小白菊内酯

小白菊内酯（精选三篇）

小白菊内酯 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

食管癌EC9706细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤学国家重点实验室惠赠，河南省肿瘤病理重点实验室冻存。细胞复苏后用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液培养。PN购自Alexis公司，纯度99%，用二甲基亚砜(DMSO)溶解配成0.1M的储存液，-20℃冰箱避光保存，实验前用RP-MI1640培养液稀释成工作浓度。MTT购自Sigma公司，用磷酸盐缓冲液(PBS)配成5 mg/m L过滤除菌置4℃冰箱储存。鼠抗人NF-κB p65单克隆抗体浓缩液，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PN处理后细胞生长曲线的测定

将细胞浓度调整为6×104/m L，每孔100μL细胞悬液接种到96孔板中，待细胞贴壁后换用含终浓度为20、40和80μmol/LPN的培养液，1‰DMSO为溶剂对照组，并设空白对照组和凋零组。将96孔培养板置37℃，5%二氧化碳孵育箱再培养，于24、48和72 h取出一块培养板，每孔加入5 mg/m L MTT试剂20μL，继续培养4 h，吸除上清液，每孔加DMSO 150μL，放于水平摇床上震荡15 min，用酶标仪(波长为492 nm，参考波长为630 nm)测每孔OD值。根据OD值计算肿瘤细胞的抑制率，公式为抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值。以作用时间为横坐标，抑制率为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.2 PN处理后细胞内NF-κBp65蛋白表达的测定

NF-κBp65(用PBS稀释为1∶100的工作浓度)用SP法检测，细胞爬片用PBS洗3遍，每遍5min,0.3%屈立通在冰上细胞通透30 min，余方法步骤按照SP 9000试剂盒说明书操作。用PBS液代替一抗作为阴性对照。乳腺癌组织为阳性对照。根据染色程度和染色细胞百分比进行评分。

1.2.3 流式细胞术检测PN对EC9706细胞凋亡的影响

收集对数生长期的细胞，分别用20μmol/L和40μmol/L的PN处理细胞72 h，收集各组细胞，调整细胞浓度为1×106个/m L，各取1 m L,1 000r/min离心5 min，吸弃上清，PBS离心洗涤2次后，弃上清备用。并设空白对照组。PBS洗涤样品细胞后，以稀释的结合缓冲液重悬细胞(用蒸馏水1:4稀释结合缓冲液)，并调整细胞浓度为(2～5)×105/m L，取195μL细胞悬液，加入5μL Annexin-V-FITC混匀，室温反应10 min,PBS洗涤1次，再以190μL稀释的结合缓冲液，加入10μL的120μL/m L PI，用流式细胞仪分析，每个样本收集20×103个细胞荧光信号，采用Cellquest软件分析结果。实验重复3次。

1.3 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件进行分析，实验结果用均数±标准差表示，MTT结果用重复测量资料的方差分析，免疫细胞化学结果和流式结果采用单因素方差分析，方差不齐将数据进行变量变换，否则用非参数检验。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 MTT法检测P N对食管癌细胞EC9706增殖的抑制作用

20、40和80μmol/L的PN作用EC 9706 24、48和72 h后，细胞生长受到不同程度的抑制。不同浓度组间(F=394.175,P<0.05)，不同时间组间(F=110.599,P<0.05)，时间组和浓度组间(F=10.55,P<0.05)抑制率均差异有显著性。(见表1，图1)。同一时间段不同浓度PN两两比较，24 h 80μmol/L的PN与对照组差异有显著性(P<0.05);48 h 40μmol/L,80μmol/L的PN与对照组差异有显著性(P<0.05),20μmol/L组与80μmol/L组差异有显著性(P<0.05);72 h PN各浓度组两两比较均差异有显著性(P<0.05);各时间段DMSO组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。同一浓度不同时间段的两两比较，40μmol/L组24 h和72 h抑制率的比较差异有显著性(P<0.05);80μmol/L组24 h、48 h与72 h差异有显著性(P<0.05)，余各组比较无显著性差异。

2.2 P N对食管癌细胞EC9706中NF-κBp65蛋白表达的影响

NF-κBp65蛋白在EC9706的细胞质中阳性表达。不同浓度(20μmol/L,40μmol/L)的PN作用EC9706 48 h后，NF-κBp65蛋白的表达与对照组比较降低，差异有统计学意义(P<0.05);浓度组两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)。(见表2，图2，图3)。

注：覮表示NF-κBp65蛋白相比较差异有显著性(P<0.05)

2.4 P N对食管癌EC9706细胞凋亡的影响

用流式细胞术检测PN(20μmol/L,40μmol/L)作用EC9706 72 h后细胞凋亡的变化。结果显示：随着PN浓度的增加，细胞早期凋亡率和晚期凋亡率逐渐升高，PN20μmol/L和PN40μmol/L组与对照组比较，早期凋亡率和晚期凋亡率的差异均有显著性(P<0.05);浓度组两两比较差异有显著性(P<0.05)。(见表3，图4)。

注：1)表示早期凋亡率两两比较差异有显著性(P<0.05)2)表示晚期凋亡率两两比较差异有显著性(P<0.05)

3 讨论

PN在民间常用于治疗偏头痛、牙痛、胃痛、发热和风湿性关节炎。现在的研究表明，PN具有抗肿瘤活性。HARIKRISHNA NAKSHATRI等[6]在乳腺癌中的研究表明，PN抑制多种乳腺癌细胞株的增殖，逆转乳腺癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导凋亡的抵抗。MONICA L GUZMAN等[7]用溶解度和生物利用度强于PN的类似物DMAPT进行实验发现，DMAPT诱导髓性和淋巴性干细胞发生快速死亡。分子水平研究显示DMAPT诱导凋亡的机制在于诱导氧化应激反应、抑制NF-κB及激活P53。本实验结果显示，20μM的PN对食管癌EC9706细胞的增殖有抑制作用，抑制作用呈时间和剂量依赖性。随着PN浓度的增加，作用时间的延长，抑制作用更明显。PN对EC9706细胞的凋亡有显著影响，PN处理的EC9706细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明显增加，PN可以诱导EC9706细胞凋亡。

NF-κB传导通路与肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关。因此，抑制肿瘤细胞中NF-κB的活性是抗肿瘤治疗的主要策略之一。研究表明，PN通过抑制IκB激酶复合物(IKC)，使NF-κB滞留在细胞质中，不能转位进细胞核与相应基因结合。PN还可以直接阻断NF-κB与DNA的结合[8]。本实验结果显示，PN处理后的EC9706细胞NF-κB p65蛋白表达降低，说明PN对NF-κB有抑制作用。抑制NF-κB的表达，NF-κB不能活化下游抗凋亡基因如凋亡蛋白抑制子(IAPs)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)，和细胞周期相关基因如cyclin D1,c-myc，从而抑制肿瘤细胞的增殖，使肿瘤细胞易于经历凋亡或对细胞因子和抗肿瘤药物诱导的细胞死亡敏感[9,10]。另有研究证实，PN可以增加肿瘤细胞内反应氧化物和钙水平，消耗谷胱甘肽和蛋白硫醇[11,12]，对STATs有抑制作用，这可能也是PN抗肿瘤的机制之一。

综上所述，PN可以抑制食管癌细胞的增殖，诱导凋亡，其作用机制可能与抑制NF-κB传导通路有关。PN以NF-κB为作用靶点抑制肿瘤增殖，诱导肿瘤凋亡，有望成为未来抗肿瘤治疗新的候选药物。

参考文献

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孙女可爱的小白菊散文 篇2

当第一次听到孙女那稚嫩的声音叫“爷爷”的一刹那，我真的喜不自禁，那种幸福感是自然的也是莫大的。

孙女是提前出生的，出生时还有十多天的时间便是“中秋节”了。

那年秋天，菊花刚开的时候，花儿艳艳的嫩嫩的;那年中秋，天上的月亮是特别的圆，天上的星星一闪一闪的特别晶亮。小家伙她不愿意一个人寂寞地呆在她妈妈肚子里了，她就提前冲出“包围”来到人世间看月亮呢。

过“满月”的那天，亲朋好友纷纷前来祝贺，像欣赏花儿似的，抱呀看呀亲呀。“这小孩真漂亮啊，白白净净的”、“你看，这方脸大耳的”、“胖呼呼的，好可爱”等等赞美之词不绝。席间大家都为给小家伙起名子“献计献策”，女儿、女婿问我有何高见，我说:“小家伙着急出来，是过‘中秋节'观星赏月的，大名就用‘中秋月圆’中的两个字‘秋月’。”女儿、女婿考虑了一会给取了小名叫“可可”，是可亲可爱的意思，大名叫“秋懿”，是秋天美好的意思。

小家伙长得很特别，刚出生头发又浓又密又黑又粗，好像在她妈妈肚子里就长成熟了似的，皮肤白白细细嫩嫩的，“胎膘”很好，一双大大的亮亮的眼睛不停眨着，特别逗人。小家伙吃饱了喝足了，在摇蓝里待久了，两条胖嘟嘟的小腿儿就乱蹬，两个小手不停地舞着，那神态可爱极了。我常常用手指在她的身上挠痒痒逗她，她就会盯着着我格格笑着，笑得像一朵正开的小菊花儿。

孩子是见风长的，有句话叫“七坐、八爬、九个月长牙”，说的是小孩子到七个月时候就能坐着了，到八个月的时候就会爬了，到了九个月的时候就开始长牙齿了。孩子每成长一步，对于我来说是最开心、最幸福的事。但是，如何让孩子健康快乐的成长，那便是个复杂的系统工程了，要有短期和长期的规划，还要懂得一些。比如，该子生病了，那是个最揪心的事。有一回是可可十六月的时候，正值冬季，大概是受了凉的原故，孩子不停地咳嗽，吃不下半点东西，一天要哭闹几回。我开始紧张了，于是和妻子之间发生了争执，怪她没有注意给孙女防寒，妻子一听来了气反问我：“带不好了，你在干嘛?你没有责任呀!再说了，哪有孩子不生病的?就算哪家全是当医生的，也难保孩子不生病的!”话说得也在理，既然事己发生，现在争吵也没多大意义了，就赶紧送孙女去医院，经医生诊断后，还好，孩子体温测量下来不高，没有发热，只是单纯的肺部发炎，须要一个疗程的挂水治疗。当扎针时，因孩子脉细很难找，护士扎了好几针，孩子经受不了扎几针，撕心裂肺地哭啊叫啊，好像是一针针扎在我心上一样。

哭，是孩子唯一的表达方式。比如说，哪儿不舒服生病了，她不会用语言表达，就用哭的方式。肚子饿了就哭，表明要吃东西了;不耐烦的哭，是想要你抱出去溜达了。这些都是有学问的，要有细心耐心去分析揣摩是哪一种哭。像我这个大男人也没得这份细心，所以，常常闹出笑话来，把孩子肚子饿了要吃奶了，当成哪里不舒服了，还有把孩子哭闹是要抱出去溜达当成要睡觉了等等，搞得我紧张兮兮、手忙脚乱的，不知如何是好。

常言道:“任挑千斤担，不抱肉疙瘩”，带孩子很辛苦很累，要有超强的耐心。当孙女学叫“妈妈、爸爸”时，很自然的就学会了，而且说得很清楚。可叫“爷爷”就不同了，发音模糊，把“爷”说成“一”字了，叫“奶奶”却变成“日”字了。不管怎么说，孩子会“呀呀”学语，我就特别高兴。孙女学走路时又逗又趣，一开始她妈妈把她站在靠墙双手松开，然后手里拿着好玩、好吃的东西，让她走过来拿，一开始向前迈总是摔倒，后来慢慢就稳实多了，那胖嘟嘟的.短短的小腿，走起路来摇摇晃晃的，好玩极了。有时高兴了，她就爬在地上学着猫狗走路，还要骑在妈妈背上学骑马的样子，逗得我们乐她也跟着乐。孩子是有天生灵性的，早上她妈妈吃完早饭拿起包准备上班时，她就举起小手说“再见，拜拜!”，到了晚上下班的时候，她准时到大门外眺望去迎接，“妈妈!妈妈!”地叫个不停。吃饭的时候，有时她还不要奶奶喂，自已学着大人的样子，用勺子一口一口吃，饭米、菜掉到桌子上，就用手捻起来放到嘴里，很是可爱，我就趁机大加赞赏她:“可可真棒!我家可可懂得爱惜粮食了!”越夸她越高兴，我便见缝插针教她一首古诗：“锄禾日当午，汗滴皆下土;谁知盘中餐，粒粒皆辛苦。”她头也不抬地边吃边跟着咿咿呀呀说:“粒粒苦”。孩子的脸说变就变，如果哪天碰到她心情不好的时，或者是遇到不称心如意的事，就闹腾不已。想要的那个东西得不到，不问地上脏不脏就躺在地上打滚耍无赖，急得她奶奶要打她屁股。看到奶奶对她进行惩罚了，她还有招儿，就是叫“爷爷”，让我来为她避护。她奶奶实在没有法子时，急中生智，摸索出一条，唯一可以让她安静下来的方法，便是打开电视机或打开平板电脑，给她看“动画”片。吸引她的注意力，使她安静下来。

孙女渐渐地长大点了，女儿说过年后可以送她上托儿班了，我说：“孩子还小了吧?”女儿说：“托儿所小孩多，是个群体，有集体主义氛围，能够培养她的团结精神。”是的，过于溺爱，等于不会爱，放开手让她融入到群体环境之中，会更好培养她的独立意识，她会更好地茁壮成长的。

小白菊内酯 篇3

关键词：小白菊内酯,人肝癌HepG-2细胞,增殖抑制,凋亡

小白菊内酯是小白菊的主要有效成分, 它属于种半萜稀内酯化合物, 也是西方的传统药物。近些年, 国内科研工作者在中国特有的药用植物—木兰科观光木属植物宿轴木兰中也发现了此单体成分[1,2], 并通过现代色谱手段对木兰科观光木属植物宿轴木兰的所有单体成分的抑瘤活性进行分析, 发现在木兰科观光木属植物宿轴木兰的所有单体成分中, 小白菊内酯的抑瘤活性最强[3,4]。近些年的研究表明:小白菊内酯对很多种肿瘤都有抑瘤活性, 如乳腺癌[5]、胆管癌[6]等, 但目前针对现有文献来讲, 有关小白菊内酯对人肝癌Hep G-2细胞株作用影响的报道很少, 这样就促使了我们对小白菊内酯作用于人肝癌Hep G-2细胞的进一步研究。本论文中用体外培养的方法培养人肝癌Hep G-2细胞;用四唑盐比色法 (MTT法) 检测小白菊内酯对人肝癌Hep G-2细胞的抗增殖及细胞毒作用;用倒置显微镜、光学显微镜等观察小白菊内酯作用人肝癌Hep G-2细胞前后细胞形态的改变;用免疫组织化学染色法通过检测药物作用前后细胞内相关基因蛋白Caspase-3、NF-κB蛋白阳性表达变化的情况来探讨小白菊内酯诱导细胞凋亡的可能机制。本研究以人肝癌Hep G-2细胞为靶细胞, 研究小白菊内酯对人肝癌Hep G-2细胞的Caspase-3和NF-κB蛋白表达的影响并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物与主要试剂

小白菊内酯, 购于北京华美生科生物技术有限公司, RPMI-1640培养液:碧云天试剂公司;胎牛血清:北京华美生科生物技术有限公司产品;二甲基亚砜:美国Amresco公司产品;免疫组化试剂盒:Caspase-3、NF-κB (一抗工作浓度1:100) 购于武汉博士德生物有限公司;PBS缓冲液:购于武汉博士德生物有限公司。

1.2 主要设备

超净台:上海净化设备厂;二氧化碳培养箱:USA产品, TC2323-2E型;倒置显微镜:日本Olympus产品;离心机:Heraeus公司产品;酶联免疫检测仪:TECAN型号infinite M200PRO;光学显微镜:日本Olympus产品。

1.3 细胞株与细胞培养

人肝癌Hep G-2细胞株购于北京华美生科生物技术有限公司。人肝癌Hep G-2细胞以适量浓度接种于含10%胎牛血清和100U/m L青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基中, 置于温度37℃, 二氧化碳浓度为5%及饱和湿度95%的二氧化碳培养箱中进行培养, 每3天传代一次。

1.4 MTT比色法测定细胞增殖抑制率

将对数生长期的细胞接种于96孔板中, 每孔180μL的细胞悬液, 于温度37℃, 二氧化碳浓度为5%及饱和湿度95%的二氧化碳培养箱中进行培养, 待贴壁后每孔加入不同浓度的小白菊内酯20μL, 各培养24、48h后, 每孔加入20μL的MTT溶液。4h后再吸出液体, 加入180μL的二甲基亚砜, 轻微震荡后, 再用酶联免疫检测仪在波长492nm处测其吸光值。

计算公式:细胞的增殖抑制率 (%) = (1-加药组平均吸光值/对照组平均吸光值) ×100%。

1.5 倒置显微镜观察

从二氧化碳培养箱中取出对数生长期的人肝癌Hep G-2的细胞, 显微镜下观察细胞状态后, 待细胞贴壁后加入终浓度为5μg/m L的小白菊内酯, 并设立对照组, 对照组加等量的药物溶剂。加药组分别培养24h、48h、72h, 用倒置显微镜观察、拍照并记录。

1.6 HE染色光学显微镜下观察

从二氧化碳培养箱中取出对数生长期的人肝癌Hep G-2细胞, 显微镜下观察细胞状态, 消化后, 加入新的培养液轻轻吹打制成浓度为10×104个/m L的细胞悬液。然后接种于6孔板中, 放回二氧化碳培养箱中, 第二天待细胞贴壁后, 加药组加入终浓度为5μg/m L的小白菊内酯, 对照组加等量的药物溶剂, 48h后取出盖玻片进行HE染色。

1.7 免疫组织化学染色

加入新的适量的培养液吹打最终制成浓度为10×104个/m L的细胞悬液, 最终将其接种在预先放有经多聚-L-赖氨酸处理的盖玻片的6孔板中, 每孔加入1m L的细胞悬液, 显微镜下观察后再放回二氧化碳培养箱内, 第二天显微镜下观察待培养瓶内细胞贴壁后, 加药组加入100μL最终浓度为5μg/m L的小白菊内酯, 对照组加入等量的药物溶剂, 48h后取出盖玻片按照SABC免疫组化染色试剂盒进行免疫组织化学染色。按照说明书操作。

结果判断标准:免疫细胞化学结果判定按文献介绍的染色强度计算法:无或染色极淡 (阴性-) , 浅棕黄色 (弱阳性+) , 棕黄色 (阳性) , 棕褐色 (强阳性) 。每张爬片以看到棕黄色为阳性表达, 基因蛋白Caspase-3和NF-κB主要在胞质中或胞核与胞质中共同表达。每张爬片在40×10高倍镜下观察5个视野, 在每个视野下分别计算阳性表达率, 阳性表达率= (阳性细胞数/总细胞数) ×100%。免疫细胞化学染色中以已知阳性物质的组织切片为阳性对照, 各组均以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.8 统计学方法

采用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析, 数据资料以均数±标准差 (±s) 表示, MTT法检测应用重复测量的方差分析, 流式细胞仪检测和免疫组化应用独立样本的t检验, 以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测小白菊内酯对人肝癌Hep G-2的抑制增殖作用

MTT法检测结果显示:药物对人肝癌Hep G-2细胞株有明显的抑制增殖作用, 当药物处在同一个浓度时, 随着药物对此细胞作用时间的延长, 药物对其细胞的抑制率逐渐增加, 与对照组相比具有统计学意义 (P<0.05) ;另外, 同一作用时间, 随着药物浓度的增加, 药物对细胞的抑制率也明显升高, 具有显著性差异, 见表1。

注:相同时间不同剂量与前一组比较*P<0.05;相同浓度不同时间比较#P<0.05。

2.2 倒置显微镜观察结果

对照组细胞贴壁生长, 伸展性良好, 细胞呈梭形或多角形, 细胞轮廓清晰。细胞之间连接紧密 (图1A) ;小白菊内酯作用人肝癌Hep G-2 24h以后, 增殖速度减慢, 细胞贴壁能力下降, 细胞体积缩小, 细胞之间连接疏松, 小部分细胞变圆漂浮在培养瓶中;药物作用48h以后 (图1 B) , 增殖速度大大减慢, 大部分细胞变圆漂浮在培养瓶中;药物作用72h以后, 显微镜下观察几乎找不到正常细胞, 大部分细胞都从瓶壁上脱落下来, 并且可见死细胞碎片。

2.3 HE染色光学显微镜下观察结果

对照组细胞呈梭形和多角形, 细胞之间连接紧密, 细胞胞浆丰富, 细胞核完整;小白菊内酯作用人肝癌Hep G-2 24h以后, 细胞伸展减弱, 有一部分细胞呈现圆形, 细胞之间连接疏松, 核浓缩, 染色质出现边聚;药物作用48h后视野中可见凋亡细胞和死亡细胞, 细胞浆浓缩, 染色质浓缩成新月形和“出泡”现象的变化。

2.4 小白菊内酯对肝癌细胞Caspase-3和NF-κB蛋白表达的影响

见表2。光镜下观察:小白菊内酯作用于细胞后Caspase-3在细胞核和细胞质内的表达都有所增强, 与对照组相比起来具有显著性差异。NF-κB在对照组中高表达于细胞质和细胞核中, 而药物处理后, NF-κB在细胞质中呈弱表达, 与对照组相比具有统计学差异, 见表2。

注:对照组与加药组比较, 二种蛋白阳性表达率均具有显著统计学差异P<0.01。

3 讨论

本论文针对不同浓度的小白菊内酯在不同时间段对人肝癌Hep G-2的作用效应。相同浓度的小白菊内酯随着作用时间的延长, 药物的抑制率逐渐增加, 有统计学意义 (P<0.05) 。在同一时间段, 随着药物浓度的增加, 药物对细胞的抑制率也随着增加, 有显著性差异。这就说明小白菊内酯在对人肝癌Hep G-2的药物效应具有时间和浓度依赖性。本实验中发现:用5μg/m L的小白菊内酯处理人肝癌Hep G-2细胞48h可以发现药物对细胞生长的抑制率可达到48.7%, 接近于半数抑制浓度 (IC50) 。本论文中通过倒置显微镜、光学显微镜方法观察细胞各个时段的形态学变化, 并从形态学上探讨小白菊内酯对人肝癌Hep G-2的诱导凋亡作用。本实验通过倒置显微镜观察到:对照组细胞贴壁生长, 伸展性良好, 细胞呈梭形和多角形, 细胞之间连接紧密。药物作用细胞24h以后, 增殖速度减慢, 细胞贴壁能力下降, 细胞之间连接疏松, 小部分细胞变圆漂浮在培养瓶中。药物作用48h以后, 增殖速度大大减慢, 大部分细胞变圆漂浮在培养瓶中。药物作用72h以后, 几乎无活细胞, 并且可见死细胞碎片。在本实验中, 通过免疫组织化学染色法观察到:实验组中终浓度为5μg/m L的小白菊内酯作用于人Hep G-2 48h以后, 实验组的Caspase-3的蛋白表达与对照组相比明显增加, 说明小白菊内酯诱导人肝癌Hep G-2细胞凋亡的机制可能是通过激活Caspase家族中的Caspase-3实现的。小白菊内酯是NF-κB的有效抑制剂, 它主要是通过阻断IκB的降解来阻碍NF-κB通路的。进而发挥各种作用[7,8]。本实验发现, 小白菊内酯作用于人肝癌Hep G-2细胞株后, NF-κB的表达下降, 这就说明小白菊内酯抗人肝癌Hep G-2的机制可能与阻碍了NF-κB通路有关。

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