大鼠脂肪肝模型的建立

大鼠脂肪肝模型的建立（精选八篇）

大鼠脂肪肝模型的建立 篇1

关键词：坐骨神经痛,动物模型

1 机械性压迫

1.1 铬肠线压迫

1990年Seltzer等[1]在动物麻醉的情况下, 用8-0的丝线将坐骨神经干结扎1/3或1/2, 然后检测动物疼痛行为的表现。现大鼠多采用劈开臀大肌切口暴露坐骨神经三根分叉部近端部分, 用4-0的铬肠线在1cm长的坐骨神经上结扎4道, 间隔1.0～2.0mm[2]。

1.2 椎间盘压迫

这种模型为模拟临床椎间盘突出的病理形式, 具体方法是将大鼠自体尾椎椎间盘组织 (纤维环和髓核) 取出后放置在L5背根节近端神经根和其下面椎体之间以直接压迫L5神经根[3], 操作中应避免对L5神经根或背根节造成损伤。

2 非机械性压迫

临床上发现有些患者的髓核并不突出, 但是神经根性的疼痛却非常剧烈。通过研究发现, 髓核本身的不同组织成分可能会影响神经根的结构和功能。这类非压迫的模型有。

2.1 髓核放置但不压迫

暴露L4～5椎板, 咬除L5棘突、一侧椎板、下关节突, 暴露L5背根节, 后将大鼠取出的尾椎髓核轻轻的放置在L5背根节近端并与神经根接触[4], 注意不造成机械压迫[5], 后逐层缝合伤口。

2.2 髓核混悬液注射

在大鼠尾椎取5个髓核并加入50μl的0.9%氯化钠溶液, 将其充分搅拌成混悬液, 以L4～5棘突间隙为穿刺点用9号腰穿针行硬膜外穿刺, 然后分别注射20μl的自体髓核混悬液及20g/L的利多卡因30μl[6]。

坐骨神经痛是一个复杂的病理过程, 诱因也多样。因此我们必须根据研究的方面来选择合适的动物模型, 这样才能做到更好的研究。随着科学的进步和人们对坐骨神经痛疾病发展的认识, 肯定会诞生出更加理想的模型。

参考文献

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大鼠脊髓损伤模型建立及评价 篇2

[关键词] 脊髓损伤 模型建立

引言

脊髓损伤是目前临床上多发且致残率较高疾病,给患者家庭、社会带来沉重负担。脊髓损伤患者生活质量明显低于正常人群[1]。脊髓作为人体低级反射中枢,其损伤直接影响到人体各器官、组织的正常生理功能。为此许多学者投入到了关于脊髓损伤的研究中,研究发现中枢神经损伤后仍具备一定的再生能力。为了找寻更好的治疗方法,标准的、可重复性高的动物模型建立尤为重要。近年来在脊髓损伤模型建立方面已有很大进展,在此回顾常用的脊髓损伤模型建立方法并进行相应评价。

Allen’s造模法

早在1911年,Allen应用重物下落敲击的方法制备出脊髓损伤动物模型[2]。实验过程中,可分别通过对重物重量、重物下落高度及损伤截断的调整而制作出不同程度、不同类型的损伤模型,由于该种方法具有最大限度的模拟现实损伤情况,不破坏硬脊膜以防止外源性物质进入脊髓内部形成干扰,避免手术过程中脊髓外露和脑脊液渗出等诸多优点[3],一直被沿用至今,但因该方法对于损伤程度、损伤位置等具有不定性,脊髓模型的严格标准性无法达到而存在着相应的不足。随着研究的推进,相继出现了一些Allen’s造模法的改良方法。

1 将打击头置于硬膜上,打击头与重物连接,并用重锤线调节引导玻管后进行敲击[4]。敲击过程中,由于引导玻管及重锤线的调节大大增加了中午落下时位置的准确度。但是也有其不足之处。首先打击头提前置于硬膜上,会造成脊髓实验预想之外的充血损伤;再者,打击头与重物相连接,之间的连接线会影响重物落于打击头的位置,从而出现偏差,易造成不同角度偏瘫;除此之外,此装置在敲击完成时不易做到迅速挪走重物,从而造成脊髓的进一步压迫性损伤。

2 在显微操作条件下,选用直径相同的重物与引导玻管对WD法进行改良,并采用标准型方丝弓槽作为打击垫片[5]。此种改良方法克服了许多不足之处,显微操作环境保证了整体操作过程的准确性,对于相同直径重物与引导玻管的选择,限制了重物在下落过程中偏离,标准型方丝弓槽打击垫片更是克服了敲击过后不能及时挪开重物而造成的损伤这一问题。此法的不足则在于引导玻管与大鼠脊髓暴露处的瞄准不够精细而易发生偏差。

3 除以上应用改良敲击装置造模外,还有许多学者根据Allen’s实验原理制作出精准度大大提高的仪器。Falconer等[6]将大鼠四肢固定于手术台上,应用立体定位仪固定大鼠头部,从而方便移动大鼠头部以调节脊髓位置。仪器包括重物、透明塑料管、铜包衣垫片以及控制重物与垫片并包绕铜线圈的三个电极,电子操纵单位、激光发生器与探测器、换能器等。首先应用电磁极将重物与垫片置于预期位置,将手术暴露脊髓的大鼠放于垫片下,点击开始按钮后,电磁极电磁消失重物沿管道迅速下落,下落过程中有两处激光透过管道小孔进行检测,探测重物下落方位,最后重物落于垫片上打击脊髓,在撞击力最大的一刹那激活第二、三电磁极和换能器,将重物与垫片迅速吸引开,防止进一步的压迫性损伤发生。该种方法可以说将Allen’s造模方法最大限度的完善。但也仅是对脊髓敲击做到了完美,人類的现实损伤情况下破坏的椎骨对脊髓造成的压迫性损伤难以模拟。

脊髓半横断造模法

脊髓损伤在临床高发,越来越多脊髓半横断的病例出现,但对于脊髓半横断动物模型的建立却并不多见,为此,许多学者开始了此类模型建立的研究。

成功动物模型的建立应具备准确性、可重复性高等特点,基于该点考虑脊髓半横断的模型建立更具难度。

1 打开大鼠选定节段处锥板,使用锐利的虹膜刀片半横断脊髓,并用玻璃针吸出损伤脊髓组织[7,8]。该种做法出血少操作方便,故大多研究人员选用此法,但是存在着脊髓去除不完全、易损伤另一半脊髓的不足之处。

2 选择合适器械从右侧椎板开始一次剔除右侧锥板、右侧关节突、棘突直至少量左侧脊髓暴露为止,由后正中沟向右垂直刺入并与脊髓垂直方向向右侧横行切断脊髓,最后自中线向外侧作一次横旋切,以确认半切完全。操作过程在显微环境下进行[9]。显微环境下可以相对准确的找准脊髓正中的位置,进行操作,并为了达到半切完全进行了最后一次横旋切,整体过程精细,该法制作调理清楚,但也存在一些细微的问题,纯手工操作进行椎骨剔除易出现周围组织损伤和不同手术个体的差异性。

3 针对椎骨的打开方法,有些研究者进行了改良。用组织剪划断两侧棘突与锥板交接处,用组织钳将选定棘突向右侧翻起[10]。运用该方法可使锥板剔除标准化,但其采用刀尖冠状面刺入脊髓腹侧,刀尖顺时针旋转左侧直接横断脊髓与上一方法比较又具有半切不完全的不足。

4 为了尽可能的保护硬脊膜的完整性,可以在脊髓半横断完全后对硬脊膜进行缝合处理[11]。这一操作减少了不必要的损伤,但由于伤口小,缝合难度大,使模型建立更加复杂。

5 脊髓半横断的损伤范围的准确把握是操作的难点,林斌珍[12]等运用自制的“脊髓半横断定量刀片”进行实验操作,将该刀片从后正中沟垂直插入,直抵对侧硬脊膜,之后以此为界进行限定脊髓组织切除。这一过程使操作更加标准化,值得学习,但对于对侧硬脊膜的损伤不易控制。

脊髓半横断整体上创伤小,出血较少,继发反应轻,适用于放置移植物或观察药物对脊髓再生作用的实验研究,国内许多学者均采用此种造模方法,但目前脊髓半横断方法局限,更加理想的方法仍有待研究。

脊髓完全横断造模法

为了避免脊髓半切模型建立的复杂性和应用脊髓损伤模型研究治疗药物症状的典型性,许多研究者也选择脊髓的安全横断造模法。

1 用小尖刀将脊髓在节段完全横断,反复切割3～4次并抬起断端确定脊髓完全横断[13]。此方法注重脊髓的离断完全,但是由于反复切割并提起断端会对动物造成很大损伤,不利于实验动物的存活。

2 用自制的银针钩从脊髓腹侧穿过, 挑起脊髓,用显微剪剪断脊髓, 银针自然脱出即可, 然后横断处尾端切除2mm[14]。使用银针操作避免了大范围不必要的损伤,但针对横断处尾端切除2mm,虽确保了离断完全,但是在操作过程中对于不必要损伤的避免给实验增加了难度。

3 李云等[15]手术去除棘突锥板,使选定节段处脊髓暴露,划开硬脊膜,提起硬脊膜并在硬脊膜下方穿过10-0丝线,显微剪横断脊髓后,将丝线提起,以确保横断完全。这种方法在离断脊髓过程中保证离断彻底的前提下尽量避免了损伤,但对于划开硬脊膜及硬脊膜下穿线过程的创伤避免仍需改进。

脊髓完全离断这一模型建立方法的重点在于避免实验预期以外的损伤条件下做到选定节段脊髓的离断彻底。

参考文献:

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[2] 张红,刘维钢,黄瑾,等.大鼠脊髓完全性损伤模型的建立[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(33):6540—6543.

[3] 虞琴,徐娟.大鼠脊髓半横断损伤对脊神经节P物质表达的影响[J].解剖学研究,2008,30(1):8-14.

大鼠脂肪肝模型的建立 篇3

试验选用高脂饲料诱导SD大白鼠高脂血症及脂肪肝,为研究高脂血症对SD大白鼠的代谢调节试验提供试验动物模型。

1材料

1.1试验动物

SD大白鼠,SPF级,20只 ( 雌雄各半) ,体重为170 ~ 200 g,由北京军事科学医学院提供。

1.2试剂和仪器

胆固醇试剂( 生产批号为20120618) 、胆酸钠试剂( 生产批号为20120528) ,安徽天启化工科技有限公司生产; 轮转式切片机( 型号为YD - 1508A) ,浙江金华益迪医疗设备厂生产; 全自动生化仪( 型号为7160) ,日本Hitachi High - Technologies Corporation公司生产; 显微镜( 型号为CX21FS1) ,日本OLYMPUS公司生产; 电子天平( 型号为HZT - A200) ,福州华志科学仪器有限公司生产。

1.3高脂饲料

高脂饲料由猪油( 4. 0% ) 、胆固醇( 2. 5% ) 、胆酸钠( 0. 7% ) 、普通混合饲料粉( 92. 8% ) 组成。先人工充分混匀,再经搅拌压成圆条状颗粒,真空包装后经辐照、消毒,备用,由内蒙古金宇保灵生物药品有限公司加工制作。

2方法

将SD大白鼠随机分为对照组、高脂模型组,每组10只( 雌雄各半) 。对照组饲喂普通饲料,高脂模型组饲喂高脂饲料,平均每天每只饲喂约20 g。动物造模30 d,试验结束前1 d晚上禁食,自由饮水,次日对SD大白鼠心脏采血,分离血清,- 20 ℃保存,由北京华英生物技术研究所检测大白鼠血清TG、总胆固醇( TC) 、高密度脂蛋白( HDL - C) 、低密度脂蛋白 ( LDL - C) 和胆汁酸指标。

取肝脏,称量湿重,计算肝脏指数,并在肝右叶离边缘1 cm处横切一块肝脏组织,并用10% 中性福尔马林溶液固定,常规脱水,苏木精 - 伊红染色( H. E. 染色) ,制作肝脏病理切片并观察。

肝脏指数( % ) = 肝脏湿重/体重 × 100% 。肝脏指数表示肝脏内部蓄积脂肪的程度,肝脏指数越大说明肝脏内部蓄积脂肪的程度越高。

应用SPSS 17. 0统计学软件对试验数据进行处理。

3结果与分析

3.1SD大白鼠血脂的变化

饲喂高脂模型组SD大白鼠高脂饲料30 d后,与对照组相比,高脂模型组血清TC、LDL - C含量极显著升高( P < 0. 01) ,高脂模型组血清HDL - C含量极显著降低( P < 0. 01) ,结果见表1。

3.2SD大白鼠体重及肝脏指数的变化

将摘取的肝脏用滤纸吸去表面组织液,在电子天平( 型号为HZT - A200) 上称其湿重,观察肝脏表面有无病理变化,计算肝脏与体重的比值[5]。

mmol· L- 1

注: 同列数据肩标**表示差异极显著( P < 0. 01) 。

于试验结束后,高脂模型组SD大白鼠体重略低于对照组,肝脏湿重略高于对照组,高脂模型组SD大白鼠肝脏指数极显著高于对照组( P < 0. 01) ,结果见表2。

注: 同列数据肩标**表示差异极显著( P < 0. 01) 。

3.3SD大白鼠胆汁酸的变化

胆汁酸是胆汁的主要成分,是一类胆烷酸的总称,以钠盐或钾盐的形式存在,在脂肪代谢中起重要作用[6]。机体的胆固醇经摄入和合成就不能再氧化分解,只能直接或间接排出体外,因此促进胆固醇向胆汁酸的转化和排泄是降低血胆固醇水平重要的可行途径之一[7,8]。

于试验结束后,高脂模型组SD大白鼠胆汁酸含量极显著高于对照组( P < 0. 01) ,结果见表3。

μmo L·L- 1

注: 同列数据肩标**表示差异极显著( P < 0. 01) 。

3.4SD大白鼠肝脏病理学变化

3. 4. 1肉眼观察结果对照组肝脏无异常变化,见235页彩图1。30 d后,高脂模型组肝脏体积明显增大,包膜紧张,部分肝脏呈奶黄色,切面油腻,见235页彩图2。

3. 4. 2显微镜观察结果病理组织学检查结果表明,对照组SD大白鼠肝小叶结构正常,肝索排列规则,肝细胞大小均匀一致,细胞核呈圆形,形态规则, 大多数肝细胞有1个细胞核,部分可见双核。汇管区无炎症细胞浸润及纤维组织增生,肝窦清晰可见,见235页彩图3。高脂模型组大多数SD大白鼠肝小叶结构轮廓基本消失,肝细胞形态不规则,大部分肝细胞肿胀呈气球样变,并可见肝细胞空泡变性,部分肝细胞发生溶解性坏死,见235页彩图4。

4讨论

试验用高脂饲料成功复制了SD大白鼠高脂血症及脂肪肝模型,与对照组相比,高脂模型组血清TC、LDL - C含量极显著升高 ( P < 0. 01 ) ,高脂模型组血清HDL - C含量极显著降低( P < 0. 01) 。严重的肝细胞变性可导致部分动物出现不同程度的肝细胞坏死。高脂模型组SD大白鼠肝脏体积增大,重量增加,质软、切面油腻为奶黄色。肝脏湿重略高于对照组,高脂模型组SD大白鼠肝脏指数、胆汁酸含量极显著高于对照组( P < 0. 01) 。试验中,高脂模型组SD大白鼠体重减轻,与其形成严重脂肪肝后影响采食量有关。

5结论

高脂血症会使TC、LDL - C含量升高,能够降低HDL - C含量,高脂血症在一定时间会导致脂肪肝, 导致肝脏脂肪变性甚至坏死。SD大白鼠血清胆汁酸的升高可能在高脂血症的发生、发展中起到一定作用,对脂代谢紊乱进行早期的干预有可能预防心血管事件的发生,检测高脂血症血清胆汁酸含量对评估高脂血症的预后和疗效具有一定价值。

参考文献

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建立湿热泄泻大鼠模型初探 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

健康SPF级大鼠20只, 体质量200±10g, 雌雄各半。由湖南中医药大学动物实验室提供, 合格证号湘SCK-011。

1.1.2 试剂

大肠杆菌cmcc (B) 44102湖南省药品检验所提供;2.4.6-三硝基苯磺酸, 购于北京舒伯伟公司, Sigma公司生产;无水乙醇, 10%甲醛, 水合氯醛, 液体石蜡, 生理盐水等提供。

1.13仪器

佳能数码照相机, 放大镜, 光学显微镜及摄像系统 (日本O LY M P U S荧光显微镜) 、轮转式切片机Y D-1508R, 德国Leitz2145;全自动组织冷冻包埋机YD-6L, 浙江金华益迪医疗设备厂等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备

将SD大鼠20只随机分为正常对照组、湿热型腹泻模型组共2组, 每组10只。正常对照组:普通饲料饲养, 自然环境 (湿度控制在40%～60%, 温度在22～25℃) 。造模方法参照综合因素造模实验方法加以改进, 湿热泄泻模型:先以高糖高脂饲料 (在普通饲料中混入12%猪油, 8%蜂蜜) 饲料喂养10d, 然后将大鼠置于置于造模箱 (电暖器控制温度 (32±2) ℃, 加湿器控制相对湿度90～95%, 2次/d, 3h/次) , 并灌服枝江大曲 (52度, 2mL/200g, 1次/d) , 共7d;连续3d后以大肠杆菌 (1.0×109/mL) 灌胃 (2mL/只) , 24h后再灌胃1次, 在自然环境下喂养1d。

1.2.2 指标观察

(1) 观察模型大鼠腹泻指数, 并与空白组比较, 腹泻指数有差异认为腹泻模型制备成功; (2) 湿热泄泻证的临床症状表现, 观察大鼠一般情况; (3) 肠道病理改变与目前模型研究结果是否基本一致来判断湿热泄泻模型制备成功。

1.2.3 肠道病理切片

给药第3天, 大鼠禁食24h, 用10%水合氯醛麻醉, 固定, 剖开腹部, 取回肠以及回盲部至乙状结肠部分, 纵向剪开, 用生理盐水冲洗干净, 并将肠黏膜向上平铺, 用大头针固定, 肉眼观察肠黏膜损伤情况。病变严重的地方剪取Icmx Icm小肠和结肠, 10%甲醛固定后, 送检。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察的比较

造模前各组大鼠皮肤光滑亮泽, 饮食正常, 善打斗, 喜活动, 活动敏捷自如。模型大鼠一般表现为:入高温仓后肛温有一定程度的升高, 为37.6～38.0℃, 出现毛发蓬松、蜷缩懒动以及食欲不振, 但无其他明显变化;在灌胃大肠杆菌4h后, 肛温达到了峰值39.5℃左右, 随后逐渐下降至38.4℃左右, 绝大部分大鼠出现饮水量和尿量减少, 肛门红肿充血或肛门扩张等症, 大部分出现大便稀软或溏泻, 有部分出现黏液脓血便, 舌苔白腻或黄腻。

2.2 大鼠湿热泄泻模型腹泻指数

实验结果显示, 湿热泄泻模型组腹泻指数为1.08±1.2 (χ—±s) , 空白对照组组腹泻指数为0, 两组比较有显著差异 (P<0.01) 。

2.3 大鼠肉眼观察肠道黏膜损伤情况的比较

正常组大鼠小肠、结肠组织结构清晰, 肠黏膜上皮完整、连续, 腺体排列规则、分泌功能活跃。湿热泄泻模型组大鼠几乎全部出现弥漫性的肠道黏膜充血、水肿, 并有大量黏液渗出, 部分大鼠肠管局部有小出血点, 这些病变以十二指肠、空肠、回肠和乙状结肠、直肠明显。

2.4 大鼠肠道黏膜损伤光镜观察情况的比较

两组大鼠小肠、结肠常规病理HE染色结果显示:正常组大鼠肠道组织结构正常, 绒毛排列整齐, 肠腺轮廓清晰 (图1) 。模型组大鼠小肠绒毛脱落显著, 可见小肠绒毛上皮细明显肿胀, 甚至出现部分坏死或脱落;肠腺变性明显, 黏膜下层有轻微充血, 严重水肿, 有少量炎性细胞浸润 (图2) 。正常组大鼠黏膜上皮及腺管排列整齐, 极向明显, 杯状细胞较丰富;间质没有见明显的充血水肿 (图3) 。模型组大鼠黏膜下出现明显充血水肿, 隐窝、肠腺及间质内可以见到大量急性炎细胞浸润 (图4) 。

3 讨论

湿热泄泻动物模型是一种“病”和“证”的模式结合, 要求同时具有腹泻引起肠道的病理生理改变, 同时还要有湿热证的特征。因此, 在中医证本质尚未探明之前, 我们应该至少保证所研制的中医证候动物模型尽量在病因、病机、体质以及症状体征等方面与人类疾病保持一致, 尤其是在病因和症状体征方面应该要保持一致[1]。因此, 在模型的制作思路上, 一般用肥甘饮食来损伤脾胃, 造成内湿形成, 再用外环境来模拟外湿因素。正如清代温病学家薛生白所说“太阴内伤, 湿饮停聚, 客邪再至, 内外相引, 故病湿热。”而且膏粱厚味的食物容易内蕴发热, 损伤脾胃, 如《素问·奇病论》所说:“肥者令人内热”。《脾胃论》指出::“饮食失节, 甘肥过度, 脾胃乃伤”。酒在湿热证的形成中也有重要意义。如《证治准绳》认为“夫酒者, 气味俱能生湿热”, 叶天士在《温热论》中指出:“有酒客里湿素盛, 外邪入里, 里湿为合。”

根据薛生白所述“太阴内伤, 湿饮停聚, 客邪再至”, 湿热泄泻证的主要病因除肥甘、白酒饮食及外在湿热环境等“内、外湿”因素, 更应重视生物致病因子的影响。因此, 仅根据中医传统理论模拟“内湿”、“外湿”还不足以形成“湿热泄泻”[2]。明代医家吴又可说:“夫温疫之为病, 非风、非寒、非暑、非湿, 乃天地间别有一种异气所感”, 提出了“疠气”致病说, 所谓“疠气”实际相当于现代传染病学所说的病原体, 如细菌、病毒、原虫等;这就提示了我们在复制湿热证模型时, 也应该要重视生物致病因子的应用。所以现代很多医家研究认为“外湿+内湿+生物致病因子”能较好地模拟温病湿热泄泻证的病程。

有医家研究[3,4,5,6]认为以饮食因素加气候环境因素, 再加上鼠伤寒沙门氏菌感染的综合因素实验方法造模所复制的湿热泄泻模型比较理想。莫日根等[7]温病研究湿热证造模方法如下:大鼠在自然环境, 给予高糖高脂饲料到10d时, 放入造模箱 (温度35℃, 相对湿度95%) , 72h后鼠尾静脉注射大肠埃希氏菌lmL/200g体质量;感染大肠埃希氏菌3h后, 移出造模箱放置在自然环境, 再常规饮食饲养。慕湖等[8]先以高糖高脂饲料喂10d, 然后将大鼠放置于高温仓 (温度35℃, 相对湿度85%) , 每天持续8h, 连续3d后以产毒性大肠杆菌 (109/mL) 灌胃 (2mL/只) , 24h后再灌注1次;有大部分的动物出现食欲不振, 肛门红肿充血, 模型组2/3的大鼠出现便溏。并研究发现血清白细胞介素-1、2、6含量升高可能为大肠湿热证的客观指标。李学等[9]运用同样的造模方法复制成大肠湿热证模型, 发现此模型除了大部分出现便溏外, 其舌苔白腻或黄腻, 而且大肠有明显的病理改变, 由此可以认为此型大肠湿热模型的复制是较为成功的。

我们根据湿热泄泻证的中医经典理论依据, 结合目前“外湿+内湿+生物致病因子”综合因素复制湿热泄泻模型大鼠研究方法的优势, 使用高糖、高脂、白酒饮食因素作为内因, 高湿高热造模箱作为外因, 复制湿热证模型, 再使用致泻性大肠杆菌作为生物致病因子, 复制湿热泄泻证模型。从造模结果来看, 模型大鼠既有腹泻病的特点, 也有毛发蓬松、食欲不振、蜷缩懒动、肛门红肿充血或肛门扩张, 大便稀软或溏泻和或黏液脓血便以及舌苔白腻或黄腻等湿热泄泻证的特点, 对模型组大鼠小肠、结肠肉眼及病理切片检测发现其病理改变与目前许多医家研究是一致的。也一定程度说明了腹泻指数, 肠道病理改变, 以及出现湿热泄泻证临床特征3个方面可以作为湿热泄泻证模型的判断指标。

摘要：建立科学可靠的湿热泄泻动物模型是进行湿热泄泻发病机理研究的基础和前提, 本文将从古今医家对于湿热泄泻理论研究探讨复制湿热泄泻大鼠动物模型的理论基础及方法, 建立改良的造模方法, 并从腹泻指数、临床症状、病理切片3方面探讨建立湿热泄泻大鼠模型的客观指标。

关键词：湿热泄泻,大鼠,模型,实验研究

参考文献

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[7]莫日根, 韩雪梅, 史圣华.蒿芩清胆汤对温病湿热证动物模型影响的实验研究[J].中医研究, 2006, 19 (6) :13.

[8]慕湖, 魏连波, 罗炳德, 等.大肠湿热证模型大鼠血清部分白细胞介素含量的变化[J].中国中西医结合消化杂志, 2003, 11 (5) :163.

大鼠脂肪肝模型的建立 篇5

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)是一种多功能的复合酶,是合成脂肪酸的关键酶,与体内脂质代谢密切相关。高脂、高糖饮食中的脂质以脂肪酸的形式被肝脏摄取,使肝脏三酰甘油(Triglycerides,TG)合成增多,容易形成脂肪肝[3]。然而国内外对非酒精性脂肪肝形成中FAS表达改变的研究结果迥异[4,5,6,7],还需深入研究。

沉默信息调节因子2 相关酶1 (silent informa-tion regulator 2/sirtuin1,Sirt1)是在哺乳动物细胞中发现的与酵母沉默信息调节因子Sir2 同源性最高的同系物,是一类尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的脱乙酰基酶,与代谢综合征的发生密切相关。Sirt1参与体内许多生理功能的调节,包括众多基因转录、能量代谢以及细胞衰老过程的调节,尤其在糖和脂代谢中发挥重要作用[8]。目前,国内外关于非酒精性脂肪肝中Sirt1 的表达也引起越来越多的重视[9,10]。本研究用高脂、高糖膳食复制大鼠非酒精性脂肪肝模型,并研究该模型动物中肝脏FAS和Sirt1 的表达。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级Wistar雄性大鼠20 只,初始体重(170±10)g,购于上海西普尔- 必凯实验动物公司,分为正常组(基础饲料)和模型组(高脂、高糖饲料)。基础饲料由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供;高糖、高脂饲料由60%基础饲料、17.5%猪油、8%蔗糖、10%鸡蛋黄粉、4%酪蛋白、0.5%牛胆盐配制而成。基础饲料供能比为:蛋白质26.48%、脂肪10.19%、碳水化合物63.33%,共12.96 k J/g。高脂高糖饲料供能比为:脂肪54.22%,蛋白质18.33%,碳水化合物27.45%(19.65%淀粉,7.8%蔗糖),共17.09 k J/g。喂养时间为13 周,期间每天观察大鼠饮食、粪便,记录每天进食量及每周体重。实验结束后,每组取3 只大鼠做肝脏病理检测和油红O染色,另外7 只大鼠断头处死后分离血清行相关指标测定,肝脏取出后液氮速冻并置于-80℃冰箱冷冻保存待用于后续实验。

1.2 试剂

总胆固醇(total cholesterol,TC)、TG试剂盒购自北京中生北控生物科技公司,SYBR green-based实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒购自大连Ta Ka Ra公司,Sirt1 抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗购自英国Abcam公司,FAS抗体购自美国Cell Signaling公司,β-actin抗体和油红O试剂购自美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 能量利用率计算由于基础饲料和高脂、高糖饲料的能量密度不同,故将食物摄入量换算为能量摄入量,再按公式算出能量利用率。能量利用率(%)= 体重增量(g)/ 同期热能摄入量(kcal)×100。1.3.2 血清及肝脏TC、TG检测血清TC、TG的测定严格按照相关试剂盒说明书进行操作。将肝脏与异丙醇1∶9 匀浆,4℃静置48 h,3 000 r/min离心15 min,取上清液进行肝脏TC、TG测定。

1.3.3肝组织苏木精- 伊红染色(hema-toxylin-eosin staining,HE)和油红O染色动物过夜禁食12 h后,4%多聚甲醛灌注固定,取固定好的肝脏组织进行常规HE染色。对于油红O染色,先配置油红O饱和液,即0.5 g油红O充分溶于100 ml异丙醇中,按饱和液与水3∶2 的比例配制成染液。取肝脏组织行厚度为8μm的冷冻切片,染色20 min,苏木素复染核25 s,1%盐酸分化后用流水冲洗反蓝,甘油明胶封片后镜下拍照观察。

1.3.4 实时逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,Real-time RT-PCR) 实验使用Trizol提取肝脏总RNA,严格按照SYBR green-based q RT-PCR试剂盒说明书在ABI-7900HT机器上进行实验。管家基因GADPH作内参,结果用2-ΔΔCt方法计算。引物设计如下:GADPH正向引物:5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3',反向引物:5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3';FAS正向引物:5'-GGACGGAGGTATCAA-3',反向引物:5'-CGGAACCACTCACAC-3';Sirt1 正向引物:5'-TTC AGAACCACCAAAGCG-3',反向引物:5'-CAGCAAG GCGAGCATAAA-3'。Real Time PCR反应条件为:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,共40 个循环,60℃继续延伸30 s,增加一个熔解曲线。

1.3.5 Western blot实验将肝脏组织切成小块用无线电免疫沉淀(radio-immunoprecipitation assay,RIPA) 裂解液[1% Triton X-100,1%脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate,SDS)]充分匀浆裂解提取总蛋白。上样前每个样本取等量蛋白与2×SDS样品缓冲液混合,100℃孵育5 min,行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。0.1% Tween-20 和5%脱脂奶粉的封闭液中孵育过夜。次日在室温下一抗孵育2 h,洗脱缓冲液洗涤3 次后用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h,洗膜后加增强化学发光法(enhanced chemiluminescence,ECL) 试剂在Western blot检测系统下检测条带,用Quantity One 4.62 软件对条带进行分析,以目的条带和 β-actin条带灰度值的比值作为检测结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用t检验,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况、体重及能量利用率比较

喂养中、后期正常组大鼠灵活好动,皮毛光泽整洁,体重持续小幅增长;模型组大鼠行动迟缓,毛发杂乱,体重持续快速增长。喂养结束时,两组大鼠体重比较差异有统计学意义。根据实验期间动物体重增量及同期热能摄入量算出能量利用率,结果表明,模型组大鼠能量利用率显著高于正常组(P =0.000)。见图1、2。

2.2 血清和肝脏TC、TG含量

模型组大鼠血清及肝脏TC、TG水平显著高于正常组(P <0.05)。见附表。

2.3 两组大鼠肝脏HE和油红O染色

HE染色光镜下显示,正常组大鼠肝细胞排列紧密,细胞核位于细胞中央,核大而圆;模型组大鼠肝细胞排列疏松,肝细胞中出现很多大的脂滴(见图3A)。肝脏做冷冻切片后进行油红O染色,结果显示,正常组大鼠肝脏未见中性脂肪沉积,模型组肝脏中可见较多较大的脂滴聚集(见图3B)。

(n=7,±s)

2.4 肝脏的FAS、Sirt1 m RNA及蛋白的表达

Real-time RT-PCR和Western blot结果显示,模型组大鼠肝脏中FAS m RNA和蛋白水平显著低于正常组(P =0.015 和0.008);模型组大鼠肝脏Sirt1m RNA水平与正常组比较,差异无统计学意义(P =0.599),但蛋白水平明显低于正常组(P =0.012)。见图4、5。

1)与正常组比较,P=0.008;2)与正常组比较,P=0.012

3 讨论

脂肪肝(fatty liver disease,FLD)是世界范围内最常见的一种肝病,分为酒精性脂肪肝与非酒精性脂肪肝。后者的病因可分为营养性(肥胖)、代谢性(低脂蛋白血症)、内分泌性(糖尿病、高脂血症)等。随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变,肥胖、高脂血症和糖尿病已成为非酒精性脂肪肝的最主要病因。

目前认为NAFLD的发病与胰岛素抵抗、脂质代谢异常、氧化应激及脂质过氧化等因素有关,其中脂质代谢异常被认为是NAFLD发病机制中最关键,也是最基础的环节之一,但具体机制尚未阐明。脂肪肝如果长期得不到有效治疗就可能发展成脂肪性肝炎,甚至是肝硬化、肝癌,但是目前脂肪肝治疗尚无特效药,所以脂肪肝重在预防。因此,对非酒精性脂肪肝形成机制进行研究,从而发现有效的预防措施非常重要。

本研究结果显示,模型组大鼠的体重、能量利用率及血清脂质含量高于正常组,肝脏TC、TG的沉积也显著高于正常水平。从肝脏HE和油红O染色可以观察到模型组大鼠肝脏严重脂肪变性,而正常组大鼠肝细胞形态正常,未见脂质沉积,说明高脂、高糖饮食造成大鼠肝脏脂质代谢异常。

脂肪酸合成酶是体内合成脂肪途径中一个关键酶,其表达上升是对内源性脂肪酸合成和细胞增殖的适应。FAS表达活性增高的意义在于满足细胞对能量需求和增殖条件下形成细胞膜脂质的需要[11,12]。作为成脂基因的FAS,随着脂类物质摄入的增多,FAS的表达往往显著升高。国内外很多研究表明,非酒精性脂肪肝大鼠的肝脏FAS在其他调控基因的作用下表达上调[4,5],从而参与高脂饮食大鼠非酒精性脂肪肝形成。本研究在实验设计时也将模型组FAS表达上升作为预期结果之一,但最后却得出相反的结论,与王玉明[6]和曹瑞等[7]的结果类似。其研究发现高脂摄入显著降低大鼠肝脏FAS m RNA及蛋白表达水平,认为肝脏脂质的蓄积并非由提高脂肪酸和TG合成相关酶活性引起,可能与脂肪酸 β氧化活性降低有关。本研究认为,模型组大鼠肝脏FAS表达降低是机体对高脂、高糖饮食的适应性调节,提示肝脏脂质沉积可能不是通过FAS表达增多引起的,但尚需更深入的研究和更多的理论支持。

Sir基因家族(Sirt1-Sirt4)在酵母中首次被发现,Sirt1 是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶,可促进脂肪动员,降低脂肪沉积,还有延缓衰老、抑制增殖、增加胰岛素分泌等作用。SUN等[13]用棕榈酸处理肝脏细胞使其产生胰岛素抵抗后,Sirt1 的表达随之降低,而通过基因转染使其高表达Sirt1 后可改善细胞的胰岛素抵抗状态。庞婧等[14]用油酸干预肝细胞生长后发现,油酸可导致三酰甘油在肝脏中的蓄积和影响肝细胞的胰岛素敏感性,而这些改变很可能是通过下调Sirt1 来实现。袁媛等[15]研究发现,高脂组小鼠脂代谢异常且肝脏Sirt1 蛋白表达水平下降,而Sirt1 激活剂白藜芦醇可改善肝脏的脂代谢功能,其机制可能与促进肝脏Sirt1 表达有关。白藜芦醇是一种Sirt1 有效激活剂,可以用过刺激Sirt1的表达及影响其活性而发挥对机体的保护作用[16]。也有研究表明,白藜芦醇能抑制非酒精性脂肪肝的形成[17]。本实验证实NAFLD大鼠肝脏Sirt1 蛋白低表达,提示抑制Sirt1 表达可能使其不能发挥促进脂肪消耗及改善胰岛素抵抗的作用,从而导致非酒精性脂肪肝的形成。但本研究仅仅探讨非酒精性脂肪肝形成中Sirt1 表达的变化,为以后进一步的研究奠定基础。

大鼠脂肪肝模型的建立 篇6

1 材料与方法

1.1 主要材料

雄性Wistar大鼠60只, 体质量160~200g, 吉林大学动物实验中心, 许可证号:SCXK- (吉) 2003-0007。多烯磷脂酰胆碱胶囊由北京安万特制药有限公司提供, 批号:国药准字H20059010;解毒健脾通络饮由枳椇子、白术、姜黄、丹参等中药组成, 长春中医药大学附属医院药剂科提供。

1.2 方法

1.2.1 模型

将Wistar大鼠随机分为4组, 分别为解毒健脾通络饮治疗组 (A组) 、多烯磷脂酰胆碱对照组 (B组) 、模型组 (C组) 及空白对照组 (D组) , 每组20只。D组大鼠每天给予标准大鼠饲料, A、B、C组大鼠每天给予高脂肪饲料 (77.5%基础饲料、10%蛋黄粉、10%猪油、2%胆固醇、0.5%胆酸钠) 喂养, 连续12周, 每周定时称量1次体质量[3,4]。造模成功后, A组大鼠给予解毒健脾通络饮药物浓度10mL/ (kg·d) [临床成人用量的20倍];B组大鼠给予多烯磷酯酰碱混悬液69.2mg/ (kg·d) , 正常对照组和模型对照组均给予等体积的蒸馏水灌胃, 继续灌胃4周。

1.2.2 标本采集及检测

各组大鼠术前隔夜禁食。麻醉后开胸穿刺心脏采血处死。血样经离心, 取血清, 使用全自动生化分析仪测定ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C等指标, 称量肝脏湿重、内脏脂肪重量。

1.2.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理, 计量资料以 (±s) 表示, 采用单因素方差分析和q检验。

2 结果

2.1 体质量、肝脏湿重及内脏脂肪的变化情况

16周后A、B、C组大鼠较D组大鼠体质量增长迅速, A、B两组大鼠应用药物治疗后, A组、B组大鼠体质量高于D组, 但明显低于C组, 均有统计学意义, A组、B组大鼠肝脏湿重、内脏脂肪明显低于模型组, A、B两组相比较无统计学差异, 见表1。

注:与模型组比较, *P<0.05, #P<0.01;与正常组比较, *P<0.05, #P<0.01

2.2 血清生物化学指标

C组大鼠AST、ALT、TG和LDL-C均较正常组明显升高, A组、B组大鼠血清ALT、AST、TG和LDL-C较模型对照组明显降低, 见表2。

3 讨论

目前认为, NAFLD是一种肝组织学改变与酒精性肝病极其相似、但无过量饮酒史、亦无其他明确损肝因素存在的临床病理综合征。NAFLD包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎以及与其相关的肝纤维化或肝硬化[3,4]。我们认为, 本病是由于嗜食肥甘厚味, 酒食内伤, 或久卧久坐, 体丰痰盛, 导致肝失疏泄, 脾失运化, 水湿内停, 痰浊内生, 瘀阻肝络, 络脉不通而发为本病, 其病位在肝, 涉及脾脏。故应以健脾化湿、解毒祛瘀、活血通络为主要治则。

我们的临床及实验研究表明, 解毒健脾通络饮治疗NAFLD有较好的疗效, 尤其在改善大鼠肝功、降低血脂等方面均与多烯磷酯酰碱对照组结果大致相当, 与空白组与模型组比较有明显差异性, 而且安全性良好, 体现了中医药治疗NAFLD的优势及特色。方中枳ā子消湿热、解瘀毒, 为君药, 白术、姜黄补气健脾、祛湿除痰, 为臣药, 配伍丹参活血祛瘀通络。诸药共用, 起到健脾气、祛湿毒、化瘀滞的作用。故解毒健脾通络饮治疗NAFLD有十分理想的临床应用价值, 其确切的治疗机制值得进一步深入研究。

注:与正常组比较, *表示P<0.05, #表示P<0.01;与模型组比较.*表示P<0.05

摘要：目的 探讨解毒健脾通络饮对非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 的疗效。方法 采用高胆固醇高脂饮食喂养, 复制NAFLD大鼠模型, 分为解毒健脾通络饮治疗组 (A组) 、多烯磷脂酰胆碱对照组 (B组) 、模型组 (C组) 及空白对照组 (D组) , 造模成功后分别测量大鼠体质量, 并继续药物干预4周, 再次测量大鼠体质量, 处死大鼠, 称量肝脏湿重、内脏脂肪的重量;检测各组大鼠血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。结果 模型组大鼠ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平明显升高, 与空白对照组比较, 差异有显著性意义 (P<0.01或P<0.05) ;解毒健脾通络饮治疗组及多烯磷脂酰胆碱对照组大鼠的指标检测结果均得到明显改善, 与模型组比较, 差异有显著性意义 (P<0.01或P<0.05) , 而两组比较无显著性差异。结论 解毒健脾通络饮治疗组能显著改善非酒精性脂肪肝大鼠的肝功能, 降低血脂, 其功效同多烯磷脂酰胆碱对照组, 对非酒精性脂肪性肝病有较好的治疗效果。

关键词：解毒健脾通络饮,非酒精性脂肪性肝病,实验研究

参考文献

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[3]厉有名.非酒精性脂肪性肝病的治疗进展[J].中华肝脏病杂志, 2008, 16 (1) :231-236.

大鼠脂肪肝模型的建立 篇7

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠90只, 体重约200g, 由佳木斯大学实验动物中心提供。分为5组, 正常对照组10只, 模型组4组, 各20只。

1.2 实验方法

饲养7d, 实验采用无不良反应, 饮水、饮食以及活动正常者。给予胆总管结扎, 时间分别是24h、48h、96h、168h。结扎后乙醚麻醉大鼠, 处死动物后立即取肝脏。肝组织标本以中性福尔马林溶液固定、石蜡包埋, 进行常规HE染色和直接免疫荧光法染色, 分别用光学显微镜和荧光显微镜进行观察。

2 结果

2.1 肝纤维化模型的成功率

80只大鼠制模成功68只, 建模成功率高达85.0%。其中, 第24小时模型组死亡1例, 建模成功率为95%, 第48小时模型组死亡2例, 建模成功率为90%, 第96小时模型组死亡4例, 建模成功率为80%, 第168小时模型组死亡5例, 建模成功率为75%, 模型组大鼠肝纤维化形成随着时间的增加, 愈发典型。

2.2 病理组织学观察

正常组大鼠肝小叶结构清晰, 呈正常肝组织结构。BDL24h后, 门脉区域的胆小管内腔扩张明显, 在48h后胆小管上皮细胞增多, 同时门脉区域间质发现有肿胀变化。96h后可见到门脉区域扩大以及增殖的胆小管上皮细胞周围的间质细胞有显著增多。168h后可以观察到在肝实质内有胆小管的大量增殖。大鼠HE染色中可见肝组织病变区域多, 面积大, 假小叶形成。168h免疫荧光显示在汇管区附近有胶原沉积。

3 讨论

肝纤维化的病理改变是肝内沉积过度的细胞外基质, 多数慢性肝病人都有不同程度的肝纤维化, 其中大约有30%～40%会发展成为肝硬化甚至肝癌。因此, 治疗肝纤维化就成为治疗慢性肝病中的一个关键问题[3]。建立比较好的肝纤维化动物模型, 对开展肝纤维化基础研究有极其重要的意义, 可以为临床对肝纤维化进行早期诊断、早期治疗提供相应的理论和实验依据, 具有重要的临床意义和价值。近几年来, 通过不同的实验方法诱导不同类型的肝纤维化模型, 已经取得了可喜的成就。主要有胆总管结扎法、四氯化碳、血清制品、重金属、二甲基亚硝胺、硫代乙酰胺、酒精及复合因素的建立模型方法[4]。胆总管结扎术是诱导大鼠肝纤维化模型中较为广泛应用的技术, 该模型在肝纤维发生相关的组织学、生物化学、细胞和分子改变等方面具有最好的特性。本实验采用胆总管结扎术模型复制方法, 既可有效形成肝纤维化模型, 同时建模时间又比较短, 而且建模成功率高达85.0%。本实验结果显示胆总管结扎术96h和168h模型组大鼠肝功能明显受损伤, 胶原纤维面积密度明显增加, 汇管区大量纤维组织增生, 较粗的纤维间隔伸入肝组织内, 形成大小不等的假小叶。另外, 在建模失败死亡的大鼠尸检中发现, 组织学观察见肝细胞大面积坏死伴有中性粒细胞浸润, 严重感染为模型组大鼠的死亡原因。因此, 在实验过程中保持严格的无菌操作以及防止感染是保证建模成功的重要因素。本实验成功地建立了大鼠肝纤维化模型, 为后续实验做了铺垫, 也为深入研究诊断以及治疗肝纤维化提供了理想的动物模型。

参考文献

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[3]唐桂连.肝星状细胞与肝纤维化[J].实用医技杂志, 2007, 14 (1) :116-117

大鼠脂肪肝模型的建立 篇8

1 材料与方法

1.1 实验动物

近交系健康雄性Lewis大鼠,3、4月龄,体重150~200 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,大鼠按标准实验室动物要求,正常饲料喂养。

1.2 主要试剂与仪器

2-乙酰氨基芴(2-acetaminofluorene,AAF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、DMEM高糖、DMEM/F12培养基和胶原酶Ⅳ均购自美国Sigma公司,c-kit多克隆兔Ig抗体为Santa Cruz公司产品,FITC标记山羊抗兔Ig抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司提供,D-Hank及胎牛血清为Hy Clone公司提供,干细胞因子(stem cell factor,SCF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和白血病抑制因子(leukemia inhibiting factor,LIF)购自Cytolab/Peprotech Asia公司,Pronase E、DNase I和Percoll由Amerdhsn Bio-sciences供给。二氧化碳培养箱为SANYO,德国LEI-CA DMIRB荧光显微镜。高速冷冻离心机Avanti J-301为美国Beckman公司制造。

1.3 肝卵圆细胞增殖模型的建立和细胞分离

清洁型雄性Lewis大鼠,室内温度18~27℃,湿度40%~80%,正常饲料喂养。将AAF溶于植物油中,每日下午灌胃1次,按20 mg/(kg·d)连续喂养6d。第7天在乙醚持续吸入麻醉下施行左肝切除术或2/3肝切除术。第8天继续喂养AAF(剂量同术前),至第14 d结束,然后于术后第12 d在全麻下再次经上腹正中切口人腹,迅速切取剩余肝脏,放人冰D-Hank液中漂洗备用。参照文献[2,3],用眼科剪剪碎肝组织成0.1 cm见方组织块,冰D-Hank液洗后,将肝组织放人2 m L含0.10%胶原酶Ⅳ和0.025%EDTA的DMEM培养基,继续剪碎肝组织,倒人50mL三角烧杯。加上述消化液8 mL,在37℃水浴振洗15 min,上部液体经100目滤器过滤,残存组织按上述消化过程重复进行1、2次。细胞悬液经50×g,4℃离心5 min。上清液经350×g,4℃离心10 min。沉淀的细胞用2 mL DMEM培养基悬浮,加入50mL含0.10%Pronase E和0.005%DNase I的DMEM培养基,37℃、5%二氧化碳培养30 min。细胞悬液经4℃、350×g离心10 min。细胞用2m L D-Hank液悬浮。用D-Hank液将Percoll按体积分数配成90%、70%和50%3种浓度梯度,经4℃、3 000 r/min离心30 min,吸取位于50%与70%Percoll之间细胞层。2 mL DMEM悬浮沉淀的细胞,接种于0.2%明胶处理的含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液的塑料培养瓶。在37℃、5%二氧化碳孵箱中培养过夜。新分离的细胞用0.25%台盼蓝染色观察细胞活力和进行干细胞表面标志鉴定[1]。

1.4 大鼠肝卵圆细胞增殖培养和诱导分化

DMEM/F12(1∶1)培养基按青霉素100 u/mL、链霉素100 g/mL和二性霉素B 1 ng/mL配制。细胞悬液按1×106个/瓶接种到DMEM/F12培养瓶,加10%胎牛血清。生长因子浓度为SCF 20 ng/mL、HGF 10 ng/mL、EGF 10 ng/mL和LIF 10 ng/mL,诱导分化时撤去LIF。在95%空气、5%二氧化碳条件下持续培养,每3天换1次新鲜培养基,双相倒置显微镜下观察细胞生长及分化情况并记录细胞形态[4]。

1.5 大鼠肝卵圆细胞表面标志c-kit免疫荧光检测

取新分离纯化的肝卵圆细胞悬液1滴置于经多聚赖氨酸处理的载玻片,涂片后室温下晾干,4%缓冲多聚甲醛固定,PBS充分漂洗。c-kit多克隆兔Ig抗体(一抗)按1∶100~1∶150滴加,4℃的湿盒内保持24 h以上。用PBS洗3次,每次3 min。加入FITC山羊抗兔Ig荧光抗体(二抗,1∶80),37℃,静置40 min。PBS洗3次,每次3 min。2%缓冲甘油封片。在LEICA DMIRB荧光显微镜下扫描摄像。

1.6 RT-PCR分析肝卵圆细胞白蛋白及CK19表达

用Tri reagent从所纯化的肝卵圆细胞中提取总RNA,用Omniscript RT纯化试剂盒将RNA转录成c DNA,加30μL反应体系:10×Hotmaster Taq Buffer 5μL,d NTP(2.5 mmol/L)4μL,c DNA2μL,上游引物及下游引物各1μL,Hotmaster Taq(2.5u/m L)1μL,加无RNA酶的水至30μL。以c DNA为模板,用Hotmaster Taq扩增目的片段。所用引物序列:白蛋白上游引物为5'-TGTCACGGCGACCTGTTG-3',下游引物为5'-GGAGATAGTGGCCTGGTTCTCA-3'。CK19上游引物为5'-GACTTCCGGACCAAGTTTGAG-3',下游引物为5'-CGCAGGCCGTTGATGTC-3'。95℃预变性15 min,循环参数为94℃变性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,循环35次,最后延伸5 min。

2 结果

2.1 肝卵圆细胞形态特征和增殖潜力

平均细胞产量为(5.10±0.40)×106,Trypan blue拒染实验细胞活性率(94.30±1.89)%。光镜下观察为单个游离体积较小的不规则圆形细胞,大小不等,约为正常肝细胞的1/5至1/3大小(图1)。肝卵圆细胞培养HOC培养12 h后开始贴壁,3 d后大部分细胞贴壁,贴壁细胞细胞体积增大,呈多边或多角形,呈现上皮细胞的特点(图2);在明胶处理的条件下,在培养基中加入HGF,48 h~7 d后细胞数量成倍增加,并快速地长出微足。细胞分化成不同的细胞形态,包括胆管细胞和肝细胞,显示出肝卵圆细胞多向分化的潜力(图3)。

多为聚集成团的细胞,其余为红细胞

2.2 肝卵圆细胞表面标志c-kit免疫荧光鉴定结果

新分离肝卵圆细胞经过2周培养后,行c-kit干细胞标志鉴定,表达c-kit抗原的肝卵圆细胞发出黄色荧光(图4、5)。

2.3 肝卵圆细胞白蛋白及CK19 mRNA表达结果

RT-PCR分析显示,成熟的肝细胞仅表达白蛋白mRNA,胆管上皮细胞表达CK19 mRNA,不表达白蛋白mRNA。而新分离的肝卵圆细胞同时表达CK19和白蛋白mRNA,提示肝卵圆细胞有2种分化潜能。

3 讨论

HOC是肝实质细胞谱系的双潜能前体细胞,具有典型的肝脏干细胞表型。关于肝脏干细胞的定位、来源以及HOC与肝病的关系已初步阐明。由于肝脏干细胞在急慢性肝功能衰竭、遗传性代谢障碍性疾病、基因导向治疗等方面具有广阔的前景,并对了解肝细胞的发育及肝癌、肝硬化等疾病的发生机制有重要意义,因而诱导分离出大量高纯度的肝脏肝细胞并进行体外大量扩增以利于更深一步的研究就显得尤为迫切和重要。

肝卵圆细胞活化模型目前最多使用的是AAF和2/3肝切除术。此类模型的基本原理是:(1)2/3肝切除或左肝切除致肝损伤,以刺激肝再生;(2)用肝脏毒性药物抑制肝细胞增殖。AAF是一种致癌药物,它在肝细胞内可被I相代谢酶分解为具有肝细胞毒性的N-羟基衍生物,该物质为细胞有丝分裂的抑制剂,可有效抑制肝实质细胞的增殖。胆管上皮细胞及幼稚的肝卵圆细胞内富含Ⅱ相酶的含量则极低,故AAF不能抑制此类细胞的增殖。此时用肝脏部分切除术诱导肝损伤,肝内星状细胞HGF合成增加,肝干细胞被激活,卵圆细胞增殖,同时表达HGF受体,星状细胞分泌的HGF作用于相邻的卵圆细胞,进一步促进卵圆细胞的大量增殖。文献[4]报道,多数人用胃管灌喂AAF给大鼠,笔者曾尝试在饮用水中加AAF,但发现AAF不溶于水,无法控制药物的摄入量,可溶于植物油,灌胃时油溶液单次不超过1m L,否则易导致大鼠腹泻,不能耐受肝切除手术。

肝卵圆细胞分离方面本实验方法有以下特点:(1)而本实验未用含0.10%胶原酶Ⅳ经门静脉灌注肝脏[6,7],而是直接将肝组织剪碎后加入含0.10%胶原酶Ⅳ的DMEM培养液消化,缩短了细胞缺血和分离时间,操作简单易行,对肝卵圆细胞存活和培养更有利。(2)分离肝卵圆细胞时,用0.025%EDTA处理细胞悬液以去除成纤维细胞,用0.10%Pronase E和0.005%DNaseⅠ培养非实质细胞悬液30 min,以去除成熟的肝细胞,因成熟的肝细胞易贴壁。(3)Percoll梯度离心时用D-Hank液分别按90%、70%和50%稀释Percoll,细胞分层比生理盐水更明显;按3 000r/min离心30 min,可将细胞和细胞碎片很好分开,细胞活度在90%以上,避免了离心管的破裂问题。本实验使用胶原酶消化自成体大鼠分离的肝卵圆细胞和Percoll浓度梯度离心分离过程得到的细胞纯度和活力均较高,有典型的卵圆细胞的形态特征。

本组采用细胞形态和增殖分化的观察、干细胞免疫荧光和RT-PCR分析法证实了肝卵圆细胞的存在,为进一步研究肝卵圆细胞生物学特征打下了基础。目前虽然未发现HOC的特异性标记物,但已经筛选出HOC高度表达的标记物如CK(CK19、CK18、CK7、CK8)、OV6、AFP、MAP kinases等。卵圆细胞具有分化和转分化的能力。可以表达幼稚型肝细胞的表面标记、胆管上皮细胞表面标记、肝细胞表面标记和造血干细胞的表面标记,。特异性的表面标记白蛋白特异定位于成熟肝细胞,CK19是胆管上皮细胞的特异性标志,新分离的肝卵圆细胞共同表达白蛋白和CK19,提示分离的肝卵圆细胞有2种分化潜能。这种细胞也表达干细胞抗原c-kit,进一步证实刺激后成体肝组织内干细胞的存在。

应用多种生长因子对体外培养的卵圆细胞进行诱导和调控被作为研究细胞分化机制的重要手段。本研究应用0.25%明胶和多种生长因子包括白血病抑制因子(LIF)使肝卵圆细胞增殖,前者使干细胞更快贴壁生长,LIF使细胞保持不分化,使其更快增殖。研究发现肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(α-FGF)等参与正常肝再生的细胞因子在卵圆细胞活化、增殖及分化的过程中起了重要的作用[8]。本研究中SCF在干细胞存活和增殖中发挥很重要的作用,EGF能显著增强上皮细胞DNA的合成和诱导肝卵圆细胞克隆形成。HGF使肝细胞增殖上调和促进分化。

总之,本研究结果显示2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激大鼠分离和提纯了c-kit阳性的肝卵圆细胞,他们有高度的生长潜力和双向分化活性。然而,肝卵圆细胞的研究尚处于初级阶段,有许多问题尚待解决。肝卵圆细胞的激活、分离、培养、筛选、鉴定等方法还需进一步完善,以提高细胞产量和纯度。今后,还将集中研究肝卵圆细胞的生物学特征、增生机制以及定向分化的调节机制,以求阐明肝脏发育及各种病变的发生机制,还将寻找特异性更高的表面标志物,研究肝卵圆细胞与其他干细胞的关系,明确它的演化过程。从而达到体外肝卵圆细胞的大规模扩增、保存、建立细胞系以及定向诱导分化。

摘要：目的建立大鼠肝卵圆细胞(HOC)的增殖模型,探讨分离培养及鉴定HOC的方法。方法采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12天切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和RT-PCR分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达。行体外培养并添加干细胞生长因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)诱导其分化。结果分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达。生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性。结论肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础。

关键词：干细胞,肝卵圆细胞,细胞分离,培养,分化

参考文献

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