病理生理学临床医学论文提纲

论文题目：两种中药提取物的降糖活性及机制研究

摘要：糖尿病（DM）是一类对胰岛素反应异常、敏感性减弱的特征性多因素疾病。通常这种慢性代谢紊乱可触发机体内许多高危事件的发生,包括高血压,中心性肥胖,肾病,心肌梗死,脑血管损伤以及视网膜病变。世界各国的糖尿病人数不断上涨,尤其在中国。2型糖尿病（T2DM）作为DM最常见形式,在患病人群中占有很大一部分比重。而胰岛素抵抗（IR）通常被定义为T2DM在病理生理学上的典型特征。它是靶组织对胰岛素代谢行为反应力下降的表现,是引发葡萄糖消耗和异生出现混乱发生稳态失衡的结果。葡萄糖转位体4（GLUT4）作为脂肪和肌肉中唯一响应胰岛素将血糖运输到细胞内的载体,本文旨在以GLUT4为靶点来挖掘潜在的降糖类治病药物。目前用于调控胰岛素或葡萄糖的降糖类药物中有许多对耐受性差的患者带来严重副作用和沉重的经济负担。天然药用植物以疗效优越,副作用少的特点越来越多地被用于现代临床医学,作为治疗T2DM的替代药物。因此我们从两种天然植物分别获取蒲公英氯仿提取物以及番泻叶乙醇提取物并通过实验研究它们的降糖活性以及其作用机理。首先,我们对蒲公英氯仿提取物进行探究。GLU-OX氧化酶试剂盒测定L6细胞对葡萄糖的消耗量。以胞内IRAP-mOrange融合蛋白为报告分子在激光共聚焦显微镜（confocal）记录下进行GLUT4易位和Ca2+动态追踪。随后,构建稳转myc-GLUT4-mOrange的L6细胞系并根据FITC免疫荧光标签来监控GLUT4与细胞质膜（PM）的融合插入情况。最后,real time-PCR以及western blotting技术分别探究GLUT4的mRNA、蛋白表达以及AMPK、PKB/Akt、PKC三种激活蛋白激酶的磷酸化水平。结果表明蒲公英氯仿提取物上调GLUT4的表达,促进GLUT4的易位和PM融合,最终导致葡萄糖的摄取。但与PI3K抑制剂wortmannin及PKC抑制剂G?6983作用不同,该提取物介导的GLUT4蛋白质表达和转运在AMPK抑制剂compound C作用下明显被削弱。AMPK是被检测蛋白质中唯一磷酸化表达增加的分子,该提取物诱导的GLUT4易位与Ca2+无关,这些结果表明蒲公英氯仿提取物通过AMPK信号途径激活了GLUT4胞内活动,提示蒲公英氯仿提取物可作为治疗T2DM的一种新型潜在降糖药物。其次,我们还探讨了在另一种天然植物番泻叶乙醇提取物影响下L6细胞内GLUT4活动与Ca2+的相互联系及其降糖机制。番泻叶乙醇提取物不仅刺激了葡萄糖摄取,GLUT4表达和易位,PM融合,而且触发胞内Ca2+升高,AMPK,Akt和PKC磷酸化。Compound C、wortmannin、G?6983,G蛋白抑制剂PTX/Gallein和PLC抑制剂U73122均可减弱番泻叶乙醇提取物诱导的GLUT4易位。同样,除PTX/Gallein和U73122外,IP3R抑制剂2-APB和0 mM Ca2+-EGTA溶液也能部分抑制细胞内Ca2+水平的升高。0 mM Ca2++10μM BAPTA-AM对番泻叶乙醇提取物介导的GLUT4活性有显著的抑制作用。总之,番泻叶乙醇提取物通过激活AMPK、PI3K/Akt和G蛋白-PLC-PKC通路调节GLUT4的表达和易位,并通过增加Ca2+浓度来促进GLUT4囊泡与PM融合以及葡萄糖摄取。因此,番泻叶乙醇提取物有望成为改善T2DM的一种潜在药物。上述研究提示,通过对天然药用植物的药物活性和分子机理的挖掘,为寻找作用于GLUT4降糖活动的系列药物提供了帮助,为治疗胰岛素抵抗或T2DM的临床研究提供了理论依据。

关键词：2型糖尿病;L6细胞;葡萄糖转运蛋白4;蒲公英氯仿提取物;番泻叶乙醇提取物;钙离子;信号通路

学科专业：发育生物学

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论

1.1 糖尿病(DM)

1.1.1 二型糖尿病(T2DM)

1.1.2 骨骼肌与T2DM

1.2 葡萄糖转运家族

1.2.1 葡萄糖转运体4(GLUT4)

1.2.2 GLUT4 的内循环途径

1.2.3 GLUT4 与糖尿病

1.3 IRAP概述

1.3.1 IRAP与 GLUT4 的联系

1.4 Ca~(2+)的信号网络

1.4.1 Ca~(2+)与GLUT4 之间的关系

1.5 GLUT4 相关的信号通路

1.6 天然药用植物

1.6.1 天然药物产物与DM治疗

1.7 本文构想

1.7.1 选题缘由及目的

1.7.2 研究内容

第2章 实验仪器、材料和试剂

2.1 实验材料

2.1.1 实验对象

2.1.2 细胞培养与准备

2.2 实验仪器和耗材

2.2.1 实验仪器

2.2.2 常用耗材

2.3 实验试剂

2.3.1 常用试剂

2.3.2 抗体及阻断剂

2.4 溶液配制

2.4.1 细胞生理溶液

2.4.2 Western blotting溶液

2.4.3 实时定量PCR溶液

第3章 实验原理及实验方法

3.1 L6 细胞的培养与保种

3.2 Western blotting

3.2.1 总蛋白的提取

3.2.2 蛋白表达量的测定

3.3 Real-time PCR

3.4 激光共聚焦显微镜监控IRAP转运和Ca~(2+)

3.5 免疫荧光实验

3.6 细胞葡萄糖摄取实验

3.7 统计分析

第4章 蒲公英氯仿提取物通过AMPK/GLUT4 途径促进L6 细胞摄取葡萄糖

4.1 引言

4.2 蒲公英氯仿部的提取

4.3 实验结果

4.3.1 蒲公英氯仿提取物促进L6 细胞葡萄糖摄取

4.3.2 蒲公英氯仿提取物促进GLUT4 易位至质膜

4.3.3 蒲公英氯仿提取物增加胞内GLUT4 的表达

4.3.4 蒲公英氯仿提取物主要通过AMPK信号通路促进GLUT4 易位和表达

4.3.5 蒲公英氯仿提取物诱导GLUT4与L6 细胞质膜融合

4.3.6 蒲公英氯仿提取物诱导GLUT4 易位与Ca~(2+)无关

第5章 番泻叶乙醇提取物介导L6 细胞的葡萄糖摄取依赖GLUT4和Ca~(2+)

5.1 引言

5.2 番泻叶乙醇提取物的收集和制备

5.3 实验结果

5.3.1 番泻叶乙醇提取物促进细胞GLUT4 表达及葡萄糖摄取

5.3.2 番泻叶乙醇提取物提高胞内GLUT4 易位

5.3.3 胞浆Ca~(2+)有利于番泻叶乙醇提取物介导GLUT4 易位

5.3.4 GLUT4 的促进依赖于AMPK,PI3K/Akt以及PKC途径

5.3.5 G蛋白和PLC调节药物的胞内Ca~(2+)和GLUT4 易位

5.3.6 IP3R参与番泻叶乙醇提取物触发的胞内Ca~(2+)释放

5.3.7 Ca~(2+)参与GLUT4 插入细胞质膜的过程

5.3.8 番泻叶乙醇提取物诱导Ca~(2+)增加促进细胞对葡萄糖的摄取

第6章 番泻叶中潜在降糖单体组分的研究

6.1 大黄素甲醚诱导GLUT4 易位和葡萄糖摄取

6.1.1 大黄素甲醚通过AMPK和 PKC途径刺激GLUT4 易位和胞浆Ca~(2+)增加

6.2 番泻叶其他单体组分对GLUT4 易位的效应

讨论与展望

参考文献

致谢