一种以中枢神经系统功能失常为主要表现的常见综合征。患者常需长期服药才能控制发病,有的则要终生用药。苯巴比妥,苯妥英钠和卡马西平是临床最常用的有效抗癫痫药物。然而苯巴比妥,苯妥英钠和卡马西平治疗指数低,安全范围窄,个性差异大,若剂量和用法不当,可导致疗效不佳或出现严重毒副反应,且不同厂家的产品存在生物利用度差异,其血药浓度与疗效和毒性密切相关。因此,为了提高临床用药的有效性和安全性,用药过程中进行治疗药物血药浓度监测已达成共识。本文运用反相高效液相色谱法摸索同时测定苯巴比妥[1],苯妥英钠和卡马西平全血浓度的方法,其操作简单,费时少,且利于保护色谱柱,为临床合理用药提供依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
LC310高效液相色谱仪(包括LC-WS310色谱工作站,高压恒流泵,柱温箱,LC-WS310紫外检测器);Accubond SPE C18柱(ODS 1mL﹕100mg);BT125D电子分析天平,赛多利斯;PHS-25酸度计,上海精科;SHA-C型恒温水浴,巩义市予华;超纯水机,南京易普易达。
1.2 试剂
苯巴比妥,国家麻醉品实验室;苯妥英钠、卡马西平,sigma公司;甲醇为色谱纯,美国tedia公司;磷酸二氢钠,磷酸二氢钾均为分析纯;水为二次蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
流动相:甲醇-KH2PO4(0.01 mol/L,p H 3.50)(50∶50);
柱温:25℃;流量1 m L/min;检测波长:311 nm[2]。
2.2 标准溶液的制备
分别精密称取PB,DPH,CBZ适量,分置250 m L容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,配成PB(200μg/m L)、DPH(200 g/m L)、CBZ(100μg/m L)标准贮备液,置4℃冰箱保存备用。
2.3 样品液的制备
取含药血清0.5 m L,加Na H2PO4缓冲液(0.1 mol/L,p H=3.20)0.5 m L,混匀备用。
2.4 样品的预处理
取血清0.1 m L,加p H 7.6的磷酸盐缓冲液0.1 m L,涡旋,加乙酸乙酯5.0 m L,混匀离心,取提取液4 m L,60℃水浴吹干,加100 m L流动相复溶、进样[3]。
2.5 标准曲线及线性范围
分别准确吸取PB、DBH、CBZ标准贮备液100、200、400、600、800μL,依次分置于5支尖底试管中,水浴吹干。每管加无药血清5 m L复溶,配成含PB、DPH、CBZ系列浓度标准血清,分别加入Na H2PO4缓冲液5 m L,振荡混匀后按2.4项操作。用外标法定量,得回归方程(见表1)。
2.6 精密度和相对回收率实验
配置高、中、底浓度的含药血清标准系列,依2.4项下操作,分别于当日和连续5日测定,计算回收率及日内差和日间差(见表2和表3)[4]。
3 讨论
(1)PB、CBZ、DPH均为常用抗癫痫药物,为提高疗效,减少毒副作用,需要测定血清中药物浓度,本实验采用RP-HPLC法。99.95%,99.36%和99.65%。
(2)本实验中回收率为苯巴比妥99.95%、苯妥英钠99.63%与卡马西平99.65%,证明准确度较好,但相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)>2%,表明精密度误差较大,日内差与日间差又无明显区别,综合考虑以上因素,血液中影响因素较多,即使已离心提纯用血清做实验,与真实值仍有较大误差,加之这三种药个体差异较大,建议临床用药不能只看数据,要综合多种因素,谨慎用药[5]。
(3)在样品处理中,先用少量磷酸盐溶液沉淀蛋白,再用乙酸乙酯提取[6]。此法综合了蛋白沉淀法和液-液萃取法之长,血样加入缓冲溶液,使药物萃取时抑制药物的解离,提高监测指数[7]。
(4)应用乙酸乙酯提取血清中的3种药物,其优点在于乙酸乙酯挥发快,提取效率高,可达到快速操作的目的[8]。
(5)癫痫为神经科的常见疾病,多数患者通过长期用药可以控制病情,但需制定合理的给药方案,使血药浓度控制在有效范围内[9]。本文所建立的方法可同时测定3种抗癫痫药物的血药浓度,操作简便,结果可靠,为医院常规监测提供了可靠手段,对其合用时的监测尤为方便。[10]
4 结论