毕业生物论文提纲

论文题目：CV-A5小鼠主动免疫保护模型建立及候选疫苗体内效力评估

摘要：手足口病（hand,foot,mouth diseases,HFMD）已成为我国发病率较高的丙类传染病。人肠道病毒71型（EV-71）、柯萨奇病毒A组、B组、埃可病毒均引起HFMD。2008年HFMD在我国爆发流行,同年被纳入传染病防治法进行管理和检测。随着EV-71疫苗的上市,重症HFMD病例明显减少。但是自2012年以来我国由非EV-71、非柯萨奇病毒A16型（CV-A16）引起的HFMD爆发逐渐增多。在北京、山东、广州、湖南、福州和深圳等省市已超过50%,并且在部分地区达到了80%以上。根据2018年中国疾病控制中心（CDC）发布的HFMD病例数据显示排除EV-71和CV-A16,柯萨奇病毒A6型（CV-A6）和柯萨奇病毒A10型（CV-A10）占比升高,柯萨奇病毒A2型（CV-A2）、柯萨奇病毒A5型（CV-A5）的病例开始增加。而本研究样品的来源湖北襄阳地区,基于EV-71疫苗干预的背景下,2016-2017年期间HFMD患儿的3216份临床样本中分析得知CV-A5的发病率增高至4.57%。为了降低HFMD的发病率,在EV-71疫苗基础上研发多价HFMD疫苗势在必行。但CV-A5相关基础研究薄弱,相关的研究进展缓慢。CV-A5致病机理、免疫原性及评价疫苗效力的各种动物模型研究和建立亟待解决。本研究首先通过原核表达系统构建和表达CV-A5结构蛋白VP1、VP2、VP3以及病毒实心颗粒（FP,细胞工厂纯化）,并将其免疫日本大耳白兔。细胞工厂制备和纯化FP,用于制备中和活性的多克隆抗体。最终获得Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP为病毒鉴定及抗原的定性定量分析提供工具。本研究将临床分离株CVA5-3487在昆明鼠和RD细胞交替适应性传代,经过15次鼠脑和16代细胞传代适应获得小鼠适应准种库CVA5-M14。该病毒株通过腹腔,颅内,口服途径感染昆明鼠。病毒株通过三次空斑纯化后获得20个克隆株,随后选取两株病毒滴度相同的克隆株,以相同的感染剂量进行体内毒力比较试验,筛选出一对强弱毒株,分别是CVA5-M14-611,CVA5-M14-111。两个病毒株全基因组序列分析得知共有8个位点核苷酸存在差异,其中有4个核酸位点与氨基酸的变化有关,与病毒毒力有关,分别为VP2-T1239C/V165A;VP3-T1749C/Y335H;VP1-A2540G/S599G;3D-A6104C/I1787L。强弱毒株及动物模型研究内容已获专利受理号（202010097588.2）。本研究通过高感染复数传代将CV-A5适应至Vero细胞,并筛选适合疫苗研发的克隆候选株。人工合成两株CV-A5克隆株基因全序列,构建至pBR322质粒形成重组载体。制备感染性cDNA进行病毒拯救,成功拯救出两株经RD细胞分离,但无RD细胞传代背景,符合人用疫苗Vero细胞基质生长的疫苗候选株。两个疫苗候选株的从生长能力、全基因组序列、抗原产量研究以选择高滴度、高产量的疫苗候选株。两株病毒对生长能力存在差异,全基因组序列分析发现共有15个位点核苷酸存在差异,其中有6个核酸位点改变引起氨基酸的改变,分别为VP4-C941T/F66S;VP4-A1107G/R121K;VP2-T1404C/A220V;VP3-G2204A/V487I;VP3-T2586C/V614A;3D-G6854A/T2037A。本研究在10层细胞工厂中培养,接种病毒,制备候选疫苗。将病毒收获液通过蔗糖垫底离心,氯化铯（CsCl）密度梯度离心纯化收获液,获得CV-A5三种病毒颗粒,即空心颗粒（EP）,FP和致密病毒颗粒（DP）。利用TEM,SDS-PAGE,WB对病毒颗粒的完整性,纯度和特异性进行鉴定,分别以EP、FP、EP+FP（自然比例2:8）、VLP为抗原,加入终浓度为1.05mg/ml铝佐剂,免疫剂量分别为每剂0.5μg、1.5μg、4.5μg纯化病毒颗粒,两次免疫小鼠并检测血清中和抗体滴度以确定每个剂量组的血清抗体阳转率和体液免疫应答。结果显示4种抗原均可诱导高水平中和抗体,血清抗体至少维持至初免后第10周。FP、EP+FP的体液免疫原性强于EP、VLP组。在抗原剂量为1.5μg时FP、EP+FP可诱导最高水平中和抗体的产生。EP在1.5μg剂量时才能诱导小鼠产生较高效价的中和抗体,并高于13.5μg的VLP组。此外,本研究建立14日龄主动免疫-攻毒保护模型并评估CV-A5单价灭活疫苗保护效率。即昆明鼠分别于第3、10日龄时进行初免和加强免疫CV-A5 EP、FP、EP+FP、VLP抗原,免疫剂量为1.5μg,对14日龄昆明鼠攻毒（加强免疫后第4天）。结果EP、FP、EP+FP疫苗保护率为100%,VLP疫苗保护效果为90%,加强免疫攻毒当天后昆明鼠血清中和效价最高可达32,免疫攻毒后观察期结束第14天仍可检测到中和抗体效价为1024。结果表明小鼠免疫-病毒攻击时,体液免疫记忆细胞快速应答。此动物模型成功用于CV-A5疫苗主动保护实验,为CV-A5单价灭活疫苗体内保护效力提供了动物试验数据,并为多价手足口疫苗研制提供了疫苗体内效力评价方法。

关键词：手足口病;柯萨奇病毒A组5型;动物感染模型;候选疫苗体内效力

学科专业：免疫学

英文缩略词表

中文摘要

Abstract

前言

第一章 实验材料与方法

1 实验材料

1.1 病毒,细胞

1.2 质粒,克隆测序用引物,菌株

1.3 实验动物

2 实验试剂

3 常规实验试剂的配置方法

3.1 细菌培养相关试剂

3.2 SDS-PAGE及 WB相关试剂

3.3 核酸电泳相关试剂

3.4 IFA实验试剂

3.5 细胞,病毒培养相关试剂

4 实验仪器设备

5 实验方法

5.1 GST-VP1-ΔN56,GST-VP2-ΔN25,GST-VP3-ΔN8 多克隆抗体的制备

5.2 细胞培养

5.3 病毒传代

5.4 基于RD/Vero细胞基质的相关病毒滴定

5.5 CV-A5在昆明鼠体内适应性传代

5.6 基于Vero细胞基质CV-A5 疫苗候选株的筛选,构建,拯救及免疫原性研究

5.7 CV-A5疫苗候选株生物学特性和免疫原性研究

5.8 CV-A5主动免疫保护模型的建立

第二章 CV-A5-VP1、VP2、VP3、FP兔多克隆抗体的制备及应用

1 结果

1.1 构建pGEX-6p-1-VP1-ΔN56、pGEX-6p-1-VP2-ΔN119、pGEX-6p-1-VP3-ΔN8重组质粒

1.2 GST-VP1-ΔN56、GST-VP2-ΔN119、GST-VP3-ΔN8 重组融合蛋白可溶性分析

1.3 Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP多克隆抗体效价测定

1.4 Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP多克隆抗体的特异性分析

1.5 多克隆抗体免疫荧光鉴定

2 小结

第三章 CV-A5在小鼠体内进行适应性传代

1 结果

1.1 CV-A5-M14的筛选过程

1.2 CV-A5-M14感染14日龄昆明鼠最优的感染途径选择

1.3 CV-A5-M14 对昆明鼠和Balb/C鼠敏感性比较

1.4 CV-A5-M14 LD_(50) 测定

1.5 CV-A5-M14-611,CV-A5-M14-111 两克隆株毒力比较

1.6 CV-A5-M14-611,CV-A5-M14-111 全基因组序列分析

2 小结

第四章 CV-A5 疫苗候选株筛选,感染性c DNA的构建及病毒拯救

1 结果

1.1 PBR322-CV-A5-rN4,PBR322-CV-A5-rN20 重组质粒构建及线性化

1.2 体外转录vRNA

1.3 病毒转染Vero细胞,及连续传代

1.4 CV-A5-N4-P3,CV-A5-N20-P3 病毒原毒株,拯救株病毒滴度比较

1.5 CV-V5-vN4-P3,CV-A5-vN20-P3 疫苗候选株生长曲线分析

1.6 CV-V5-vN4-P3,CV-A5-vN20-P3 全序列比较

2 小结

第五章 CV-A5 Vero细胞基质抗原纯化及免疫原性研究

1 实验结果

1.1 CsCl梯度离心纯化CV-A5 病毒颗粒

1.2 TEM,SDS-PAGE,WB鉴定病毒颗粒

1.3 CV-A5 抗原产量比较及EP、FP、DP比例计算

1.4 中和毒的滴度测定

1.5 中和毒的鉴定

1.6 CV-A5免疫原性实验

1.7 CV-A5-3487 株免疫血清与CV-A5 Swartz株,EV-71 的交叉中和反应

2 小结

第六章 主动免疫保护实验

1 结果

1.1 14日龄昆明鼠主动免疫保护实验存活率、临床评分和体重变化

1.2 RNA标准品制备

1.3 病毒载量的测定

1.4 主动免疫保护模型小鼠中和血清效价测定

1.5 组织病理切片分析

1.6 免疫组化切片分析

2 小结

第七章 总结,讨论与后续实验计划

1 总结和讨论

2 研究意义

3 下一步的工作计划

参考文献

致谢