基因型耐药检测

基因型耐药检测（精选八篇）

基因型耐药检测 篇1

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)属于肠杆菌科柠檬酸杆菌属沙门菌族。弗氏柠檬酸杆菌是条件性致病菌,广泛分布于自然界中,可以引发人和动物的肠炎、脑膜炎,严重时可导致败血症。至今为止,国内外学者对弗氏柠檬酸杆菌已经开展了一定的研究[1,2,3,4],但是尚缺少关于鲫鱼弗氏柠檬酸杆菌耐药性方面的研究。本研究对鲫鱼弗氏柠檬酸杆菌进行了耐药表型及耐药基因检测,探讨了此菌的耐药情况和耐药规律,以期为弗氏柠檬酸杆菌所致鱼病的防治及其耐药分子机理的深入研究积累科学参考资料。

1 材料

1.1 菌种来源

鲫鱼弗氏柠檬酸杆菌,分离自四川成都某养殖场的鲫鱼,以甘油菌的形式保存于西南民族大学生命科学与技术学院动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室(于-80 ℃冰箱保存)。

1.2 主要试剂

营养琼脂,购自北京奥博星生物技术有限责任公司;SS琼脂、MH肉汤、 MH琼脂,购自杭州微生物试剂有限公司;药敏纸片,购自英国Oxiod 公司;TaqMix,购自TIANGEN BIOTECH (BEIJING)公司,DL-2 000 Marker,购自宝生物工程(大连)有限公司。

2 方法

2.1 药敏试验

采用标准Kirby-Bauer纸片扩散法,根据美国临床实验室标准委员会 (CLSI/NCCLS) 执行标准判定结果。将鲫鱼弗氏柠檬酸杆菌单菌接种于灭菌生理盐水中,并与麦氏比浊管比较,将菌液浓度校正到 0.5麦氏单位。取少量菌液均匀涂抹到MH琼脂平板上,将药敏纸片紧贴于平板表面,于35 ℃培养16～18 h后测量抑菌圈直径。

2.2 耐药基因的检测

参照参考文献[5,6]设计四环素类和磺胺类药物耐药基因的引物(序列见表1),由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系(50 μL):以单个菌落为模板ddH2O 23 μL,2×TaqMix 25 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL。PCR反应条件:1)四环素类。94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s,56 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s ,共35个循环;72 ℃ 10 min。2)磺胺类。94 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,共35个循环;72 ℃ 5 min。取PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像仪拍照。

3 结果与分析

3.1 鲫鱼弗氏柠檬酸杆菌耐药表型的检测(结果见表2)

由表2可知:该菌株对环丙沙星、新霉素、庆大霉素、氧氟沙星、阿奇霉素、氟苯尼考和磺胺甲恶唑敏感;对红霉素、氨苄西林、强力霉素、四环素、头孢拉定和阿莫西林耐药。

注:S表示敏感,R表示耐药。

3.2 鲫鱼弗氏柠檬酸杆菌耐药基因的检测

四环素类tetA 基因检测出1条长900 bp的单一条带,tetM基因检测出1条长为500～600 bp的目的条带,均与预期条带大小一致,tetC基因未见明显条带(见图1)。磺胺类药物耐药基因Sul1、Sul2、Sul3都未检出。

1～3.四环素类耐药基因tetM、tetA、tetC; M.DL-2 000 Marker。

4 讨论

至今为止,关于弗氏柠檬酸杆菌对抗生素的耐药性已经有了一些报道。河蟹弗氏柠檬酸杆菌对四环素和头孢拉定等7种抗生素耐药[2]。红螯螯虾弗氏柠檬酸杆菌对青霉素 G和四环素等5种抗生素耐药[3]。中华鳖弗氏柠檬酸杆菌对四环素和复方新诺明等抗生素耐药[4]。本研究中鲫鱼弗氏柠檬酸杆菌对四环素和头孢拉定等6种抗生素耐药。这些结果显示:四环素的耐药性较普遍,这可能与四环素的广谱特性及大量使用有关;耐药表型也有一些差异,这可能与不同地区、不同养殖场抗生素的使用情况有关。

耐药基因是一种新型的水体污染物,已经从不同水环境中检出,并对水产品质量安全和人体健康构成严重的威胁[7,8]。四环素类抗生素是水产养殖业在治疗细菌疾病时使用的主要抗生素之一。四环素类抗生素的大量使用增加了水体环境中四环素抗性病原菌的数量,因此此类抗性基因在环境中的检出频率与其他抗生素相比也是最高的。目前,已报道的四环素类抗性基因已经超过40种[9]。本研究检测出了tetA、tetM基因。从韩国某水产养殖场的病鱼体内分离出的抗四环素爱德华迟钝菌株均携带有tetB和 tet G 中的一种或两种基因[10]。从澳大利亚的水产养殖区分离的弧菌和黄杆菌中也检测出tetA、tetE和tetM 基因[11]。此外,四环素耐药基因的分布存在多样性,不同细菌、宿主种类及地理位置等都表现出四环素耐药基因的差异[12,13]。

由于水产养殖业中多种抗生素的交叉使用,除四环素抗性基因外,还存在着其他不同类型的抗生素抗性基因。从越南的虾塘和鱼塘中分离出127个抗磺胺类药物的菌株,其中Sul1基因的出现率最高,其次是Sul2和Sul3。而本试验未检测出磺胺类Sul1、Sul2、Sul3耐药基因,这可能是由于该养殖场使用该类抗生素较少。

摘要：为了检测鲫鱼费氏柠檬酸杆菌的耐药表型及耐药基因,试验采用标准Kirby-Bauer纸片扩散法检测鲫鱼弗氏柠檬酸杆菌对13种抗生素的耐药表型,并用PCR法检测弗氏柠檬酸杆菌对四环素类和磺胺类抗生素的6种耐药基因(tetA、tetC、tetM、Sul1、Sul2和Sul3)。结果表明:鲫鱼弗氏柠檬酸杆菌对四环素、氨苄西林、强力霉素、红霉素、头孢拉定和阿莫西林耐药;仅检测出四环素类的tetA和tetM基因,而其他未检测出。

基因型耐药检测 篇2

目的:探讨医院获得性肺炎(HAP)鲍曼不动杆菌耐药谱型、DNA基因型及两者关联性.方法:收集HAP患者痰液培养病原菌,分离鲍曼不动杆菌,根据此菌对7种抗生素耐药特征进行耐药谱分型;建立标准IRSPCR体系.对鲍曼不动杆菌DNA进行基因分型;对照分析耐药谱型和基因型之间的.对应关系.结果:本组176例,分离鲍曼不动杆菌21株,根据其对氨苄西林、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、阿米卡星和左氧氟沙星7种抗生素多霞耐药情况分为I～X 10个耐药谱型;根据IRS-PCR分为A、B、C、D 4个DNA基因型;关联性研究显示A型与Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型有关,B型与Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ型有关,C型与Ⅶ、Ⅸ犁有关,D型与Ⅵ、Ⅷ、Ⅹ型有关.结论:鲍曼不动杆菌多重耐药谱型与DNA基因型具有较高的关联性.

作 者：姜德波 栾林 吕锐 张文卿 JIANG Dabo LUAN Lin LU Rui ZHANG Wenging 作者单位：姜德波,栾林,JIANG Dabo,LUAN Lin(青岛阜外心血管病医院,山东,266034)

吕锐,张文卿,LU Rui,ZHANG Wenging(青岛大学医学院病原生物学试验中心)

基因型耐药检测 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

我院2001年3月~2006年3月收治入院的慢性乙肝患者300例, 均接受阿德福韦酯治疗, 其中, 男122例, 女178例;年龄最大67岁, 最小23岁, 平均45岁;用药时间为1~3年。治疗期间患者的饮食习惯及生活方式不变, 不使用其他抗肝炎病毒类药物。于服药前及服药过程中测定并记录观察指标, 本组患者间年龄、性别等基本情况相似, 具有可比性。

1.2 方法

该研究共纳入300例接受ADV治疗的慢性乙肝患者, 每日口服阿德福韦酯10 mg, 平均治疗18个月。患者基线HBV-DNA平均水平为7.4 log10 copies/ml。生化学和病毒学指标每2~3个月评估1次。采用高通量光谱基因分型法 (RFMP) 检测ADV的耐药基因型[2]。

1.3 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析, 数值的比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

300例患者治疗前的HBV-DNA平均水平为7.4log10 copies/ml。经1~3年治疗后其血清HBV-DNA水平和基因型耐药率见表1。

与服用阿德福韦1年时比较, ﹡P<0.05

3 讨论

基因型耐药为核苷 (酸) 类似物耐药变异相关概念之一, 准确的定义是出现了导致药物靶位氨基酸变异的单核苷酸变异, 这些变异在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关。通常通过对治疗中发生病毒学突破的患者治疗前后HBV株的核苷酸及其编码的氨基酸比较分析而确定是否存在基因型耐药, 阿德福韦酯只要1个位点突变就足以发生突变, 基因屏障低[3]。Liaw等进行的研究确定了rtN236T和rtA181V变异与阿德福韦耐药有关。阿德福韦耐药相关的变异发生率0~48周为0 (0/629) , 49~96周为2% (6/293) , 97~144周为1.8% (3/163) , 3年的累计发生率为3.9%。但同时阿德福韦酯也显示了抗HBV作用, 其血清HBV-DNA下降的中位数为4.3 log10 copies/ml。含DNA多聚酶突变 (rtT128N和rtR153Q或rtW153Q, 与乙型肝炎免疫球蛋白耐药相关) 的HBV变异株[4]。

抗病毒药物耐药是乙肝长期治疗中的一大临床难题, 耐药的发生降低了疗效, 减少了肝硬化患者生存时间。需要进行密切监测。在核苷类似物初治患者中, 通过使用强效抗病毒药, 使用高耐药基因屏障的抗病毒药物, 以提高患者的依从性等, 可以将HBV耐药时间延迟及降低耐药率。阿德福韦酯同样具有更加良好的安全性和耐受性, 治疗后能获得长期的病毒抑制、维持生化指标正常和肝脏组织学改善, 加上病毒耐药出现晚且发生率低 (如HBeAg阴性患者中所见) , 使得阿德福韦酯成为治疗乙肝病毒感染的重要药物, 是慢性乙肝相关肝病长期治疗的一个很好选择。当耐药发生后, 应考虑使用强效的抗病毒药物或联合治疗。

摘要：目的:了解阿德福韦酯治疗慢性乙肝患者产生基因型耐药的原因。方法:对我院2001年3月～2006年3月收治入院的慢性乙肝患者300例进行阿德福韦酯治疗, 在治疗的不同阶段检测患者HBV-DNA水平, 了解患者阿德福韦酯的基因型耐药。结果:300例乙肝患者经阿德福韦酯治疗, 3年时间内15例患者出现基因型耐药。结论:经研究证明阿德福韦酯在治疗过程中基因屏障较低。

关键词：乙型肝炎 (乙肝) ,阿德福韦酯,基因型耐药

参考文献

[1]何建文, 何丽芳, 姚忻, 等.乙型肝炎病毒全基因组研究的新方法[J].中华传染病杂志, 1998, 2 (15) :2.

[2]Peters M, Hann HW, Martin P, et al.Adefovir dipivoxil alone and incombination with lamivudine in patients with lamivudine-resistancechronic hepatitis B[J].Gastroenterology, 2004, 126 (1) :91-101.

[3]Ghany M, Lutchman G, Kleiner D, et al.Lamivudine and adefovir versusadefovir alone for HBeAg-positive chronic hepatitis B[J].Hepatology, 2005, 42 (4 Suppl 1) :591A (Abstract 1005) .

基因型耐药检测 篇4

国内相关学者已经研究证实, Ex PEC在猪热综合征中的分离比例极高, 毒力比传统大肠杆菌更强, 且耐药性也明显高于其他细菌[2], 但由于未对猪进行攻毒试验, 因此Ex PEC对猪的致病性及在高热综合征中所起的作用尚不明确。鉴于此, 本研究在对Ex PEC进行分离鉴定的基础上, 进行了动物回归试验, 并对其耐药表型及耐药基因型进行分析, 以期为Ex PEC毒力和耐药性的研究奠定一定的试验基础。

1 材料与方法

1.1 病原

吉林省某猪场患呼吸系统疾病病猪1头, 分别进行临床观察和死后病理剖检, 并无菌采集病猪的肺脏、心血等病料。

1.2 试验动物

小白鼠25只, 体重为20~25 g, 购自吉林大学实验动物中心;健康断奶仔猪6头, 购自1年内未发生过呼吸系统疾病的吉林省某猪场。

1.3 主要试剂

Taq酶、d NTPs、DL-2 000 Marker, 购自Ta KaRa公司;细菌基因组DNA快速抽提试剂盒, 购自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。

1.4 受检药物

强力霉素、氟苯尼考、环丙沙星、阿米卡星等8种抗菌药物, 均购自北京海洋医化生物科技有限公司。

1.5 病原菌的分离

无菌采集死亡猪肺脏、脑、心脏等组织划线接种EMB平板, 37℃温箱培养过夜, 挑取深紫黑色、边缘光滑、带有金属光泽的圆形菌落进行革兰染色。同时, 应用血琼脂和PPLO琼脂对巴氏杆菌、支原体等肺炎病原菌进行分离。

1.6 PCR鉴定

根据Gen Bank中登录的细菌16S r DNA序列, 设计鉴定用通用引物, 引物序列:P1 5'-AGAGTT-GATCCTGGCTCAG-3', P2 5'-AAGGAGGTGATC CTCCAACCGCA-3', 预期扩增的目的片段大小为1 500 bp左右。回收目的片段, 与p MD18-T连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 选取阳性克隆进行测序。将测序结果与Gen Bank中已发布的序列进行BLAST比对。

1.7 小鼠致死性试验

挑取纯化的单个菌落接种于5 m L LB培养液中, 37℃摇床培养过夜并进行菌落计数。用LB培养液将菌液稀释至1.2×106cfu/m L、1.2×107cfu/m L、1.2×108cfu/m L、1.2×109cfu/m L, 腹腔注射小鼠, 0.5 m L/只[3];对照组腹腔注射无菌的LB培养液, 0.5 m L/只。两组隔离饲养, 定时观察小鼠发病情况, 对死亡小鼠立即剖检, 观察病理变化。

1.8 动物回归试验

将健康仔猪随机分试验组和对照组, 3头/组。试验组滴鼻接种1.7中计数后的菌液, 1.0×1010cfu/只;对照组滴鼻接种相同剂量的LB培养液。两组隔离饲养, 每6 h观察发病情况1次, 对病死猪立即剖检, 观察病理变化, 无菌采集肺脏、心脏、脑等病料进行病原重分离。

1.9 药物敏感性试验

以试管双倍稀释法对分离菌进行药物敏感性试验, 并以大肠杆菌ATCC25922为质控菌株。受试药物的质控范围及敏感折点值判断标准主要参考CLSI动物源细菌药敏试验标准。

1.1 0 耐药基因型分析

提取菌株基因组构建Paired-End测序文库, 并运用Illumina公司Hiseq2000高通量测序系统进行测序, 将测序结果与NCBI数据库进行BLAST比对, 并分析耐药基因型。

2 结果与分析

2.1 临床症状观察及病理剖检

发病仔猪精神萎靡, 有明显的呼吸道疾病症状, 无腹泻等肠道疾病症状。剖检后可见左、右肺尖叶出现明显肉变, 胸前有积液, 肠道及其他实质性器官无明显病变。

2.2 病原菌的分离

病原菌经革兰染色均为革兰阴性杆菌, 在伊红美蓝培养基上生长的菌落为紫黑色、圆形、稍凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润且有金属光泽, 将此菌株命名为SLPE。巴氏杆菌及支原体等病原体的检测结果为阴性。

2.3 16S r DNA序列分析

经PCR扩增得到的16S r DNA片段大小为1 500 bp左右, 见图1, 与预期大小相符。运用BLAST搜索比对, 结果与Gen Bank中Escherichia coli ATCC8739的同源性高达100%。

2.4 小鼠致死性试验

经计算, SLPE菌株对小鼠的LD50为6.7×107cfu/kg, LD100为1.2×109cfu/kg。

2.5 动物回归试验

攻毒后24 h内试验组仔猪全部死亡, 对病死猪进行剖检, 可见典型的病理变化, 左、右肺尖叶出现明显肉变, 见259页彩图2A, 肠道及其他实质性器官无明显病变, 对照组仔猪无明显症状。肺脏经4%中性甲醛液固定, 常规脱色, 石蜡包埋, 切片 (厚度为4μm) , H.E.染色, 光镜观察结果见259页彩图2B。

2.6 药物敏感性试验 (结果见表1)

由表1可知, SLPE菌株对氟苯尼考、强力霉素、环丙沙星、阿米卡星等7种抗菌药均具有很高的耐药性, 仅对头孢噻肟敏感。

μg·m L-1

2.7 耐药基因型分析

全基因组测序及耐药基因型分析结果显示, SLPE基因组具有外排调控基因Mar C、SoxR, 外排泵基因MATE和ABC, 耐药基因移动原件IS, 四环素耐药基因tet, 氟苯尼考耐药基因FloR, 氯霉素乙酰转移酶基因及多重耐药基因共35个[4]。

3 讨论

近年来, Ex PEC已成为引起肠外组织感染的人畜共患病病原[5,6]。研究表明, Ex PEC能够合成独特的毒力因子使其定植于尿路上皮引发炎症反应, 如α-溶血素可与上皮细胞和巨噬细胞的受体蛋白形成稳定结构, 并触发炎症信号传导级联反应[7,8]。此外, Ex PEC在猪热综合征中的分离率极高, 毒力比传统E.coli更强。本试验结果显示, SLPE单独回归动物可引起宿主肺部感染并致死, 但其较强的毒力是由毒力基因的差异表达, 还是由外源毒力基因的整合作用所致, 还有待进一步研究。

目前, 相关研究表明Ex PEC的耐药性显著高于传统E.coli。T.N.D.Dang等[9]对人源的Ex PEC菌株进行的耐药性检测结果显示, 其对β-内酰胺类和磺胺类药物耐药。A.Mora等[10]研究证实, 禽Ex PEC菌株对β-内酰胺类、磺胺类药物和萘啶酮酸耐药。由表1结果可知, SLPE也具有多重耐药性, 仅对β-内酰胺类药物敏感。同时, 本试验对SLPE菌株耐药基因型的分析结果显示, 其耐药基因型与肠内大肠杆菌并无显著差异。侯敏[11]研究证实, 携带3种及3种以上毒力基因的人源Ex PEC均表现为多重耐药, 但是否与毒力基因、耐药性的改变相关, 还有待进一步研究。总之, 猪源Ex PEC的耐药性已经明显高于其他菌群, 今后应加强对猪源Ex PEC耐药性的监测, 并对其耐药机制进行研究, 以减缓其抗药性产生的速度。

参考文献

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基因型耐药检测 篇5

Acr AB外排系统与细菌的耐药性关系密切,抑制Acr AB外排系统的活性或降低其表达水平可使细菌对环境的适应能力及抗生素耐药水平下降。因此,主动外排系统抑制剂的研究和开发是解决细菌耐药问题的重要途径。但尽管对外排泵抑制剂进行了不少的研究,现尚无适用于临床的外排泵抑制剂。本试验通过体外诱导的方法使原来敏感的大肠杆菌产生多重耐药,并对Acr A基因进行了PCR全基因扩增及测序,为进一步研究细菌多重耐药机理以抗菌药物的开发提供一个理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

大肠杆菌敏感株,由韩国国立兽医检验院提供。

1.2 试验药品

标准DNA Marker为大连宝生物制品有限公司产品;氯霉素、环丙沙星和四环素,均购自中国药品生物制品检定所;Taq DNA聚合酶、d NTPs、蛋白酶K,均购自北京基因组研究所;PCR产物纯化试剂盒,购自上海英骏生物技术公司;琼脂糖为上海生物工程公司产品。

1.3 试验仪器

数码凝胶图像分析系统GDS-800,美国;PCR仪9700,美国;水平电泳槽JYDF,北京君意东方电泳设备有限公司;台式高速离心机,Sigma公司;超净工作台,苏州安泰空气技术有限责任公司。

1.4 试验方法

1.4.1 大肠杆菌耐药菌株的诱导

采用浓度梯度法进行人工诱导[5]。以大肠杆菌的MIC前1个浓度为起始浓度,按2的幂次方:21,22,23,24,25,……依次配制药物含量逐渐递增的LB培养基。首先以敏感大肠肝菌对环丙沙星(CIP)的1/2MIC为起始浓度,连续培养5代。在每次进行下一轮培养之前菌液先移至无药液体培养基中培养,并进行无杂菌检查。之后将大肠肝菌低浓度连续诱导后的菌液接入药物浓度等于MIC的含药培养基中,待其生长后,在同一药物浓度的培养基中连续传代2次,然后接种到相邻的高浓度中,待其生长后,传2代,再接种到下一个药物浓度的培养基。依次在MIC,2MIC,4MIC,8MIC,16MIC,32MIC等逐步升高的药物浓度下连续诱导直至产生耐药性。同样在移至浓度升高的液体培养基之前先在无药液体培养基中培养,并进行无杂菌菌株检查[6]。

将得到的对CIP耐药的大肠杆菌分别进行氯霉素和四环素的最小抑菌浓度测定以及耐药的诱导,在此过程中的方法步骤均同于环丙沙星。在进行耐药诱导的同时应进行大肠杆菌的鉴别,以确定没有其它的杂菌污染。

1.4.2 大肠杆菌基因组DNA的提取[7]

培养5 m L大肠杆菌培养物至饱和状态,取1.5 m L的培养物离心2 min。具体提取方法按试剂盒步骤进行。

1.4.3 大肠杆菌Acr A基因片段的获取

从Gen Bank中查到大肠杆菌Acr A基因序列借助计算机软件设计引物,引物由上海英骏公司合成。上游引物为:5'GACGACAAACAGGC-CCAACA3',下游引物为:5'TTAAGACTTGGA-CTGTTCA3'。将大肠杆菌基因组作为模板,反应体系为50 L,灭菌双蒸水为30 L,10×buffer反应缓冲液5 L,5 mmol/Ld NTPs 4 L,25 pmol/L引物各1 L,1.5UTTag DNA聚合酶1 L,DNA模板8 L,PCR循环参数为94℃30 s,60℃45 s,72℃60 s,30个循环,最后一个循环72℃延伸10 min。用含有0.5 mg/L溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并拍照。

1.4.4 Acr A基因产物序列分析

由上海英骏生物有限公司测序完成。

2 结果

2.1 多重耐药菌株筛选结果

经环丙沙星、氯霉素和四环素诱导,敏感的大肠杆菌由低浓度到高浓度逐渐对三种抗生素适应。最后选出对环丙沙星(8 mg/L)、氯霉素(32 mg/L)和四环素(32 mg/L)多重耐药的大肠杆菌菌株。

2.2 PCR扩增产物结果

PCR扩增后,对其产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳,在1005bp处出现明显的条带,如图1。

2.3 Acr A基因测序结果

TCAAAACTGAACCTCTGCAGATCACAACCGAGCTTCCGGGTCGCACCAGTGCCTACCGGATCGCAGAAGTTCGTCCTCAA 80GTTAGCGGGATTATCCTGAAGCGTAATTTCAAAGAAGGTAGCGACATCGAAGCTGGTGTCTCTCTCTATCAGATTGATCC 160TGCGACCTATCAGGCGACATACGACAGTGCGAAAGGTGATCTGGCGAAAGCCCAGGCTGCAGCCAATATCGCGCAATTGA 240CGGTGAATCGTTATCAGAAACTGCTCGGTACTCAGTACATCAGTAAGCAAGAGTACGATCAGGCTCTGGCTGATGCGCAA 320CAGGCGAATGCTGCGGTAACTGCGGCGAAAGCTGCCGTTGAAACTGCGCGGATCAATCTGGCTTACACCAAAGTCACCTC 400TCCGATTAGCGGTCGCATTGGTAAGTCGAACGTGACGGAAGGCGCATTGGTACAGAACGGTCAGGCGACTGCGCTGGCAA 480CCGTGCAGCAACTTGATCCGATCTACGTTGATGTGACCCAGTCCAGCAACGACTTCCTGCGCCTGAAACAGGAACTGGCG 560AATGGCACGCTGAAACAAGAGAACGGCAAAGCCAAAGTGTCGCTGATCACCAGTGACGGCATTAAGTTCCCGCAGGACGG 640TACGCTAGAATTCTCTGACGTTACCGTTGATCAGACCACTGGGTCTATCACCCTACGCGCTATCTTCCCGAACCCGGATC 720ACACTCTGCTGCCGGGTATGTTCGTGCGCGCACGTCTGGAAGAAGGGCTTAATCCAAACGCTATTTTAGTCCCGCAACAG 800GGCGTAACCCGTACGCCGCGTGGTGATGCCACCGTACTGGTAGTTGGCGCGGATGACAAAGTGGAAACCCGTCCGATCGT 880TGCAAGCCAGGCTATTGGCGATAAGTGGCTGGTGACAGAAGGTCTGAAAGCAGGCGATCGCGTAGTAATAAGTGGGCTGC 960AGAAAGTGCGTCCTGGTGTCCAGGTAAAAGCACAAGAAGTTACCG 1005

3 小结与讨论

近年来,对大肠杆菌多重耐药机制的研究表明,大肠杆菌多重耐药的形成主要与大肠杆菌存在主动外排系统Acr AB有关[8]。本试验用环丙沙星、四环素和氯霉素对敏感大肠杆菌进行多重耐药诱导,成功得到了大肠杆菌多重耐药菌株,这可为进一步研究细菌多重耐药机理以及抗菌药物的开发提供一个前提条件。

多重耐药大肠杆菌的Acr A基因的测序结果与文献报道的序列相比,只有4个碱基发生突变(见DNA序列中加下划线的碱基),同源性为99.8%,因而对Acr A编码的蛋白功能没有影响。

本实验设计了能扩增出Acr A结构基因的引物序列,并对其进了PCR检测,结果得到了Acr A序列,表明Acr A基因在多重耐药大肠杆菌中是的确存在的,并进一步证实了大肠杆菌的多重耐药性主要与Acr AB外排系统有关这一理论。

虽然已证实了大肠杆菌的多重耐药性主要与Acr AB外排系统有关,但菌体细胞膜通透性的改变与主动外排系统的超量表达共同作用,可引起细菌对多重抗生素高频率、高水平的耐药,而耐药性质粒的存在可能使多重耐药水平提高数倍。至于这些过程的相互作用机理还不清楚,有待进一步研究。

摘要：临床分离的大肠杆菌多重耐药菌株越来越多,大肠杆菌形成多重耐药的原因主要与大肠杆菌染色体上存在的AcrAB外排系统有关。本试验首先用环丙沙星、四环素和氯霉素对敏感大肠杆菌进行多重耐药诱导,使敏感大肠杆菌具有了多重耐药性。然后对多重耐药性大肠杆菌的基因组DNA进行了提取,以基因库中AcrA基因的编码序列设计引物,以多重耐药性大肠杆菌基因组为模板,对AcrA基因进行了PCR扩增和测序,得到了1005bp的片断,并与基因库中AcrA基因的序列进行了比较,同源性为99.8%。结果表明:AcrA基因与大肠杆菌的耐药性有关。

关键词：大肠杆菌,AcrA基因,PCR检测

参考文献

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基因型耐药检测 篇6

1 材料和方法

1.1 实验菌株

临床菌株为自2006年5月~2007年5月从我院住院病人各类标本中分离出的117株肺炎克雷伯菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603和产TEM-1酶大肠埃希菌ATCC35218。

1.2 菌株鉴定

117株临床菌株及3株质控菌株用GNI鉴定卡在VITEK-60微生物自动分析仪上进行鉴定,另加吲哚试验与产酸克雷伯菌进行鉴别。

1.3 药敏试验

用M-H琼脂,以K-B法进行抗生素敏感性试验。实验操作及结果判读均严格按照美国临床实验室国家标准委员会(NCCLS)制定的标准进行。K-B法中所用药敏纸片及M-H琼脂均为英国OXOID公司产品,药敏纸片中抗生素含量和纸片大小符合WHO的规定。

1.4 ES BL确证试验

以大肠埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCC700603分别作为阴性和阳性对照。按NCCLS(1999年)规定,头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸和头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸两组中任一组合中含克拉维酸的抑菌圈直径比不含克拉维酸的纸片抑菌圈直径≥5 mm,即判为ESBL阳性。

1.5 脉冲场凝胶电泳

参照文献[2,3]的方法并略加改进,所有标本经离心集菌、低溶点琼脂糖包埋、溶菌酶裂菌、蛋白酶K去蛋白、限制酶酶切、电泳、成像等步骤,然后用FingerprintingⅡ软件对电泳图谱进行分析,分别比较各菌株DNA条带的数目与分子量大小(位置),用Dice系数计算相似值,通过应用算术平均数的非加权成组配对法(unweighted pair-group method using an arithmetic average,UPGMA)来计算各菌株间的遗传距离并绘制数值分类树状图。

1.6 ES BL基因型检测

用传统碱裂解法提取细菌质粒DNA,用PCR检测产ESBLs肺炎克雷伯菌的基因型。根据Genebank和EMBL数据库公布的bla TEM型DNA、bla SHV型DNA和bla CTX-M型DNA序列分别设计3对特异性引物,分别扩增847、930和759 bp长度的bla TEM DNA、bla SHV DNA和bla CTX-M DNA片段。引物由上海生工生物工程有限公司合成,序列如下:(1)bla TEM DNA引物:(upstream:5'-GAGTATTCAACATTTCCGTGTC-3';downstream:5'-TAATCAGTGAGGCACCTATCTC-3'),(2)bla SHV DNA引物:(upstream:5'-GGGTTATTCT-TATTTGTCG

C-3';downstream:5'-TTAGCGTTGCCAGTGCTC-3'),(3)bla CTX-M DNA引物:(upstream:5'-ACGCTGTT GTTAGGAAGTG-3';downstream:5'-TTGAGGCTGGG TGAAGT-3')。PCR扩增在ABI 9700基因扩增仪上进行,以大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照,以E-co.j53R1(TEM-1)、Eco.j53P1010(SHV-1)分别为阳性对照。

扩增条件:94℃预变性5 min,(94℃变性1min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min(35个循环),72℃延伸10 min,4℃保存。

1.7 P CR产物测序

阳性PCR产物用QIAGEN公司的QIAquick PCR purification kit纯化。产物测序用双脱氧末端终止法,在ABI 377自动DNA测序仪上进行,测序引物为PCR上游引物upstream,所测DNA序列用Chromas与DNAMAN软件处理,用BLASTN在Gen Bank数据库中进行比对查询。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌对20种抗生素的耐药表型分析

如表1所示,对20种抗生素的耐药率以氨苄西林最高,为97.40%,其次为哌拉西林和氨苄西林/舒巴坦,分别达到64.10%和62.40%;第二代头孢菌素的耐药率都在50.00%以上;第3代头孢中头孢塞肟和头孢曲松的耐药率较高,分别为32.50%和41.90%,而头孢他定的耐药率稍低,为28.20%;第4代头孢头孢吡肟的耐药率为10.30%;庆大霉素与阿米卡星的耐药率分别为47.00%和27.40%,环丙沙星的耐药率为30.80%,头孢菌素类头孢西丁耐药率为31.60%,单酰胺类氨曲南耐药率为34.20%,尚未出现碳青霉烯类耐药株。

2.2 产ES BL肺炎克雷伯菌的耐药结果分析

通过ESBL确证试验,117株肺炎克雷伯菌中有51株产ESBL,占实验菌株的43.60%。除亚培氨南与类洛培南外,产ESBL株对其余18种抗生素的耐药率均高于非产ESBL株。产ESBL菌对青霉素类及二代头孢的耐药率均接近100.00%;在三代头孢中,对头孢曲松的耐药率最高,达78.40%;氨曲南为62.70%,头孢西丁的耐药率为477.10%,头孢吡肟的耐药率为11.80%,环丙沙星的耐药率为38.80%,庆大霉素与阿米卡星的耐药率分别为80.40%和49.00%。与非产ESBL株相比较,除亚培氨南、类洛培南、氨苄西林、头孢吡肟外,其余16种抗生素的耐药率差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 实验菌株的多重耐药情况

在117株肺炎克雷伯菌中,有49株耐3种以上类型抗生素,占41.90%;其中75.50%为ESBL阳性株,24.50%为ESBL阴性株。

2.4 P FGE结果

酶切后的肺炎克雷伯菌染色体DNA电泳图谱可显示9~18条DNA条带,其分子量大小40~800kb,见图1。经FingerprintingⅡ软件分析,可大致将117株肺炎克雷伯菌分为3群,其中每一群又可细分为不同数目的亚群。如图2所示:A群包括12株肺炎克雷伯菌,群内相似度为38.03%;B群包括86株肺炎克雷伯菌,群内相似度为47.21%;C群包括16株肺炎克雷伯菌,群内相似度为55.65%;B群与C群的群间相似度为40.64%;B群、C群与A群的群间相似度为37.30%;另有3株肺炎克雷伯菌不能被分群。产ESBL肺炎克雷伯菌分散于各群之中,没有单独成群。

2.5 ES BL基因型检测结果

51株产ESBL肺炎克雷伯菌中,SHV型引物扩增阳性共15株,占29.40%;TEM型引物扩增阳性共39株,占76.50%;CTX-M型引物扩增阳性共9株,占17.60%。同时携带SHV、CTX-M基因者有19株,占37.30%;同时携带TEM、SHV、CTX-M 3种基因者为5株,占9.80%;同时携带TEM、CTX-M基因者有2株,占3.90%;未见同时携带有TEM、SHV基因的菌株。PCR产物电泳结果分别见图3~5。

3 讨论

肺炎克雷伯菌是临床感染菌中分离率较高的致病菌,也是造成医院感染的常见菌之一。本研究采用WHO推荐的K-B法测定了117株肺炎克雷伯菌对20种抗生素的敏感性。药敏结果显示,肺炎克雷伯菌对抗生素耐药性较高的5种依次为氨苄西林、哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛和复方新诺明;敏感性较高的5种抗生素依次为亚胺培南、美洛培南、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦和阿米卡星。在本次实验中,多重耐药菌占实验菌株的41.90%。由此可见,我院肺炎克雷伯菌的耐药状况非常严重,且表现为多重耐药。

由于第3代头孢菌素的广泛应用,近年来ESBL的检出率有上升的趋势。本次试验产ESBL菌株占实验菌株的43.60%,可见ESBL的产生已经成为细菌耐药的最重要机制之一。本研究结果显示,我院产ESBL肺炎克雷伯菌检出率与国内部分地区报道相近[4~6],但明显高于国外的平均水平(15.00%左右),可能与本地区第3代头孢菌素的广泛应用有关,此外,ESBLs阳性菌株呈现多重耐药;除亚胺培南、美洛培南、氨苄西林和头孢吡肟外,产ESBLs菌株对氨苄西林/舒巴坦等16种抗生素的耐药程度均高于非产ESBLs株。本实验中117株肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美洛培南均表现敏感,这可能与本地区尚未广泛使用亚胺培南有关,同时也说明碳青霉烯类药物对产ESBLs的肺炎克雷伯菌有良好的抗菌活性,但为了减少ESBL的产生,应严格控制第3代头孢菌素及其他广谱β内酰胺类抗生素的使用,对多重耐药株的用药应参考药敏试验结果,做到合理用药,以限制和减少ESBL阳性菌和多重耐药菌株的产生和播散。

耐药菌是由敏感菌株变异而来,变异机制有多种,最重要的是基因突变。PFGE通过低频率限制酶切割染色体DNA分子,若耐药突变导致酶切位点丢失或增加,使酶切片段长度发生改变,则DNA片段在凝胶中的迁移率就会发生相应变化,从而在电泳后呈现出基因组型的多态性;若突变发生在酶切位点之外,突变不足以改变相应DNA的分子大小,则PFGE的电泳图谱不会发生改变,是以肺炎克雷伯菌的耐药表型与PFGE基因分型结果可以表现一致,也可以表现为不同[7]。本次实验117株肺炎克雷伯菌大致可分为3群,3群细菌间的相似值为37.30%,产ESBL菌株和不产ESBL分散在各群之中,没有发现特异的ESBL条带,从而提示不存在由同一菌株所引发的医院感染。

不同的国家和地区由于抗生素使用的种类和数量的不同,所造成的抗生素选择性压力不同,相对应的ESBL流行类型也有所不同[8~14]。本研究结果显示,2006年5月~2007年5月,我院产ESBL肺炎克雷伯菌的基因型以TEM和SHV为主;同一菌株携带多个基因的现象较为普遍,这可能导致菌株的抗药性更强、耐药谱更广,大大增加了临床抗感染治疗的难度。

TEM-1是革兰阴性杆菌中最常见的β-内酰胺酶,主要介导细菌对各种青霉素和部分第1代头孢菌素耐药,而对第3代头孢菌素和酶抑制剂较敏感[15,16]。我院临床分离的51株产ESBLs肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率接近100%,其原因可能为我院以TEM-1流行为主。PCR扩增与DNA测序亦证实我院2004年的TEM-1的检出率达到76.50%。SHV型ESBL突变位点主要在238、240、179以及35等,其中238位点的突变最为普遍,蛋白质晶体结构分析表明,此点突变与TEM起源的ESBL一样,主要提高了酶对头孢噻肟的水解,而240和179的突变则主要提高了酶对头孢他啶的水解。本次试验,SHV型共15株,其检出率为29.40%,均显示对头孢噻肟有较强的耐药性。CTX-M系列酶是ESBLs家族中的新成员,其主要特征是对头孢噻肟水解能力较强,而对头孢他啶的水解能力很弱。CTX-M酶与TEM和SHV起源ESBLs的同源性不到40.00%,此类酶相互间氨基酸序列的差异性也较大[17],所以不能象TEM和SHV起源的ESBL那样使用一对特异性引物将其全部扩增,如本试验所设计的引物主要是针对扩增CTX-M-1、3、10、11、12、15。经PCR扩增,发现9株(17.60%)细菌具有CTX-M型基因,另外有少量产ESBL菌株,虽其表型符合CTX-M酶的特点,但PCR扩增阴性,其原因可能为存在本引物无法扩增的CTX-M基因型。

摘要：目的分析肺炎克雷伯菌的耐药现状,探讨其耐药型与基因组型间的关系,检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)各基因型的流行状况。方法用纸片扩散法检测117株肺炎克雷伯菌对20种抗生素的耐药情况。用PFGE实验探讨耐药表型与基因组型间的关系。用PCR扩增所有产酶株的TEM、SHV及CTX-M基因片段,分析ESBL各基因型的流行状况。结果肺炎克雷伯菌耐药情况严重,产ESBL肺炎克雷伯菌检出率达到43.59%。PFGE将117株肺炎克雷伯菌分为3群,群间相似度为37.30%,没有发现特异的ESBL条带。PCR扩增检出SHV型15株,占29.40%;TEM型39株,占76.50%;CTX-M型9株,占17.60%。同时携带SHV、CTX-M基因者有19株,占37.30%。结论该院肺炎克雷伯菌的耐药现象严重、多重耐药现象突出,ESBL检出率高。该次实验未发现由同一菌株所致的医院感染,肺炎克雷伯菌的耐药表型与PFGE基因分型结果可以表现一致,也可以表现为不同。产ESBL肺炎克雷伯菌的基因型以TEM和SHV为主,同一菌株携带多个基因的现象较为普遍。

基因型耐药检测 篇7

1资料与方法

1.1一般资料从本院2014年12月~2015年12月随机选取30例无症状Uu携带者作为本次调查研究的对照组 (均为女性) , 年龄3~72岁, 平均年龄 (39.2±10.5) 岁, 均无自觉症状;随机选取同期30例Uu感染者作为本次调查研究的观察组 (均为女性) , 均有自觉症状, 年龄2~70岁, 平均年龄 (38.7±10.3) 岁。两组一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2试剂与方法对两组研究对象均进行病史询问, 并且进行Uu筛查试验 (通过液体培养的方式) , 对于阳性标本进行复查, 最后作聚合酶链式反应 (PCR) 测定。

1.2.1主要试剂由法国梅里埃公司提供的Uu选择性液体培养基;由上海生工生物工程技术服务有限公司提供的Uu固体培养基;由深圳匹基生物工程有限公司提供的DNA定量测定试剂盒;由MBI公司提供的Taq DNA聚合酶;由上海生工生物工程技术服务有限公司提供的各种引物。

1.2.2实验方法首先将收集的标本接种, 然后将接种后的标本放置在液体培养基内, 并且保留初筛Uu阳性标本, 之后进行DNA模板提取, 对PCR进行荧光定量, 进行Uu基因分型检测, 并且分析其耐药性。

1.3统计学方法采用SPSS20.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计数资料以率 (%) 表示, 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1基因型检测结果观察组30例患者的基因型标本检测出:Uu阳性17例, 占56.67% (17/30) 。17例Uu阳性患者中, 基因型标本为单纯Uu阳性的有14例, 在整个Uu阳性中所占的比例为82.35% (14/17) 。另外, 对这14例单纯Uu阳性患者进行基因分群, 发现:属于生物2群的有2例, 占整个单纯Uu阳性患者的14.29% (2/14) , 属于混合感染的患者有9例, 占整个单纯Uu阳性患者的64.29% (9/14) , 属于生物1群的有3例, 占整个单纯Uu阳性患者的21.43% (3/14) 。

对照组30例携带者的基因型标本检测出:Uu阳性16例, 占53.33% (16/30) 。16例Uu阳性患者中, 基因型标本为单纯Uu阳性的有11例, 在整个Uu阳性中所占的比例为68.75% (11/16) 。另外, 对这11例单纯Uu阳性患者进行基因分群, 发现:属于生物2群的有1例, 占整个单纯Uu阳性患者的9.09% (1/11) , 属于混合感染的患者有3例, 占整个单纯Uu阳性患者的27.27% (3/11) , 属于生物1群的有7例, 占整个单纯Uu阳性患者的63.64% (7/11) 。

对照组生物1群基因型感染率高于观察组, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。

2.2多重耐药性检测结果对照组30例携带者的药敏试验结果显示:携带者对各类抗生素的耐药率几乎为0, 观察组患者对各类抗生素的耐药率均高于对照组 (P<0.05) 。观察组30例患者的药敏试验结果见表1。

3讨论

Uu是一种常见的支原体 (存在于女性泌尿生殖道中) , 主要表现为患者的泌尿生殖道发生炎症, 或者当患者的泌尿生殖道黏膜表面受损, 使得各种致病因素侵入患者的泌尿生殖道, 引发一系列的感染[3]。针对该病的发病机制, 有研究认为:在患者的免疫功能下降时 (或者泌尿生殖道黏膜表面受损) , 容易引发Uu的大量繁殖[4,5], Uu经患者的细胞入侵, 与原有的宿主细胞争夺必要的营养物质, 从而导致原有宿主细胞中的染色体发生变异, 最终影响机体蛋白质和DNA合成, 造成细胞凋亡, 病情严重者, 会导致死亡。

Uu基因型和多重耐药性的相关性研究, 需要利用PCR方法进行基因分型检测, 并且进行相应的耐药性检测, 另外, 由于女性生殖道菌群复杂, 容易受到外界危险因素的影响, 引发一系列的感染, 因此, 需要对泌尿生殖道支原体进行培养实验, 鉴定Uu阳性, 并且保证研究对象的科学筛选, 保证Uu阳性检测的准确率。本次调查研究随机选取30例无症状Uu携带者作为本次调查研究的对照组对象, 且随机选取30例Uu感染者作为本次调查研究的观察组对象, 对比性探究Uu基因型和多重耐药性的相关性, 其结果显示:对照组 (无症状Uu携带者) 基因型主要为:生物1群基因型单感染, 生物1群感染率明显高于观察组 (Uu感染者) (P<0.05) ;观察组基因型主要为:混合感染 (生物2群、生物1群中各基因型交叉感染) ;观察组对各类抗生素的耐药率均高于对照组 (P<0.05) , 这都充分的证明了Uu主要的感染类型为生物1群单型别感染, 而且混合感染的比例较低, 另外, 若滥用抗生素, 则会导致Uu的耐药情况加重, 需要对抗生素的应用加强监管, 同时, 在基因分型检测的过程中, 要保证检测样本的安全有效, 避免研究差错, 针对患者的实际情况, 探讨其多重耐药性, 综合分析、归纳、总结Uu基因型和多重耐药性的相关性。

总之, 生物2群、生物1群、混合感染等对各类抗生素的耐药性较严重, 存在多重耐药的现象, 需要通过各种方式, 进一步加强抗生素的应用监管力度, 保证Uu基因型和多重耐药性的相关性研究的科学性和准确性, 得出科学合理的Uu基因型和多重耐药性的相关性研究结果, 提升研究价值。

参考文献

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基因型耐药检测 篇8

河南农业大学药理实验室曾对鸭大肠杆菌氟苯尼考floR、β-内酰胺类、氨基糖苷类等耐药基因进行过检测和研究[5,6,7],在前期对鸭大肠杆菌分离鉴定与药物敏感性检测的基础上,本试验对鸭大肠杆菌四环素类及磺胺类耐药基因进行了检测,旨在了解各菌株携带的耐药基因的流行情况,为养鸭业大肠杆菌的感染防治提供理论参考,现将结果报道如下。

1 材料

1.1 菌株

菌株为河南农业大学药理实验室冻存的2013年从河南郑州、焦作、尉氏和信阳等地区鸭场分离的22株鸭大肠杆菌,从中选择8株对四环素类及磺胺类抗生素耐药的菌株。

1.2 培养基

MH肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、LB肉汤培养基、LB琼脂培养基,均购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.3 主要仪器

全自动细菌鉴定仪,购自法国生物-梅里埃公司;电子分析天平,购自梅特勒-托利多仪器有限公司;电泳仪,购自北京市六一仪器厂。

1.4 主要试剂

普通质粒小提试剂盒,购自TIANGEN公司;DNA Marker,购自宝生物工程(大连)有限公司;Taq Mix,购自北京康为世纪有限公司。

2 方法

2.1 细菌DNA模板的制备

取适量受试菌用普通质粒小提试剂盒提取质粒DNA。

2.2 引物的设计与合成

根据Gen Bank公布的相关基因设计以下引物,四环素类抗生素设计6对引物,磺胺类抗菌药设计7对引物,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,具体见表1、表2。

2.3 耐药基因的PCR扩增

PCR反应体系(总体积为25μL):Taq Mix12μL,模板DNA 1μL,上、下游引物各0.5μL,去离子水11μL,同时设阴性对照。PCR反应条件:四环素类耐药基因tet A、tet B、tet C、tet D、tet E、tet M为94℃预变性5 min;94℃变性60 s,57℃退火60 s,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃再延伸5 min,4℃预冷3 min。其余耐药基因的退火温度分别见表1、表2。

2.4 PCR产物的检测与分析

PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳,溴化乙锭染色,用凝胶成像系统摄像保存并观察结果。阳性PCR产物送北京华大基因公司测序,对测序结果进行BLAST比对分析。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增结果

以鸭源大肠杆菌质粒DNA为模板进行PCR扩增,获得tet A、tet B、tet C、sul1、sul2、dfr A5和dfr A17基因片段,经1.2%琼脂糖凝胶电泳,得到大小分别为210 bp、659 bp、418 bp、789 bp、722 bp、300 bp和475 bp的目的条带,与预期结果一致,见图1~3。

M.100 bp Marker;1.1号菌tet A基因;2.1号菌tet C基因;3.2号菌tet A基因;4.2号菌tet C基因;5.5号菌tet A基因;6.5号菌tet C基因;7.6号菌tet A基因;8.6号菌tet B基因;9.6号菌tet C基因;10.7号菌tet A基因;11.7号菌tet C基因;12.8号菌tet A基因;13.9号菌tet A基因;14.9号菌tet C基因;15.10号菌tet A基因;16.10号菌tet C基因。

M.DL-2 000 Marker;1.1号菌dfr A5基因;2.2号菌dfr A5基因;3.5号菌dfr A5基因;4.6号菌dfr A17基因;5.7号菌dfr A17基因;6.8号菌dfr A17基因;7.9号菌dfr A5基因;8.10号菌dfr A5基因。

3.2 耐药基因的检测

在所检测的13种基因中,四环素类耐药基因tet A、tet B、tet C的阳性检出率分别为100%、12.50%和87.50%;磺胺类耐药基因sul1、sul2、dfr A5、dfr A17的阳性检出率分别为25.00%、62.50%、62.50%和37.50%,临床分离菌耐药基因的携带情况见表3。

4 讨论

随着河南省养鸭业的快速发展,养鸭的规模日趋增大,但因养殖空间的局限,出现了饲养密度大、养殖条件低等一系列问题,加之管理不规范、环境污染,在一定程度上导致了鸭大肠杆菌病的过度发生[8]。故在现代养殖中,要做好平时的饲养管理,严格做好卫生工作,确保没有环境污染,尽可能消除各种诱发因素,创造一个良好的饲养环境,在一定程度上可以减少该病的发生,为养殖户创造更多的利润空间[9]。

本试验从22株临床分离的鸭大肠杆菌中随机选择8株对西环素类和磺胺类抗生素耐药的菌株,对四环素类及磺胺类耐药基因进行检测。结果显示,tet A、tet C、sul2、dfr A5等耐药基因的检出率较高,特别是tet A、tet C的检出率均达到85.00%以上,且出现了单一菌株携带多种耐药基因的现象。这些耐药基因的高检出率,与前期耐药性检测的高耐药呈正相关,原因与河南省乃至全国临床兽用抗菌药物的不合理使用或严重滥用有关,已呈普遍现象,此乃是加剧细菌耐药性发生的根本原因。为此,今后在临床用药时,要合理、规范地使用抗生素,不滥用、不随意应用抗菌药物,建议交替使用或联合用药[10];另外,提高养殖水平,采取综合防控措施,减少鸭大肠杆菌的暴发感染也是主要手段。

M.DL-2 000 Marker;1.5号菌sul2基因;2.6号菌sul1基因;3.6号菌sul2基因;4.7号菌sul2基因;5.9号菌sul1基因;6.9号菌sul2基因;7.10号菌sul2基因。

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在对四环素类耐药基因检测过程中,检测到了tet A、tet B和tet C耐药基因,检出率分别是100%、12.50%和87.50%。tet A耐药基因如此高的检出率,推测可能是该基因的质粒或转座子插入序列在菌株间传播导致的[11]。据报道[12,13,14],tet A基因是革兰氏阴性菌中最普遍存在的四环素类耐药基因。许瑞等[15]研究发现,四环素类耐药基因tet A的检出率高达100%。在对磺胺类耐药基因检测时发现,sul2、dfr A5的检出率较高,均是62.50%。据报道,太原地区鸡大肠杆菌磺胺类耐药基因sul2的检出率达32.1%[16]。本试验检测的四环素类及磺胺类耐药基因携带率比较高,究其原因可能是通过质粒或染色体进行了水平散播,有待深入研究加以证实。